›
›

Xây dựng mô hình gây nhiễm Candida albicans âm đạo chuột nhắt trắng

pdf 44 trang phuongnguyen 170
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Xây dựng mô hình gây nhiễm Candida albicans âm đạo chuột nhắt trắng", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfxay_dung_mo_hinh_gay_nhiem_candida_albicans_am_dao_chuot_nha.pdf

Nội dung text: Xây dựng mô hình gây nhiễm Candida albicans âm đạo chuột nhắt trắng

  1. XÂY DỰNG MÔ HÌNH GÂY NHIỄM CANDIDA ALBICANS ÂM ĐẠO CHUỘT NHẮT TRẮNG TÓM TẮT Mục tiêu: xây dựng mô hình gây bệnh Candida albicans âm đạo ở chuột nhắt trắng và áp dụng được mô hình vào nghiên cứu tác dụng của các chất kháng nấm ở in vivo. Phương pháp: chuột nhắt trắng cái, cân nặng khoảng 18 -22g, chưa sinh sản, được gây nhiễm vi nấm Candida albicans ATCC 10231 vào âm đạo sau khi làm suy yếu hệ miễn dịch bằng Estradiol valerat (EV) và gây rối loạn vi khuẩn chí trong âm đạo với Cloramphenicol theo 5 mô hình khác nhau về liều lượng và thời gian. Các lô chuột bị viêm âm đạo do Candida gây nhiễm sẽ được điều trị bằng clotrimazol để khảo sát các tiêu chuẩn đánh giá mức độ bệnh của chuột sau gây nhiễm. Kết quả: có thể gây nhiễm C. albicans âm đạo chuột để thử tác dụng của các chất kháng nấm in vivo bằng mô hình: cloramphenicol 1%, tiêm 2ml/ngày x 7 ngày trước gây nhiễm, Estradiol valerat 0,05mg/100ml tiêm dưới da trong 3 ngày
  2. trước gây nhiễm, 3 ngày trong gây nhiễm và 2 ngày sau gây nhiễm, tiêm 20ml C. albicans 106 CFU/ml. Kết luận: một số điều kiện gây suy giảm miễn dịch và rối loạn cân bằng vi sinh ở âm đạo chuột nhắt trắng đã được dò tìm để đưa ra mô hình gây nhiễm bệnh thực nghiệm C. albicans âm đạo trên chuột nhắt trắng. Mô hình này có thể áp dụng để thử tác dụng kháng C. albicans của các chất kháng nấm in vivo. ABSTRACT Objectives: Desining a protocol for the infection by Candida albicans at the vagina of the white mouse. Applying this protocol to test in vivo the action of antifungus substances. Methods: Test animals were young female white mice, of 18- 22g weigh, and no previous birth experience. Estradiol valerat (EV) treatment had weakened their immunity system, and 5 different treaments of Cloramphenicol on quantity and time had disturbed the micro flora of their vagina. The micro-organism strain was Candida albicans ATCC 10231. Clotrimazol will treat samples of mic that got vagina inflamation by Candida infection. Hence their sicness degree will be evaluated and will constitute criteria for clinical examination. Results: the C. albicans infection of the mouse vagina was done by this prescription: Cloramphenicol 1% injection 2µl/day, on 7 days before
  3. contamination; Estradol valerate 0.05 mg/100ml under-skininjection on 3 days before contamination, on 3 days during contamination and on 2 days after contamination. Contamination by injection of 20µl C. albicans 106 CFU/ml. Conclusions: Determining the conditions of weakening the immune system of the mouse, disturbing the balance of micro flora in the vagina of white mouse, and the protocol for experimental infection of C. albicans vagina. This protocol can be used in the test in vivo of antifungus action on C. albicans. ĐẶT VẤN ĐỀ Candida albicans là vi nấm sống hoại sinh ở da và niêm mạc, có thể gây bệnh khi gặp cơ hội, hiện nay bệnh do Candida rất thường gặp ở người suy giảm miễn dịch. Ngoài việc thường gây bệnh, kháng thuốc còn là vấn đề được đặt ra gần đây với nhóm nấm này. Vì vậy, việc sử dụng kháng sinh kháng nấm hợp lý trong điều trị cũng như tìm thêm thuốc mới kháng Candida được xem là vấn đề cấp thiết. Từ yêu cầu trên, chuẩn hóa mô hình xác định hoạt lực kháng sinh kháng nấm in vitro và in vivo đang được quan tâm. Hiện nay để xác định hoạt lực các chất kháng nấm in vitro trên nấm men, NCCLS đã đưa ra qui trình thử nghiệm chuẩn M27- A2, bên cạnh đó một số mô hình xác định mức độ tác dụng của thuốc kháng nấm in vivo trên C. albicans cũng đã được đề nghị. Tuy nhiên mô hình gây nhiễm bệnh Candida âm đạo ở thú chỉ mới được thực bước đầu trên chuột cống (1) (3). Vì
  4. vậy, mục tiêu của đề tài này nhằm xây dựng được mô hình gây bệnh Candida albicans âm đạo ở chuột nhắt trắng, dễ tìm hơn chuột cống trắng, và áp dụng được mô hình này trong nghiên cứu tác dụng của các chất kháng nấm ở in vivo. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Nguyên liệu Chuột nhắt trắng cái, trong lượng từ 18-22 g, chưa sinh sản. Vi nấm Candida albicans ATCC 10231 Estradiol valerat (EV), Cloramphenicol Môi trường Sabouraud, thạch bột ngô. Phương pháp Nguyên tắc xây dựng mô hình: bệnh Candida không phải là bệnh tự nhiên ở chuột, vì vậy để gây được bệnh cho chuột cần thiết phải gây suy giảm miễn dịch và xáo trộn cân bằng tự nhiên ở âm đạo chuột bằng cách sử dụng estradiol valerat (3) (4) và cloramphenicol theo sơ đồ sau: Chuột nuôi quen chuồng Estradiol valerat/cloramphenicol
  5. Gây nhiễm Cấy + phết ướt Thời gian (ngày) Sơ đồ 1. Các bước thực hiện mô hình gây nhiễm Candida âm đạo chuột nhắt trắng Chi tiết trong từng bước thực hiện mô hình như liều estradiol valerat, thời gian cho cloramphenicol, liều và thời gian gây nhiễm C. albicans ở âm đạo chuột, được thay đổi theo bảng 1 để tìm điều kiện thích hợp gây ra bệnh nhiễm ở chuột.
  6. Mức độ bệnh của chuột được đánh giá dựa trên các tiêu chuẩn sau: - Mật độ C. albicans dạng sợi ở phết ướt âm đạo chuột (2). - Mật độ khúm nấm men cấy từ dịch âm đạo chuột trước và sau gây nhiễm lên môi trường Sabouraud. Mật độ sợi nấm trong phết ướt âm đạo chuột và khúm nấm men cấy trên thạch Sabouraud được mã hóa thành điểm để xử lý thống kê theo F test và T test. Bảng 1. Tóm tắt các điều kiện áp dụng trong các bước thực hiện mô hình MH 1 MH 2 MH 3 MH 4 0,2mg/100 0,1mg/100 0,05mg/100 0,05mg/100 Liều EV ml ml ml ml ml Tiêm dưới Tiêm dưới Tiêm dưới Đường cho EV Uống da da da da
  7. MH 1 MH 2 MH 3 MH 4 1 lần/ngày Liên tục 3 1 lần/ngày 1 lần/ngày ngày trước gây ngày trư 1 lần nhiễm nhi Thời gian cho Liên tục 3 Liên tục 3 3 ngày EV ngày trước gây ngày trước gây 3 ngày khi trước gây nhiễm nhiễm nhiễm gây nhiễm gây nhi 2 ngày sau gây nhiễm gây nhi Ngày 1 lần Ngày 1 lần, liên tục 3 ngày Liên tục 7 Cloramphenicol Không Không trước khi gây ngày trước gây ngày trư nhiễm nhiễm nhi 105 105 106 106 C. albicans CFU/20 ml CFU/20 ml CFU/ml CFU/ml CFU/ml
  8. MH 1 MH 2 MH 3 MH 4 1 ngày 2 ngày 3 ngày liên 3 ngày liên liên tiếp tục tục tục Ngày thứ 3 CLZ Không Không Không sau gây nhiễm. sau gây nhi Liên tục 6 ngày Liên t Thời gian đánh 3 ngày 3 ngày 6 ngày 8 ngày giá sau gây nhiễm Bảng 2. Mật độ vi nấm xuất hiện trong dịch âm đạo chuột Biểu Tần Lượng Điểm thị mật độ số xuất hiện khúm nấm sợi nấm / men trên đĩa phết ướt âm
  9. đạo chuột Petri - Không 0 0 gặp / 10 thị trường (+/-) Xuất 300 4
  10. nhiều (dầy đặc)/ 1 thịtrường Xác định khúm nấm men trên thạch Sabouraud đúng là C. albicans bằng cách lấy ngẫu nhiên 5-10 khúm nấm men, cấy lại lên thạch bột ngô, phải có sự hiện diện của sợi nấm giả và bào tử bao dày(1). KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Mô hình gây nhiễm 1 được thực hiện theo sơ đồ 2 Ngày Estradiol valerat 0,2 mg/100 ml
  11. C. albicans 105 CFU/20 ml Cấy + phết ướt Nuôi quen chuồng / 1 tuần -3 -2 -1 0 1 2 3
  12. Sơ đồ 2. Các bước thực hiện mô hình gây nhiễm 1 Bảng 3: Kết quả gây nhiễm theo mô hình 1 Chuột Những biến đổi ở dịch âm đạo chuột theo thời gian (ngày) Trước gây nhiễm Gây Sau gây nhiễm nhiễm
  13. -3 -2 -1 0 1 2 3 1 BT BT BT BT + Quan sát bằng mắt thường: âm đạo chuột không có 2 BT BT Chết - biểu hiện bệnh lý + Phết ướt: Mật độ nấm 3 BT BT Chết - men (+), + Mật độ sợi nấm (-). 4 BT BT BT BT + Mật độ khúm nấm men cấy trên đĩa thạch: (+) (Ghi chú: BT – bình thường) Mô hình 1 chưa gây được bệnh nhiễm ở chuột. Estradiol valerat 0,1 mg/20 ml C. albicans 105 CFU/20 ml
  14. Cấy + phết ướt Ngày Nuôi quen chuồng/ 7 ngày -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 Mô hình gây nhiễm 2 được thực hiện theo sơ đồ sau:
  15. Sơ đồ 3. Các bước thực hiện mô hình gây nhiễm 2 Bảng 4. Kết quả gây nhiễm theo mô hình 2 Những biến đổi ở dịch âm đạo chuột theo thời gian (ngày) Chuột Trước gây nhiễm Gây nhiễm Sau gây nhiễm -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 1 BT BT BT BT BT + Âm đạo
  16. Những biến đổi ở dịch âm đạo chuột theo thời gian (ngày) Chuột Trước gây nhiễm Gây nhiễm Sau gây nhiễm -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 chuột không có biểu 2 BT BT BT BT BT hiện bệnh lý. 3 BT BT BT BT BT + Kết quả xem phết ướt: nấm men (+), nấm sợi (-). + Kết quả cấy: 4 BT BT BT BT BT Vi khuẩn (++++), nấm men (±) Ghi chú BT: Bình thường Mô hình 2 chưa gây được sự nhiễm nấm ở chuột Mô hình gây nhiễm 3 Estradiol valerat
  17. 0,05 mg/100 ml C. albicans 106 CFU/ml Cấy + phết ướt Ngày -4 -3 -2 -1 1 2 3 4 -5 5
  18. 6 0 Cloramphenicol Nuôi quen chuồng/7 ngày
  19. Sơ đồ 4. Các bước thực hiện mô hình gây nhiễm 3 Bảng 5. Mật độ sợi nấm trong phết ướt âm đạo chuột khi gây nhiễm theo mô hình 3. Mật độ sợi nấm trong dịch âm đạo chuột sau gây nhiễm (ngày) 1 2 3 4 5 6 1 0,5 1 2 2 3 2 2 1 2 2 3 4 Chết 3 1 2 1 1 1 2
  20. 4 1 1 2 3 3 Chết Nhận xét - 1 ngày sau gây nhiễm, sợi nấm xuất hiện trong phết ướt âm đạo chuột, mật độ sợi nấm tăng dần đến ngày thứ 5 sau gây nhiễm. - Ở các chuột thử nghiệm, ngoài sợi nấm và nấm men, mật độ vi khuẩn trong phết ướt âm đạo chuột còn cao. Bảng 6: Mật độ khúm nấm men trên đĩa thạch sau khi cấy từ dịch âm đạo chuột Mật độ khúm nấm thay đổi sau gây nhiễm (ngày) Chuột 1 2 3 4 6 1 0,5 1 2 2 3 2 1 2 4 3 Chết
  21. 3 1 2 3 4 4 4 1 3 4 3 Chết Tương tự, mật độ khúm nấm cấy từ dịch âm đạo chuột cũng tăng dần sau khi gây nhiễm từ ngày thú 1 đến ngày thứ 4. Các khúm nấm trên thạch Sabouraud được cấy chuyển sang môi trường thạch bột ngô chứa 1% Tween 80 đều cho sợi nấm giả và bào tử bao dầy. Mô hình 3: đã tạo được bệnh nhiễm Candida âm đạo chuột nhắt, tuy nhiên 2/4 chuột chết vào ngày thứ 6, ở các chuột chết, mật độ vi khuẩn trong phết ướt âm đạo chuột vào ngày thứ 4 vẫn cao. Mô hình gây nhiễm 4 Chuột dùng thử nghiệm gây nhiễm với mô hình 4 được chia thành 3 lô, mỗi lô 6 chuột Lô Co: chuột không gây nhiễm Lô C1: chuột gây nhiễm với C. albicans, không điều trị Lô CLZ: Chuột gây nhiễm với C. albicans, điều trị với dung dịch clotrimazol 1%,ngày 1 lần, liên tục 5 ngày.
  22. Estradiol valerat 0,05 mg/100 ml C. albicans 106 CFU/ml Ngày Cloramphenicol -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3
  23. -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 . Cấy + phết ướt
  24. Lô chứng Sơ đồ 5. Các bước thực hiện mô hình gây nhiễm 4 Lô điều trị với clotrimazol 1% (CLZ) Estradiol valerat 0,05 mg/100 ml C.albicans
  25. 106 CFU/ml Ngày Cloramphenicol -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2
  26. 3 4 5 6 7 . Cấy + phết ướt Clotrimazol 1%
  27. Bảng 7: Mật độ sợi nấm ở phết ướt âm đạo ở các lô chuột Biến đổi mật độ nấm sợi trong phết ướt âm đạo chuột theo thời gian (ngày) Gây nhiễm Sau gây nhiễm Sau gây nhiễm v Chuột -2 2 3 Co C1 CLZ Co C1 CLZ Co C1
  28. 1 0 0 0 0 1 4 0 1 2 0 0 0 0 3 3 0 4 3 0 0 0 0 2 2 0 2 4 0 0 0 0 0,5 0,5 0 1 5 0 0 0 0 0,5 0,5 0 2 6 0 0 0 0 2 2 0 2 Nhận xét - Mật độ sợi nấm trong phết ướt âm đạo chuột gây nhiễm, không điều trị tăng dần từ ngày thứ 2 sau gây nhiễm đến ngày thứ 7. So với lô chứng không gây nhiễm, không tìm thấy nấm men lẫn nấm sợi trong phết ướt âm đạo chuột. - Ở lô chuột gây nhiễm và điều trị với clotrimazol, 1 ngày sau điều trị (ngày thứ 3 sau gây nhiễm), mật độ sợi nấm tăng nhẹ hoặc không tăng, nhưng sau 3 ngày điều trị
  29. (ngày thứ 5 sau gây nhiễm) mật độ sợi nấm giảm rõ rệt và càng giảm sau 5 ngày điều trị (ngày thứ 7 sau gây nhiễm). Bảng 8: Kết quả trải đếm khúm nấm men trước và sau khi gây nhiễm Biến đổi mật độ khúm nấm trong phết ướt âm đạo chuột theo thời gian (ng Gây nhiễm Sau gây nhiễm Sau cho thuốc Chuột -2 2 4 Co C1 CLZ Co C1 CLZ Co C1 1 0 0 0 0 1 4 0 3 2 0 0 0 0 3 4 0 4 3 0 0 0 0 4 3 0 4 4 0 0 0 0 3 4 0 3
  30. Biến đổi mật độ khúm nấm trong phết ướt âm đạo chuột theo thời gian (ng Gây nhiễm Sau gây nhiễm Sau cho thuốc Chuột -2 2 4 Co C1 CLZ Co C1 CLZ Co C1 5 0 0 0 0 3 3 0 3 6 0 0 0 0 4 2 0 4 Nhận xét Mật độ khúm nấm cấy từ dịch âm đạo lô chuột gây nhiễm không điều trị (C1) tăng dần từ ngày thứ 2 đến ngày thứ 7 sau gây nhiễm. Lô chứng không gây nhiễm (Co) không có nấm men. Các khúm nấm trên thạch Sabouraud được cấy chuyển sang môi trường thạch bột ngô chứa 1% Tween 80 đều cho sợi nấm giả và bào tử bao dầy.
  31. - Ở lô chuột gây nhiễm và điều trị (lô CLZ), vào ngày thứ 2 sau gây nhiễm (chưa điều trị với clotrimazol), mật độ khúm nấm men cấy từ dịch âm đạo chuột tương đương với lô C1, sự khác biệt về mật độ khúm nấm men ở 2 lô chuột C1 và CLZ khác nhau không có ý nghĩa thống kê với: t = -0,63 F = 0,2 và T = 0,4 T 0.05 = 2,36. Mô hình 5 - Lô Co: Lô chứng không gây nhiễm - Lô C1: Lô chứng gây nhiễm không điều trị - Lô CLZ: Lô gây nhiễm và điều trị bằng Clotrimazol 1%, ngày 1 lần, liên tục trong 7 ngày.
  32. Estradiol valerat 0,05 mg/100 ml C. albicans 106 CFU/ml Ngày Cloramphenicol -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0
  33. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Clotrimazol 1% Cấy + phết ướt
  34. Sơ đồ 6. Các bước thực hiện mô hình gây nhiễm 5 Bảng 9: Mật độ nấm sợi trong phết ướt âm đạo chuột Biến đổi mật độ tế bào nấm sợi trong phết ướt âm đạo chuột theo thời gian (ngày) gây nhiễm Sau gây nhiễm Sau cho thuốc -2 1 3
  35. Co C1 CLZ Co C1 CLZ Co C1 CLZ 1 0 0 0 0 1 3 0 2 2 2 0 0 0 0 2 1 0 3 1 3 0 0 0 0 3 2 0 2 4 4 0 0 0 0 0 2 0 1 3 5 0 0 0 0 1 4 0 3 4 6 0 0 0 0 0.5 2 0 1 0.5 Ghi chú: * chuột chết - C. albicans bắt đầu cho dạng sợi nấm trong phết ướt âm đạo chuột ngày thứ 1 sau đợt gây nhiễm cuối cùng ở cả 2 lô chuột. ( lô gây nhiễm không cho thuốc và lô gây nhiễm nhưng chưa cho thuốc). Sự khác biệt về mật độ C. albicans dạng sợi ở phết ướt âm đạo chuột không có ý nghĩa thống kê (t = -1,77 < t0,05 = 2,23). Chứng tỏ lượng nấm trong âm đạo chuột ở 2 lô chuột vào thời gian đầu gần như nhau.
  36. - Vào ngày thứ 3 sau gây nhiễm (1 ngày sau cho thuốc), Sự khác biệt về mật độ sợi nấm C. albicans trong âm đạo 2 lô chuột không có ý nghĩa thống kê (t = - 0,6 t0,05 = 2,6. - Sự khác biệt này càng rõ rệt hơn vào ngày thứ 7 và thứ 9 sau gây nhiễm. Bảng 10. Kết quả trải đếm khúm nấm men trước và sau khi gây nhiễm Biến đổi mật độ khúm nấm trong phết ướt âm đạo chuột theo thời gian (ng gây nhiễm Sau gây nhiễm và cho thuốc CHUỘT -2 1 2 Co C1 CLZ Co C1 CLZ Co C1 1 0 0 0 0 2 1 0 4
  37. Biến đổi mật độ khúm nấm trong phết ướt âm đạo chuột theo thời gian (ng gây nhiễm Sau gây nhiễm và cho thuốc CHUỘT -2 1 2 Co C1 CLZ Co C1 CLZ Co C1 2 0 0 0 0 1 1 0 3 3 0 0 0 0 2 2 0 4 4 0 0 0 0 1 1 0 2 5 0 0 0 0 4 1 0 4 6 0 0 0 0 1 1 0 1 Nhận xét:
  38. - Sau 1 ngày gây nhiễm, mật độ khúm nấm cấy từ dịch âm đạo của 2 lô chuột (lô CLZ chưa bôi thuốc và lô chứng C1) khác nhau không có ý nghĩa thống kê, với t = 1,32 T 0.05 = 2,3 - Sau 5 ngày điều trị, dịch âm đạo chuột cấy trên thạch sabouraud không cho khúm nấm men nào phát triển. Ở lô không cho thuốc lượng khúm nấm men cao ở phần lớn chuột, 1 chuột chết. - Mật độ khúm nấm men cấy từ dịch âm đạo 2 lô chuột khác nhau có ý nghĩa thống kê với T= 4,3 > T 0.05 = 2,57. - Sau khi ngưng thuốc 1 ngày, vẫn không thấy sự phát triển của bất kỳ khúm nấm men nào trên thạch sabouraud cấy từ dịch âm đạo lô chuột được điều trị với clotrimazol, trong khi lô không cho thuốc vẫn còn cho mật độ khúm nấm men cao. Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê với T= 4,3 > T0.05 = 2,57.
  39. Phết ướt của âm đạo chuột bình thường (X100) Sơi nấm dày đặc/ phết ướt âm đạo chuột bệnh (X100) Phết ướt âm đạo của chuột khỏi bệnh (X100) Hình 1. Sự biến đổi mật độ sợi nấm C. albicans ở dịch âm đạo chuột
  40. Hình 2. Sợi nấm giả và bào tử bao dầy của Candida albicans trên môi trường Thạch bột ngô Từ kết quả nhận được ở mô hình 4 và mô hình 5, chúng tôi đề nghị mô hình gây nhiễm C. albicans âm đạo chuột để thử tác dụng của các chất kháng nấm in vivo như sau. Ngày Estradiol valerat 0,05 mg/100 ml
  41. Gây nhiễm Cloramphenicol -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3
  42. 4 5 6 7 8 9 Cấy + phết ướt Điều trị với chất kháng nấm
  43. Sơ đồ 7. Mô hình gây nhiễm C. albicans âm đạo chuột để thử tác dụng kháng nấm in vivo KẾT LUẬN Qua dò tìm các điều kiện gây nhiễm nấm C. albicans âm đạo chuột ở 5 mô hình khác nhau, chúng tôi đã đề nghị được mô hình gây bệnh C. albicans thực nghiệm trên chuột nhắt trắng với: - Thời gian sử dụng cloramphenol 1% để gây xáo trộn cân bằng hệ vi sinh âm đạo chuột là 7 ngày trước khi gây nhiễm với C. albicans.
  44. - Tiêm dưới da Estradiol valerat liều 0,05 mg/100 ml, ngày 1 lần, liên tục 8 ngày (3 ngày trước gây nhiễm, 3 ngày khi gây nhiễm và 2 ngày sau gây nhiễm). - Gây nhiễm với 20 µl dịch treo nấm men C. albicans chứa 106 CFU/ml, gây nhiễm liên tục 3 ngày, mỗi ngày 1 lần. - Khảo sát các tiêu chuẩn để đánh giá mức độ bệnh của chuột trước và 1, 5 và 9 ngày sau gây nhiễm. Mô hình này có thể được áp dụng để xác định tác dụng kháng C. albicans của các chất kháng nấm in vivo.