›
›

Tiếp cận vấn đề phát hiện tồn dư kháng sinh trong các thực phẩm có nguồn gốc từ động vật (Phần 1) - Phạm Kim Đăng

pdf 71 trang phuongnguyen 40
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Tiếp cận vấn đề phát hiện tồn dư kháng sinh trong các thực phẩm có nguồn gốc từ động vật (Phần 1) - Phạm Kim Đăng", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdftiep_can_van_de_phat_hien_ton_du_khang_sinh_trong_cac_thuc_p.pdf

Nội dung text: Tiếp cận vấn đề phát hiện tồn dư kháng sinh trong các thực phẩm có nguồn gốc từ động vật (Phần 1) - Phạm Kim Đăng

  1. TIẾP CẬN VẤN ĐỀ PHÁT HIỆN TỒN DƯ KHÁNG SINH TRONG CÁC THỰC PHẨM CÓNGUỒN GỐC TỪ ĐỘNG VẬT (Phần1) PHẠM KIM ĐĂNG KhoaChănnuôivàNuôitrồngthuỷ sản ĐạihọcNôngnghiệpHàNội
  2. THỰC PHẨM CÓNGUỒN GỐC TỪ ĐỘNG VẬT
  3. Khángsinhvàchănnuôithâmcanh Chăn nuôithâmcanh Mật độ cao Tổnthương, ô nhiễmtiểukhíhậu chuồngnuôi, mấtvệsinh Tổnthấtkinhtế Tăngtỷlệchết, con non thường rấtquantrọng yếu ớt, đề khángkém, Chậmsinh trưởng Sản lượnggiảmhaygiảmnăng suấtchănnuôi
  4. Cácnhómkhángsinhchínhsửdụng trogchănnuôi § β-lactam(penicilline, cephalosporine) § Tetracyclines (oxy-vàchlortetracycline, ) § Aminoglycosides (streptomycine, ) § Macrolides (Erythromycine, ) § Phenicol (chloram~1phe0ni0c ohl, ợ )pchất § Peptid (avoparcine, )Khácnhau § Ionophores (monensine, ) § Sulfonamides (25 loại, sulfaméthazine, ) § Trimétroprim § Nitrofurannes (furazolidone, ) § (Fluo)quinolones § Carbadox
  5. Côngthứcrấtkhácnhauvàphứctạp H NH O H NH H O2N O HO CH N N O CH CO NH 3 2 NH C NH2 N HO OH FURAZOLIDONE CH3 O O CH3 O NH C NH CHO 2 Benzylpenicilline (penicilline) COOH CH2OH C2H5 OH H3 C NH N H H O OH O NHCH S 3 CH CO NH O 2 COOH OH  N OH O O O CH3 CH OH OXOLINIC ACID COOH 2 Cephalexine (cephalosporine) Streptomycine (aminoglycoside) H NHCOCHCl 2 O2N C C CH2OH HOCH H H O 3 N(CH 3)2 OH H H OH H H OH N N O H3CHN O O CH OH 3 CHLORAMPHENICOL N CH3 NH 2 O N O HO OH O OH O O H OH O NHCH 3 O O Tétracycline CARBADOX Spectinomycine (aminocyclitol) S (C H ) N 2 5 2 O CH3 H O OCH3 H3CO N NH 2 H3C O H2C N H3C H3CO H 3C CH3 TIAMULIN HO CH3 NH Trimethoprim 2 HO OH OH H3C CH3 N(CH 3)2 O HO CH H C O 3 HO 3 H C O O 3 H3C H5C2 CH3 H N CH CH2 H2 N S N CH3 H3C 3 O O OCH3 H N CH3 O CH CH CH3O O O O O 3 3 H H O OH H CH2OH CH3 H3C O H OH Sulphadimidine ou sulfamethazine CH CH3 3 MONENSIN (sulphonamide) Erythromycine(macrolide) COOH
  6. Côngthứcrấtkhácnhauvàphứctạp OHH H3CO2S CH2F H NHCOCHCl2 Florfenicol (FF) OHH OHH H3CO2S CH2OH O2N CH2OH H NHCOCHCl2 H NHCOCHCl2 Chloramphenicol (CAP) Thiamphenicol (TAP) OHH H3CO2S CH2F H NH2 Florfenicol amine (FFA)
  7. Côngthứcrấtkhácnhauvàphứctạp 7 FQ lưỡngtính: -Norfloxacine -Ofloxacine -Enoxacine -Marbofloxacine -Enrofloxacine -Ciprofloxacine -Danofloxacine 4 FQ acides: -Cinoxacine -Flumequine -acideOxolinic -acideNalidixic
  8. Tạisaolạiphảikiểmtratồn dư khángsinh trongthựcphẩmcónguồngốc độngvật? p Ảnh hưởng kỹ thuật chế biến, bảo quản sản phẩm: ức chế sự lên men sản xuất acid p Độc hại n Bảovệngườitiêudùng n Bảovệmôitrường: khángthuốc à thúy, nhâny pNgười tiêu dùng: Vấn đềđạo đức
  9. Khángsinhvàtiềmtàngnguyhiểm p Ít độccấptính p Khángsinhcấm(ungthư, quáithai, bất thường ) pGâydịứng p Mấtcầnbằnghệvsv đườngruột à Rốiloạn p Gâykhángthuốc ở vi khuẩn - xuấthiệncácchủngvi khuẩngâybệnhkhángnhiềuloại khángsinh(multi-resistante) - Vô hiệuhoácácloạikhángsinh - Nguycơ ô nhiễmmôi trường
  10. Nguồngốctồndưtồndưkhángsinh Khángsinh+ lợinhuậnchănnuôi Sử dụngkhángsinh(lạmdụng, bấthợppháp) - Điềutrị bệnhcáthể - Phòngbệnhcho đànhoặclô - Kíchthíchsinhtrưởng(Feedadditives ????) - Bảoquản???? Tồndưtrongsảnphẩmchănnuôi Ảnhhưởngxấuđếnmôitrường vàngườitiêudùng
  11. Nguyênnhân p Sử dụngsainguyêntắcvàbấthợppháp: § Cácsảnphẩmchợđen § Bảoquản???? § Sainguyêntắchoặccóchủ định 1. Khôngcó đơn thuốccủaBSTY, 2. Khôngtuânthủ liều 3. Thờigiandừngthuốc. ĐặcbiệtcácVùngdântríthấp
  12. LUẬT LIÊN QUAN TỒN DƯ HAI NHÓM Nhómcácchấtchophépsửdụng à MRL (Maximum Residue Limit). - NhómcácchấtcấmàMRPL (Minimum Require Performance Limit) Cơ sở qui định MRL vàMRPL????
  13. Cơ sở qui địnhMRL vàMRPL???? Tác độngcó Tổng lượng thể quansát khángsinh Mứckhôngthể quansátthấytác độngbấtlợi Hệsốan toàn ADI = Acceptable Daily Intake MRL=Maximum Residue Limit
  14. Khángsinhtừchuồngnuôi đếnbàn ăn • Điềutrị bệnhcủaThú y (ngườichănnuôi) •Kiểmsoátvs giếtmổ, dịchbệnh Kiểmsoátnhậpkhẩu •Cácthuốc đượcphép •Bắtbuộccóthôngbáo Thúy cửakhẩu???? •H.dẫnsửdụng, thờigianchờ •Kiểmsoátthânthịtvànộitạng •Cấmkíchthíchsinh trưởng Cơ quanthẩmquyền: Cụcthúy -Bộ nôngnghiệp •Traçability CụcVSATTP -Bộy tế •KiểmsoátMRL CụcVSANTYTS -BộThuỷ sản Hệ thốngLab ???????
  15. Kiểmsoátcáckhángsinh Khó khăn: chấtcầntìmkhôngbiết trước LiệucóKhángsinhnào trongthựcphẩmkhông? Cáchtiếpcận Cáchtiếpcận theolýthuyết theophântích ể ! th Điềutrkahtônghúy nh ư n Pháttriển, sử dụngmultianalyse Gầ -Sànglọc(screening) Xác địnhdanh -Kỹthuậtphântách sáchcácchấtcần kiểmsoát -Kỹthuậtphântíchphổ (MS)
  16. CHIẾN LƯỢCPHÂN TÍCH CHUNG Mẫu Nhanh, hạnchế tốithiểu Sànglọc dươngtínhgiả, âmtínhgiả Phântích địnhlượng Phântích địnhtính Kếtquả cógiátrị theotiêuchí đặtra
  17. CHIẾN LƯỢCPHÂN TÍCH CHUNG Mục đíchphântích kiểmtra1 mẫu(hay 1 lô) đạttiêuchuẩn hay không? Nhómchophépsửdụng Ø Nồng độ MRL ð Không đạttiêuchuẩn
  18. CHIẾN LƯỢCPHÂN TÍCH CHUNG Mục đíchphântích kiểmtra1 mẫu(hay 1 lô) đạttiêuchuẩn hay không? Nhómcấmsửdụng Ø Nồng độ MRPL (LOD) ð Không đạttiêuchuẩn
  19. CHIẾN LƯỢCPHÂN TÍCH CHUNG 1.Sànglọc (screening) Đạt tiêuchuẩn Nghingờ ( LOD hoặc > MRL) 2. Phântích Lô đượcchấpnhận khẳng định Đạt tiêuchuẩn Không đạttiêuchuẩn ( LOD hoặc> MRL) Lô đượcchấpnhận Bị từ chối????
  20. CHIẾN LƯỢCPHÂN TÍCH CHUNG I. Phươngphápsànglọc(screening) - Nhanh - Phântíchnhiềuchấtcùnglúc(Multi-analyte) - Rẻ - Cóthể tựđộnghoá - Khôngchokếtquả âmtínhgiả II. Phươngphápkhẳng định(lýhoá) - Đặchiệu - Khôngchokếtquả dươngtínhgiả
  21. CHIẾN LƯỢCPHÂN TÍCH CHUNG I. Phươngphápsànglọc(screening) - Test vsv (“Test thậnBỉ”, test 4 đĩa ChâuÂu Premitest, Delvotest, Copan, ) n Test miễndịch (ELISA, RIA ), Receptor-essais (Beta-STAR, Tetrasensor, ) II. Phươngphápkhẳng định(lýhoá) - Nhậndiệnchấttồndư - Địnhlượngchínhxácvà đốichiếuMRL
  22. CÁC PHƯƠNG PHÁP SÀNG LỌC VÀKHẲNG ĐỊNH Phùhợp để khẳng định các chất cấm MS-MS Phùhợp để khẳng định LC/GC-MS các chất cóMRL HPLC-F HPLC-UV Thíchhợpđể sànglọc ELISA VSV
  23. Cácchủngvsv đượcdùngtrongtest VSV kiểm tra tồn dư 1. BACILLUS STEAROTHERMOPHILUS var. CALIDOLACTIS p IMPROVED AGAR DIFFUSION TESTDELVOTEST SP-NT p CHARM AIM-96 DISK ASSAY PLATE METHOD p DELVOTEST MCS COPAN MILK TEST 2. STREPTOCOCCUS SALIVARIUS ssp. THERMOPHILUS ACIDIFICATION TEST or ACIDIFICATION TEST+ TMP VALIO T101 VALIO T102 LUMAC RAPID ANTIBIOTIC TEST KIT 3. BACILLUS CEREUS BACILLUSCEREUS-TEST (tetracyclines) 4. ESCHERICHIA COLI ESCHERICHIA COLI -TEST (quinolones) 5. BACILLUS SUBTILIS BGA 6. MICROCOCCUS LUTEUS 7. BACILLUS BRONCHESEPTICA 8.
  24. Ưunhược điểmcủatest VSV p Ưu điểm p Nhược điểm n Đơn giản n Mộtsốtrườnghợpđọcbằngmàu n Trangbịđơngiản n Ảnhhưởngmộtsốchấtcótrongmẫu (chấtcókhả năng ứcchế VSV (FP), n Cầnítmẫu VSV (FN)) n Phổ pháthiệnrộng n Thờigiantest quálâu n Tương đốinhạy n Không đặchiệu n Tương đốinhanh n Không địnhlượng n Rẻ n Mộtsốchấtkhôngpháthiện được n Mộtsốtrườnghợpđặchiệu nhóm p CAP, nitrofurans, nitro-imidazoles n Độ nhạyphụ thuộc điềukiệncủachủng n Cóthể tựđộnghoá vSVsửdụng n Rấttiện để sànglọc
  25. Cácdạng test VSV - Ứcchế vi sinhvậttạovòngvôkhuẩn -1 chủngcùng1 điềukiệnmôitrường -1 chủng điềukiệnmôitrườngkhácnhau(pH) -Cácchủngchọnlọcchocácnhómkhángsinh -Cácchủngchọnlọc+ pH khácnhau STAR (B.subtilispH 7.2, Kocuriavarians8, B.cereus6, E.coli 8, Geobacillusstearothermophilus7) -Phản ứnglênmen: chỉ thị màu(premitest, DelvoTest .)
  26. Enzym, receptor, miễn dịch p ENZYM n PENZYM 100 PENZYM 100S n TG (tetracycline galactosidase) –test p RECEPTOR & MIỄN DỊCH n SNAP (beta lactam en tetracycline test kit) · LacTek n b_S.T.A.R. · Delvo –X- Press (II) n ELISA · PARALLUX n Charm MRL-test (ROSA) (b -lactam, tetra or both) n CHARM II (5 groups) · Twin Sensor
  27. Ưunhược điểmcủaphươngpháp miễndịch p Ưu điểm p Nhược điểm n Đặc hiệu n Giáthành n Đa số rấtnhạy n Đa số cần KTV được đào tạo n Cóthể sử dụngcácmẫu n Độ đặc hiệu cao đôi khi trở khácnhau thành bất lợi n Bán địnhlượng n Phản ứng chéo (FP) n Tương đốinhanh n Cóthểảnh hưởng mẫu matrix n Một số KT không cótrên thị n Thích hợp dùng kiểm trường soát đầu vào
  28. Ưunhược điểmcủaphươngpháp lýhoá(HPLC, GC, MS, MS/MS) p Ưu điểm p Nhược điểm n Qui trìnhrấtphứctạp(chuẩn n Nhậndiện rõ ràng bị, tách chiết, làm sạch) n Thông tin định lượng n Thiết bị đắt n KTV chuyên nghiệp cao n Rất nhạy n Một số KS không cóqui trình n Thích hợp cho khẳng phân tích bằng PP này định n Mộtsốtrườnghợpthay đổi độ thuhồi
  29. Khả năng phân biệt vàtiềm tàng các chất gây nhiễu (interference) MS-MS Tăng tiềm LC/GC-MS Tăng khả tàng các chất HPLC-F năng phân gây nhiễu biệt HPLC-UV ELISA VSV
  30. CHIẾN LƯỢCPHÂN TÍCH CHUNG Cácsảnphẩmkhácnhau??? Chiếnlượcphântíchcụthể vàcác phươngphápkhácnhau
  31. SỮA Mẫu sữa Test vsv + - Nhận định: Nhận định: è Ảnh hưởng kỹ thuật (quality errors) è Không có vấn đề kỹ thật è Nghi ngờ có chất kháng khuẩn è Có thể có một số chất kháng khuẩn nào đó Nếu cần thiết Khẳng định (nhận dạng) và định lượng Bước 1: Test nhận diện chất/nhóm đặc hiệu = Penase, Penzym, PABA, Receptor test, Immuno assay Bước 2: Phân tích lý hoá = HPLC, GC, GC/MS Kết quả đối chiếu MRL
  32. Kiểmtrakhángsinhtrongthịtvàthận ở Bỉ Procéder à un test rénal Résultat positif Résultat négatif Pas d’analyse de l’échantillon Analyse de l’échantillon de viande de viande par la méthode des La carcasse est acceptée 4 plaques Résultat négatif Résultat positif La carcasse est acceptée Analyse physico-chimique de l’échantillon de viande Concentration LMR La carcasse est La carcasse est acceptée rejetée
  33. Kiểmtrakhángsinhtrongthịtvàthận ở Bỉ Analyse de la lésion d’injection Concentration > LMR Concentration LMR Concentration < LMR La carcasse est La carcasse est rejetée acceptée partiellement
  34. Cáccông đoạntrongphântíchtồn dư p Lấymẫu Chuẩnbịmẫu p Làmsạch p Nghiền Táchchiết p Dungmôihữucơ p Phân táchphalỏng-lỏng Tinhchế, cô đặc p Táchchiếtpharắn(silice) p Bằngáilựcmiễndịch Đo định lượnghoặc địnhtính
  35. Ý tưởngpháttriểnphươngpháp Dư luận Phântích điềutra Yêucầuthựctế Yêucầutheoluật Hìnhthànhý tưởng Tổchứcthựchiện ý tưởng Kiểmtrakếtquả
  36. Nguyênlý“Test thậnBỉ” Đốichứngdương Mẫu+ Mẫu- (Ф1 + Ф2)/2 >= 20 mm ou L >= 2 mm 20 mm 17 mm Ф1 Tyl Sulf L Strep Oxyt 20 mm 18 mm Ф2 Vòngvô Đĩagiấychứa khuẩn Mẩuvỏthận 1µg khángsinh Thạchcấy chuẩn B. subtilis Giấytẩmdịch vùngvỏthận
  37. Nguyênlý“Test thậnBỉ” Ưunhược điểm????
  38. Ý tưởngkhắcphụcnhược điểm Khôngdùngdịchthận, mẩuthậnmà dùngmẫutáchchiết Táchchiếtthế nào? Lượngmẫubaonhiêu? Làmthế nào để kiểmtra đượcchấtlượngtest??
  39. Yêu cầuqui trìnhtáchchiếtthế nào? p Tách đượcchấtcầntìmrakhỏimẫu pĐảmbảođộ thuhồi pCácchấtsửdụngkhông ảnhhưởng đếnchấtcầntìmvàkếtquảđọc p Nếucóthể hạnchếđượccácchất gâydươngtínhgiả Thích ứngPremi-Test
  40. Lượngmẫubaonhiêu? KiểmsoátChấtlượngmôi trường, Đĩacấyvsv Xác định Độ mẫncảmcủa VSV vớikhángsinh Xác địnhlượngKS ítnhất cóthể tạovòngvôkhuẩn (A) Kiểmtralạiqui trìnhtách chiết= kschuẩn M (g) = A * MRL-1 Xâydựngcôngthứctính lượngmẫubénhấtcần lấy(M)
  41. Làmthế nào để kiểmtra đượcchất lượngtest?? Đánhgiácácthamsốđộ mạnh (LOD, Độ nhạy, Độđặchiệu, độ chínhxác) Phạm Kim Đăng, Marie-Louise SCIPPO; Guy DEGAND; Caroline DOUNY; Guy MAGHUIN-ROGISTER (2007): Chuẩn hóa phương pháp sàng lọc định tính kiểm soát tồn dư kháng sinh trong thực phẩm cónguồn gốc động vật theo qui định số 2002/657/EC (bài tổng hợp). Tạp chíKHKT Nông nghiệp, ĐHNN I, TậpV, Số 1/2007; Trang 24-30. d=11&ID_S=20
  42. Chuẩnbịthựchiện Nguyênliệuvàhoáchât - Dungdịchchuẩn (dung môi, chấtchuẩn) - Giốngvisinhvật: Bacillussubtilis BGA - Môi trường nuôi cấy Standard IINutrient Agar for microbiology - Mẫu“trắng” - Dextrose, methanol, NH4OH 2M, NaOH1M, HCl1 và2M. - Trimethoprime (TMP) 1 mg/ml - Đĩagiấy đườngkính12 mm - ĐĩaPetri - Acetonitrile, Acetone
  43. Dụngcụ pMicropipet p Cânphântích(gam, mg, µg) p Nồihấptiệttrùng p Nồihấpcáchthuỷ à45-47°C p Vortex p Máylắcđảo đầu p Lytâm(2000-6000 vòng/phút) p Hệ thốngbay hơi(lytâmchânkhôngor thổiNitơ) p Tủấm30°C
  44. Chuẩnbịmôitrường(1 lít) § Cân 25 g môi trường § Thêm 6 g dextrose = 0,6% (nếudùngdungdịch20% cần?) § Hoàtrong 1 lit nướccất(–số ml đường) (đunsôi, khuấy liêntục, cẩnthậnkhi sắpsôi) § Chovàocáclọ(4x250 ml) (nắphơilỏng) § Tiệttrùngtrong15 phút ở 121°C +/-0,1. § Làmnguồivề47°C bằngnồicáchthuỷ (Nếuthạchdự trữà90°C trong3h, làmnguộià47°C khoảng30 phút)
  45. Chuẩnbịmôitrường(1 lít) § Môitrường đưavàosửdụngsaukhihiệuchỉnh pH=7,2±0,1 ở 25°C bằngHClhoặcNaOH1M § Mỗilọ100 ml môitrường: 20µl TMP (1mg/ml) + 100 µldungdịchhuyềnphùB.subtilis đượcphaloãngtheo hướngdẫnàlắcđều § Đổ 14 ml thạch/đĩa (dày2,2 mm) à (200 ml = 14 đĩa) § Sau khi để thạchcứng, đĩa baogóibaonilonplastic và đượcbảoquản ở 4°C tối đa 1 tuần(úpnắpxuống)
  46. Kiểmtrachấtlượng đĩachuẩnbị
  47. XÁC ĐỊNH MIC Solution µg/ml 8 0,625 7 1,25 6 2,5 5 5 4 6,67 3 10
  48. XÁC ĐỊNH MIC 6.0 Danofloxacine Oxolinic acid Difloxacine Ciprofloxacine Norfloxacine Enrofloxacine Flumequine Sulfadiazine Sulfadimethoxine 5.0 Sulfamethoxazole Chlortetracycline Oxytetracycline Tetracycline 4.0 3.0 2.0 Độ r ộ ng v òng ô k hu ẩ n q u a nh đĩ a gi ấ y ( m ) 1.0 0.0 25.00 37.50 50.00 62.50 75.00 87.50 100.00 112.50 125.00 137.50 150.00 162.50 175.00 Lương kháng sinh chuẩn/đĩa (ng) Độ rộngvòngvôkhuẩnquanh đĩa giấybiến độngtuỳ theo lượngkhángsinhcótrong50 µldungdịchchuẩn
  49. Qui trìnhtáchchiết 3 ± 0,1g tômnghiền 5 ml acetonitrile/acetone(70/30: V/V) Lắc đảo đầutrong10 phút Lytâmtốc độ3000 vòng/phúttrong10 phút ở 15°C ThuhồiLớptrên được 3 gam tôm/200 µl methanol Làmbayhơi đếnkhô=«SAVANT» or khi N2 40°C Phầnchấtkhôcònlại đượcthuhồitrong200 µlmethanol Lytâmtốc độ3000 vòng/phúttrong10 phút ở 15°C 50µl chứa0,75 gamtôm Lớptrên đượcà đĩa
  50. Xác địnhkhối lượngmẫutômbénhất cầnlấychomộtlầntáchchiết Qui trìnhtáchchiết Giớihạnnồng độ tối đa (LMR) QME (g) = QMI * LMR-1 QMI (ngtrong50 µl/đĩa) Khối lượngmẫutômbé nhấtcầnlấy(QME)/phân tích
  51. Phương pháphiểuchỉnhphươngpháp Chuẩnhoá theo QĐ 2002/657/CE -LCR, AFSSA, FOUGERES Xác địnhLOD: MIC à mẫutrắngcủngcốgầnvớiMIC à <5% âmtính Mẫuthựcsựdươngtính Mẫuthựcsựâmtính Kếtquả test (N+) (mẫucủngcố) (N-) (mẫutrắng) PA (Dươngtínhtheo qui Dươngtính FP (Dươngtínhgiả) định) Âmtính FN (Âmtínhgiả) NA (Âmtínhtheo qui định) PA + NA Độ xácthực (%)= x 100 OùN = N+ + N- N PA NA Độ nhạy (%)= x 100 Độ đặchiệu (%)= x 100 N+ N-
  52. NGUYÊN LÝ CỦAKÍT ELISA (FLUORO)QUINOLONES 2 HOURS DO CER CUNG CẤP Giántiếp-Canhtranh
  53. (FLUORO)QUINOLONES 2 HOURS CER _ BỈ
  54. ThànhphầncủamộtKit 1. Mộtplate 96 giếngcóphủ KT tinhsạchcủacừukhánglạiKT cónguồn gốcthỏ 2. 7 lọ cóchứadungdịchchuẩn(KN): 1, 0.5, 0.3, 0.2, 0.1, 0.05 và0 ng/ml 3. DungdịchchứaKN cógắnvớimengâyphản ứngtạomàu(Peroxide cọnugatednorfloxacin) 4. Lọ chứaKT cónguồngốctừthỏ đặchiệuvới KN được đông khô 5. 1 lọ 18 ml Substrate/chromogen(thamgiaphản ứngtạomàu perocide/TMB) 6. 50 ml dungdịch đệmphaloãngpH 7,4 -10x 7. Dungdịchdừngphản ứngH2SO4 6N 8. 50 ml dungdịch đệm để rửa-10x 9. TàiliệuthôngsốkỹthuậtcủaKit
  55. 1. Phủ kháng thể đã được tinh lọc lên bề mặt rắn (1 µg kháng thể cừu kháng lại kháng nguyên có nguồn gốc thỏ IgG) Kháng thể + °C 16/04/2008
  56. 2. a) Cho mẫu đã được tách chiết hoặc 2. b) Cho kháng nguyên có gắn men dung dịch kháng nguyên chuẩn vào vào E Ag-EEnz E Antigen E E E E E E E E E
  57. 2. c) Cho kháng thể đặc hiệu thỏ vào 3. ủ 2h ở 4°C SpecificAb E E E E E E E E E E E E
  58. 4. Rửa loại bỏ các chất không 5. Cho dung dịch phản ứng màu vào được gắn (ba lần) TMB/H2O2 và ủ 30’ trong bóng tối Substate /chromophore E E E E E E E E 6. Dừng phản ứng bằng H2SO4. 7. Đọc ở 450 nm.
  59. Chuẩnbịhoáchất PBS pH 7.4 : 9g NaCl+ 7,78g Na2HPO4.2H2O+ 0,75 g KH2PO4 trong1 lítH2O Methanol/PBS (50/50 V/V) Phaloãngdung dịch đệm10x PhaloãngKN gắnenzyme 100x KhôiphụcKT đôngkhô(+ 6 ml dung dịchphaloãng) ! Lượnghoáchấtchuẩnbịsốmẫuphântích+ đườngchuẩn
  60. QUI TRÌNH TÁCH CHIẾTMẪU 30’’ 10’, 4000rpm lắc đảo đầu30’ 5 gammẫu 5 ml methanol/PBS Ly tâm10 phút (50/50v/v) vớivậntốc3000 0,5 ml 50 µl/giếng vòng/phút 30 giây 4,5 ml d2 đệm phaloãng (phaloãng10x) (*) PBS pH 7.4 :9 gamNaCl, 7,78 gamNa2HPO4.2H2O và0,75 gamKH2PO4 trong1 lít nướccất
  61. QUI TRÌNH TEST
  62. QUI TRÌNH TEST 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A NS NS S1 S1 S9 B 0 0 S2 S2 S9 ChuẩnbịPlate C .05 .05 S3 S3 S10 D 0.1 0.1 S4 S4 S10 E 0.2 0.2 S5 S5 S11 F 0.3 0.3 S6 S6 S11 G 0.5 0.5 S7 S7 S12 H 1 1 S8 S8 S12 Dungdịchchuẩn Mẫu
  63. QUI TRÌNH TEST ô Bước1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 B10 A1 A2 150 µl dd đệmp.loãng - L ắ B1 B2 50 µl dd0 ng/ml c L nh d ắ ố C1 C2 50 µl dd1 ng/ml c ẹ c 50 nh , b D1 D2 50 µl dd0.5 ng/ml đ o ỏ µ 100 L ẹ 150 l , ắ h ở dd ủ c E1 E2 50 µl dd0.3 ng/ml ế t b ư µ 3 0 ph nh , µ l d r l p e r o x i d / T M B/ ử dd ớ ẹ ừ F1 F2 50 µl dd0.2 ng/ml 100 a c ng 1 ú ủ 3 s E . C o n j u g at e/ ph G1 G2 50 µl dd0.1 ng/ml t ó µ 1 h ph l t r o ng ầ ng l ú n dd ả t H1 H2 50 µl dd0.05 ng/ml ở = n 4 5 0 r 4 ồ K T/ dd ứ ° i b A3 A4 50 µl mẫu1 táchchiết C ng ủ ó t r o ng đ gi 1 h ng ệ B3 B4 50 µl mẫu2 táchchiết m ế m gi ng à ở gi t , ế ố u / gi 4 ng ế v C3 C4 50 µl mẫu3 táchchiết i v òng ng ° ỗ t C ° ú ế D3 D4 50 µl mẫu4 táchchiết p hò ng ng p 30 h E3 E4 50 µl mẫu5 táchchiết ế t ph F3 F4 50 µl mẫu6 táchchiết ú G3 G4 50 µl mẫu7 táchchiết t H3 H4 50 µl mẫu8 táchchiết
  64. Tínhkếtquả 2,000 y = -1,0115x - 1,2697 R2 = 0,9915 1,500 1,000 0,500 T 0,000 -3,500 -3,000 -2,500 -2,000 -1,500 -1,000 -0,500 0,000 0,500 l og i t (( B - N S ) / ( 0 NS )) -0,500 -1,000 -1,500 ln (concentration) Đồ thị 1. Đườngchuẩn -B, B0 tương ứnglàmật độquangcủadungdịchchuẩn ở cácnồng độ khácnhauvàtạinồng độ bằng0. -NS mật độ quangcủadungdịchkhông đặchiệu
  65. QUI TRÌNH TEST Mật độ quang Dungdịchchuẩn (OD) NSB* 0 0,07 C0 0 1,226 C1 1 0,307 C2 0,5 0,485 C3 0,3 0,642 C4 0,2 0,801 C5 0,1 0,923 C6 0,05 1,043 Mẫu1: OD = 0,121 Mẫu2: OD = 0,095 Mẫu3: OD = 0,45 à Hãy tínhNồng độ thực ?? Và đưarakếtluận??
  66. NGUYÊN LÝ CỦAKÍT Tetrasensor RECEPTOR ASSAY Assayfor tetracyclineresidues: TheMilkProtocol
  67. CÁC DẠNGKÍTVÀKHẢ NĂNG PHÁT HIỆN
  68. CÁC DẠNGKÍTVÀKHẢ NĂNG PHÁT HIỆN SỮA MẬT ONG MÔ ĐÔNG VẬT Kidney, Liver, Muscle Pig, Chicken, Beef, Seafood, Fish, Eggs
  69. QUI TRÌNH TEST
  70. QUI TRÌNH TEST
  71. ĐỌC VÀGIẢI THÍCH KẾT QUẢ