Xác định thành phần loài sán lá thường gặp ở Việt Nam bằng sinh học phân tử

Nội dung text: Xác định thành phần loài sán lá thường gặp ở Việt Nam bằng sinh học phân tử

1. XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN LOÀI SÁN LÁ THƯỜNG GẶP Ở VIỆT NAM BẰNG SINH HỌC PHÂN TỬ TÓM TẮT Sán lá ký sinh ở người thường gặp ở Việt Nam bao gồm sán lá gan nhỏ lưu hành ở ít nhất 24 tỉnh, sán lá gan lớn ít nhất ở 43 tỉnh, sán lá ruột lớn ít nhất 16 tỉnh, sán lá ruột bé ở ít nhất 15 tỉnh, sán lá phổi ở ít nhất 10 tỉnh. Mục tiêu: Sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử để xác định thành phần loài sán lá ký sinh ở người thường gặp ở Việt Nam. Phương pháp: sử dụng hệ gen ty thể (cob, cox, nad1) và/hoặc phần giao gen (ITS-2) và 18S ribosome của hệ gen nhân, so sánh với các chủng đã biết của Việt Nam và trên thế giới. Kết quả: Các mẫu sán lá, sán dây và ấu trùng của chúng được thu thập từ 22 tỉnh ở cả 3 miền trong cả nước đã được giải trình tự v# so sánh với các chuỗi chuẩn. Kết luận: loài sán lá phổi được xác định là Paragonimus heterotremus; loài sán lá gan lớn là Fasciola gigantica (có lai với F. hepatica); loài sán lá gan nhỏ ở
2. miền Bắc là Clonorchis sinensis; loài sán lá gan nhỏ ở miền Nam là Opisthorchis viverrini; loài sán lá ruột lớn trên người là Fasciolopsis buski; loài sán lá ruột nhỏ trên người là Haplorchis taichui và H. pumilio. ABSTRACT Common parasitic trematodes such as small liver fluke was determined in more than 24 provinces; giant liver fluke in more than 43 provinces, giant intestinal fluke in more than 16 provinces, small intestinal flukes in more than 15 provinces, lung fluke in more than 10 provinces in Vietnam. Objectives: Used molecular method for identification of species of human Trematode. Methods: molecular method (PCR technique) using mitochondrial genetic markers as cob, cox1, nad1, nuclear markers as ITS-2 and ribosomal 18S rRNA. Results: Adult worms and larvae were collected from 22 provinces in Vietnam were taxonomically identified by the sequence obtained for the above species were compared with those of the known species from different geographical origins in the world. Conclusions: The Vietnamese isolates were identified as Paragonimus heterotremus; Fasciola gigantica (pure and hybrid with F. hepatica); Clonorchis
3. sinensis in the North, Opisthorchis viverrini in the South; Fasciolopsis buski; Haplorchis pumilio; H. taichui. ĐẶT VẤN ĐỀ Theo thông báo của Tổ chức Y tế thế giới, có trên 40 triệu người nhiễm sán lá truyền qua thức ăn phân bố ở nhiều nước, đặc biệt ở các nước nhiệt đới(11). Trong 10 năm gần đây và hiện nay, phương pháp sinh học phân tử dựa vào kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) sử dụng chỉ thị di truyền hệ gen nhân và hệ gen ty thể đang được ứng dụng rộng rãi và có độ tin cậy cao, đặc biệt được coi là rất có hiệu quả trong giám định và phân loại ký sinh trùng(11). Tại Việt Nam, bệnh sán lá phổ biến hầu khắp trong cả nước như sán lá gan nhỏ (Clonorchis và Opisthorchis) lưu hành ở ít nhất 24 tỉnh với tỷ lệ nhiễm, có nơi 37-40% (Nam Định, Hà Tây, Thanh Hoá, Phú Yên)(16); sán lá gan lớn (Fasciola) lưu hành ở ít nhất 43 tỉnh(14,16), có nơi tỷ lệ nhiễm 11,1% (Khánh Hoà)(10); sán lá phổi (Paragonimus) lưu hành ở ít nhất 9 tỉnh, có nơi tỷ lệ nhiễm 15% (Sơn La)(12,15). Từ trước đến nay, việc xác định thành phần loài giun sán ở Việt Nam thường dựa vào đặc điểm hình thái học. Vấn đề định loại bằng hình thái học đã đóng góp to lớn vào việc xác định thành phần loài ký sinh trùng, song vẫn còn
4. những hạn chế nhất định và chính phân loại bằng sinh học phân tử sẽ khắc phục được những khiếm khuyết đo(5,6). Do vậy, việc nghiên cứu sinh học phân tử đối với các loài giun sán nói riêng và ký sinh trùng nói chung là hết sức cần thiết ở nước ta hiện nay. Mục tiêu nghiên cứu đề tài này là: Sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử (kỹ thuật PCR và phân tích chuỗi gen) để xác định thành phần loài của một số loài sán lá ký sinh ở người thường gặp ở Việt Nam. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Thu thập mẫu Thu thập mẫu trên người Sán lá gan, sán lá ruột từ bệnh nhân bằng đãi phân khi điều trị; mẫu sán lá phổi từ đờm bệnh nhân khi điều trị. Các mẫu được thu thập từ các địa phương như sau: Sán lá gan nhỏ tại: Nam Định, Ninh Bình, Hà Tây, Thanh Hoá, Hà Nam, Hoà Bình, Quảng Ninh, Nghệ An, Thừa Thiên- Huế, Quảng Nam, Phú Yên, Bình Định và Đắc Lắc; sán lá phổi tại: Lai Châu, Sơn La, Lào Cai, Hoà Bình, Yên Bái; sán lá ruột lớn tại: Nam Định, Ninh Bình, Nghệ An, Thừa Thiên- Huế, Cần Thơ và An Giang; sán lá ruột nhỏ tại Yên Bái, Quảng Ninh, Nam Định, Ninh Bình, Thừa Thiên Huế, Lâm Đồng.
5. Thu mẫu từ vật chủ trung gian ấu trùng sán lá gan từ cá tại Hà Nội, Nam Định; ấu trùng sán lá ruột nhỏ tại Nam Định, Ninh Bình; ấu trùng sán lá phổi thu thập từ cua tại Hoà Bình, Sơn La, Lai Châu, Lào Cai, Yên Bái theo phương pháp tiêu cơ bằng pepsin acid. Bảo quản mẫu - Mẫu sán được rửa sạch bằng nước muối sinh lý. - Mẫu được cố định trong cồn 70% và bảo quản lạnh – 20°C, cho đến khi sử dụng. Các bước tiến hành kỹ thuật Tách chiết ADN từ mẫu nghiên cứu: ADN tổng số được tách chiết bằng bộ hoá chất Genomic-Tip Kit hoặc DNeasy hoặc QIAamp DNA kit (QIAGEN Inc.) theo qui trình của nhà sản xuất. Mô tả rút gọn như sau: mẫu vật bảo quản trong cồn 70% được lấy ra và cho cồn bay hơi hết trong ly tâm chân không, sau đó rửa nhiều lần trong PBS. Mẫu vật được nghiền kỹ và xử lý với các dung môi của Kit, rồi hấp phụ lên màng và ly chiết ADN theo qui trình tách chiết. Chọn mồi cho phản ứng PCR
6. Gen cox1 (cytochrome oxidase 1) hoặc gen cob (cytochrome oxidase b) hoặc nad1 (nicotinamide dehydrogenase subunit 1) là gen ty thể, vùng giao gen ITS-2 (internal transcribed spacer 2) của hệ gen nhân hay gen 18S ribosome được chọn làm đích nghiên cứu. Quy trình phản ứng PCR ADN đích đã được nhân bản bằng PCR tiêu chuẩn với bộ hoá chất PCR Master Mix Kit (Promega). Chu trình nhiệt của PCR trên máy Perkin-Elmer (Perkin-Elmer Inc., Mỹ) gồm các bước như sau: 940C/5 phút trong 1 chu kỳ; tiếp theo là 35 chu kỳ ở 940C/1 phút, 500C/1 phút và 720C/1 phút; chu kỳ cuối kéo dài 10 phút ở 720C. Sản phẩm PCR được tinh chế bằng bộ hoá chất QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN Inc.) và được dòng hoá vào vector có tên gọi là pCR2.1 hoặc pCR2.1TOPO của bộ hoá chất TA-cloning Kit (Invitrogen Inc.). Vector pCR2.1 tiếp nhận sản phẩm PCR được chuyển nạp vào dòng tế bào IVNaF’ và chọn lọc khuẩn lạc theo phương pháp kháng sinh và chỉ thị màu (Sambrook và Russell, 2001). ADN của plasmid có chứa sản phẩm PCR cần nghiên cứu được tách chiết với bộ hoá chất QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN Inc.)(5,7,8). Trình tự nucleotid của ADN trong plasmid chứa sản phẩm PCR tái tổ hợp được giải trình trên máy tự động ABI 3100 Avant Genetic Analyzer của hãng Perkin-Elmer (Mỹ). Chuỗi nucleotid được xử lý bằng chương trình SeqEd1.3; sau đó so sánh sử dụng chương trình AsemblyLIGN1.9 và MacVector8.2 (Accelrys
7. Inc.). Trong phân tích phả hệ, tất cả các chuỗi của các chủng chọn lọc trong đó có các chủng của Việt Nam được sắp xếp theo chương trình GENEDOC2.5, sau đó được đưa vào phân tích phả hệ bằng chương trình MEGA3.1 về thành phần nucleotid và acid amin, sử dụng hệ số tiến hoá thấp ME (minimum evolution index) (Kuma và cs, 2004). Phương pháp xử lý nucleotid/ chuỗi acid amin và ứng dụng tin-sinh học xử lý kết quả Giải trình nucleotid trực tiếp hoặc sau khi dòng hoá, từ ADN của plasmid tái tổ hợp, được thực hiện bằng máy giải trình tự động, xử lý bằng các phần mềm được cung cấp chuyên biệt. Giám định chuỗi ADN (gen chẩn đoánểttước hết bằng truy cập Ngân hàng gen (GenBank) bằng chương trình BLAST ( (Altschul và cs, 1997). Sự đồng nhất giữa 2 hay nhiều chuỗi được thu nhận qua so sánh đa chuỗi (multiple alignment) bằng chương trình ClustalW bố trí sẵn trong hệ chương trình MacVector8.2 Tra cứu so sánh sử dụng các phần mềm có trong các Trung tâm tin-sinh học quốc tế (NCBI = National Centre for Biotechnology Information/USA ( hay sử dụng một số chương trình đặc biệt có ở ExPASy ( Sự sai khác về nucleotid và acid amin dưới 5% thông thường được đánh giá là biến đổi nội loài (intraspecific variation) và 5% trở lên là biến đổi ngoại loài (Interspecific variation) (Blair và Agatsuma, 1993).
8. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Kết quả xác định loài sán lá gan nhỏ Clonorchis sinensis Bảng 1: So sánh nucleotid tại 10 điểm có sự sai khác trong chuỗi gen cox1 của Clonorchis spp Việt Nam với C. sinensis chủng Trung Quốc (CsCN) Ký hiệu Chủng gốc Các vị trí trong chuỗi gen cox1 trong giải trình tự Nước Địa phương 9
9. 10 22 69 219 318 436 439 440
10. 441 Cs(CN) T. Quốc Quảng Tây C C T C
11. T C G C T T Cs(Kor) H.Quốc
12. Nam Hàn C C T C T C
13. G C T T CsNgNB Việtnam Ninh Bình C
14. C T T T C G C T
15. A CsNgTH Vietnam Thanh Hoá C C T T
16. T C G C T A CsNgNB2 Việtnam
17. Ninh Bình C C T T T C
18. G C T A CsNgTH2 Vietnam Thanh Hoá C
19. C T T T C G C T
20. A CsNgND Vietnam Nam Định C C T T
21. T C G C T A CsNgBG Vietnam
22. Bắc Giang C C T T T C
23. G C T A CsNgHB Vietnam Hoà Bình C
24. C T T T C G C T
25. A CsNgHT Vietnam Hà Tây C C T T
26. T C G C T A CsNgHNa Việtnam
27. Hà Nam C C T T T C
28. G C T A CsNgQN Vietnam Quảng Ninh C
29. C T T T C G C T
30. A CsNgNA Vietnam Nghệ An C C T T
31. A C G C G A CsNgDN Vietnam
32. Đồng Nai C C T T T T
33. G C T A CsMeND Vietnam Nam Định T
34. C G T T C G T T
35. A CsMeHNo Vietnam Hà Nội C T G T
36. T C T C T A Ghi chú: CsNgNB= mẫu Clonorchis ở Ninh Bình; CsNgND= mẫu Clonorchis ở Nam Định; CsNgTH= mẫu Clonorchis ở Thanh Hoá; CsNgBG= mẫu Clonorchis ở Bắc Giang; CsNgHB= mẫu Clonorchis ở Hoà Bình; CsNgHT= mẫu Clonorchis ở Hà Tây; CsNgHNa= mẫu Clonorchis ở Hà Nam; CsNgQN= mẫu
37. Clonorchis ở Quảng Ninh; CsNgNA= mẫu Clonorchis ở Nghệ An; CsNgDN= Đồng Nai; CsMeND= mẫu ấu trùng Clonorchis ở Nam Định; CsMeHNo= mẫu ấu trùng Clonorchis ở Hà Nội. Nhận xét: Trình tự nucleotid của các mẫu Clonorchis spp thu thập từ người ở Ninh Bình, Nam Định, Thanh Hoá, Bắc Giang, Hoà Bình, Hà Tây, Hà Nam, Quảng Ninh đều giống nhau (tương đồng 100%), chúng đều sai khác với C. sinensis Trung Quốc và Hàn Quốc ở vị trí thứ 69 và 441 (mức độ tương đồng 99,6%). Trong khi đó chủng Clonorchis sp Đồng Nai có mức độ sai khác với chủng C. sinensis Trung Quốc và Hàn Quốc 3 nucleotid (mức độ tương đồng 99,3%); chủng Clonorchis sp Nghệ An có mức độ sai khác với chủng C. sinensis Trung Quốc và Hàn Quốc 4 nucleotid (mức độ tương đồng 99,1%). Trình tự về acid amin của tất cả các chủng C. sinensis Việt Nam hoàn toàn giống với C. sinensis Trung Quốc và Hàn Quốc (mức độ tương đồng 100%). Trình tự nucleotid của ấu trùng sán lá gan (metacercaria) từ cá Nam Định và Hà Nội giống nhau và so với C. sinensis của Trung Quốc, Hàn Quốc có sai khác 5 nucleotid (mức độ tương đồng nucleotid là 98,9%) và tương đồng acid amin 100%. Như vậy các mẫu Clonorchis sp thu thập từ người và metacercaria thu thập từ cá trong nghiên cứu này là C. sinensis thuộc họ Opisthorchiidae. Kết quả xác định loài sán lá gan nhỏ Opisthorchis viverrini
38. Các mẫu sán lá gan nhỏ trưởng thành thu thập từ người tại các địa phương được xác định bằng sinh học phân tử sử dụng chuỗi gen cox1 hệ gen ty thể. Trình tự nucleotid được so sánh với các chuỗi đã biết trước của Thái Lan (chủng Khon Kaen). Bảng 2: Danh mục các mẫu sán lá gan trưởng thành thu nhận trên người tại Việt Nam sử dụng giám định phân tử trong nghiên cứu Loài (hình thái) Ký hiệu mẫu Nguồn gốc Trạng thái mẫu Từ vật chủ Opisthorchis spp
39. OvNgPY Phú Yên Sán trưởng thành Người Opisthorchis spp OvNgBD Bình Định Sán trưởng thành
40. Người Opisthorchis spp OvNgQN Quảng Nam Sán trưởng thành Người Opisthorchis spp OvNgH
41. Thừa Thiên-Huế Sán trưởng thành Người Opisthorchis spp OvNgDL Đắc Lắc Sán trưởng thành Người
42. Trình tự nucleotid đoạn gen cox1 với 326 nucleotid của Opisthorchis spp Việt Nam hoàn toàn giống với trình tự của đoạn gen này thu nhận từ loài O. viverrini chủng Khon Kaen của Thái Lan (mức độ tương đồng 100%). Điều này khẳng định mẫu sán lá gan nhỏ thu thập từ bệnh nhân ở Phú Yên, Bình Định, Quảng Nam, Thừa Thiên-Huế và Đắc Lắc là loài Opisthorchis viverrini thuộc họ Opisthorchidae. Kết quả xác định loài sán lá gan lớn Fasciola Các mẫu sán lá gan lớn trưởng thành thu thập từ bệnh nhân ở Hà Tây (FspNgHT), Nghệ An (FspNgNA), Bình Định (FgNgBD) và TP. Hồ Chí Minh (FspNgHCM) và trên súc vật tại Hoà Bình (FVN1HB), Lai Châu (FVN2LC), Lạng Sơn (FVN3LS); miracidium nở từ trứng trong phân bệnh nhân ở Nghệ An (FspMirNA), ở TP. Hồ Chí Minh (FspMirHCM) được xác định loài sử dụng gen nad1 và ITS2 so sánh với Fasciola gigantica chủng Nhật Bản (FgJp), Hàn Quốc (FgKor), Indonesia (FgIndo). Đồng thời so sánh với F. hepatica chủng Australia (FhAUS) và Mỹ (FhUS). Bảng 3: So sánh nucleotid tại 9 điểm có sự sai khác trong chuỗi gen nad1 của Fasciola spp nghiên cứu với Fasciola gigantica chủng Nhật Bản và Hàn Quốc Ký hiệu
43. Nguồn gốc Các vị trí trong chuỗi gen nad1 của giải trình tự 86 90 212 213 312 332
44. 334 359 387 (FgJp) Nhật Bản A G T
45. C G T G G C (FgKor) Hàn Quốc
46. A G T C G T G G
47. C (FgIndo) Indonesia A A C C A
48. T G G T (FgNgBD) Bình Định A G
49. T C G G T G C (FVN1HB)
50. Hoà Bình A G T C G G
51. T G C (FVN2LC) Lai Châu A G T
52. C G G T G C (FVN3LS) Lạng Sơn
53. G A T T A G T T
54. T FspNgHT Hà Tây A G T C G
55. G T G C FspMirNA Nghệ An A G
56. T C G G T G C FspNgHCM
57. TP Hô Chí Minh A G T C G G
58. T G C FspMirHCM TP Hô Chí Minh A G T
59. C G G T G C Nhận xét: So sánh đối chiếu thành phần nucleotid đoạn gen nad1 của các mẫu nghiên cứu so với mẫu F. gigantica của Nhật Bản cho thấy mức độ tương đồng cao (99,5%), chỉ sai khác 2 nucleotid kể cả mẫu cho nở miracidium từ trứng trong phân bệnh nhân. Trong đó mẫu Fasciola từ động vật ở Lạng Sơn có 8 sai khác nucleotid, đạt mức độ tương đồng 98%. Trình tự acid amin ở vị trí thứ 110 và
60. 111 trong chuỗi nad1 Fasciola gigantica Nhật Bản là FG thì trong chuỗi tương ứng chủng Việt Nam là LV hoàn toàn giống với F. hepatica, đây là điểm đặc biệt của sán lá gan lớn Việt Nam. Kết quả xác định loài sán lá phổi Paragonimus Các mẫu sán lá phổi ở Việt Nam bao gồm: sán trưởng thành thu thập từ chó nhiễm tự nhiên tại Lai Châu (PhetLChdog1,2,3), Sơn La(PhetSLdog), Hoà Bình (PspHBdog); mèo gây nhiễm thực nghiệm bằng metacercara lấy từ cua đá tại Sơn La (PspSLcat), Lào Cai (PspLCacat), Hoà Bình (PspHBcat) và Yên Bái (PspYBcat); mẫu sán trưởng thành thu thập trên người tại Hoà Bình (PspHBHuma); miracidium nở từ trứng trong đờm bệnh nhân ở Yên Bái (PspYB Mira); metacercaria thu thập trên cua đá Potamicus sp. tại Sơn La (PspSLcrab), Hoà Bình (PspHBcrab), Lào Cai (PspLCacrab), Yên Bái (PspYBcrab) đều được áp dụng phương pháp sinh học phân tử hệ gen ty thể để phân tích đoạn gen cytochrome oxidase 1 (cox1) gồm 390 cặp nucleotid so sánh với P. heterotremus của Thái Lan (PhetTL), Trung Quốc (PhetCN). Bảng 4: So sánh nucleotid tại 13 điểm có sự sai khác trong chuỗi gen cox1 của mẫu nghiên cứu với Paragonimus heterotremus Trung Quốc và Thái Lan Ký hiệu
61. Nguồn gốc Các vị trí trong chuỗi gen cox1 của giải trình tự Nước/Địa phương 69 78 93 138 162
62. 198 201 210 291 348 364 366 381
63. PhetCN1 T. Quốc/Quảng Tây T T C T T G
64. T C C T C G G PhetCN2
65. T. Quốc/Quảng Tây C T C T C G
66. T C T T C G A PhetTL
67. Thailand/ Saraburi C T C T C G T
68. C T T C G A PhetLChdog1 Vietnam/Lai Chau
69. T T T C C G T
70. C T T C G G PhetLChdog2 Vietnam/Lai Chau
71. T T C C C G C C
72. T T C A G PhetLChdog3 Vietnam/Lai Chau T
73. T C C C G C C
74. T T C A G PhetSLdog Vietnam/Son La T
75. T T C T G T T T
76. T T G G PspSLcat Vietnam/Son La T T
77. T C T G T C T
78. T C G G PspLCacat Vietnam/Lao Cai T T
79. C C T G C C T T
80. C A G PspHBdog Vietnam/Hoa Binh T T C
81. T T G T C C C
82. C G G PspHBcat Vietnam/Hoa Binh T T C
83. T T G T C C C C
84. G G PspHBHuma Vietnam/Hoa Binh T T T C
85. T G T C T T C
86. G G PspYBMira Vietnam/Yen Bai T T C T
87. T G T C C C C G
88. G PspYBCat Vietnam/Yen Bai T T C T T
89. G T C C C C G
90. G PspSLcrab Vietnam/Son La T T C C T
91. G C C T T C A G
92. PspHBcrab Vietnam/Hoa Binh T T T C T G
93. T C T T C G G PspLCacrab
94. Vietnam/Lao Cai T T C C T G
95. C C T T C A G PspYBcrab
96. Vietnam/Yen Bai T T C T T A T
97. C C T C G G PspHTcrab Vietnam/Hà Tĩnh
98. T T C T T A T
99. C C T C G G Nhận xét: Mức độ tương đồng nucleotid của Paragonimus spp ở Việt Nam so với P. heterotremus của Trung Quốc, Thái Lan đạt 99,0-99,7%, trong khi đó chủng PhetCN2 và chủng PhetTL tương đồng với chủng PhetCN1 là 99,0%. Mức độ tương đồng acid amin đạt 100% trong tất cả các mẫu so với loài P. heterotremus của Trung Quốc PhetCN1. Như vậy, loài sán lá phổi trưởng thành
100. trên người, chó, mèo và ấu trùng của nó trên cua ở Việt Nam là Paragonimus heterotremus Chen et Hsia, 1964. Kết quả xác định loài sán lá ruột lớn Fasciolopsis Các mẫu sán lá ruột trưởng thành được thu thập ở người tại Nam Định, Ninh Bình, Thanh Hoá, Nghệ An (miền Bắc), Thừa Thiên-Huế (miền Trung) và Cần Thơ, An Giang (miền Nam) và với mẫu sán lá ruột trưởng thành thu thập từ lợn tại Hà Nội đã được xác định bằng sinh học phân tử với toàn bộ gen 18S ribosome (18S rARN) và vùng phụ cận bao gồm 1950 cặp nucleotid được thu nhận bằng phản ứng PCR và giải trình trình tự để so sánh đối chiếu với dữ liệu hiện có trong Ngân hàng gen (GenBank). Bảng 5: Danh mục các mẫu sán lá ruột nghiên cứu thu thập trên người Loài (hình thái) Ký hiệu mẫu Nguồn gốc
101. Trang thái mẫu Từ vật chủ Fasciolopsis sp FspNDHuma Nam Định Sán trưởng thành Người Fasciolopsis sp FspNBHuma
102. Ninh Bình Sán trưởng thành Người Fasciolopsis sp FspTHHuma Thanh Hoá Sán trưởng thành Người
103. Fasciolopsis sp FspNAHuma Nghệ An Sán trưởng thành Người Fasciolopsis sp FspHHuma Thừa Thiên-Huế
104. Sán trưởng thành Người Fasciolopsis sp FspCTHuma Cần Thơ Sán trưởng thành Người Fasciolopsis sp FspAGHuma
105. An Giang Sán trưởng thành Người Fasciolopsis sp FspHNPig Hà Nội Sán trưởng thành Lợn
106. Nhận xét: Qua so sánh đối chiếu, sán lá ruột phân lập trên người và lợn ở Việt Nam trong nghiên cứu này đã có hệ số tương đồng về thành phần nucleotid gần như tuyệt đối (1948/1950 nucleotid = 99,99%) của gen 18S rARN Fasciolopsis buski trong Ngân hàng gen (số hiệu: L06668). Như vậy, với 1950 nucleotid thuộc chuỗi gen 18S ribosome của các mẫu sán lá ruột thu thập trên người Việt Nam so sánh với chuỗi lưu trữ trong Ngân hàng gen cho phép xác định sán lá ruột lớn gây bệnh ở người Việt Nam là Fasciolopsis buski và đã được nhập Ngân hàng gen số AY311386, AY618841, AY618842 và AY618843. Kết quả xác định loài sán lá ruột nhỏ Haplorchis Mẫu sán lá ruột nhỏ trưởng thành và metacercaria thu thập trên người tại Yên Bái, Quảng Ninh, Nam Định, Ninh Bình, Thừa Thiên Huế, Lâm Đồng đã được xác định loài bằng sinh học phân tử sử dụng chỉ thị di truyền ITS-2 và 18S ribosome, so sánh với mẫu Thái Lan (nhận từ Jitra Waikagul, Đại học Mahidol). Kết quả Haplorchis pumilio Việt Nam có mức độ tương đồng 99-100% nucleotid với H. pumilio Thái Lan và 94-99% với một số chuỗi có trong Ngân hàng gen. Cũng tương tự, trong số bệnh phẩm thu được ở các địa phương tren, chúng tôi xác định có Haplorchis taichui có tỷ lệ tương đồng 98-99% với H. taichui (Thái Lan). Như vậy, trong quần thể heterophid ký sinh ở ruột người và cá ở Việt Nam đã có 2 loài là H. pumilio và H. taichui đã được xác định bằng sinh học phân tử. Độ dài gen ITS-2 của H. taichui lớn hơn gen ITS-2 của H. pumilio là 154 nucleotid, như nhận xét khi phân tích gen này của Kim Văn Vạn và cs (2007).
107. BÀN LUẬN Sán lá gan nhỏ Thành phần loài sán lá gan nhỏ ở Việt Nam nhiều thập kỷ trước đây đã có thông báo về hình thái tồn tại Clonorchis sinensis và Opisthorchis felineus ở miền Bắc nhưng cho đến nay, chúng tôi chỉ mới xác định ở miền Bắc tồn tại C. sinensis và miền Nam tồn tại loài O. viverrini (trong bài này, từ vĩ tuyến 17 trở ra là miền Bắc, từ vĩ tuyến 17 trở vào là miền Nam). Lần đầu tiên áp dụng phương pháp phân tử để thẩm định thành phần loài sán lá gan nhỏ ở Việt Nam năm 2002(2). Các mẫu sán lá gan nhỏ đã được thu thập từ bệnh nhân thông qua điều trị đặc hiệu và đãi phân khi điều trị (trừ 3 bệnh nhân ở Bắc Giang, Hà Nam và Đồng Nai được thu mẫu sán khi phẫu thuật gan-mật). Qua kết quả nghiên cứu này cho nhận xét bước đầu có tính khẳng định là các tỉnh miền Bắc có sự phân bố của C. sinensis và các tỉnh miền Nam có sự phân bố của O. viverrini(7). Cần tiếp tục nghiên cứu xác định sự có mặt của loài nào trong 3 tỉnh còn lại là Hà Tĩnh, Quảng Bình và Quảng Trị. Một điều đặt ra ở đây là có sự giao lưu và biến động dân cư của 2 miền Bắc Nam, bệnh nhân có thể mang mầm bệnh từ miền Bắc vào miền Nam và ngược lại. Trong lúc đó vật chủ trung gian truyền bệnh sán lá gan nhỏ sẵn có ở cả 2 miền và đến một lúc nào đó 2 loài sán lá gan nhỏ ở nước ta sẽ phân bố xen kẽ nhau, pha lẫn với nhau. Chẳng hạn mẫu sán lá gan nhỏ từ bệnh nhân ở Đồng Nai trong nghiên cứu này chính là người Nam Định di cư vào, rất có thể nhiễm sán từ Nam Định. Nghiên cứu sinh học phân tử cần tiếp tục để giải mã gen của chúng để xác định có
108. sự lai chéo (natural hybridization) như ở sán lá gan lớn (Fasciola spp) hay không? Hơn nữa cần giải mã gen ty thể với độ dài cần thiết để xem xét sự biến đổi gen theo vùng địa lý. Sán lá gan lớn Sán lá gan lớn Việt Nam tuy đã được xác định là Fasciola gigantica cả về hình thể cũng như sinh học phân tử nhưng trong thành phần nucleotid và acid amin đã chứng tỏ có sự hợp lai với F. hepatica và chính các cấu trúc gen giống nhau này mà rất có thể sán lá gan lớn Việt Nam sẽ được xếp thành loài riêng nằm giữa 2 loài F.gigantica và F.hepatica như đối với sán lá gan lớn ở Nhật Bản. Đối với sán lá gan lớn (Fasiola spp) đã có sự lai tự nhiên giữa F. hepatica và F. gigantica (Agatsuma và cs, 2000; Huang và cs, 2004; Itagaki và cs, 2005), và trong quần thể Fasiola spp của Việt Nam (Lê Thanh Hoà và cs, 2007). Sán lá gan lớn ở Việt Nam chủ yếu ký sinh ở trâu bò với tỷ lệ nhiễm cao và chúng ký sinh trong ống mật, đẻ trứng theo phân ra ngoài. Điều đáng quan tâm là loài sán lá gan lớn ở súc vật và người Việt Nam là cùng một loài và khi chúng ký sinh ở người thường đẻ trứng ít, thậm chí không đẻ và còn di chuyển ra khỏi hệ thống gan mật. Có thể chúng sẽ thích nghi dần với vật chủ là người và sự thích nghi này có biến đổi gì về gen hay không?, dấu hiệu thay đổi gen khi giải trình tự nucleotid và acid amin đoạn nad1 cho thấy có điểm giống với F. hepatica đã phần nào chứng tỏ điều này(13), chúng ta cần nghiên cứu tiếp. Vấn đề thu mẫu sán lá gan lớn trưởng thành từ người khó khăn hơn nhiều so với mẫu sán lá gan nhỏ, vì vậy cái mới trong
109. nghiên cứu của chúng tôi là thu thập trứng sán lá gan lớn trong phân bệnh nhân cho nở thành miracidium để sử dụng làm mẫu nghiên cứu vì phương pháp phân tử không phụ thuộc giai đoạn phát triển của ký sinh trùng(9). Sán lá phổi Chính thành phần loài sán lá phổi ở Vệt Nam là vấn đề lớn vì theo y văn trước 1995 thì loài sán lá phổi Việt nam là Paragonimus ringeri (Paragonimus westermani). Sau khi Kino và cs (1995) xác định loài sán lá phổi Việt Nam là P. heterotremus thì hàng loạt nghiên cứu hình thái và sinh học phân tử đã khẳng định sự tồn tại của P. heterotremus ở Việt Nam. Trong đó các mẫu sán lá phổi ở hầu hết vùng lưu hành bệnh ở trên các vật chủ khác nhau như người, súc vật và vật chủ trung gian đều được xác định là P. heterotremus(4,8). Nhưng một vài nghiên cứu về hình thái học cho rằng Việt Nam còn tồn tại P. westermani và P.ohirai. Chính vì vậy, hơn bao giờ hết các nhà nghiên cứu cả hình thái học và đặc biệt là sinh học phân tử cần nghiên cứu một cách hệ thống để có được thành phần loài và phả hệ đầy đủ của sán lá phổi Việt Nam. Sán lá ruột lớn Thông qua phân tích gen 18S ribosome của sán lá ruột lớn Fascilopsis buski ở trên lợn và trên người Việt Nam có sự đồng nhất gần như tuyệt đối với F. buski có trong Ngân hàng gen(3). Kết hợp với sự ký sinh và đẻ trứng trên người cho phép nhận xét loài sán lá ruột trên người chính là F. buski có từ lợn mới bắt đầu
110. thích ứng trên người hay nói cách khác lợn và người đều là vật chủ thích hợp. Trong vấn đề chẩn đoán xác định, khi sử dụng phương pháp xét nghiệm phân tìm trứng sán lá ruột lớn do trứng sán lá gan lớn và trứng sán lá ruột lớn khá giống nhau về hình thể, nhất là trong tiêu bản Kato và Kato-Katz, do đó đôi khi cần sử dụng phương pháp phân tử để khẳng định. Sán lá ruột nhỏ Tại Việt Nam, đã phát hiện ra nhiều tỉnh có lưu hành sán lá ruột nhỏ truyền qua cá sang người thuộc họ Heterophyidae và Echinostomatidae bao gồm Haplorchis pumilio, H. taichui, H. yokogawai, Stellantchasmus falcatus, Procerovum varium, Echinostoma spp (Nguyễn Văn Đề và cs, 2006)(14), nhưng bước đầu đã thẩm định loài bằng sinh học phân tử H. pumilio và H. taichui. Cần tiếp tục sử dụng phương pháp phân tử để thẩm định các loài khác. Theo nhận xét của Lê Thanh Hoà (trao đổi riêng), giữa pumilio và H. taichui có những biểu hiện phân tích phâ tử cho thấy có lai tự nhiên như ở Fasciola spp. Như vậy, một số loài thuộc lớp Trematoda có khả năng lai chéo loài trong tự nhiên, một đặc tính đặc sắc của quá trình tiến hoá. KẾT LUẬN Bằng sinh học phân tử, các mẫu sán đã được xác định loài như sau:
111. - Sán lá gan nhỏ trên người ở Nam Định, Ninh Bình, Thanh Hoá, Bắc Giang, Hoà Bình, Hà Tây, Hà Nam, Quảng Ninh, Nghệ An, Đồng Nai và ấu trùng của nó trên cá ở Nam Định, Hà Nội được xác định là Clonorchis sinensis. Sán lá gan nhỏ trên người ở Phú Yên, Bình Định, Quảng Nam, Thừa Thiên-Huế, Đắc Lắc được xác định là Opisthorchis viverrini. - Sán lá gan lớn trên người ở Hà Tây, Nghệ An, Bình Định và TP. Hồ Chí Minh là Fasciola gigantica có phần hợp lai với Fasciola hepatica. - Sán lá phổi từ chó, mèo, người và ấu trùng sán lá phổi từ cua đá ở Lai Châu, Sơn La, Hoà Bình, Lào Cai, Yên Bái được xác định là Paragonimus heterotremus. - Sán lá ruột lớn trên người ở Ninh Bình, Thanh Hoá, Thừa Thiên Huế, Cần Thơ và An Giang là Fasciolopsis buski. - Sán lá ruột nhỏ ở Yên Bái, Quảng Ninh, Nam Định, Ninh Bình, Thừa Thiên Huế, Lâm Đồng được xác định bằng sinh học phân tử là Haplorchis taichui và H. pumilio.