Giáo trình Miễn dịch thực vật

Nội dung text: Giáo trình Miễn dịch thực vật

1. TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI KHOA NÔNG HỌC BỘ MÔN BỆNH CÂY MIỄN DỊCH THỰC VẬT (Chương trình đại học - 2 tín chỉ) Biên soạn Hà Viết Cường 2008 1
2. Mục lục CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU VỀ MIỄN DỊCH THỰC VẬT 6 1. Định nghĩa và đối tượng nghiên cứu 6 1.1. Nguồn gốc từ miễn dịch (immunity) 6 1.2. Định nghĩa miễn dịch thực vật 6 1.3. Đối tượng nghiên cứu 6 2. Lịch sử miễn dịch động vật 6 2.1. Lịch sử miễn dịch thực vật 7 3. So sánh miễn dịch ở động vật và thực vật 8 3.1. Sự khác nhau 8 3.2. Sự giống nhau 8 4. Các khái niệm cơ bản về tính kháng bệnh thực vật 9 CHƯƠNG 2. CƠ CHẾ GÂY BỆNH CỦA TÁC NHÂN GÂY BỆNH 12 1. Cấu tạo tế bào thực vật 12 1.1. Vách tế bào 12 1.1.1. Phiến giữa (middle lamella) 12 1.1.2. Vách sơ cấp (primary cell wall) 12 1.1.3. Vách thứ cấp (secondary cell wall) 12 1.1.4. Các chất cấu tạo nên vách tế bào 12 1.2. Màng tế bào 13 1.3. Các chất bề mặt của cây 13 2. Đặc điểm chung của tác nhân gây bệnh cây 13 2.1. Nấm gây bệnh cây 13 2.2. Vi khuẩn gây bệnh cây 14 2.3. Virus thực vật 14 3. Cơ chế gây bệnh của tác nhân gây bệnh 15 4. Quá trình xâm nhập của tác nhân gây bệnh vào trong cây và tế bào 15 4.1. Xâm nhập (penetration)của nấm vào trong cây 15 4.1.1. Trực tiếp qua bề mặt ký chủ nguyên vẹn (chủ động) 15 4.1.2. Qua lỗ mở tự nhiên (thụ động) 16 4.1.3. Qua các vết thương cơ giới, các vết nứt tự nhiên (thụ động) 16 4.2. Xâm nhập của vi khuẩn 16 4.2.1. Xâm nhập của virus, mollicute (phytoplasma, spiroplasma) 16 4.3. Dinh dưỡng ký sinh của tác nhân gây bệnh 16 4.4. Các enzyme của tác nhân gây bệnh 17 4.4.1. Các enzyme phân hủy vách tế bào. 17 4.4.2. Enzyme phân giải vật chất trong tế bào ký chủ. 18 4.5. Độc tố của tác nhân gây bệnh 18 4.5.1. Độc tố không chọn lọc ký chủ (NST) 18 4.5.2. Các độc tố chọn lọc ký chủ (HST) 20 4.6. Hocmon thực vật. 20 4.6.1. Auxins. 20 4.6.2. Gibberellins 21 4.6.3. Cytokinin 21 2
3. 4.6.4. Ethylene 21 4.7. Khái niệm tính gây bệnh, tính độc của tác nhân gây bệnh 22 4.8. Phân loại tác nhân gây bệnh theo tính ký sinh. 22 4.9. Phân loại tác nhân gây bệnh theo phương thức sử dụng nguồn dinh dưỡng. 23 CHƯƠNG 3: CÁC BIỂU HIỆN CỦA TÍNH KHÁNG 25 1. Giới thiệu 25 2. Phòng thủ thụ động 25 2.1. Phòng thủ nhờ rào cản vật lý có sẵn 25 2.2. Phòng thủ nhờ các chất hóa học có sẵn 26 2.2.1. Các chất ức chế được cây tiết ra bên ngoài 26 2.2.2. Các chất ức chế có sẵn trong tế bào cây 26 3. Phòng thủ chủ động 27 3.1. Phòng thủ chủ động nhờ hình thành các cấu trúc bảo vệ 27 3.1.1. Phản ứng phòng thủ tế bào chất 27 3.1.2. Hình thành cấu trúc phòng thủ vách tế bào 27 3.1.3. Hình thành cấu trúc phòng thủ mô 27 3.2. Phòng thủ chủ động sinh hóa 28 3.2.1. Phytoalexin 28 3.2.2. Các hợp chất phenolic 29 3.2.3. PR protein (pathogenesis-related protein) 29 4. Sự chết tế bào được lập trình (Programmed Cell Death – PCD), Apostosis và phản ứng siêu nhạy (Hypersensitive Responnd – HR) 31 4.1. Sự chết tế bào được lập trình (PCD) 31 4.2. Tự thực bào (Autophagy) 31 4.3. Apoptosis 31 4.4. Phản ứng siêu nhạy 32 CHƯƠNG 4: THUYẾT GEN ĐỐI GEN 33 1. Giới thiệu 33 2. Thí nghiệm về bệnh gỉ sắt cây lanh của Flor 33 2.1. Vòng đời nấm gỉ sắt Melampsora lini 33 2.2. Kỹ thuật phân tích lai nấm M. lini 34 2.3. Đặc điểm cây ký chủ. 34 2.4. Các thí nghiệm của Flor 35 3. Khái niệm gen - đối – gen. 35 3.1. Khái niệm 35 3.2. Đặc điểm quan hệ gen-đối-gen 36 4. Đặc điểm của gen không độc (gen Avr) của ký sinh 36 5. Gen kháng R và protein R 38 5.1. Pto 38 5.2. CNL (CC-NB-LRR) 38 5.3. TNL (TIR-NB-LRR) 38 5.4. Cf 39 5.5. Xa21 39 6. Tương tác giữa protein R và Avr 39 6.1. Tương tác trực tiếp – mô hình Elicitor – Receptor 39 3
4. 6.2. Tương tác gián tiếp – mô hình bảo vệ (Guard model) 40 7. Đồng tiến hóa giữa gen Avr và gen R 40 7.1. Sự đa dang trong quần thể tác nhân gây bệnh 40 7.1.1. Nấm - Sinh sản hữu tính 40 7.1.2. Nấm – chuyển gen theo chiều ngang 41 7.1.3. Nấm – Đột biến. 41 7.1.4. Vi khuẩn – sinh sản hữu tính 41 7.1.5. Vi khuẩn – đột biến 42 7.1.6. Virus – tái tổ hợp 42 7.1.7. Virus – đột biến 42 7.2. Các yếu tố điều khiển sự tiến hóa của tác nhân gây bệnh 42 7.3. Đồng tiến hóa giữa gen Avr và gen kháng R 43 7.3.1. Đồng tiến hóa trong sản xuất nông nghiệp 43 7.3.2. Đồng tiến hóa trong hệ sinh thái tự nhiên 43 CHƯƠNG 5: MIỄN DỊCH BẨM SINH 46 1. Quan hệ giữa vi sinh vật và cây 46 2. Miễn dịch bẩm sinh (innate immunity) ở động vật máu nóng 46 3. Miễn dịch bẩm sinh (innate immunity) ở thực vật 46 3.1. Tính kháng không đặc hiệu (Non-specific resistance) 47 3.2. Tính kháng đặc hiệu (tính kháng đặc hiệu giống cây/chủng tác nhân gây bệnh 48 4. Các receptor nhận biết PAMP/MAMP/Avr protein 48 5. Nhận biết và tương tác giữa các protein R và PAMP/MAMP/Effector 48 6. Dẫn truyền tín hiệu trong miễn dịch thực vật 49 6.1. Đường hướng salicyclic acid (SA) 49 6.2. Đường hướng dẫn truyền JA và ET 49 6.3. Giao tiếp chéo (cross talk) giữa đường hướng SA và JA/ET 50 6.4. Dòng thác ion và sự đốt cháy oxy hóa 50 6.5. Đường hướng MAPK (Mitogen Activated Protein Kinases) 51 CHƯƠNG 6. TÍNH KHÁNG TẬP NHIỄM HỆ THỐNG 52 1. Định nghĩa 52 1.1. Các hóa chất ngoại bào có khả năng cảm ứng SAR 52 CHƯƠN 7. MIỄN DỊCH TV ĐỖI VỚI MỘT SÔ BỆNH 54 1. Bệnh đạo ôn (tham khảo giáo trình bệnh cây nông nghiệp) 54 1.1. Triệu chứng 54 1.2. Tác nhân gây bệnh: 54 1.3. Xâm nhiễm gây bệnh. 54 1.4. R và Avr proteins 55 1.5. Đa dạng của nấm/ Bộ giống chỉ thị 55 1.6. Quần thể nấm P. oryzae tại miền Bắc Việt Nam 56 1.7. Các giống kháng nhiễm 56 2. Bệnh bạc lá (tham khảo giáo trình bệnh cây nông nghiệp) 56 2.1. Tác nhân gây bệnh. 56 2.2. Xâm nhiễm gây bệnh 57 2.3. R và Avr gen 57 2.4. Đa dạng của vi khuẩn Xoo 58 4
5. 2.5. Đa dạng của Xoo tại Việt Nam 59 2.6. Các giống kháng nhiễm tại Việt nam 59 3. Bệnh xoăn lá cà chua (begomovirus) 59 3.1. Triệu chứng bệnh 59 3.2. Nguyên nhân gây bệnh 59 3.2.1. Tác nhân gây bệnh là một phức hợp loài 59 3.2.2. Hình thái của begomovirus gây bệnh xoăn vàng lá cà chua 60 3.2.3. Đặc điểm bộ gien của begomovirus gây bệnh xoăn vàng lá cà chua 60 3.3. Xâm nhiễm gây bệnh 61 3.3.1. Lan truyền của begomovirus 61 3.3.2. Tái sinh (sinh sản) của begomovirus 61 3.4. Tính kháng đối với begomovirus 61 3.4.1. Tính kháng của begomovirus thông qua gen kháng 61 3.4.2. RNA silencing và begomovirus 61 3.5. Bệnh xoăn lá cà chua ở Việt Nam 62 CHƯƠNG 8. CHỌN TẠO GIỐNG KHÁNG 63 1. Giới thiệu 63 2. Đa dạng của quần thể tác nhân gây bệnh 63 2.1. Đa dạng của tác nhân gây bệnh 63 2.2. Các kỹ thuật dùng để nghiên cứu mức độ đa dạng của tác nhân gây bệnh là: 64 2.2.1. Sử dụng giống chỉ thị (khái niệm và ví dụ: xem chương ) 64 2.2.2. Các phân tích phân tử 64 3. Xác định nguồn gen kháng 66 3.1. Sự đa dạng của thực vât 66 3.2. Nguồn gen kháng 66 4. Lựa chọn gen kháng 67 4.1. Vai trò của tính kháng ngang và kháng dọc trong tạo giống kháng 67 4.1.1. Tính kháng dọc 67 4.1.2. Tính kháng ngang 68 4.2. Lựa chọn gen kháng 69 5. Sử dụng marker phân tử trong chọn tạo giống kháng. 69 6. Đánh giá tính kháng 70 5
6. CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU VỀ MIỄN DỊCH THỰC VẬT 1. Định nghĩa và đối tượng nghiên cứu 1.1. Nguồn gốc từ miễn dịch (immunity) Miễn dịch (immunity) có nguồn gốc từ từ la tinh “immunitas” có nghĩa là “ngoại lệ” chẳng hạn như “không phải phục vụ quân đội”, “không phải trả thuế và các dịch vụ công cộng khác”. Trong văn học Roman, “immunity” có nghĩa rộng hơn như khả năng sống sót khi bị nhiễm độc hoặc là bị bệnh truyền nhiễm. 1.2. Định nghĩa miễn dịch thực vật Hiện nay, miễn dịch (immunity) là một thuật ngữ y học mô tả trạng thái có đủ sự phòng thủ sinh học nhằm chống lại sự nhiễm bệnh hoặc sự tấn công của các tác nhân sinh học. Tương tự, đối với thực vật, miễn dịch, cũng có thể được hiểu là khả năng của cây duy trì sự không bị bệnh trước sự tấn công của các tác nhân sinh học. Cần chú ý là theo sự phân chia truyền thống thì tác nhân gây bệnh bao gồm các vi sinh vật (ví dụ như nấm, vi khuẩn), virus, tuyến trùng và các tác nhân do môi trường bất lợi. Tuy nhiên, hiện nay, một số ý kiến, căn cứ vào định nghĩa bệnh cây, cho rằng côn trùng (đặc biệt là nhóm côn trùng chích hút) cũng có thể gây ra bệnh. Miễn dịch trong môn học miễn dịch thực vật cần phải được hiểu rộng hơn là khả năng của cây chống lại ở mọi mức độ sự tấn công của tác nhân gây bệnh nhờ các đặc điểm cấu trúc và di truyền. Theo nghĩa rộng này, miễn dịch thực vật có thể được hiểu là tính kháng của cây với tác nhân gây bệnh. 1.3. Đối tượng nghiên cứu Miễn dịch thực vật, do vậy, nghiên cứu sự tương tác giữa tác nhân gây bệnh và cây ký chủ trong quá trình gây bệnh nhằm hiểu và ứng dụng khả năng kháng bệnh của cây. 2. Lịch sử miễn dịch động vật Miễn dịch động vật, vẫn thường được gọi là miễn dịch học, là một ngành khoa học quan trọng trong y học và thú y học. Nhiều khám phá lịch sử đã được phát hiện hoặc ngẫu nhiên hoặc gắn liền với nhiều tên tuổi lớn trong khoa học sinh học. Phương pháp chủng đậu của người Trung Quốc và Ấn Độ. Bệnh đậu mùa trên người do Variola major virus (chi Orthpoxvirus) xuất hiện khoảng 10.000 năm trước công nguyên, và là một trong nhưng bệnh nguy hiểm trên người, đặc biệt trên trẻ em. Từ 20 – 60 % người nhiễm bệnh (trong đó 80% là trẻ em) có thể bị chết. Bệnh đã gây ra khoảng 300-500 triệu người chết trong thế kỷ 20. Năm 1979, Tổ chức Y tế thế giới (WHO) đã tuyên bố xóa bỏ được bệnh nhờ các chiến dịch tiêm chủng vacxin trong suốt 2 thế kỷ 19 và 20. Từ nhiều thế kỷ trước, người Trung Quốc và Ấn Độ (khoảng thế kỷ 16) đã biết chữa bệnh bằng cách nghiền vảy đậu mùa từ người bệnh, sau đó nhỏ vào mũi hoặc bôi vào vết cắt trên da người khỏe để phòng bệnh. Vào khoảng 1720, bà Mary Montagu, vợ một đại sứ người Anh tại Thổ Nhĩ Kỳ đã giới thiệu phương pháp chủng đậu của người Thổ (tương tự như của người Ấn và người Trung Quốc) vào Tây Âu. Phương pháp tạo miễn dịch chéo. Cuối thế kỷ 18, Edward Jenner, một dược sĩ người Anh, đã nghe được thông tin rằng có một cô gái không bị bệnh đậu mùa vì cô đã bị bệnh đậu bò (do Cowpox virus, một virus cùng chi Orthpoxvirus với virus đậu mùa), một bệnh trên gia 6
7. súc và cả người nhưng triệu chứng nhẹ hơn nhiều. Thông tin này đã gợi ý Jenner thực hiện thí nghiệm chủng đậu người khỏe bằng cách sử dụng vết bệnh lấy trên da của người bị bệnh đậu bò nhằm chống lại bệnh đậu mùa. Phương pháp của Jenner, sau đó được sử dụng rộng rãi ở Anh. Vào năm1838, chính phủ Anh thông qua luật chủng đậu miễn phí cho người dân, và 20 năm sau (1858), chủng đậu là bắt buộc tại Anh. Phương pháp tạo miễn dịch dùng tác nhân gây bệnh nhược độc. Phương pháp này gắn liền với tên tuổi của Louis Pasteur, một nhà hóa học và vi sinh vật học người Pháp. Ông đã khám phá ra kỹ thuật tiêm chủng này nhờ các nghiên cứu về bệnh tả gà (Pasteurella multocida), bệnh than (Bacillus anthracis) và bệnh dại (Rabies virus). 2.1. Lịch sử miễn dịch thực vật 1894, Ericksson đã phát hiện thấy nấm gỉ sắt cây cốc (Puccinia graminis) gồm các chủng sinh lý không thể phân biệt được về hình thái nhưng khác nhau về tính gây bệnh trên cây ký chủ (ví dụ một số chủng nấm gây bệnh trên lúa mỳ nhưng không gây bệnh trên đại mạch và tiểu mach). Hiện nay, các chủng sinh lý này đã được xác định là: - Puccinia graminis f.sp. tritici gây hại lúa mỳ (wheat) - P. graminis f.sp. avenae gây hại đại mạch (oat) - P. graminis f.sp. secalis gây hại tiểu mach (barley) 1902, Ward và 1915, Stakman. Khi nghiên cứu bệnh gỉ sắt lúa mỳ, các tác giả này đã ghi nhận phản ứng chết hoại rất nhanh trên mô lúa mỳ do nấm và gọi phản ứng này là “phản ứng siêu nhạy, hypersensitive respond”. 1964, Klement và đồng nghiệp ghi nhận rằng phản ứng siêu nhạy cũng xảy ra đối với cây bị vi khuẩn tấn công. Cần chú ý là vào năm 1972, phản ứng siêu nhạy cũng được phát hiện trên động vật và được gọi là phản ứng apoptosis. Apotosis hiện đang là lĩnh vực nghiên cứu rất hấp dẫn trong sinh học (y học, thú y học và bệnh cây, xem chương ) 1905, Biffen cho biết tính kháng bệnh gỉ sắt của 2 giống lúa mỳ (Michigan Bronze (S) và Rivet (R)) di truyền được theo luật Mendel. 1909, Orton, khi nghiên cứu bệnh héo Fusarium (Fusarium oxysporum) trên bông, dưa hấu và đậu đã phân biệt các khái niệm kháng bệnh (resistance), thoát bệnh (escape), chịu bệnh (tolerance). 1914, Stakman và đồng nghiệp đưa ra khái niệm rằng các chủng khác nhau của cùng một loài tác nhân gây bệnh không thể phân biệt được về hình thái nhưng có thể phân biệt được trên cở sở tính gây bệnh khác nhau trên các giống khác nhau của cùng một loài cây ký chủ. Điều này giải thích tại sao (i) một giống cây kháng bệnh tại vùng này nhưng có thể nhiễm bệnh ở vùng khác, (ii) tính kháng bệnh thay đổi từ năm này sang năm khác và (iii) tại sao các giống kháng bỗng trở lên nhiễm bệnh bất thình lình. Tất cả đều do sự có mặt hay sự thay đổi thành phần chủng sinh lý của tác nhân gây bệnh. 1940-1965. Flor, một nhà bệnh cây Mỹ, khi nghiên cứu bệnh gỉ sắt cây lanh đã phát hiện thấy rằng: đối với mỗi gen qui định tính kháng trong cây ký chủ thì có một gen tương ứng qui định tính gây bệnh trong ký sinh “For each gene that conditions resistance in the host there is a corresponding gene that conditions pathogenicity in the parasite”. Ông đặt tên mối quan hệ này là quan hệ gen-đối-gen (gene-for-gene) và thuyết do ông khám phá được gọi là thuyết gen-đối-gen Ông được xem là một trong những nhà khoa học có công lao nhất và thuyết gen-đối-gen là một trong những thuyết quan trọng nhất trong lĩnh vực tính 7
8. kháng bệnh cũng như bệnh học thực vật. Ngày nay, nhiều khía cạnh trong thuyêt gen-đối-gen đã được chứng minh và bổ sung ở mức phân tử. 1963, Vanderplank cho biết có hai loại tính kháng: (1) tính kháng dọc (vertical resistance) được điều khiển bởi một vài gen kháng chủ (“major” resistance gene), có tính kháng cao nhưng chỉ chống một hay một vài chủng tác nhân gây bệnh; và (2) tính kháng ngang (horizontal resistance) do nhiều gen kháng thứ (“minor” resistance gene) có tính kháng yếu nhưng chống được tất cả các chủng tác nhân gây bệnh. Vanderplank cũng được xem là nhà khoa học có đóng góp lớn trong bệnh cây học. 3. So sánh miễn dịch ở động vật và thực vật Trong những năm gần đây, các nhà nghiên cứu thường so sánh tính kháng của thực vật với tính miễn dịch của động vật và đã áp dụng nhiều khái niệm của miễn dịch động vật vào nghiên cứu tính kháng thực vật. Cơ chế miễn dịch động vật với tính kháng thực vật chia sẻ nhiều điểm khác nhau nhưng cũng có nhiều điểm giống nhau. 3.1. Sự khác nhau Sự khác nhau dễ thấy nhất là động vật máu nóng có hệ miễn dịch còn thực vật không có. Hệ miễn dịch của động vật máu nóng bao gồm các cơ quan có thẩm quyền miễn dịch và các tế bào có thẩm quyền miễn dịch. Các cơ quan có thẩm quyền miễn dịch (tuyến ức, lách, tủy ) là nơi sản sinh, duy trì, biệt hoá và điều khiển sự hoạt động của các tế bào có thẩm quyền miễn dịch. Các tế bào có thẩm quyền miễn dịch (chủ yếu gồm 2 loại là lympho bào B và lympho bào T) tham gia vào quá trình đáp ứng miễn dịch của cơ thể nhằm chống lại các tác nhân lạ xâm nhập. Có 2 kiểu đáp ứng miễn dịch: Kiểu đáp ứng miễn dịch dịch thể: Khi kháng nguyên xâm nhập vào cơ thể, bị đại thực bào vây bắt, xử lý và trình diện cho lympho bào T. Lympho bào T trở thành trợ bào T. Trợ bào T hoạt hóa lympho bào B thành tế bào plasma để sản xuất ra kháng thể dịch thể. Các kháng thể dịch thể chính là các globulin miễn dịch (Immuno globulin = Ig) bao gồm 5 lớp là IgG, IgM, IgA, IgD và IgE. Kháng thể dịch thể tồn tại trong dịch cơ thể (huyết tương) và sẽ kết hợp đặc hiệu với kháng nguyên. Ở một số ít trường hợp, kháng nguyên có thể kích thích trực tiếp lympho bào B thành tế bào plasma. Kiểu đáp ứng miễn dịch tế bào: Khi kháng nguyên xâm nhập vào cơ thể, bị đại thực bào vây bắt, xử lý và trình diện cho lympho bào T. Lympho bào T được biệt hoá thành lympho bào T mẫn cảm kháng nguyên và chính bản thân chúng là kháng thể tế bào. Kháng thể cũng kết hợp đặc hiệu với kháng nguyên. 3.2. Sự giống nhau Ở mức độ phân tử và tế bào, phản ứng phòng thủ của thực vật và động vật chia sẻ nhiều đặc điểm chung mà quan trọng nhất là quá trình nhận biết và khởi động phản ứng kháng hay miễn dịch. Để có thể kích hoạt các phản ứng kháng hay miễn dịch, tế bào động vật cũng như thực vật phải có khả năng nhận biết được các tác nhân vi sinh vật ngoại lai. Các tác nhân vi sinh vật hình thành các phân tử chứa các vùng bào thủ (gọi là các mô hình phân tử) có nguồn gốc vi sinh vật (gây bệnh hay không gây bệnh). Các phân tử này có ký hiệu là MAMP/PAMP (Microbe/Pathogen-Associated Molecular Pattern). Một số ví dụ về các MAMP/PAMP của vi sinh vật là lipopolysacharide (LPS) của vi khuẩn Gram (-), peptidoglycan của vi khuẩn Gram (+), flagellin của lông roi vi khuẩn; glucan, chitin của vách tế bào nấm. Một trong những đặc 8
9. điểm quan trọng là các MAMP/PAMP khá bảo thủ; điều này dẫn tới các receptor nhận biết các phân tử này (PRR, viết tắt từ Pattern Recognition Receptor) tức là nhận biết PAMP/MAMP khá giống nhau ở động vật và thực vật. Các PRR của động vật là các protein như Toll receptor của ruồi dấm, Toll-like receptor (TLR) của các động vật khác (kể cả Interleukin receptor của động vật máu nóng). Các PRR của thực vật là nhiều loại protein kháng (gọi là các protein R = Resistance protein). Các PRR này có đặc điểm cấu trúc giống nhau, chẳng hạn có vùng lặp giàu leucine ở đầu carboxyl (gọi là vùng LRR, viết tắt từ Leucine Rich Repeats) – là nơi nhận biết MAMP/PAMP; vùng TIR (viết tắt từ Toll – Interleukin 1 Receptor) ở đầu amin. Các PRR này có đặc điểm chức năng giống nhau là nhận biết MAMP/PAMP và khởi động phản ứng miễn dịch/kháng kháng bẩm sinh. 4. Các khái niệm cơ bản về tính kháng bệnh thực vật Tính kháng (resistance). Là khả năng loại bỏ hoặc khắc phục hoàn toàn, hoặc ở mức độ nào đó, ảnh hưởng của tác nhân gây bệnh hoặc các yếu tố gây hại. Miễn dịch (Immunity). Nghĩa hẹp là dạng cực kháng, có nghĩa tác nhân gây bệnh không thể gây bệnh cho cây (chú ý phân biệt với nghĩa rộng của miễn dịch thực vật) Bệnh là ngoại lệ chứ không phải qui luật. Cây thường không bị bệnh mặc dù trong suốt đời sống của mình cây có thể tiếp xúc với rất nhiều tác nhân gây bệnh. Mỗi loài cây trung bình bị tấn công bởi khoảng 100 loại tác nhân gây bệnh khác nhau; và mỗi một cá thể cây có thể bị hàng trăm tới hàng trăm ngàn cá thể của 1 loại tác nhân gây bệnh. Mặc dù có thể chịu thiệt hại nhưng cây vẫn tồn tại, và nhìn chung sinh trưởng và phát triển tốt. Nếu tác nhân gây bệnh có thể tiếp xúc nhưng hoàn toàn không gây bệnh cho cây thì cây được gọi là cây phi ký chủ (non-host) của tác nhân gây bệnh và tính kháng của cây trong trường hợp này được gọi là tính kháng phi kí chủ (non-host resistance) hay còn được gọi là tính kháng cơ bản (basic resistance). Tương tác giữa tác nhân gây bệnh và cây, trong trường hợp này được gọi là tương tác không tương hợp (incompatible intereaction). Cây phi kí chủ của một tác nhân gây bệnh đôi khi được gọi là miễn dịch đối với tác nhân gây bệnh đó. Ví dụ mối quan hệ giữa nấm đạo ôn lúa với cây cà chua. Nếu tác nhân gây bệnh tiếp xúc và có thể gây bệnh ở một mức độ nào đó đối với cây thì cây, trong trường hợp này, được gọi là cây ký chủ (host) và tính kháng của cây được goi là tính kháng ký chủ (host resistance). Tính kháng ký chủ được chia thành 2 loại: tính kháng đặc hiệu chủng (race-specific resistance) và tính kháng không đặc hiệu chủng (race-none- specific resistance). Tính kháng không đặc hiệu chủng (Race-non-specific resistance): Tính kháng yếu nhưng kháng được đối với tất cả kiểu gen của 1 tác nhân gây bênh. Tính kháng không đặc hiệu chủng còn được gọi là tính kháng ngang (horizontal resistance). Tính kháng đặc hiệu chủng (Race-specific resistance): Tính kháng cao nhưng chỉ kháng được một số kiểu gen (chủng, nòi) của tác nhân gây bệnh. Tính kháng đặc hiệu chủng còn được gọi là tính kháng dọc (vertical resistance). Tính kháng bẩm sinh (Innate resistance): Tính kháng do tiềm năng di truyền qui định. Tính kháng tạo được (Acquired resistance=induced resistance). Tính kháng hình thành hoặc cục bộ hoặc hệ thống trên cây ký chủ mẫn cảm khi bị kích thích bởi tác nhân gây bệnh hoặc yếu tố vô sinh. 9
10. Tính kháng cả đời (hay còn gọi là tính kháng cây con) (Seedling or overall resistance): Tính kháng biểu hiện ở tất cả các giai đoạn của cây. Việc chọn tính kháng thường làm ở giai đoạn cây con. Tính kháng này thường được điều khiển bởi các các gen chủ đặc hiệu chủng. Tính kháng mô trưởng thành (Mature tissue resistance): Ở một số loài cây, chỉ có mô non mẫn cảm với bệnh còn các mô già hoàn toàn kháng. Tính kháng cây trưởng thành (Adult plant resistance): Tính kháng chỉ biểu hiện khi cây trưởng thành, thường do các gen chủ đặc hiệu chủng điều khiển. Tính kháng gen chủ (Major gene resistance): Tính kháng được qui định bởi một hoặc vài gen có ảnh hưởng lớn đến sự biểu hiện tính kháng. Mức độ lớn này đủ để tạo ra các tính trạng kháng riêng rẽ không liên tục. Tính kháng gen thứ (Minor gene resistance): Tính kháng được qui định bởi các gen có ảnh hưởng nhỏ đến biểu hiện tính kháng. Mức độ nhỏ này tạo ra tính trạng kháng liên tục. Tính kháng đơn gen (Monogenic resistance): tính kháng được điều khiển bởi chỉ 1 gen, thường là gen chủ. Tính kháng đa gen (polygenic resistance): tính kháng được điều khiển bởi nhiều gen, thường là các gen thứ. Tính kháng chất lượng (quanlitative resistance): Kiểu gen cây ký chủ không có sự biến động liên tuc trong tính kháng. Kiểu gen kháng và mẫn cảm có thể phân biệt dễ dàng. Tính kháng số lượng (Quatitative resistance-QR): Kiểu gen của cây ký chủ có sự biến động liên tuc trong biểu hiện tính kháng từ kháng rất nhẹ tới khá kháng. Hầu hết các giống cây đều có tính kháng số lượng. Tính kháng đồng ruộng (Field resistance): Tính kháng biểu hiện tốt nhất trên đồng ruộng, thường là tính kháng số lượng. Tính kháng bền vững (Durable resistance): Tính kháng duy trì trong thời gian lâu dưới tác động của tác nhân gây bệnh. Tính kháng ổn định (Stable resistance): Đôi khi dùng sai theo nghĩa tính kháng bền vững. Nghĩa đúng là tính kháng được biểu hiện ở nhiều điều kiện sinh trưởng khác nhau. Ví dụ nhiều gen kháng bệnh gỉ sắt của cây ngũ cốc mẫn cảm với nhiệt độ nên có thể được xem là có tính kháng không ổn định. Tính kháng biểu kiến (apparent resistance). Trong một số điều kiện nào đó, mặc dù tác nhân gây bệnh và ký chủ là tương hợp với nhau (thậm chí ký chủ rất mẫn cảm) nhưng cây có thể không bị nhiễm bệnh hoặc nhiễm bệnh nhưng không biểu hiện triệu chứng hoặc triệu chứng không đáng kể. Trường hợp này được gọi là tính kháng biểu kiến. Tính kháng biểu kiến gồm 2 loại: sự thoát bệnh và chịu bệnh. - Sự thoát bệnh (Disease escape). Một cây (giống cây) ký chủ mẫn cảm có thể thoát bệnh nếu 3 thành phần cần thiết cho sự hình thành và phát triển bệnh (ký chủ mẫn cảm, tác nhân gây bệnh độc và môi trường thuận lợi) không trùng khớp và tương tác với nhau tại thời điểm thích hợp hoặc với thời lượng đủ. - Tính chịu bệnh (Tolerance). Tính chịu bệnh là khả năng của cây bị nhiễm bệnh nhưng không bị ảnh hưởng nhiều đến sinh trưởng và sinh sản. Cần chú ý là, mặc dù có ý kiến cho rằng chịu bệnh là một dạng của kháng bệnh, thì sự khác nhau căn bản ở đây là đối với tính chịu bệnh, cây không biểu hiện bất cứ phản ứng kháng bệnh nào. 10
11. Phản ứng siêu nhạy: là phản ứng của cây đối với sự nhiễm bệnh trong đó các tế bào bị xâm nhiễm và các tế bào lân cận chết nhanh chóng tạo ra vết chết hoại, chết cục bộ. Vết chết hoại này sẽ ngăn không cho tác nhân gây bệnh phát triển tiếp. Tài liệu tham khảo đọc thêm Nurnberger et al. 2004. Innate immunity in plants and animals: striking similarities and obvious differences. Immunological Reviews. Vol. 198: 249–266. Nhằm tìm hiểu sự giống nhau và khác nhau của MDĐV và MDTV. Marie-Pierre et al. 2007. Resistance to pathogens and host developmental stage: a multifaceted relationship within the plant kingdom. New Phytologist. 175: 405–416. Nhằm hiểu tính kháng giai đoạn. Vale et al. 2001. Concepts in plant disease resistance. Fitopatologia Brasileira. 26:577- 589. Nhằm hiểu các khái niệm tính kháng bệnh. Đọc thêm: 11
12. CHƯƠNG 2. CƠ CHẾ GÂY BỆNH CỦA TÁC NHÂN GÂY BỆNH 1. Cấu tạo tế bào thực vật Tế bào thực vật bao gồm 3 phần: vách tế bào (cell wall), màng tế bào (cell membrane) và tế bào chất (cytoplasm). Các tế bào liên hệ với nhau qua sợi liên bào. Hai phần được trình bày kỹ hơn ở đây là vách tế bào và màng tế bào. 1.1. Vách tế bào. Một trong những chức năng sinh học quan trọng của vách tế bào thực vật là bảo vệ tế bào khỏi sự tấn công của các tác nhân gây hại. Vách tế bào thực vật gồm 3 lớp, tính từ ngoài vào trong là: phiến giữa, vách sơ cấp và vách thứ cấp. Đặc điểm quan trọng của vách tế bào thực vật là được cấu tạo chủ yếu từ các loại polysaccharid khác nhau như pectin, cellulose, hemicelulose. Ngoài ra, vách tế bào cũng chứa một số các chất khác như glycoprotein, lignin. Lignin lấp đầy khoảng không trong vách tế bào giữa các phân tử cellulose, hemicellulose và pectin. Lignin liên kết đồng hóa trị với hemicelulose và do đó tạo mối liên kết chéo giữa các phân tử polysaccharid và tạo sự vững chắc cơ học của vách tế bào. 1.1.1. Phiến giữa (middle lamella) Là lớp phía bên ngoài nhất, có chức năng gắn kết các tế bào với nhau và hình thành lỗ liên bào. Phiến giữa được cấu tạo chủ yếu bằng pectin. 1.1.2. Vách sơ cấp (primary cell wall) Phía dưới phiến giữa là vách sơ cấp. Vách sơ cấp hình thành cùng với sự phân chia tế bào. Vách sơ cấp gồm một mạng lưới các vi sợi cấu tạo từ cellulose. Hệ sợi này được bao bọc bởi các chất giống như gel gồm các hợp chất pectic, hemicellulose, và glycoproteins 1.1.3. Vách thứ cấp (secondary cell wall) Vách thứ cấp hình thành sau khi tế bào đã phát triển đầy đủ. Vách thứ cấp rất rắn chắc, thường phân lớp và được cấu tạo từ cellulose, hemicellulose và lignin 1.1.4. Các chất cấu tạo nên vách tế bào Pectin. Pectin là chuỗi polymer mạch thẳng của galacturonic acid (polygalacturonic acid), trong đó có chứa một số ít các phân tử đường rhamnose, galactose và xylanose. Pectin là thành phần chủ yếu của phiến giữa vách tế bào nhưng cũng thấy ở vách sơ cấp. Cellulose. Cellulose là chuỗi polymer của đường glucose. Hemicellulose Hemicellulose là polymer mạch ngắn, phân nhánh. Xyloglucan (chứa đường xylose) là loại hemicellulose phổ biến nhất gồm chuỗi chính là glucose với các chuỗi bên là xylose và một số ít đường galactose, arabinose và fucose. Hemicellulose hình thành các liên kết hydro để liên kết các sợi cellulose với nhau. Lignin. Lignin là polimer có cấu trúc 3 hướng với đơn vị cấu trúc cơ bản nhất là phenylpropanoid với 1 hoặc nhiều phân tử carbon có 1 nhóm –OH, -OCH 3 hoặc =O Lignin rất bền khó bị phân giải bởi vi sinh vật. 12
13. 1.2. Màng tế bào Phía trong vách tế bào là màng tế bào. Màng tế bào có tính thấm chọn lọc và có 2 chức năng chính: (i) là rào cản giữ các chất cần thiết bên trong tế bào và ngăn các chất không cần thiết bên ngoài tế bào, và (ii) là kênh vận chuyển các chất cần thiết vào trong tế bào và thải các chất không cần thiết ra khỏi tế bào. Màng tế bào (còn được gọi là màng plasma, màng kép phospholipids) là một lớp màng kép được cấu tạo bởi các phân tử phospholipid. Phân tử phospholipid gồm 2 phần: phần đầu phosphate phân cực, ưa nước và phần đuôi lipid không phân cực, ghét nước. Các phân tử phospholipids của lớp màng kép xắp xếp sao cho đầu ưa nước hướng ra ngoài (về 2 phía của màng) và đầu ghét nước hướng vào trong. Gắn vào màng là nhiều loại protein chức năng. Các protein nằm vắt ngang màng được gọi là các protein xuyên màng (transmembrane proteins); các protein gắn phía ngoài màng hướng ra môi trường được gọi là các protein bề mặt; còn các protein gắn trên màng về phía trong tế bào được gọi là các protein ngoại vi (peripheral proteins). Nhiều protein trên màng liên kết với các phân tử carbonhydrate và được gọi là glycoprotein. Các protein trên màng có nhiều chức năng sinh học. Một số tham gia quá trình vận chuyển các chất vào và ra tế bào; một số là các phân tử receptor liên kết với các phân tử cung cấp thông tin và sau đó truyền tín hiệu tương ứng vào bên trong tế bào. 1.3. Các chất bề mặt của cây Lớp tế bào biểu bì của lá cây còn được bao phủ bởi một tầng cutin (là một polyester của acid béo) và trên cùng là một lớp sáp. Ngoài ra, ở lớp biểu bì của mô vỏ và các bộ phận dưới mặt đất như rễ, củ còn có suberin. 2. Đặc điểm chung của tác nhân gây bệnh cây 2.1. Nấm gây bệnh cây  Trên 80% số bệnh hại cây trồng là do nấm gây ra. Nấm thực ra gồm 2 nhóm nấm thật (fungi) và các vi sinh vật giống nấm (ví dụ các loại sương mai). Tuy nhiên do đặc điểm cấu tạo và tính chất gây bệnh nên đều được gọi chung là nấm.  Phần lớn nấm có cơ quan sinh trưởng là sợi nấm có cấu tạo dạng sợi, hợp thành một tản nấm  Sợi nấm đa bào hoặc đơn bào, phân nhánh.  Không có diệp lục, dị dưỡng  Sinh sản tạo ra bào tử ; quá trình xâm nhiễm của nấm thường bắt đầu từ bào tử  Tế bào sợi nấm có vách tế bào, nhân; tế bào chất có không bào và các bào quan.  Cấu tạo vách tế bào của nấm và các visinh vật giống nấm gồm : Nấm thật : vách tế bào gồm 1 lớp chitin (là các chuỗi N-acetyl-D-glucosamine không phân nhánh), 1 lớp β-1,3-glucan và 1 lớp mannoproteins (glycoprotein chứa đường mannose) VSV giống nấm (vd các nấm sương mai): vách tế bào không có chitin nhưng được cấu tạo bởi cellulose và glucan. 13
14. 2.2. Vi khuẩn gây bệnh cây  Hiện có khoảng 1600 loài vi khuẩn, phần lớn hoại sinh (có lợi).  Khoảng 100 loài gây bệnh thực vật  Hình thái : Phần lớn hình gậy, 2 đầu tù  Kích thước : 1 - 3 x 0.3 - 0.5 µm  Là vi sinh vật tiền nhân (không có nhân thật), đơn bào.  Cấu tạo: Tế bào vi khuẩn cũng gồm 3 phần là vách tế bào, màng tế bào và tế bào chất. Vách tế bào : o Làm tế bào có hình dạng cố định o Cấu tạo khác nhau giữa vi khuẩn gram (-) và gram (+) : Gram (-) chủ yếu chứa lipopolysaccharid còn Gram (+) chủ yếu chứa peptidoglican. o Bên ngoài vách có lớp nhày Màng tế bào o Cấu tạo bằng lipoprotein o Có tính bán thấm o Chứa nhiều enzim cần cho hoạt động sống của tế bào Tế bào chất o Thiếu lục lạp và ti thể o Thể nhân là nhiễm sắc thể (DNA dạng vòng), kích thước lớn o Plasmid (DNA sợi đơn, dạng vòng, kích thước nhỏ và tái sinh độc lập với nhiễm sắc thể) Lông roi o Phần lớn có lông roi, giúp vi khuẩn di động o Có thể 1 lông roi (Xanthomonas), 1 chùm lông roi (Pseudomonas) ở đầu hoặc lông roi bao quanh tế bào (Erwinia). 2.3. Virus thực vật  Hiện có khoảng hơn 2000 loài virus.  Khoảng 1000 loài gây bệnh thực vật  Cá thể virus được gọi là phân tử virus (virion).  Phân tử virus có kích thước rất nhỏ (vài chục tới vài trăm nm) nên chỉ có thể quan sát được bằng kính hiển vi điện tử (độ phóng đại tối thiểu 100.000 x).  Hình thái : Hình sợi mềm, hình gậy, hình chùy, hình nhộng và hình cầu đa diện  Tác nhân gây bệnh đặc biệt không có cấu tạo tế bào.  Thường chỉ gồm hai thành phần chính là acid nucleic và protein.  Axit nucleic của đa số virut thực vật là ARN, một số ít là ADN.  Acid nucleic nằm ở bên trong được bao bọc bằng một lớp vỏ ngoài protein.  Sinh sản : Sau khi xâm nhập tế bào ký chủ, sự tái sinh virus trải qua 4 giai đoạn: o Tháo vỏ để giải phóng bộ gien virus 14
15. o Tổng hợp protein virus o Tổng hợp bộ gien mới của virus o Lắp ráp phân tử virus mới Virus chỉ mã hóa một số ít gien nên sự sinh sản của virus trong tế bào cây phụ thuộc hoàn toàn vào bộ máy tổng hợp axit nucleic và protein của ký chủ mặc dù các protein của virus cũng có tham gia vào quá trình này. Ví dụ: Papaya ringspot virus (gây bệnh đốm hình nhẫn đu đủ có 9 gien. Tham khảo : giáo trình bệnh cây nông nghiệp (2001) hoặc giáo trình bệnh cây đại cương (2007). 3. Cơ chế gây bệnh của tác nhân gây bệnh Để có thể gây bệnh cho cây, tác nhân gây bệnh nhìn chung cần phải:  Tiếp xúc khả nhiễm trên bề mặt kí chủ.  Xâm nhập vào trong cây hoặc tế bào  Thực hiện quá trình dinh dưỡng ký sinh để sinh trưởng và sinh sản. Trong quá trình tiếp xúc khả nhiễm trên bề mặt lá, thân, rễ (trước khi xâm nhập) và cả trong quá trình dinh dưỡng bên trong mô và tế bào sau khi xâm nhập thì giữa tác nhân gây bệnh và ký chủ hình thành nhiều tương tác hóa học để một mặt tác nhân gây bệnh khắc phục tính kháng của cây và mặt khác cây hình thành tính kháng. Do cấu tạo của thực vật, nhìn chung, tác nhân gây bệnh sử dụng 2 kho vũ khí để xâm nhập và thực hiện quá trình dinh dưỡng là vật lý và hóa học. 4. Quá trình xâm nhập của tác nhân gây bệnh vào trong cây và tế bào 4.1. Xâm nhập (penetration)của nấm vào trong cây Nấm có thể xâm nhập vào trong cây bằng sợi nấm hoặc bào tử. Phần lớn nấm xâm nhập bằng bào tử. Trước khi xâm nhập, bào tử phải tiếp xúc với bề mặt ký chủ. Gặp điều kiện thuận lợi (ẩm độ, nhiệt độ), bào tử nấm nảy mầm thành ống mầm. Tùy thuộc loại nấm, nấm có thể xâm nhập vào bên trong cây trực tiếp hoặc gián tiếp 4.1.1. Trực tiếp qua bề mặt ký chủ nguyên vẹn (chủ động). Nhiều loại nấm có thể xâm nhập trực tiếp qua bề mặt nguyên vẹn (lá, rễ ) của cây ký chủ vào trong cây nhờ lực cơ học và enzyme. Bào tử một số loại nấm, ví dụ bào tử động nấm Phytophthora (gây bệnh thối gốc rễ) Plasmodiophora brassicae (gây bệnh sưng rễ bắp cải) nảy mầm thành ống mầm xâm nhập trực tiếp qua bề mặt rễ. Bào tử một số loại nấm, ví dụ bào tử phân sinh nấm Alternaria (gây bệnh đốm vòng), nảy mầm thành ống mầm xâm nhập trực tiếp qua tầng cutin của lá. Trong quá trình xâm nhập trực tiếp, nấm luôn tiết ra các enzyme để làm mềm bề mặt tạo điều kiện cho sự xâm nhập. Đối với một số loại nấm, ví dụ nấm Pyricularia oryzae (gây bệnh đạo ôn lúa), Colletotrichum (gây bệnh thán thư), Oidium (gây bệnh phấn trắng), bào tử nảy mầm thành ống mầm. Đầu ống mầm hình thành một cấu trúc đặc biệt gọi là giác bám hay còn gọi là vòi áp/vòi bám/đĩa áp (appressorium). Giác bám hình thành đế xâm nhập hay còn gọi là vòi xâm nhập/móc xâm nhập (penetration peg) đâm xuyên qua mặt ký chủ gồm 15
16. tầng cutin và vách tế bào. Giác bám tích lũy nhiều carbonhydrate, chủ yếu là glycerol và do áp lực thẩm tích cao sẽ hút nước từ bên ngoài vào trong giác bám và tạo ra một áp suất trương rất lớn (giác bám của nấm phấn trắng có thể tạo áp suất trương 20-40 at, của nấm đạo ôn lúa Pyricularia oryzae là khoảng 80 at; để so sánh: áp suất trong lốp xe hơi khoảng 2-3 at). Áp suất trương cao sẽ cho phép nấm xâm nhập qua bề mặt ký chủ bằng đế xâm nhập dễ dàng. Mặc dù sự xâm nhập bằng giác bám và đế xâm nhập là do lực cơ học nhưng nấm cũng tiết ra các enzym để hỗ trợ sự xâm nhập như các cellulose và pectinase. Trong nhiều trường hợp, ví dụ như ở nấm đạo ôn, sự xâm nhập chỉ có thể xảy ra nếu vách giác bám tích lũy melanin (sắc tố đen). Sự tích lũy melanin làm vách giác bám rắn cứng. 4.1.2. Qua lỗ mở tự nhiên (thụ động) Một số loại nấm sẽ xâm nhập vào cây qua lỗ mở tự nhiên như khí khổng, thủy khổng, bì khổng. Ví dụ, bào tử nấm Cercospora (gây bệnh đốm mắt cua), bào tử nấm gỉ sắt nảy mầm thành ống mầm xâm nhập qua khí khổng. 4.1.3. Qua các vết thương cơ giới, các vết nứt tự nhiên (thụ động) Một số nấm có thể xâm nhập qua các vết tổn thương cơ giới hoặc các vết nứt tự nhiên. Ví dụ, bào tử nấm Fusarium oxysporum nảy mầm thành ống mầm xâm nhập qua vết nứt hình thành khi rễ bên nhú ra từ rễ chính. Cần chú ý là đối với nhiều loài nấm, chúng có thể vừa xâm nhập chủ động, vừa xâm nhập chủ động. 4.2. Xâm nhập của vi khuẩn Mặc dù vi khuẩn có thể di động nhờ lông roi trong màng nước nhưng do không có khả năng tự xuyên thủng bề mặt nguyên vẹn của ký chủ nên phần lớn vi khuẩn xâm nhập vào cây hoàn toàn thụ động qua lỗ mở tự nhiên như khí khổng, thuỷ khổng, và qua vết thương cơ giới trên lá, rễ. Trên lá, điều kiện có màng nước là cần thiết để vi khuẩn di chuyển tới lỗ mở. Một số vi khuẩn lan truyền nhờ vector sẽ xâm nhập vào cây nhờ vector như vi khuẩn Erwinia tracheiphila (gây bệnh héo bầu bí) xâm nhập nhờ bọ cánh cứng (Acalymma vittata). Một số loại vi khuẩn biệt dưỡng cũng xâm nhập vào cây nhờ vector như Candidatus liberobacter asiaticus (bệnh greening cây có múi) xâm nhập nhờ rầy chổng cánh (Diaphorina citri). 4.2.1. Xâm nhập của virus, mollicute (phytoplasma, spiroplasma) Mặc dù nhiều loài virus có thể xâm nhập vào cây nhờ tổn thương cơ giới thì ngoài tự nhiên, hầu hết virus xâm nhập vào cây nhờ vector. Tất cả mollicus xâm nhập vào cây nhờ vector côn trùng chẳng hạn Phytoplasma gây bệnh trắng lá mía. 4.3. Dinh dưỡng ký sinh của tác nhân gây bệnh Sau khi đã hoàn thành quá trình xâm nhập qua bề mặt ký chủ, tác nhân gây bệnh thực hiện quá trình dinh dưỡng ký sinh. Tùy thuộc nhóm mà tác nhân gây bệnh có các hình thức dinh dưỡng khác nhau. Đối với nấm. Để hấp thụ dinh dưỡng, nhiều loài, chủ yếu thuộc nhóm sinh dưỡng bắt buộc (obligate biotroph) chẳng hạn các nấm sương mai, gỉ sắt, phấn trắng hoặc một số loài thuộc nhóm bán sinh dưỡng (semibiotroph) như Pyricularia orizae tạo ra các cấu trúc gọi là 16
17. vòi hút (haustorium) bên trong tế bào ký chủ để hấp thụ dinh dưỡng. Các nấm thuộc nhóm sinh dưỡng (biotroph) thường không giết chết tế bào nhưng các nấm thuộc nhóm bán sinh dưỡng (semibiotroph) có thể giết chết tế bào ký chủ về sau. Trái lại, các nấm thuộc nhóm hoại dưỡng (necrotroph) chẳng hạn nấm Rhizoctonia, Sclerotium, thường không tạo thành vòi hút và ngay trong quá trình xâm nhập, chúng đã tiến hành phân hủy tế bào và mô bằng enzyme và độc tố. Đối với vi khuẩn và mollicute. Sau khi xâm nhập vào trong mô, vi khuẩn không hình thành bất cứ cấu trúc đặc biệt nào để hấp thụ dinh dưỡng. Do vậy, vi khuẩn sẽ sử dụng các enzyme và độc tố để phân hủy tế bào ký chủ, vật chất hữu cơ để hấp thụ qua màng tế bào. Đối với virus. Virus có hình thức dinh dưỡng đặc biệt hơn. Vì số lượng gen mã hóa bởi virus rất ít nên quá trình tái sinh virus phụ thuộc vào vật liệu (amino acid, nucleotide), bộ máy tổng hợp acid nucleic, năng lượng (chủ yếu dưới dạng các hợp chất cao năng như ATP), và bộ máy dịch mã (ribosome, tRNA và các enzyme liên quan) của tế bào ký chủ. Cần chú ý là ngoài sử dụng tài nguyên của tế bào ký chủ thì quan trọng hơn, virus gây bệnh cho cây nhờ sự tương tác giữa protein virus (mặc dù ít) với các chất chịu trách nhiệm cho chức năng sinh lý của tế bào ký chủ. Ví dụ (1) protein replicase của TMV tương tác với protein Aux/IAA của tế bào ký chủ chịu trách nhiệm điều hòa các phản ứng sinh hóa qua đường hướng dẫn truyền auxin và (2) protein Rep của các geminivirus tương tác với protein tương tự Retinoblastoma (pRBR) của tế bào ký chủ chịu trách nhiệm điều khiển chu kỳ tế bào. 4.4. Các enzyme của tác nhân gây bệnh Trong quá trình xâm nhiễm gây bệnh, các tác nhân gây bệnh như nấm, vi khuẩn và cả tuyến trùng thường tiết ra nhiều enzyme. 4.4.1. Các enzyme phân hủy vách tế bào. Cutinase. Nhiều loài nấm có khả năng tiết cutinases để phân hủy lớp cutin trên bề mặt lá và làm mềm mô giúp cho quá trình xâm nhập cơ học được thuận lợi. Cutinase phân cắt phân tử cutin và tạo ra nhiều các phân tử nhỏ oligomer là các dẫn xuất của acid béo. Các loại nấm có kiểu xâm nhập trực tiếp lúc đầu tiết ít cutinase và tạo ra một lượng nhỏ các phân tử monomer (sản phẩm của quá trình phân hủy cutin). Các monomer này xâm nhập trở lại vào cơ thể nấm, kích thích sự biểu hiện của các gen cutinase dẫn tới nấm tiết ra nhiều cutinase hơn (có thể tăng vài ngàn lần). Nhìn chung, cutinase được tiết ra nhiều nhất tại điểm xâm nhập của của ống mầm hoặc tại đế xâm nhiễm của các loại nấm tạo vòi áp. Một số loại nấm vốn thường xâm nhập qua khí khổng không tạo cutinase nhưng sẽ có khả năng xâm nhập trực tiếp nếu bổ sung gen tạo cutinase vào cơ thể chúng. Các chủng nấm tạo nhiều cutinase thường có độc tính cao hơn các chủng nấm tạo ít cutinase. Ví dụ bào tử của một chủng Fusarium độc tạo nhiều cutinase hơn bào tử của chủng không độc và chủng không độc trở thành chủng độc nếu bổ sung cutinase vào bào tử của nó. Pectinase. Các tác nhân gây bệnh như nấm, vi khuẩn và tuyến trùng có thể tiết pectinase bao gồm pectin methyl esterase (PME), polygalacturonase (PG) và pectin lyase hay transeliminase. PME loại bỏ nhóm methyl (CH3) dẫn tới làm biến đổi độ hòa tan của pectin và do đó ảnh hưởng đến tốc độ phân cắt chuỗi pectin do PG và pectin lyase chịu trách nhiệm. PG cắt chuỗi pectin bằng cách thêm một phân tử nước còn pectin lyases cắt chuỗi bằng cách loại bỏ một phân tử nước. Giống như đối với cutinase, khả năng tiết các pectinase ngoại bào được điều khiển bởi lượng pectin và lượng sản phẩm phân cắt của nó như các phân tử galacturonan. Các phân tử galacturonan, khi được hấp thụ bởi tác nhân gây bệnh sẽ kích thích tác nhân gây bệnh tiết nhiều pectinase hơn nữa. Khả năng tiết các enzyme pectinase cao là đặc điểm quan trọng của các tác nhân gây các bệnh thối mềm như vi khuẩn Erwinia 17
18. carotovora pv. carotovora (bệnh thối nhũn bắp cải) hoặc các nấm hoại dưỡng như Sclerotinia sclerotiorum, Rhizoctonia solani. Tuyến trùng, ví dụ Meloidogyne, cũng tiết pectinase để tạo điều kiện xâm nhập và di chuyển trong mô cây. Cellulase, hemicelulase. Các tác nhân gây bệnh như nấm, vi khuẩn và tuyến trùng có thể tiết các enzyme cellulase và hemicelluase để phân hủy vách tế bào ký chủ. Các enzyme cụ thể của nhóm này bao gồm xylanase, galactanase, glucanase, arabinase Ligninase. Lignin là hợp chất rất bền và chỉ có một số ít vi sinh vật có khả năng phân giải lignin (khoảng 500 loài nấm, phần lớn là các nấm đảm, có thể phân hủy lignin nhờ tiết enzyme ligninase). 4.4.2. Enzyme phân giải vật chất trong tế bào ký chủ. Tất cả các nhóm tác nhân gây bệnh (ngoại trừ virus), trong quá trình gây bệnh đều tiết các enzym phân giải các hợp chất hữu cơ của tế bào: Protease, peptidase, amylase, maltase, lipase, phospholipase để phân hủy protein, các hợp chất carbonhydrate và chất béo. 4.5. Độc tố của tác nhân gây bệnh Trong quá trình gây bệnh, tác nhân gây bệnh có thể tạo ra một số các chất gây độc cho tế bào và mô của cây gọi là độc tố. Độc tố có một số đặc điểm chung sau: 1. Hai nhóm tác nhân gây bệnh tạo độc tố được nghiên cứu nhiều nhất là nấm và vi khuẩn, phần lớn là nhóm hoại dưỡng (necrotroph) 2. Độc tố không có bản chất enzyme nhưng đa dạng về thành phần và cấu trúc hóa học. 3. Độc tố tác động lên tế bào ở nồng độ rất thấp. 4. Độc tố thường do tác nhân gây bệnh tổng hợp trong cây nhưng cũng có thể trên môi trường nhân tạo. 5. Độc tố tác động lên nhiều chức năng sinh lý của tế bào cây, chủ yếu thông qua sự tương tác với các enzyme chức năng của tế bào. 6. Độc tố có thể đóng vai trò như tác nhân qui định tính độc (còn gọi là yếu tố độc – virulent factor), tác động phụ thuộc số lượng và làm thay đổi triệu chứng. Độc tố cũng có thể đóng vai trò như tác nhân qui định tính gây bệnh (còn gọi là yếu tố gây bệnh – pathogenic factor), tác động phụ thuộc chất lượng (có nghĩa phụ thuộc sự có mặt hay không có mặt của độc tố). 7. Một số độc tố cũng có thể gây hại cho động vật 8. Chức năng: Giết chết tế bào để (1) giải phóng dinh dưỡng cần cho tác nhân gây bệnh hoặc (2) ngăn cản tế bào thực hiện các phản ứng phòng thủ Trong bệnh cây, độc tố của tác nhân gây bệnh được chia làm 2 nhóm chính: (1) độc tố không chọn lọc ký chủ (nonhost-selective hay nonhost-specific toxin, viết tắt là NST) và (2) độc tố chọn lọc ký chủ (host-selective hay host-specific toxin, viết tắt là HST). Phần lớn độc tốc thuộc nhóm 2. 4.5.1. Độc tố không chọn lọc ký chủ (NST) Độc tố không chọn lọc ký chủ có các đặc điểm sau:  Tác động không chọn lọc: tác động đến không chỉ loài cây ký chủ của tác nhân gây bệnh mà còn tác động đến nhiều loài cây khác không phải là ký chủ của tác nhân gây bệnh. 18
19.  Thường là yếu tố độc có nghĩa làm tăng tính độc của tác nhân gây bệnh (tăng mức độ biểu hiện triệu chứng)  Về cơ chế tác động: một số độc tố (vd tabtoxin, phaseolotoxin) ức chế enzyme của tế bào ký chủ dẫn tới tích lũy các chất tới mức đầu độc tế bào hoặc dẫn tới làm thiếu hụt nghiêm trọng các chất cần thiết cho tế bào  Một số ví dụ điển hình: Tabtoxin. Tabtoxin do vi khuẩn Pseudomonas syringae pv. tabaci gây bệnh đốm cháy (wildfire) thuốc lá. Một số chủng (gọi là các chủng tạo độc tố) của vi khuẩn này tạo vết đốm với quầng vàng trên lá thuốc lá. Dịch lọc vi khuẩn nuôi cấy trên môi trường nhân tạo hoặc độc tố tinh chiết tạo ra triệu chứng giống hệt với triệu chứng không chỉ trên thuốc lá mà còn trên nhiều loài cây thuộc nhiều họ thực vật khác nhau. Một số chủng bị đột biến mất khả năng tạo tabtoxin (ký hiệu là chủng Tox-) có tính độc giảm và tạo ra vết đốm chết hoại nhng không có quầng vàng. Tabtoxin là một dipeptide gồm 2 amino acid (threonin - tabtoxinin). Bản thân tabtoxin không độc nhưng ở trong tế bào, tabtoxin bị thủy phân thành threonin và tabtoxinin. Tabtoxinin là một chất độc vì nó làm bất hoạt glutamine synthetase (cần cho tổng hợp glutamine từ glutamate và NH3) dẫn tới suy giảm nghiêm trọng lượng glutamine trong tế bào đồng thời tích lũy quá nhiều NH3. Hậu quả của sự tích lũy NH3 là tế bào không kết hợp giữa quang hợp và quang hô hấp, phá hủy màng lục lạp dẫn tới tạo ra đốm biến vàng và cuối cùng mô bị chết hoại (có quầng vàng bao quanh). Tabtoxin cũng làm giảm khả năng phản ứng chủ động của cây đối với vi khuẩn. Phaseolotoxin Phaseolotoxin do vi khuẩn Pseudomonas syringae pv. phaseolicola gây bệnh đốm quầng (halo blight) đậu đỗ. Cây nhiễm bệnh hay được xử lý với Phaseolotoxin đều tạo triệu chứng giống nhau: giảm sinh trưởng của lá, phá vỡ mô đỉnh và tích lũy ornithin (một amino acid). Phaseolotoxin là một tripeptide gồm 3 amino acid (N-[N'-sulfo - diaminophosphinyl]- ornithyl-alanyl-homoarginine). ornithin – alanine – và arginin) chá một nhóm phosphosulfinyl. Ngay khi vi khuẩn tiết ra phaseolotoxin, enzyme của cây sẽ cắt các liên kết peptid để giải phóng alanine, arginine và phosphosulfinylornithine. Phosphosulfinylorthinin có hoạt tính sinh học Độc tố ảnh hưởng đến tế bào bằng cách bất hoạt enzyme ornithine carbamoyltransferase chịu trách nhiệm chuyển ornithine thành citrulline – tiền chất của arginine. Hậu quả là tế bào tích lũy quá mức ornithine và suy giảm nghiêm trọng citrulline và arginine. Phaseolotoxin còn ảnh hưởng tới tổng hợp pyrimidine, giảm hoạt tính ribosome, tương tác với quá trình tổng hợp lipid, thay đổi tính thấm của màng, tích lũy tinh bột trong lục lạp. Tentoxin Tentoxin do nấm Alternaria alternata tạo ra. A. alternata là loại nấm gây bệnh đốm và biến vàng trên nhiều loại cây. Tentoxin là một tetrapeptide vòng, tương tác với một protein liên quan đến dẫn truyền năng lượng vào lục lạp (Chloroplast F(1)-ATPase (CF(1)). Độc tố cũng cũng ức chế quá trình quang phosphoryl hóa (photophosphorylation). Ở những loài cây mẫn cảm, tentoxin ảnh hưởng đến sự phát triển bình thường của lục lạp dẫn tới mô bị biến 19
20. màu do không thể tổng hợp được chlorophyll. Ngoài ra, tentoxin còn ức chế hoạt tính của các polyphenol oxydase cần cho phản ứng phòng thủ của cây. Cercosporin Cercosporin là độc tố do nấm Cercospora tiết ra. Nấm Cercospora gây nhiều bệnh đốm lá trên cây (Vd C. nicotianae gây bệnh đốm mắt cua thuốc lá). Cercosporin là là 1 perylenequinon có đặc điểm khác so với nhiều độc tố khác là chỉ gây độc tế bào thực vật khi được hoạt hóa bởi ánh sáng. Cercosporin hấp thụ năng lượng ánh sáng trở thành trạng thái hoạt hóa. Cercosporin hoạt hóa phản ứng với oxy để tạo thành các lớp oxy hoạt hóa độc với tế bào (Vd như - peroxide (O2 ) sẽ oxy hóa lipid của màng tế bào). 4.5.2. Các độc tố chọn lọc ký chủ (HST) Độc tố chọn lọc ký chủ có các đặc điểm sau:  Tác động chọn lọc: chỉ tác động đến loài cây ký chủ của tác nhân gây bệnh.  Thường là yếu tố gây bệnh nghĩa là tác nhân gây bệnh chỉ có thể gây bệnh cùng với sự có mặt của độc tố do nó tiết ra.  Một số ví dụ Victorin (HV toxin). HV toxin do nấm Cochliobolus victoriae tổng hợp trên cây đại mạch. Nấm bệnh xuất hiện tại Mỹ nằm 1945, nhiễm bệnh trên giống đại mạch (oat) Victoria. Chỉ có chủng nấm tạo HV toxin mới có khả năng gây bệnh trên giống đại mạch này. Victorin là một pentapeptide, gây hại màng tế bào ký chủ, ức chế enzyme glycin decarbolylase do đó ảnh hưởng đến quang hô hấp của tế bào. T toxin. T toxin do chủng T của nấm Bipolaris maydis (=Cochliobolus heterostrophus) tạo ra. Nấm gây bệnh đốm lá nhỏ trên ngô. Chủng T của nấm chỉ nhiễm trên giống ngô bất dục tế bào chất. T toxin là một họ các phân tử polyketide có từ 35-47 gốc carbon (chủ 39 hoặc 41 C), tấn công ty thể và ức chế tổng hợp ATP. T toxin tương tác với một protein URF13 nằm phía trong màng ty thể. URF13 (do gen T-urf13) chỉ có ở dòng bất dục tế bào chất. Khi có mặt T toxin, URF13 hình thành các lỗ của màng ty thể dẫn tới làm mất tính thấm của màng. Tham khảo: 4.6. Hocmon thực vật. Tác nhân gây bệnh có thể gây bệnh trên cây thông qua các hormon thực vật. Các tác nhân gây bệnh có thể trực tiếp hoặc kích thích cây tổng hợp hormon thực vật. Ngoài ra, tác nhân gây bệnh cũng có thê tương tác với các chất tham gia quá trình tổng hợp hormon trong tế bào cây và làm biến đổi cân bằng hormon dẫn tới hình thành triệu chứng. 4.6.1. Auxins. Auxin thực vật, điển hình nhất là Indole – 3 – acetic acid (IAA), cần cho sự kéo dài và biệt hóa của tế bào cây. IAA có thể ảnh hưởng đến tính thấm của màng tế bào, tăng hô hấp và 20
21. thúc đẩy tổng hợp protein. Nồng độ IAA trong cây tăng lên do 3 lý do : (1) tác nhân gây bệnh ức chế enzyme IAA oxidase dẫn tới IAA được hình thành tự nhiên trong cây không bị kiểm soát về nồng độ ; (2) tác nhân gây bệnh kích thích cây tạo nhiều IAA ; và (3) tác nhân gây bệnh tự tổng hợp được IAA. Một số ví dụ  Nấm Ustilago maydis gây bệnh ung thư ngô.  Nấm Plasmodiophora brassicae gây bệnh sưng rễ cây thập tự.  Vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bênh héo xanh cà chua, khoai tây. Vi khuẩn cảm ứng cây hình thành nhiều IAA (nồng độ có thể tăng tới 100 lần). Trong trường hợp này, mặc dù không có sự biến đổi nhiều về hình thái cây, nhưng hàm lượng IAA cao giúp các enzyme của vi khuẩn dễ thâm nhập qua vách và màng tế bào cây.  Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens gây bệnh u sưng nhiều loại cây. Vi khuẩn sẽ chuyển gen tổng hợp auxin (và các chất sinh trưởng khác) nằm trên vùng T-DNA của Ti plasmid vào bộ genome của cây.  TMV : protein tái sinh (Rep protein) của TMV tương tác với các protein Aux/IAA (điều khiển sự cân bằng auxin của cây) dẫn tới hình thành triệu chứng. 4.6.2. Gibberellins Gibberellin là hormone thực vật có tác dụng thúc đẩy ra hoa, kích thích sự kéo dài của thân và rế, tăng trưởng quả Gibberellin là một nhóm gồm khoảng 80 hợp chất trong đó gibberellic acid (GA3) là quan trọng nhất. Một số tác nhân gây bệnh có thể tổng hợp được gibberellin. Ví dụ nấm Gibberella fujikuroi (Fusarium moniliforme) gây bệnh lúa von trên lúa. Một số tác nhân có thể tương tác với thành phần của ký chủ làm biến đổi hàm lương giberrellin trong cây. Ví dụ Rice dwaft virus (RDV) là một virus gây triệu chứng lùn cây và lá xanh lục tối trên lúa. Protein P2 (là một protein vỏ capsid) của RDV tương tác với ent- kaurene oxidase của cây lúa. Ent-kaurene oxidase là một enzyme chính chịu trách nhiệm tổng hợp gibberellin trong cây. Cây lúa bị nhiễm RDV có hàm lượng GA1 giảm rõ rệt và xử lý GA3 có thể làm mất triệu chứng lùn cây. 4.6.3. Cytokinin Cytokinin (điển hình là zeatin và kinetin) là hormone thực vật chịu trách nhiệm kích thích phân chia tế bào, chống già hóa, liên kết với ribosomes và điều khiển tổng hợp protein. Cytokinin cũng là receptor trên màng tế bào. Cytokinin đã được biết là tham gia trong quá trình hình thành các khối u do các tác nhân như ở nấm Taphrina deforman (gây ệnh xoăn lá đào), nấm Plasmodiophora brassica (gây bệnh sưng rễ bắp cải). 4.6.4. Ethylene Ethylene được tạo ra tự nhiên trong cây và có ảnh hưởng tới nhiều chức năng sinh lý của cây bao gồm biến vàng, rụng lá, kích thích hình thành rễ bên, thúc đẩy sự chín của quả Trong bệnh cây, ethylene có một vai trò kép. Một mặt ethylene là phân tử dẫn truyền tín hiệu để thúc đẩy tính kháng của cây; mặt khác, ethylene lại là một yếu tố độc chịu trách nhiệm tăng cường triệu chứng hoặc khả năng phát triển của tác nhân gây bệnh. Ví dụ dòng vi khuẩn Pseudomonas syringae pv. glycinea đột biến mất khả năng hình thành ethylene không thể phát triển tốt trên lá đậu. Nhiều tác nhân gây bệnh kích thích cây hình thành nhiều ethylene và tạo ra một số triệu chứng như epinasty (ngọn, thân, lá bị cuốn cong gập xuống), 21
22. ví dụ ethylene chịu trách nhiệm về triệu chứng epinasty và rụng lá trên cây bông bị nhiễm nấm Verticillium dahliae, các triệu chứng biến vàng, còi cọc do nhiễm Cucumber mosaic virus. 4.7. Khái niệm tính gây bệnh, tính độc của tác nhân gây bệnh. Tính gây bệnh (pathogenicity/pathogenic): là khả năng gây ra bệnh trên cây của một tác nhân. Đây là một khái niệm chất lượng có nghĩa một tác nhân chỉ có thể gây bệnh hoặc không gây bệnh. Yếu tố gây bệnh (pathogenic factor): là các chất hình thành bởi tác nhân gây bệnh qui định tính gây bệnh. Nói cách khác, các yếu tố gây bệnh liên quan đến các bước chủ chủ chốt của quá trình gây bệnh bao gồm: nhận biết ký sinh – ký chủ, gắn kết tác nhân gây bệnh trên bề mặt ký chủ, nảy mầm và hình thành các cấu trúc xâm nhập (ví dụ giác bám) và xâm nhiễm (vòi hút), phân hủy tế bào Các ví dụ về yếu tố gây bệnh của một số nhóm tác nhân gây bệnh là: Đối với nấm: (1) Các gen/sản phẩm điều khiển hình thành cấu trúc xâm nhiễm. Vd gen tạo melanin trong vòi áp của nấm Pyricularia oryzae. Khi gen này bị phá hủy, nấm không thể tạo melanin dẫn tới vòi áp mất sức trương và nấm không thể xâm nhập gây bệnh. (2) Gen/độc tố đặc hiệu ký chủ (xem ví dụ độc tố chọn lọc ký chủ). Đối với vi khuẩn .Gen/sản phẩm của hệ thống tiết. Ở vi khuẩn có 5 hệ thống tiết I, II, II, IV và V, trong đó hệ thống tiết loại III là quan trọng nhất với chức năng vận chuyển các protein cần cho sự tương tác vi khuẩn – ký chủ từ tế bào vi khuẩn vào tế bào ký chủ. Ở vi khuẩn, các gen hrp mã hóa cho các protein cấu tạo nên hệ thống tiết loại III. Nếu các gen này bị mất chức năng, vi khuẩn sẽ mất khả năng gây bệnh. Đối với virus. Virus nói chung mã hóa rất ít gen liên quan chủ yếu đến tái sinh, cấu trúc phân tử, di chuyển (nhân-tế bào chất; tế bào – tế bào; hệ thống) và lan truyền qua vector. Một trong các gen liên quan đến tính gây bệnh là gen vỏ protein (CP gen). Gen CP của nhiều virus thường đa chức năng (ví dụ vừa là gen cấu trúc, vừa qui định khả năng lan truyền qua vector, vừa qui định khả năng lan truyền ). Do vậy nếu gen CP bị mất chức năng, virus sẽ mất tính gây bệnh. Tính độc (virulence/virulent): là mức độ của tính gây bệnh. Đây là khái niệm số lượng có nghĩa một tác nhân có tính gây bệnh với mức độ độc khác nhau. Các yếu tố độc (virulence factors): là các chất hình thành bởi tác nhân gây bệnh qui định tính độc. Sự có mặt của yếu tố độc không cần cho khả năng gây bệnh của cây nhưng ảnh hưởng đến mức độ gây bệnh (hay biểu hiện triệu chứng của bệnh). Một ví dụ về yếu tố độc là các độc tố không đặc hiệu ký chủ của nấm và vi khuẩn (xem ví dụ độc tố không chọn lọc) 4.8. Phân loại tác nhân gây bệnh theo tính ký sinh. Có thể xem mối quan hệ giữa tác nhân gây bệnh là quan hệ ký sinh (parasitic). Quan hệ ký sinh là quan hệ mà một sinh vật sẽ được hưởng lợi còn sinh vật kia bị gây hại. Dựa theo mức độ ký sinh trên cây, tác nhân gây bệnh cây có thể được chia làm 3 nhóm là ký sinh chuyên tính, bán ký sinh và bán hoại sinh. Một nhóm nữa, không gây bệnh cho cây nhưng cũng được xét là nhóm hoại sinh. 1. Ký sinh chuyên tính (obligate parasite): chỉ có thể gây bệnh trên mô và tế bào sống. Ví dụ là nấm gỉ sắt, sương mai, phấn trắng, phytoplasma hoặc virus. Các ký sinh chuyên tính, nhìn chung, không thể nuôi cấy được trên môi trường nhân tạo. 22
23. 2. Bán ký sinh (hoại sinh có điều kiện = facultative saprophyte): sống ký sinh trên tế bào sống là chủ yếu nhưng vẫn có khả năng sống trên tàn dư, mô suy nhược hoặc đã chết. Ví dụ điển hình là nhiều loài nấm túi như Cercospora (gây các bệnh đốm lá). 3. Bán hoại sinh (ký sinh có điều kiện = facultative parasite): chủ yếu sống trên tế bào suy nhược, đã chết, trên tàn dư cây trồng, trên đất, trên hạt, quả, nhưng có thể ký sinh trên tế bào sống. Ví dụ là nấm mốc đen Rhizopus; nấm chổi Penicillium, nấm Botrytis. 4. Hoại sinh (saprophyte): chỉ có thể sống ở các tế bào cây đã chết, tàn dư, đất. Các loại này ý nghĩa lớn trong phân giải vật chất hữu cơ trong đất trồng. Một số là những vi sinh vật đối kháng, có thể được sử dụng trong việc phòng ngừa bệnh cây (biện pháp sinh học) như nấm Trichoderma. Tiến hóa về tính gây bệnh của nấm Giả thiết tiến hóa về tính gây bệnh của nấm cho rằng sự tiến hóa xảy ra theo chiều từ hình thức hoại sinh lên ký sinh chuyên tính. Sự tiến hóa này bắt đầu bằng việc lợi dụng cơ hội tiếp xúc giữa nấm và (i) bề mặt cây ký chủ hoặc (ii) khoảng gian bào mà nấm đã xâm nhập vào thông qua khí khổng hoặc tổn thương cơ giới. Sự tương tác giữa cây và nấm dẫn tới sự tiến hóa về tính gây bệnh có thể đã trải qua 4 giai đoan sau:  Đầu tiên nấm chỉ có thể sống hoại sinh trên vật liệu hữu cơ chết và không thể gây bệnh cho cây.  Nấm hoại sinh trở thành ký sinh cơ hội. Nấm có thể xâm nhập vào cây và có thể sống được, đặc biệt trên các mô suy yếu do già cỗi hoặc do street bởi điều kiện bất lợi. Trong giai đoạn này, chúng chỉ có tính độc thấp. Như một qui luật, sự xâm nhập xảy ra chủ yếu qua các tổn thương ngẫu nhiên trên bề mặt cây. Khi tiến hóa hơn, chúng có thể xâm nhập qua lỗ mở hoặc thậm chí trực tiếp bằng vòi áp (appressorium). Các nấm cơ hội này tiết enzyme giết chết tế bào ký chủ và phân hủy mô chết hoại để hấp thụ dinh dưỡng. Các tác nhân gây bệnh có ít tính đặc hiệu ký chủ và cây phòng thủ chống lại sự tấn công này nhờ tính kháng cơ bản vốn đã bị giảm sút trên các mô suy yếu. Các ví dụ đối với nấm ký sinh cơ hội là Helminthosporium (hiện nay tách thành Bipolaris, Exerohilum và Dreschlera), Alternaria, Fusarium và Botrytis.  Nấm vẫn thuộc nhóm hoại dưỡng nhưng đã tiến hóa theo hướng hình thành các cấu trúc xâm nhiễm đặc biệt, tính đặc hiệu ký chủ và các cơ chế khắc phục tính kháng của cây. Nhiều loài tạo ra các enzyme như pectinase, cutinase, protease và các độc tố. Tính độc của nấm thay đổi theo hoạt tính của độc tố, một số thuộc nhóm đặc hiệu ký chủ. Một sô nấm thuộc nhóm tiến hóa này là Cercospora, Bipolaris, Exerohilum và Dreschlera), Alternaria, Fusarium.  Nấm tiến hóa thành nhóm sinh dưỡng. Một số nấm sinh dưỡng có thể nuôi cấy được trên môi trường nhân tạo thích hợp (Vd Pyricularia oryzae) nhưng một số khác là ký sinh chuyên tính bắt buộc như nấm gỉ sắt, phấn trắng, Plasmopara viticola (sương mai nho). Cần chú ý các dạng chuyển tiếp chẳng hạn Phytophthora hoặc Peronospora: giai đoan xâm nhiễm đầu tiên là biotroph nhưng sau đó chuyển sang pha necrotrph. 4.9. Phân loại tác nhân gây bệnh theo phương thức sử dụng nguồn dinh dưỡng. Theo phương thức sử dụng nguồn dinh dương, tác nhân gây bệnh có thể được chia thành 3 nhóm: (1) Nhóm sinh dưỡng (biotroph): sử dụng nguồn thức ăn từ mô ký chủ sống. Các ví dụ điển hình là nấm sương mai (Phytophthora parasitica), gỉ sắt và và phấn trắng (Erysiphe 23
24. cichoracearum). Nhóm sinh dưỡng, nhìn chung có phổ ký chủ hẹp, và không giết chết tế bào ký chủ ngay sau khi xâm nhiễm; mà thay vào đó, chúng để tế bào sống càng lâu càng tốt vì chúng phụ thuộc vào quá trình trao đổi chất nguyên vẹn của tế bào ký chủ để thực hiện quá trình dinh dưỡng và sinh sản. Điều này tạo cơ hội cho ký chủ có thể thiết lập được các phản ứng phòng thủ liên quan tới gen kháng. Đối với nấm thuộc nhóm sinh dưỡng, phương thức hấp thụ dinh dưỡng thường được thực hiện nhờ vòi hút (haustorium). Mô bị chết hoại hình thành chỉ sau khi nấm đã hoàn thành quá trình sinh sản. (2) Nhóm hoại dưỡng (necrotroph): sử dụng nguồn thức ăn từ mô chết hoặc đang chết. Các ví dụ điển hình là nấm Botrytis cinerea, Alternaria brassicicola, Rhizoctonia solani. Nhóm hoại dưỡng, nhìn chung có phổ ký chủ rộng hơn nhiều và ngay sau khi xâm nhiễm, chúng ngay lập tức giết chết tế bào ký chủ rất sớm và tạo một loạt các độc tố mà chúng dường như thúc đẩy tế bào chết. Vì tế bào ký chủ bị chết rất sớm nên nhìn chung tế bào không đủ thời gian để thiết lập các phản ứng phòng thủ thông qua gen kháng. Tuy nhiên các mô xung quanh vết chết hoại có thể tạo được phản ứng kháng nhờ các chất khuyếch tán ra từ vết bệnh. (3) Bán sinh dưỡng (semi-biotroph). Một số vi sinh vật có kiểu sinh dưỡng hỗn hợp. Ví dụ vi khuẩn Pseudomonas syringae có lúc được xem như thuộc nhóm sinh dưỡng, có lúc lại được xem như thuộc nhóm hoại dưỡng. Vi khuẩn xâm nhập vào cây qua tổn thương cơ giới hoặc khí khổng. Trong giai đoạn đầu của sự nhiễm bệnh, vi khuẩn không giết chết tế bào ký chủ nhưng về sau vi khuẩn sẽ giết chết tế bào. Đối với nhóm biotroph, phản ứng siêu nhậy sẽ cô lập sự phát triển của tác nhân gây bệnh và là biểu hiện của tính kháng. Trái lại, phản ứng này dường như thuận lợi cho sự phát triển của tác nhân gây bệnh nhóm necrotroph. Như vậy, dường như cơ chế kháng (dựa vào gen kháng R và phản ứng siêu nhậy) là khác nhau giữa 2 nhóm. Kết luận này đã được chứng minh bằng thực nghiệm trên cây Arabidopsis (một cây mô hình cho khoa học thực vật), trong đó nhóm biotroph có phản ứng phòng thủ dựa vào đường hướng SA (salisilic acid) và nhóm necrotroph có phản ứng phòng thủ dựa vào đường hướng JA (jasmonic acid) và ET (ethylene) vì: Đột biến nr1 hoặc cây chuyển gen NahG (cả hai đều khóa đường hướng dẫn truyền tín hiệu SA) dẫn tới mất tính kháng đối với nấm biotroph Phytophthora parsitica nhưng không ảnh hưởng tới nấm necrotroph Alternaria brassicicola. Trái lại, đột biến coi1 (khóa đường hướng dẫn truyền JA) làm giảm mạnh tính kháng đối với nấm necrotroph A.brassicicola nhưng không ảnh hưởng đến tính kháng đối với nấm biotroph P. parsitica. Tham khảo: Jane Glazebrook. 2005. Annu. Rev. Phytopathol. 43:205–27 24
25. CHƯƠNG 3: CÁC BIỂU HIỆN CỦA TÍNH KHÁNG 1. Giới thiệu Mỗi loài cây trung bình bị tấn công bởi khoảng 100 loại tác nhân gây bệnh khác nhau. Thông thường, mỗi một cá thể cây bị tấn công bởi hàng trăm đến hàng trăm ngàn cá thể của một loại tác nhân gây bệnh. Mặc dù phải chịu một thiệt hại nào đó thì phần lớn các cây vẫn tồn tại và thường là vẫn sinh trưởng, phát triển tốt. Nhìn chung, cây chống lại tác nhân gây bệnh nhờ kết hợp các vũ khí từ 2 kho vũ khí là: (1) các đặc điểm cấu trúc – có vai trò là các rào cản vật lý ngăn cản tác nhân gây bệnh xâm nhập vào và phát triển trong cây; và (2) các phản ứng sinh hóa xảy ra trong tế bào và mô cây, hình thành các chất hoặc là độc đối với tác nhân gây bệnh hoặc tạo điều kiện ức chế sự sinh trưởng của tác nhân gây bệnh. Sự kết hợp 2 kho vũ khí này khác nhau tùy tổ hợp ký sinh – ký chủ. Ngoài ra, thậm chí cùng tổ hợp ký sinh – ký chủ, thì sự kết hợp này cũng khác nhau tùy tuổi cây, loại cơ quan hoặc mô bị tấn công, điều kiện dinh dưỡng của cây và điều kiện thời tiết. Các vũ khí cấu trúc và hóa học có thể có sẵn từ trước (phòng thủ thụ động, thường không đặc hiệu) hoặc hình thành do tác động của tác nhân gây bệnh (phòng thủ chủ động, thường đặc hiệu), và đương nhiên được qui định bởi bộ gen cây ký chủ. 2. Phòng thủ thụ động 2.1. Phòng thủ nhờ rào cản vật lý có sẵn Nhìn chung, phòng tuyến đầu tiên là bề mặt cây ký chủ nơi tác nhân gây bệnh tiếp xúc và xâm nhập. Các đặc điểm cấu trúc bề mặt ảnh hưởng tới sự tiếp xúc và xâm nhập của tác nhân gây bệnh gồm số lượng và chất lượng lớp sáp và cutin; vách tế bào biểu bì; số lượng, kích thước, vị trí và hình dạng khí khổng và lỗ thở ở thân (lenticel) và sự có mặt của tế bào vách dày (tế bào cương mô). Lớp sáp. Lớp sáp trên bề mặt lá, quả tạo ra bề mặt ghét nước, do đó ngăn sự hình thành màng nước cần cho bào tử nấm tiếp xúc và nảy mầm và vi khuẩn nhân lên. Mật độ lông lá dày cũng có ảnh hưởng tương tự và có thể làm giảm sự nhiễm bệnh. Tầng cutin. Tầng cutin dày có thể ngăn cản sự xâm nhập của các tác nhân gây bệnh có kiểu xâm nhập trực tiếp. Tuy nhiên, độ dày tầng cutin không luôn luôn quan hệ thuận với tính kháng. Lớp tế bào biểu bì. Độ dày và độ cứng của vách tế bào biểu bì dường như là yếu tố quan trọng đối với tính kháng của một số tổ hợp ký sinh – ký chủ. Vách dày và cứng của tế bào biểu bì có thể ngăn cản sự xâm nhập theo kiểu trực tiếp của tác nhân gây bệnh. Cây với đặc điểm này thường kháng bệnh mặc dù nếu tác nhân gây bệnh được đưa vào mô bên dưới nhờ tổn thương cơ học thì bệnh vẫn phát triển dễ dàng. Đặc điểm khí khổng. Nhiều loại nấm và vi khuẩn chỉ xâm nhập qua khí khổng. Mặc dù phần lớn chúng có khả năng xâm nhập qua khí khổng đóng thì một số, chẳng hạn nấm gỉ sắt thân lúa mỳ, chỉ có thể xâm nhập qua khí khổng mở. Do vậy, một số giống lúa mỳ có khí khổng mở muộn trong ngày là kháng bệnh vì ống mầm của bào tử nấm (hình thành nhờ sương đêm) sẽ bị khô trước khi khí khổng mở. Khí khổng với cấu tạo lỗ mở hẹp cũng có thể ngăn cản sự xâm nhập của vi khuẩn. 25
26. Tế bào bên trong. Vách tế bào của mô đang bị xâm nhập thường thay đổi độ dày và độ cứng và đôi khi cũng ức chế sự phát triển của bệnh. Sự có mặt của nhiều tế bào cương mô ở thân nhiều cây ngũ cốc có thể hạn chế sự phát triển một số bệnh, chẳng hạn bệnh gỉ sắt hại thân. Ngoài ra, các tế bào xylem, bó bẹ (bundle sheath), cương mô của gân lá cũng giới hạn sự phát triển của một số bệnh đốm lá do nấm, vi khuẩn và tuyến trùng và tạo ra các vết bệnh góc cạnh. Tế bào mạch xylem dường như liên quan trực tiếp hơn đến mức độ kháng hay mẫn cảm của các loại bệnh hại mạch dẫn. Ví dụ, đường kính tế bào, tỷ lệ tế bào mạch xylem có kích thước lớn có mối tương quan thuận với độ mẫn cảm của cây du (elm) do nấm Ophiostoma novo-ulmi. 2.2. Phòng thủ nhờ các chất hóa học có sẵn Mặc dù rào cản vật lý có thể tạo ra một số mức độ phòng thủ nhưng nhìn chung khả năng tấn công của tác nhân gây bệnh phụ thuộc không nhiều vào rào cản này. Thực tế là nhiều tác nhân gây bệnh không thể xâm nhập dù không có trở ngại cấu trúc của ký chủ. Phòng thủ hóa học chắc chắn đóng vai trò quan trọng hơn trong cơ chế phòng thủ bị động của cây. Một số nhóm hợp chất có sẵn phổ biến bao gồm: - Phenolics (phenols, phenolic acids, quinones, flavonoids, flavonones, flavenols, tannins, coumarins). - Terpenoids (capsaicin). - Alkaloids (berberine, piperine) - Lectins và polypeptides (mannose, fabatin). 2.2.1. Các chất ức chế được cây tiết ra bên ngoài. Cây có thể tiết ra một số hợp chất có tính độc đối với nấm bệnh. Ví dụ lá cà chua và củ cải đường tiết ra các chất kháng nấm ức chế sự nảy mầm bào tử nấm Botrytis và Cercospora; củ hành tây vỏ trắng bị nhiễm bệnh thán thư (Colletotrichum circinans) còn củ có vỏ đỏ không bị nhiễm do củ vỏ đỏ tạo ra các hợp chất phenolic (protocatechuic acid và catechol) có khả năng ức chế sự nảy mầm của nấm. Phun cây hướng dương bằng acibenzola-S-methyl (ASM) có thể chống bệnh gỉ sắt (Puccinia helianthi) do ASM kích thích cây tiết ra courmarin và các hợp chất phenolic có khả năng ức chế sự nảy mầm và hình thành giác bám của bào tử nấm. 2.2.2. Các chất ức chế có sẵn trong tế bào cây. Một số hợp chất phenolic, tannin và các hợp chất giống acid béo (ví dụ diene) có sẵn ở nồng độ cao trong tế bào lá non, quả non hoặc hạt có khả năng chống một số loại nấm nào đó, chẳng hạn Botrytis. Nhiều hợp chất tương tự có khả năng ức chế các enzyme thủy phân kể cả enzyme phân hủy pectin của tác nhân gây bệnh. Khi mô non trở nên già, nồng độ các chất ức chế này giảm và tính kháng cũng giảm theo. Catechin (có nhiều trong lá dâu tây) có khả năng ức chế sự hình thành đế xâm nhiễm của bào tử nấm Alternaria alternate. Nhiều hợp chất khác, chẳng hạn như saponin (là các hợp chất glycosid của triterpen và steroid; ví dụ điển hình là tomatin trong cà chua) ức chế các nấm thiếu enzyme saponinase phân hủy saponin. Ngoài ra, ở một số cây còn có một số chất – là các protein có trọng lượng phân tử thấp gọi là phytocystatin ức chế hoạt tính các enzyme proteinase nhóm cystein có trong hệ tiêu hóa của tuyến trùng và cũng do một số nấm tiết ra. 26
27. Một nhóm hợp chất nữa gọi là lectin – là các protein liên kết đặc hiệu với đường. Lectin có nhiều trong hạt của nhiều loại cây và có thể dung tan hoặc ức chế sinh trưởng của nhiều loại nấm. 3. Phòng thủ chủ động 3.1. Phòng thủ chủ động nhờ hình thành các cấu trúc bảo vệ Cây phản ứng lại sự tấn công của tác nhân gây bệnh bằng cách hình thành 4 loại cấu trúc phòng thủ đặc biệt: (1) cấu trúc hình thành liên quan đến tế bào chất của tế bào bị tấn công và được gọi là phản ứng phòng thủ tế bào chất; (2) cấu trúc liên quan đến vách tế bào bị xâm nhập và được gọi là cấu trúc phòng thủ vách tế bào; (3) cấu trúc liên quan đến mô cây phía trước tác nhân gây bệnh (sâu hơn về phía cây) và được gọi là cấu trúc phòng thủ mô; và (4) mô bị chết nhanh chóng nhằm ngăn chặn sự phát triển của bệnh và được gọi là phản ứng siêu nhạy. 3.1.1.Phản ứng phòng thủ tế bào chất Trong một vài trường hợp đối với các tác nhân ký sinh yếu, chẳng hạn môt số chủng nấm Armillaria gây bệnh cây thân gỗ, thì tế bào chất của tế bào ký chủ bao quanh cụm sợi nấm và nhân bị kéo căng và vỡ làm đôi. Trong một số trường hợp khác, tế bào chất của tế bào kí chủ trở nên đậm đặc, kết hạt. Sợi nấm cuối cùng bị phân hủy. 3.1.2. Hình thành cấu trúc phòng thủ vách tế bào Vách tế bào có thể biến đổi về hình thái để phản ứng lại sự xâm nhiễm của tác nhân gây bệnh, mặc dù kiểu phản ứng này tương đối kém hiệu quả. Có 4 loại biến đổi chính. (1) Lớp ngoài của vách tế bào nhu mô đang tiếp xúc với vi khuẩn gây bệnh sẽ phồng lên và tạo ra các vật liệu dạng sợi, vô định hình; các vật liệu này sẽ bao quanh vi khuẩn và ngăn cản sự nhân lên của vi khuẩn. (2) Vách tế bào hóa dày nhờ một chất có bản chất cellulose. Cấu trúc này thường liên kết với các hợp chất phenolic và ngăn cản sự xâm nhập của tác nhân gây bệnh. (3) Vách tế bào bị lignin hóa nhằm tăng cường chống sự xâm nhập của nấm tạo vòi áp; ngoài ra, sự lignin hóa cũng kháng nước do đó giảm hoạt tính của các enzyme phân hủy vách tế bào. (4) Hình thành các núm cấu tạo bởi callose (callose papillae; callose là 1 polysaccharide thực vật, cẩu tạo bởi glucose, hình thành bởi callose synthases ở vách tế bào và bị phân hủy bởi glucanases). Các núm này hình thành vài phút sau khi tế bào bị tổn thương và khoảng 2 – 3 giở sau khi lây nhiễm tác nhân gây bệnh. Mặc dù chức năng chính của núm callose là sửa chữa các tổn thương vách tế bào thì trong một số trường hợp, núm cũng có tác dụng ngăn cản sự xâm nhập của tác nhân gây bệnh. Trong một số trường hợp, các hợp chất callose bao quanh đỉnh sợi nấm xâm nhập, liên kết với các hợp chất phenolic và hình thành một ống bao quanh sợi nấm. 3.1.3. Hình thành cấu trúc phòng thủ mô (1) Hình thành lớp bần (cork layer). Sự xâm nhiễm của nấm, vi khuẩn, một số virus và tuyến trùng thường kích thích sự hình các lớp bần phía trước điểm xâm nhiễm. Bần là mô vỏ (thân, rễ) cấu tạo chủ yếu bởi suberin. Các lớp bần ngăn cản tác nhân gây bệnh phát triển xa hơn, ngăn cản các độc tố của tác nhân gây bệnh khuyếch tán ra phần mô khỏe và ngăn cản sự vận chuyển nước và dinh dưỡng từ phần mô khỏe vào mô nhiễm bệnh. Mô bị chết hoại, cùng với tác nhân gây bệnh, bị giới hạn bởi các lớp bần, có thể vẫn ở nguyên vị trí và tạo ra các vết bệnh kiểu vết đốm mà hình dạng, màu sắc và kích thước phụ thuộc vào tổ hợp ký sinh 27
28. – ký chủ. Đối với một số bệnh, phần mô chết hoại có thể bị mô khỏe phía dưới đẩy lên tạo thành các vết ghẻ hoặc vết vẩy và do đó loại bỏ hoàn toàn tác nhân gây bệnh. (2) Hình thành tầng rời (abscission layer). Phiến giữa của 2 lớp tế bào bào bao xung quanh vết bệnh tách khỏi nhau tạo thành một lớp trống gọi là tầng rời. Sự hình thành tầng rời sẽ cô lập phần mô bệnh và thông thường mô bệnh sẽ tách khỏi mô khỏe tạo ra các lỗ thủng. Sự hình thành tầng rời rất hay bắt gặp trên các lá non đang phát triển của cây quả hạch. (3) Hình thành tylose. Tyloses hình thành trong mạch xylem của hầu hết cây bị strees hoặc bị tác nhân gây bệnh hại mạch dẫn tấn công. Tylose là sự sinh trưởng quá mức của protoplasm của tế bào nhu mô bao quanh tế bào xylem và nhô vào trong mạch xylem. Tylose có vách bằng cellulose và do kích thước cũng như số lượng nhiều của nó trong mạch xylem dẫn tới bịt kín mạch xylem ngăn không cho tác nhân gây bệnh phát triển tiếp. Ở một số giống kháng, tylose hình thành rất nhiều và nhanh ngay phía trước đường tiến của tác nhân gây bệnh ngay trong rễ non và do đó ngăn không cho tác nhân gây bệnh phát triển tiếp. (4) Hình thành gôm. Nhiều loài cây, đặc biệt là các cây quả hạch, hình thành gôm ở xung quanh vị trí xâm nhiễm và tạo ra một rào cản không thể vượt qua đối với tác nhân gây bệnh. 3.2. Phòng thủ chủ động sinh hóa 3.2.1. Phytoalexin Lịch sử. Năm 1940, Muller và Borger đã công bố nghiên cứu trong đó củ khoai tây được lây nhiễm trước với một chủng nấm Phytophthora infestans không tương thích (không gây bệnh) sẽ tạo tính kháng đối với chủng P. infestans tương thích hoặc 1 chủng nấm Fusarium gây bệnh trên củ. Tiếp theo, trong vòng 15 năm, Muller đã làm các thí nghiệm và quan sát thấy hiện tượng tương tự trên đậu Hà Lan và đã phân lập được các hợp chất có hoạt tính kháng nấm mà ông gọi là phytoalexin. Định nghĩa. Phytoalexin là các hợp chất có trong lượng phân tử thấp, có tính kháng vi sinh vật, được tạo ra bởi cây do hậu quả của sự nhiễm bệnh hoặc các street sinh học. Đặc điểm. Phytoalexin đươc tạo ra trên các tế bào khỏe xung quanh, nhằm phản ứng với các chất khuyếch tán ra từ các tế bào bị xâm nhiễm hoặc tổn thương. Sự hình thành và tích lũy phytoalexin mang tính cục bộ (có nghĩa phytoalexin không lưu dẫn xa khỏi vị trí xâm nhiễm hoặc tổn thương), và xảy ra khá nhanh (khoảng vài giờ tới tối đa 2 ngày sau lây nhiễm). Các nguồn kích thích hình thành phytoalexin. Các chất kích thích cây hình thành phytoalexin được gọi là các elicitor. Số lượng và nguồn gốc elicitor rất đa dạng. Nấm, vi khuẩn, virus, tuyến trùng (đặc biệt là nấm) là các nhóm tác nhân gây bệnh cây được biết tạo ra các elicitor cảm ứng hình thành phytoalexin. Phần lớn các chất elicitor là các hợp chất cao phân tử như các chất cấu tạo vách tế bào nấm (glucan, chitosan, glycoprotein và polysaccharide; các chất này được giải phóng ra từ vách tế bào nấm nhờ enzyme của tế bào ký chủ). Phần lớn elicitor là không đặc hiệu có nghĩa chúng có mặt trên các chủng tác nhân gây bệnh khác nhau và kích thích tạo phytoalexin trên cả giống nhiễm và giống mẫn cảm. Mặc dù phần lớn elicitor có nguồn gốc từ tác nhân gây bệnh thì một số hợp chất lại có nguồn gốc từ tế bào cây. Ví dụ enzyme của tác nhân gây bệnh phân hủy galacturonic acid, một chất cấu tạo nên vách tế bào cây, thành các oligomer có hoạt tính kích thích tế bào cây tạo phytoalexin. 28
29. Phytoalexin hình thành và tích lũy trên mô của cả giống nhiễm và giống kháng. Khi phytoalexin tích lũy tới một nồng độ nào đó sẽ ức chế sự phát triển của vi sinh vật . (thường là nấm). Các loài/chủng nấm có tính gây bệnh có xu hướng kích thích hình thành phytoalexin với nồng độ thấp hơn so với các loài/chủng không có tính gây bệnh. Ngoài ra, các loài/chủng nấm có tính gây bệnh cũng dường như kém mẫn cảm với tính độc của phytoalexin hơn so với các loài/chủng nấm có tính gây bệnh. Phytoalexin rất đa dạng về số lượng và cấu trúc. Khoảng 350 chất có tính chất giống phytoalexin đã được phát hiện từ khoảng 30 họ thực vật; trong đó khoảng 150 chất được phân lập trên cây họ đậu (Leguminosae). Phần lớn phytoalexin được phân lập trên cây 2 lá mầm, một số được phân lập trên cây một lá mầm. Cấu trúc hóa học của phytoalexin được phân lập từ một họ cây thường khá giống nhau. Các phytoalexin nhóm phenylpropanoid phổ biến trong nhiều họ thực vật như Leguminosae, Solanaceae, Convolvulaceae, Umbelliferae và Gramineae; các phytoalexin nhóm isoflavonoid phổ biến trong họ Leguminosae; nhóm sesquiterpenoid phổ biến trong họ cà (Solanaceae). Một số phytoalexin được nghiên cứu nhiều là pisatin (trên đậu Hà Lan), glyceolin (trên đậu tương, cỏ 3 lá, cỏ alfafa), rhisitin (khoai tây); capsidiol (ớt); cammaxin (Arabidopsis). Tham khảo: Phytoalexin: What have we learned after 60 years. Annu. Rev. Phytopathol. 1999. 37:285–306 3.2.2. Các hợp chất phenolic Các hợp chất phenolic đơn giản. Một số hợp chất phenolic phổ biến thường hình thành và tíc lũy với tốc độ nhanh hơn trên cây bị bệnh, đặc biệt trên các giống kháng. Một số các hợp chất phenolic phổ biến là chlorogenic acid, caffeic acid, ferulic acid. Ví dụ quả đào xanh và quả đào trên giống kháng hình thành nhiều chlorogenic acid khi bị nhiễm nấm Monilinia fructicola. Hợp chất phenolic này ngoài gây độc trực tiếp đối với nấm thì quan trọng hơn còn ức chế các enzyme của nấm dùng để phân hủy mô ký chủ. Các hợp chất phenolic độc hình thành từ các hợp chất phenolic không độc. Nhiều cây chứa các chất glycoside (ví dụ như đường glucose) liên kết với các phân tử phenolic. Ở trạng thái liên kết, các hợp chất này không độc. Một số loại nấm và vi khuẩn có thể hình thành hoặc kích thích mô cây hình thành các enzyme glycosidase thủy phân các hợp chất trên và giả phóng các hợp chất phenolic độc. Vai trò của các enzyme oxy hóa các hợp chất phenolic. Nhiều hợp chất phenol trong cây có độc tính thấp đối với tác nhân gây bệnh. Trong nhiều trường hợp, trong mô nhiễm bệnh của các giống kháng bệnh, hoạt tính của các enzyme oxy hóa phenol (Vd. polyphenol oxydase) nhìn chung được tăng cường. Các enzyme này sẽ oxy hóa các hợp chất phenolic thành các hợp chất quinone có tính độc mạnh hơn. Một cơ chế khác: Trong quả xanh thường chứa dien (là các hợp chất hydrocarbon có chứa 2 liên kết kép), có tính độc cao đối với tác nhân gây bệnh. Khi quả chín, lượng lipoxygenase cũng gia tăng dẫn tới dien bị bẻ gẫy dẫn tới làm mất tính kháng của quả chín. Ở một số loại quả, elicitor từ nấm không gây bệnh đã kích thích hình thành một hợp chất phenolic là epicatechin. Epicatechin ức chế enzyme lipoxygenase dẫn tới lượng dien không bị giảm và quả chín vẫn có thể kháng được sự xâm nhiễm của nấm (đặc biệt là nấm thán thư) 3.2.3.PR protein (pathogenesis-related protein) Định nghĩa. Protein liên quan đến sự gây bệnh (PR protein) là các protein được cây tạo ra do sự gây bệnh bởi các tác nhân gây bệnh chủ yếu thuộc các nhóm nấm vi khuẩn, virus, tuyến trùng. Ngoài ra sự tấn công của côn trùng cũng kích thích cây tạo ra PR protein. 29
30. Hiện có khoảng 17 nhóm (còn được gọi là họ) PR protein khác nhau, được ký hiệu từ PR1 đến PR17 (theo thứ tự được phát hiện. Nhiều nhóm có hoạt tính kháng nấm. Dưới đây là đặc điểm của một số nhóm quan trọng nhất : PR-1. Là nhóm protein có số lượng nhiều nhất; thường hình thành trong cây với hàm lượng rất cao sau khi bị nhiễm bệnh (có thể đạt tới 1-2% tổng lượng protein của lá). Protein của nhóm này đã được phát hiện thấy trên tất cả các loại cây được kiểm tra. Các protein có chức năng tương tự PR-1 cũng được phát hiện thấy ở nhiều sinh vât khác như nấm, côn trùng, đọng vật có xương sống (kể cả người). Mặc dù chức năng sinh học và cơ chế hoạt động của nhóm này chưa rõ nhưng các protein PR-1 có hoạt tính kháng nấm cả invitro và invivo. Các protein PR-1 có thể chia thành 2 nhóm hoặc kiềm hoặc acid. Trên thuốc lá, có ít nhất 16 protein PR-1 đã được khám phá, trong đó 3 protein loại acid (PR-1a, -1b,-1c) và 1 protein (PR-1g) hình thành khi cây bị nhiễm Tobacco mosaic virus. Trên lúa có 23 gen mã hóa protein PR-1. Trên ớt, sự biểu hiện của gen PR-1 loại kiềm được cảm ứng bởi TMV đã tạo tính kháng đối với tolerance to P. parasitica var. nicotianae, Ralstonia solanacearum, và P. syringae pv. tabaci. PR-2. (β-1,3- glucanase). Là nhóm protein có mặt trong nhiều loài cây, động vật và vi sinh vật. Glucanase có thể chia thành 3 nhóm: nhóm I là các glucanase có tính kiềm hình thành ở không bào; nhóm II và III có tính acid và là các protein ngoại bào. Glucanase thuộc nhóm I có hoạt tính kháng nấm cả invitro và invivo. Glucanase thuộc nhóm II và III chỉ có hoạt tính kháng nầm nếu phối hợp với glucanase nhóm I hoặc chitinase. Đặc tính kháng nấm của glucanase là khả năng phân hủy vách tế bào của nấm (cấu tạo bởi glucan). PR-3 (chitinase lớp I, II, IV, VI, VII), PR-8 (chitinase lớp III) và PR-11 (chitinase lớp V). Các chitinase là loại protein chiếm số lượng lớn thứ 2 trong các PR protein. Các chitinase thực vật được chia làm 7 lớp (I, II VI) căn cứ vào cấu trúc protein, tính đặc hiệu cơ chất, cơ chế xúc tác và tính mẫn cảm với các chất ức chế. 7 lớp này lại được xếp vào 3 nhóm PR protein. Các chitinase có hoạt tính kháng nấm bằng cách xúc tác cho phản ứng thủy phân để cắt liên kết β-1,4-glycoside của N-acetyl-Dglucosamine (chitin, thành phần của vách tế bào nấm). Cần chú ý là phản ứng thủy phân này tạo ra các oligosacharid có vai trò là elicitor cho các phản ứng phòng thủ khác. PR-4 (protein liên kết chitin). Hoạt tính kháng nấm của các protein nhóm PR-4 làdo khả năng liên kết với chitin của vách tế bào nấm dẫn tới ức chế sinh trưởng của nấm. Loại PR-4 phổ biến nhất là legumin và vicilin (chiếm tới 80% hàm lương protein của hạt đậu). Vicilin đã được chứng minh có khả năng ức chế sinh trưởng và nảy mầm bào tử của nhiều loại nấm như Fusarium solani, F. oxysporum, Collectotrichum musae, Phytophthora capsici, Neurospora crassa, Ustilago maydis. Vicilin cũng được biết là có khả năng kháng cả côn trùng như một đậu (Callosobruchus maculatus). PR-5 (Thaumatin-like proteins). Osmotin và thaumatin-like (TL) protein là các protein có tính kiềm và có mức tương đồng chuỗi aa đáng kể với thaumatin (một protein có vị ngọt, phân lập từ cây Thaumatococcus danielli. Osmotin và TL tương tác với màng tế bào nấm và hình thành các lỗ thủng xuyên màng. Hai loại protein này cũng có hoạt tính 1,3-glucanase, liên kết với actin. Osmotin trên thuốc lá kích thích MAPK do đó phá vỡ 1 đường hướng dẫn truyền tín hiệu (dựa vào MAPK) nhằm tăng cường tính ổn định của vách tế bào nấm. TL protein có mặt trong nhiều loài cây. PR-6. Là họ các protein ức chế protease. Các protein PR6 có thể ức chế các protease nhóm aspartic, serine, cystein. PR-12 (Defensins) và PR-13 (thionins). Defensin và thionin là các protein có trọng lượng phân tử nhỏ (~5 kD), kích thước khoảng 45-54 aa. Các protein này là các protein hoạt 30
31. động trên màng, phát hiện thấy ở tất cả các nhóm sinh vật và độc đối với nấm. Cơ chế gây độc đối với nấm của các loại protein này vẫn chưa rõ nhưng defensin đã được chứng tỏ là làm tăng vận chuyển ion K + ra ngoài màng, tăng hấp thụ Ca +2 của nấm Neurospora crassa. Chất defensin Dm-AMP1 của cây thược dược có thể tương tác đặc hiệu với sphingolipid của nấm men Sacharomyces cerevisiae. PR-14 (Protein vân chuyển lipid-LTP). Các LTP là các protein nhỏ, có tính kiềm. LTP vận chuyển phospholipid qua màng. Phân tử LTP có cấu hình gồm một xoang ghét nước chạy dọc phân tử. Phân tử LTP khi tương tác với màng tế bào nấm sẽ tự gắn xuyên qua màng tế bào và xoang ghét nước sẽ tạo ra các lỗ dò trên màng tế bào nấm và nấm sẽ chết. Ngoài ra, một LTP tờ cây Arabidopsis dã đươch chứng minh có khả năng vận chuyển các các phân tử tín hiệu trong phản ứng SẢR 4. Sự chết tế bào được lập trình (Programmed Cell Death – PCD), Apostosis và phản ứng siêu nhạy (Hypersensitive Responnd – HR) 4.1. Sự chết tế bào được lập trình (PCD) PCD là quá trình tự chết của tế bào, có những biến đổi hình thái đặc trưng, diễn ra theo một trình tự nhất định, được điều khiển bởi di truyền, nhằm đạt được và duy trì trạng thái cân bằng trong quá trình phát triển và chống lại các street môi trường và sự tấn công của tác nhân gây bệnh. PCD xuất hiện thường xuyên trong suốt đời sống thực vật, trong quá trình biệt hóa cơ quan, mô và tế bào. Các ví dụ là:  Sự hình thành và phát triển hoa: hoa đực hình thành do PCD ở các tế bào vòi nhụy, noãn hình thành trước đó; và ngược lại, hoa cái hình thành do PCD ở các tế bào nhị đực.  Các tế bào chóp rễ bị chết do PCD trong qua trình phát triển; hoặc các rễ bên hình thành mới tại vị trí có dinh dưỡng hoặc nước còn các rễ già không chức năng sẽ chết do PCD.  Tầng aleuron sẽ chết do PCD sau khi phôi phát triển. Hai dạng chính của PCD là tự thực bào (autophagy) và apoptosis. Ngoài ra, nhằm chống lại sự tấn công của tác nhân gây bệnh, thực vật còn phát triển một loại PCD nữa là phản ứng siêu nhạy (Hypersensitive Resopnse – HR). 4.2. Tự thực bào (Autophagy) Tự thực bào là quá trình phân hủy các thành phần tế bào nhờ lysosome và không bào. Lysosome sẽ dung hợp với không bào và tiết enzyme vào không bào. Tự thực bào có nhiều kiểu nhưng quan trọng nhất là đại tự thực bào (macroautophagy) trong đó phần tế bào chất (kể cả các cơ quan tử) cần phân hủy sẽ bị cô lập bởi một màng kép và tạo thành autophagosome. Autophagosome sẽ bị hấp thụ theo kiểu thực bào bởi không bào/lysosome và bị phân hủy. Autophagy có 2 chức năng chính là (i) cứu tế bào khỏi chết trong trường hợp thiếu hụt dinh dưỡng và (ii) phân hủy các thành phần tế bào trước khi chết. 4.3. Apoptosis Apoptosis là một dạng PCD và hiện đang nhân được nhiều chú ý trong nghiên cứu y sinh và kể tính kháng bệnh ở thực vật. Apoptosis là một quá trình chết sinh lý nhằm loại bỏ có chọn lọc các tế bào không mong muốn. Quá trình apoptosis có một số đặc điểm sau: tế bào chất bị nhăn, màng tế bào chất bị phồng, mất tiếp xúc giữa các tế bào, nDNA (DNA 31
32. nhân) bị phân cắt tại các vị trí bên trong nhiễm sắc thể, tăng cường luồng ion Ca vào tế bào, hoạt hóa một số enzyme đặc biệt và giải phóng cytochrome c khỏi ty thể. Ngoài ra apoptosis liên quan đến đường hướng dẫn truyền tín hiệu dựa vào ceramide (là một họ các phân tử chất béo; một ceramide gồm một phân tử sphingosin và một phân tử acid béo). Các ceramide là các phân tử gắn trên màng. Người ta đã phát hiện thấy một số độc tố nấm như fumonisinB (do nấm Fusarium moniliforme) và AAL toxin (do nấm Alternaria alternate) có khả năng ức chế các enzyme ceramidase dẫn tới hoạt hóa phản ứng apoptosis. 4.4. Phản ứng siêu nhạy Một trong các dấu hiệu của tính kháng bệnh là phản ứng siêu nhạy. Phản ứng siêu nhạy (HR) được định nghĩa là sự chết nhanh chóng và cục bộ của tế bào thực vật tại vị trí nhiễm bệnh. HR có thể được cảm ứng bởi nhiều nhóm tác nhân gây bệnh (nấm sinh dưỡng, vi khuẩn, virus và tuyến trùng). HR thường xuất hiện trong nhiều tính kháng: tính kháng phi kí chủ/kí chủ, tính kháng thông qua gen R, tính kháng đơn gen/đa gen HR là hậu quả của một dòng thác các phản ứng dẫn truyền tín hiệu và phòng thủ tại các tế bào bị xâm nhiễm hoặc lân cận dẫn tới hình thành các chất độc (ví dụ các hợp chất phenolic bị oxy hóa) đầu độc cả tế bào lẫn tác nhân gây bệnh. Ngoài ra, nếu tác nhân gây bệnh không chết thì mô bị chết hoại cũng ngăn không cho tác nhân gây bệnh lan truyền tiếp. Cần chú ý là, trong nhiều trường hợp, HR không hình thành vết chết hoại có thể nhìn thấy bằng mắt thường vì HR xuất hiện chỉ ở tế bào nhiễm bệnh hoặc ở vài tế bào xung quanh. HR của tế bào ký chủ có một số đặc điểm khá khác biệt so với các dạng PCD khác, nhất là về biến đổi hình thái của tế bào ký chủ. Nghiên cứu phản ứng siêu nhạy giữa nấm Uromyces vignae và đậu đũa, giữa nấm Erysiphe graminis f.sp hordei và tiểu mạch thấy các sự kiện sau: (1) nhân tế bào ký chủ di chuyển tới vị trí xâm nhiễm, dòng tế bào chất mất linh động, trở nên căng; (ii) tế bào chất ngừng chuyển động, các cơ quan tử chuyển động Brown, nhân hóa đậm đặc, tích lũy các thể hạt ở ngoại vi tế bào chất, nguyên sinh chất trở nên nhăn; và (iii) tế bào chất sụp đổ, tế bào chết. Các nghiên cứu gần đây còn cho thấy trong phản ứng HR, các loại màng bị mất chức năng, tế bào chất hóa không bào mạnh (vacuonization), phá hủy không bào và hình thái ty thể bị biến đổi toàn diện (ty thể bị phồng lên và rãnh ty thể bị phá hủy). Ngoài ra một đặc điểm để phân biệt khác là tốc độ phản ứng. Nhìn chung, HR diễn ra rất nhanh: khi nghiên cứu tổ hợp nấm Phytophthora infesstans/ khoai tây và sử dụng kính hiển vi video, người ta đã quan sát thấy tế bào ký chủ sụp đổ và chết sau 26 giây và nấm chết sau đó khoảng 20 giây; vết chết hoại có thể quan sát thấy bằng mắt sau nhiều giờ (ví dụ sau 8-12 giờ sau khi lây nhiễm vi khuẩn Erwinia carotovora mang gen HrpEcc trên thuốc lá). Việc phân biệt HR và các dạng PCD khác không dễ dàng. Trong một số trường hợp, HR có biểu hiện biến đổi hình thái giống như apoptosis chẳng hạn như: khi nhiễm nấm gỉ sắt Uromyces vignae trên giống đậu đũa kháng bênh đã tao ra phản ứng HR, trong đó nDNA của các tế bào chết hoại đã bị phân cắt thành thang DNA, một dấu hiệu của apoptosis. Hơn nữa các đường hướng nhận biết, dẫn truyền tín hiệu và các đặc trưng sinh hóa khá giống nhau giữa HR và apoptosis, chẳng hạn đều có sự liên quan đến dòng thác ion (Ca +2, K+1) vào/ra tế - bào, các lớp oxy hoạt hóa (O2 , H2O2), nitơ hoạt hóa (NO), các protein kinase Tham khảo. Mol. Pla. Pathol. 2007. 8 ( 5 ) , 677–700 Annu. Rev. Phytopathol. 2006. 44:135–62 32
33. CHƯƠNG 4: THUYẾT GEN ĐỐI GEN 1. Giới thiệu Trong quần thể cây ký chủ mẫn cảm đối với một loài/chủng tác nhân gây bệnh, một hiện tượng thường thấy là có một số cá thể cây vẫn có khả năng kháng lại sự tấn công. Từ các cá thể kháng này, người ta có thể chọn tạo ra các giống kháng bệnh chống lại một chủng nào đó. Giống cây tạo được gọi là giống kháng (resistant) còn chủng tác nhân gây bệnh gọi là chủng không độc (avirulent). Tuy nhiên, sau một thời gian trồng ngoài đồng ruộng, tính kháng này lại bị mất. Người ta đã nhận thấy rằng trong quần thể chủng tác nhân gây bệnh đã hình thành các đột biến có thể khắc phục được tính kháng của giống cây kháng bệnh. Trong trường hợp này, chủng tác nhân gây bệnh trở thành chủng độc (virulent) đối với giống kháng đó. Như vậy giữa tác nhân gây bệnh và cây ký chủ dường như tồn tại một mối quan hệ đồng tiến hóa dẫn tới sự tồn tại lâu dài của cả tác nhân gây bệnh và ký chủ. Mối quan hệ đồng tiến hóa này có thể được giải thích bằng thuyết gen-đối-gen. Thuyết gen-đối-gen (gene-for-gene) là nền tảng của nghiên tính kháng đặc hiệu ký chủ. Thuyết gen-đối-gen gắn liền với tên tuổi của Harol Henry Flor (1900-1991), một nhà bệnh cây học người Mỹ. Mặc dù không phải là người đầu tiên sử dụng thuật ngữ gen-đối-gen, nhưng ông là người đầu tiên chứng minh rằng biểu hiện bệnh là hậu quả mối tương tác của cả tác nhân gây bệnh và ký chủ và di truyền được. Flor đã xây dựng thuyết gen-đối-gen dựa trên nhiều thí nghiệm di truyền về tính gây bệnh và tính độc của các tổ hợp lai giữa các chủng sinh lý của nấm Melampsora lini gây bênh gỉ sắt cây lanh (Linum usitatissimum) trên các giống lanh có tính kháng và mẫn cảm khác nhau với nấm. Các thí nghiệm này chủ yếu được thực hiện từ những năm 1940 đến 1960. 2. Thí nghiệm về bệnh gỉ sắt cây lanh của Flor 2.1. Vòng đời nấm gỉ sắt Melampsora lini Nấm M. lini thuộc họ Melampsoraceae, bộ Uredinales, lớp Urediniomycetes, ngành nấm đảm Basidiomycota với bộ nhiễm sắc thể n = 18. M. lini là nấm gỉ sắt đồng chủ có nghĩa hoàn thành vòng đời trên một cây ký chủ. Nấm cũng là loài nấm gỉ sắt chu kỳ lớn có nghĩa tạo đủ 5 loại bào tử trong cả vòng đời, theo trình tự là bào tử giống – bào tử xuân – bào tử hạ - bào tử đông - bào tử đảm. Vòng đời của nấm khá phức tạp gồm 2 pha đơn bội và song hạch (2 nhân). Nấm qua đông dưới dạng bào tử đông lưỡng bội (2n) trên tàn dư cây ký chủ. Vào mùa xuân, nhân lưỡng bội của bào tử đông giảm nhiễm thành nhân đơn bội (1n) và bào tử đông nảy mầm thành đảm, từ đảm sẽ hình thành 4 bào tử đơn bội gọi là bào tử đảm (1n). Bốn bào tử đảm này khác nhau về kiểu ghép cặp (mating type) trong đó 2 bào tử thuộc kiểu ghép cặp (+) và 2 bào tử còn lại thuộc kiểu ghép cặp (-). Bào tử đảm tách khỏi đảm, phát tán và tiếp xúc trên bề mặt lá cây lanh. Trong điều kiện đủ ẩm, bào tử đảm nảy mầm và xâm nhập qua biểu bì trên của lá và hình thành sợi nấm đơn bội trong mô lá. Trong mô lá, sợi nấm phát triển trong gian bào và hình thành vòi hút bên trong tế bào để hấp thụ dinh dưỡng. Ở pha đơn bội này, nấm là loài dị tản (heterothallic) có nghĩa mỗi cá thể (sợi nấm) hoặc thuộc kiểu ghép cặp (-) hoặc thuộc kiểu ghép cặp (+). Tiếp theo, sợi nấm đơn bội hình thành 2 cơ quan sinh sản khác nhau. (1) ở phía biểu bì trên, nấm tạo ra ổ bào tử giống dạng bình tam giác có lỗ mở, bên trong chứa các bào tử giống (1n) đóng vai trò như giao tử đực. Nhô ra khỏi lỗ mở của ổ bào tử giống là các sợi nấm hữu thụ, phân nhánh, không có vách ngăn gọi là sợi tiếp nhân. (2) Ở 33
34. phía biểu bì dưới, vẫn cùng một cá thể nấm, sợi nấm hình thành tiền ổ bào tử xuân (gồm các sợi nấm tụ tập lại) chứa các tế bào gốc (basal cells) đóng vai trò như giao tử cái. Quá trình sinh sản hữu tính bắt đầu khi bào tử giống khác kiểu ghép cặp (ví dụ là +) tiếp xúc và dung hợp (fusion) với sợi tiếp nhận (ví dụ là -). Sau khi dung hợp, nhân của bào tử giống (+) sẽ di chuyển dọc sợi tiếp nhận (-), vượt qua các vách ngăn tế bào của sợi nấm (-) tiến tới tiền ổ bào tử xuân (-), cuối cùng tới tế bào gốc (-) để tạo thành tế bào gốc chứa 2 nhân (- và +). Tiển ổ bào tử xuân sẽ phát triển thành ổ bào tử xuân có lỗ mở, bên trong hình thành các bào tử xuân 2 nhân (n+n) mọc thành chuỗi. Bào tử xuân giải phóng khỏi ổ bào tử xuân, phát tán nhờ gió, tiếp xúc, xâm nhập vào mô lá, thân và hình thành sợi nấm 2 nhân trong mô. Sợi nấm 2 nhân sẽ hình thành các ổ bào tử hạ chứa nhiều bào tử hạ 2 nhân. Bào tử hạ tiếp tục phát tán và tạo ra nhiều chu kỳ xâm nhiễm mới. Vào mùa thu, trên tàn dư lá bệnh, sợi nấm 2 nhân sẽ hình thành ổ bào tử đông chứa các bào tử đông hình trụ. Lúc đầu, mỗi tế bào của bào tử đông gồm 2 nhân riêng biệt nhưng trong thời gian ngủ nghỉ, 2 nhân sẽ tiến hành hợp nhân (karyogamy) để tạo thành 1 nhân lưỡng bội (2n). Như vậy bào tử đông thành thục là bào tử đơn nhân lưỡng bội và ngủ nghỉ qua đông để tới mùa xuân bắt đầu chu kỳ bệnh mới. Như vậy, nấm gỉ sắt lanh có pha 2 nhân chiếm ưu thế trong chu kỳ phát triển. Vì sợi nấm hay bào tử 2 nhân chứa kiểu gen của cả bố và mẹ nên di truyền tính gây bệnh và tính độc của nấm có thể được phân tích theo các qui luật di truyền Mendel. 2.2. Kỹ thuật phân tích lai nấm M. lini Nấm M. lini gồm nhiều chủng có tính độc khác nhau. Để phân tích di truyền tính độc của nấm, Flor và cộng sự đã tiến hành lai chéo giữa các chủng. Kỹ thuật lai như sau: Bào tử đông được cảm ứng để tạo đảm và bào tử đảm. Các bào tử đảm được nhiễm riêng rẽ trên ký chủ mẫn cảm. Mỗi bào tử đảm sẽ hình thành các ổ bào tử giống. Trong lai chéo, bào tử giống (có kiểu ghép cặp +) từ chủng A sẽ được cho giao phối với sợi nấm tiếp nhận (có kiểu ghép cặp -) của chủng B. Việc lai chéo này khá dễ dàng vì nấm không thể tự thụ nếu cùng kiểu ghép cặp. Con cháu của chúng là các bào tử xuân (hoặc bào tử hạ) thế hệ F1. Để nhận được thế hệ F2 tự thụ nhằm phân tích phân ly tính trạng, các bào tử xuân (hoặc bào tử hạ) F1 được nhiễm riêng rẽ trên cây mẫn cảm và bào tử đông sẽ được thu thập vào mùa thu. Vào mùa xuân, các bào tử đông của mỗi dòng nấm F1 lại được cảm ứng để tạo bào tử đảm và lây nhiễm trên ký chủ mẫn cảm. Trên mỗi dòng F1, bào tử giống (+) được cho giao phối với sợi nấm tiếp nhận (-) để nhận được bào tử xuân (hoặc bào tử hạ) thế hệ F2 tự thụ. Như vậy phân ly di truyền của M. lini thông qua lai chéo là tương tự như đối với cây. Để phân tích sự phân ly tính gây bệnh/độc của nấm, các bào tử xuân (hoặc bào tử hạ) của các thế hệ F1 hoặc F2 được nhiễm trên các giống lanh đồng hợp tử mang các gen kháng khác nhau. Biểu hiện triệu chứng trên các giống này sẽ xác định kiểu gen của nấm. 2.3. Đặc điểm cây ký chủ. Cây lanh (Linum usitatissimum) là cây tự thụ, được trồng chủ yếu để lấy hạt và dầu, trồng nhiều ở Mỹ, Canada và Trung Quốc. Vào những năm 30, các nhà bệnh cây Mỹ đã xác định được cây lanh có thể kháng được bệnh gỉ sắt và tính kháng được điều khiển bởi di truyền với kiểu hình kháng là trội so với kiểu hình nhiễm. Cho tới nay, 31 gen kháng bệnh gỉ sắt đã được phát hiện trên lanh. Các gen này nằm trên 5 loci được ký hiệu là K (2 gen), L (13 gen), M (3 gen), N (6 gen) và P (13 gen). Trong những năm 40 và 50, Flor đã sử dụng nhiều giống lanh kháng bệnh để nghiên cứu di truyền về tính kháng bệnh của cây lanh. Các giống 34
35. lanh này là các giống thuần, đồng hợp tử về tính trạng kháng nhiễm và được gọi là các giống chỉ thị 2.4. Các thí nghiệm của Flor  Năm 1942, Flor lai chủng nấm số 6 với số 22. Khi thử tính gây bệnh của 67 con cháu F2 trên 12 giống chỉ thị ông đã: Xác định được 57 kiểu hình không độc/độc khác nhau (ông gọi là các chủng). Kết quả này gợi ý rằng trên mỗi giống chỉ thị thì kiểu hình độc và không độc là khác nhau giữa chủng 6 và chủng 22. Kiểu hình không độc là trội so với kiểu hình độc vì trên mỗi giống chỉ thị, tỷ lệ phân ly không độc/độc = 3/1.  Năm 1946, Flor lai chủng nấm số 22 với chủng số 24. Khi thử tính gây bệnh của 133 con cháu F2 trên 14 giống chỉ thị ông thu được kết quả sau: Xác định được 68 kiểu hình không độc/độc khác nhau (chủng). Xuất hiện sự phân lý tính trạng không độc/độc trên 14 giống. Tỷ lệ phân ly khác nhau tùy thuộc số gen kháng cây chỉ thị: 3/1 trên 9 giống mang 1 gen kháng; 15/1 trên 2 giống mang 2 gen kháng, và 63/1 trên 1 giống mang 3 gen kháng.  Năm 1955, Flor sử dụng lại 67 con lai F2 của chủng số 6 và chủng số 22 để thử tính gây bệnh trên 32 giống chỉ thị, phần lớn chúng chỉ có một gen kháng (theo xác định của Flor). Ông thu được kết quả tương tự: Xuất hiện sự phân ly tính trạng không độc/độc trên 24 giống chỉ thị. Tỷ lệ phân ly trên 23 giống đều là 3/1. Đa số các cặp không độc/độc là khác nhau vì chúng phân ly độc lập với nhau. Các kết quả trên đưa Flor tới kết luận là (1) khả năng gây bệnh của nấm M. lini trên cây lanh do sự tương tác của các gen kháng/nhiễm của cây ký chủ và gen không độc/độc của nấm gây bệnh; (2) Mối tương tác này là đặc hiệu nghĩa là một gen qui đinh tính không độc/độc của nấm tương tác với chỉ một gen qui định tính kháng/nhiễm của cây ký chủ; và (3) các gen qui định tính kháng của cây và tính không độc của nấm các gen trội. 3. Khái niệm gen - đối – gen. 3.1. Khái niệm Thực tế, Flor chưa bao giờ đưa ra một định nghĩa rõ ràng về lý thuyết của mình. Năm 1971, tổng kết nghiên cứu của mình và của các tác giả khác, Flor đã viết” đối với mỗi gen qui định tính kháng trong cây ký chủ có một gen tương ứng qui định tính gây bệnh trong ký sinh “For each gene that conditions resistance in the host there is a corresponding gene that conditions pathogenicity in the parasite”. Khẳng định này của Flor được sử dụng rộng rãi và được xem là định nghĩa chính thức của Flor về thuyết gen-for-gen. Vì mối quan hệ gen-đối-gen thường là quan hệ trội – trội trong khi đó “gen qui định tính gây bệnh” thường được hiểu là gen lăn nên định nghĩa trên của Flor dễ gây nhầm lẫn. Do vây, khái niệm gen-đối-gen của Flor đã được biến đổi một chút cho phù hợp với lý thuyết của ông như sau: “đối với mỗi gen qui định tính kháng trong cây ký chủ có một gen tương ứng qui định tính không độc trong ký sinh và 2 gen này tương tác đặc hiệu với nhau” 35
36. “for each gen determining resistance in the host there is a corresponding gen for avirulence in parasite with which it specifically interacts” Quan hệ gen-đối-gen cho tới nay đã được chứng minh là tồn tại trong rất nhiều loại bệnh do hầu hết các nhóm tác nhân gây bệnh (nấm, vi khuẩn, virus, tuyến trùng, mollicus ) gây ra. Các gen cây ký chủ qui định tính kháng (chú ý không nhất thiết phải tuân theo quan hệ gen-for-gen) được gọi chung là gen R (Resistance). Các gen ký sinh qui định tính không độc của ký sinh được gọi chung là gen Avr (Avirulence). Các ký hiệu R hoặc Avr sẽ được viết thường là r hoặc avr nếu trạng thái của gen là lăn. Các chữ số viết kèm theo (nếu có) cho biết sự tương ứng của các cặp gen. Ngoài qui định chung này, trên mỗi hệ ký sinh – ký chủ, người ta thường sử dụng các ký hiệu riêng. Ví dụ: - Cây lanh: L2, L5 Nấm M. lini: AL2 (hoặc AvrL2), L5 (hoặc AvrL5) - Cây lúa: Pi-ta Nấm P. oryzae : AvrPi-ta - Cây lúa: Xa5, Xa21 Vi khuẩn X. oryzae: AvrXa5, AvrXa21 - Cây cà chua: Cf2, Cf9 Nấm C. fulvum: Avr2, Avr9 - Cà chua: AvrPto Vi khuẩn P. syringae: Pto 3.2. Đặc điểm quan hệ gen-đối-gen  Phần lớn quan hệ gen-đối-gen là quan hệ trội-trội có nghĩa đối với cây ký chủ, gen qui định tính kháng là gen trội (R) còn gen qui định tính mẫn cảm (thiếu tính kháng) là gen lặn (r); đối với ký sinh, gen qui định tính không độc (không có khả năng gây bệnh) là gen trội (Avr) còn gen qui định tính độc là gen lặn (avr). Nói cách khác cả gen kháng của ký chủ và gen không độc của ký sinh đều phải được biểu hiện để tạo ra tính kháng.  Mỗi gen ký chủ thường nhận biết và tương tác với chỉ gen tương ứng của ký sinh (và ngược lại). Điều này dẫn tới nếu ký chủ có nhiều gen kháng/nhiễm và ký sinh có nhiều gen không độc/độc thì tính kháng chỉ có thể hình thành khi ít nhất có tương tác của một cặp gen tương ứng. Ví dụ: Cây (R1, r2, r3) + ký sinh (Avr1, Avr2, Avr3) => kháng Cây (R1, r2, r3) + ký sinh (avr1, Avr2, Avr3) => nhiễm  Số lượng chủng (race) tối đa trong quần thể tác nhân gây bệnh =2 n trong đó n là số gen kháng R trong quần thể ký chủ.  Việc xác định kiểu hình kháng hay nhiễm hoàn toàn dễ dàng khi sử dụng bảng punnett. Khi xây dựng bảng punnett cần chú ý là kiểu gen của cây ký chủ là lưỡng bội còn kiểu gen của ký sinh sẽ hoặc đơn bội hoặc lưỡng bội tùy thuộc loại tác nhân gây bệnh. Ví dụ ký sinh có kiểu gen đơn bội là vi khuẩn, nhiều loại nấm túi (như nấm đạo ôn lúa Pyricularia oryzae); ký sinh có kiểu gen lưỡng bội là tuyến trùng, các loài nấm đảm (như nấm gỉ sắt, than đen ).  Tính kháng của cây trồng tuân theo quan hệ gen-đối-gen được gọi là tính kháng gen-đối- gen. Tính kháng gen-đối-gen thường là tính kháng đặc hiệu ký chủ, tính kháng đơn gen, tính kháng gen chủ, tính kháng không bền vững.  Hậu quả của một phản ứng kháng gen-đối-gen thường là phản ứng siêu nhạy/apoptosis. 4. Đặc điểm của gen không độc (gen Avr) của ký sinh 36