Ứng dụng vi khuẩn Corynebacterium sp. cố định trong lên men thu nhận lysine

Nội dung text: Ứng dụng vi khuẩn Corynebacterium sp. cố định trong lên men thu nhận lysine

1. TẠP CHÍ KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ CÁC TRƢỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT . SỐ 70 - 2009 ỨNG DỤNG VI KHUẨN CORYNEBACTERIUM SP. CỐ ĐỊNH TRONG LÊN MEN THU NHẬN LYSINE IMMOBILIZING CORYNEBACTERIUM SP. CELL AND APPLICATION FOR PRODUCING LYSINE Nguyễn Thuý Hương, Trần Thị Minh Tâm Trường Đại học Bách khoa - ĐHQG Tp. Hồ Chí Minh TÓM TẮT Bài báo nghiên cứu việc ứng dụng các chế phẩm tế bào vi khuẩn Corynebacterium sp. cố định trên một số chất mang alginate, Bacterial Cellulose (BC) và phức Bacterial Cellulose- Alginate (BC-A) để ứng dụng lên men thu nhận lysine. Kết quả thu được như sau: - Chất mang BC có nhiều ưu thế hơn các chất mang truyền thống alginate trong kỹ thuật cố định tế bào vi khuẩn Corynebacterium sp. - BC hoàn toàn phù hợp các yêu cầu của chất mang trong kỹ thuật cố định tế bào vi khuẩn. - Phức chất mang Bacterial Cellulose- Alginate (BC-A) phát huy được những ưu thế của chất mang Bacterial Cellulose và Alginate. - Hiệu quả sử dụng chế phẩm Corynebacterium sp. cố định trên phức chất mang BC-A trong lên men thu nhận lysine khá cao: có thể tái sử dụng chế phẩm 12 lần vẫn đảm bảo về mặt thời gian lên men và sản lượng lysine so với đối chứng. ABSTRACT In this paper, we investigate the immobilization of Corynebacterium sp. in some carriers (alginate, bacterial cellulose -BC and bacterial cellulose- alginate BC-A) and apply in producing lysine. The results are given as follows: - The bacterial cellulose (BC) showed many advantages compared with traditional carrier (alginate) in immobilization Corynebacterium sp. - BC entirely satisfied the conditions required for immobilization Corynebacterium sp. - The effect of using Corynebacterium sp., immobilized in BC-A, for producing lysine was high: it could be reused about 12 times, the quantity of lysine remained rather good against control experiments. ăn nên người Việt Nam rất dễ bị thiếu hụt I. MỞ ĐẦU lysine [1,3]. L-lysine là một trong 9 acid amin thiết Kỹ thuật cố định tế bào đang được đề cập yếu và là acid amin không thay thế. Cơ thể và quan tâm nhiều, đặc biệt trong các lĩnh vực người và động vật không tự tổng hợp lysine. lên men sản xuất các sản phẩm trao đổi chất. Tế Hai lãnh vực lớn ứng dụng lysine là thực phẩm bào cố định có nhiều ưu điểm so với việc sử và dược phẩm. dụng tế bào tự do như: tế bào sau khi được cố Lysine được thu nhận từ dịch thủy phân định có thể sử dụng được nhiều lần, không lẫn protein động vật, thực vật và phương pháp lên vào sản phẩm và có thể chủ động ngừng phản men vi sinh vật, trong đó ưu thế thuộc về ứng theo ý muốn [4,5]. phương pháp lên men. Do nhu cầu lớn về Trong giới hạn bài báo này, nhằm nâng lysine, việc sản xuất lysine ở các quốc gia Mỹ, cao hiệu quả quá trình lên men thu nhận lysine, Nhật, Nga, đã tiến hành quy mô công nghiệp. chúng tôi nghiên cứu việc ứng dụng các chế Ở Việt Nam, lysine phải nhập khẩu hoàn toàn phẩm tế bào vi khuẩn Corynebacterium sp. cố và chưa có một cơ sở nào sản xuất lysine ở quy định trên một số chất mang để lên men thu nhận mô lớn. Hơn nữa, do bất hợp lý thành phần thức lysine. 96
2. TẠP CHÍ KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ CÁC TRƢỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT . SỐ 70 - 2009 II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP - Mật độ vi khuẩn mặt ngoài chất mang là: 4,9x104 tế bào/cm2. 2.1 Vật liệu - Mật độ vi khuẩn bên trong chất mang là: - Chủng vi khuẩn: Corynebacterium sp. có 4,3x104 tế bào/cm2 [6,7]. nguồn gốc từ bộ sưu tập giống trường đại học Bách khoa TP.HCM. Cố định trên phức chất mang BC-A: - Các chất mang: Na-alginate (Kanta, Nhật Trên phức chất mang BC-A, chúng tôi Bản), Cellulose vi khuẩn (Bacterial Cellulose- kết hợp cả 2 phương pháp nhốt và bẫy hấp phụ BC) [6]. tế bào Corynebacterium sp 2.2 Các phƣơng pháp cố định tế bào Ưu thế của phương pháp nhốt trong gel alginate là tế bào bị nhốt sẽ không khuếch tán ra Cố định trên chất mang alginate: Tế bào môi trường xung quanh, nhưng vẫn cho cơ chất Corynebacterium sp. được cố định trên chất có phân tử lượng nhỏ vào và các sản phẩm trao mang alginate bằng phương pháp nhốt: điều đổi chất của tế bào ra khỏi mạng lưới gel. kiện cố định là nồng độ alginate 3%, nồng độ CaCl2 2% và nồng độ tế bào vi khuẩn đưa vào Ưu thế của phương pháp bẫy hấp phụ cố định là 1010 tế bào/ml. [4,5,6]. Hạt alginate trên chất mang BC là tính chất cơ lý bền vững, tạo thành dạng tròn có đường kính khoảng 3,5- dễ phù hợp với hình dạng thiết bị lên men. Tính 4 mm. chất cơ lý bền vững của BC giúp chế phẩm tế bào cố định chịu được các điều kiện khuấy đảo Cố định trên chất mang BC: Trên chất mang trong quá trình lên men và góp phần gia tăng số BC (kích thước 2cm x 2cm x 1 cm), tế bào lần tái sử dụng. Corynebacterium sp. được cố định bằng phương pháp bẫy- hấp phụ (gồm 2 giai đoạn: Các điều kiện tối ưu cố định hấp phụ vi khuẩn trên bề mặt BC và bẫy tăng Corynebacterium sp. trên phức chất mang BC- sinh trên và trong chất mang BC). Cụ thể gồm A chính là tổng hợp các điều kiện tối ưu trên các bước như sau: Hoạt hoá chủng vi khuẩn → chất mang alginate và BC, gồm các bước như Bổ sung chất mang BC vô trùng vào dịch tế bào sau: đã hoạt hoá → Quá trình cố định trên chất -Dịch alginate 3% và tế bào Corynebacterium mang BC sẽ trải qua 2 giai đoạn liên tiếp: sp. đồng nhất với mật độ khoảng 1010 tế bào/ml. Giai đoạn hấp phụ: trong khoảng 30 phút - BC (kích thước 2cm x 2cm x 1cm) hấp phụ đầu tiên sau khi ngâm BC trong dịch tế bào, BC dịch giống- alginate bằng máy lắc trong 30 sẽ trương nở về trạng thái ban đầu, đồng thời sẽ phút. hấp phụ tế bào vào hệ thống sợi bên trong cũng như trên bề mặt bên ngoài. - Khi cho chất mang BC vào huyền phù vi khuẩn có chứa 3% alginate, để tránh sự ảnh Giai đoạn bẫy tăng sinh: kế tiếp giai hưởng độ nhớt của huyền phù đến sự phân bố đoạn hấp phụ. Sau giai đoạn hấp phụ, chất của vi sinh vật và chất mang trong dung dịch, mang BC được tách khỏi huyền phù vi sinh vật cần thực hiện trên máy lắc (200 vòng/phút, thời và các tế bào đã được hấp phụ giai đoạn trên gian 30 phút). Chế độ này đã được ghi nhận là tiếp tục phát triển và tăng sinh trên giá đỡ BC, tối ưu cho sự phân bố vi sinh vật và quá trình khi tiếp tục ủ ở điều kiện tối ưu của giống vi hấp phụ [2,6]. sinh vật cố định. - Bổ sung chất hỗ trợ tạo gel CaCl2 2%. Các điều kiện tối ưu cố định Corynebacterium sp. trên chất mang BC: hấp - Thời gian ủ 3 ngày, ở nhiệt độ 300C. phụ bằng máy lắc, thời gian ủ 3 ngày, ở nhiệt 0 Với các điều kiện trên, lượng tế bào vi độ 30 C, lượng tế bào vi khuẩn cố định trên khuẩn cố định trên phức chất mang BC-A đạt chất mang đạt được như sau: được: 9 - Mật độ trung bình là: 8,8 x10 /g . - Mật độ trung bình là: 8,9 x109/g . 97
3. TẠP CHÍ KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ CÁC TRƢỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT . SỐ 70 - 2009 - Mật độ vi khuẩn mặt ngoài chất mang là: 5,0 x thu nhận lysine. Lượng chế phẩm được tính 104 tế bào/cm2. toán sao cho tỷ lệ giống là như nhau ở cả 4 nghiệm thức: sử dụng tế bào tự do và sử dụng 3 - Mật độ vi khuẩn bên trong chất mang là: 4,6 chế phẩm vi khuẩn cố định trên alginate, BC và x104 tế bào/cm2 [6,7]. BC-A. Điều kiện lên men thu nhận lysine được 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu bố trí như nhau [1,3,6]. - Định lượng vi khuẩn cố định trên bề mặt chất - Định tính L-lysine bằng phương pháp sắc ký mang BC: Mẫu đại diện → Dập mẫu vô trùng giấy. Định lượng L-lysine bằng phương pháp → Xử lý bằng cellulase → Định lượng bằng quang phổ [1,3]. phương pháp đếm gián tiếp. - Phương pháp xử lý số liệu: Số liệu được xử lý - Xác định tỷ lệ rửa trôi tế bào (T) sau mỗi chu bằng chương trình Excel, Stagraphic Version kỳ lên men: 7.0. B III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN T= x100% A 3.1 Các đặc điểm sinh học của chủng (với A: mật độ tế bào ban đầu của chế phẩm, B: Corynebacterium sp. khảo sát. mật độ tế bào trong dịch lên men tại chu kỳ Các biến động về tăng trưởng, pH môi khảo sát). trường và sản lượng lysine của chủng - Lên men bởi chế phẩm tế bào cố định ở quy Corynebacterium sp. được thể hiện qua đồ thị mô phòng thí nghiệm trong fermenter (5 lít) để 1. 35 30 25 20 15 10 5 0 Ban đầu 1 2 3 4 5 Ngày lên men Mật độ tế bào (triệu/ml) pH Lysine (g/l) Đồ thị 1. Biến động về tăng trưởng, pH môi trường và sản lượng lysine của chủng Corynebacterium sp. theo thời gian lên men Như vậy, với chủng khảo sát, thời gian Sử dụng 3 chế phẩm Corynebacterium lên men cho sản lượng lysine cao nhất là 3 ngày sp. (được cố định bằng 3 chất mang alginate, đạt khoảng 32 g/l và mật độ tế bào đạt được cao BC và phức BC-A đã giới thiệu trong phần nhất sau 3-4 ngày nuôi cấy. Xét về thời gian và phương pháp) để lên men thu nhận lysine nhằm hiệu suất quá trình lên men sinh tổng hợp so sánh hiệu quả của các chế phẩm cố định. lysine, sản lượng lysine của chủng khảo sát nằm Tiêu chí đánh giá để xác định số lần tái sử dụng ở mức 70-80% so với các báo cáo ngoài nước là sản lượng lysine của các lần tái sử dụng lên [1,3] và tương đương so với báo cáo trong nước men bằng các chế phẩm vi khuẩn cố định trong [9]. Với mục đích nâng cao hiệu quả quá trình cùng một thời gian lên men là 72 giờ. Thời gian lên men thu nhận lysine, chúng tôi sử dụng 72 giờ đã được xác định qua đồ thị 1. chủng này cho các nghiên cứu tiếp theo về cố Các chế phẩm vi khuẩn Corynebacterium định tế bào. sp. cố định trên alginate dưới tác động khuấy 3.2 Ứng dụng vi khuẩn Corynebacterium sp. đảo trong lên men, đã bị trương và vỡ ra sau 5 cố định trong lên men thu nhận lysine lần tái sử dụng. Tỷ lệ chất mang alginate bị vỡ 98
4. TẠP CHÍ KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ CÁC TRƢỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT . SỐ 70 - 2009 là 50%. Trong môi trường lên men có một Đánh giá hiệu quả cố định của các chế lượng Na+ và gốc phosphat là những tác nhân phẩm Corynebacterium sp. cố định trên các phá vỡ cấu trúc hệ gel của alginate. Trong khi chất mang thông qua sản lượng lysine trong quá đó, màng BC giữ nguyên cấu trúc rất chắc sau trình lên men và xử lý số liệu, cho kết quả như 10 lần theo dõi tái sử dụng (đồ thị 2). sau: Dựa vào các yêu cầu của chất mang trong - Đối với chất mang alginate: có thể tái sử dụng kỹ thuật cố định tế bào, ưu điểm nổi bật của 3 lần cho hiệu quả lên men không khác biệt so chất mang BC thể hiện qua 4 điểm: tính chất cơ với đối chứng. Lần lên men tái sử dụng thứ 4, lý bền vững, dễ phù hợp với hình dạng thiết bị sản lượng lysine giảm khoảng 24%. Lần tái sử lên men, giá thành thấp và số lần tái sử dụng dụng thứ 5, sản lượng giảm 32%. Dưới tác động cao. Nhưng kiểu cố định tế bào bằng phương khuấy đảo trong quá trình lên men, chế phẩm pháp bẫy-hấp phụ dẫn đến hiện tượng rửa trôi tế Corynebacterium sp. cố định trên alginate bị bào sau mỗi lần tái sử dụng. Vì vậy, khi cố định trương và vỡ ra sau 5 lần tái sử dụng. Tỷ lệ chất tế bào bằng phương pháp bẫy hấp phụ trên BC mang alginate bị vỡ là 50%. chỉ có khả năng tái sử dụng khoảng 9 lần (đồ thị - Đối với chất mang BC: có thể tái sử dụng 8 2). Khi kết hợp với nhốt tế bào bằng alginate lần cho hiệu quả lên men không khác biệt so trên phức BC-A đã khắc phục được hiện tượng với đối chứng. Lần lên men tái sử dụng thứ 9, rửa trôi tế bào. Sau 10 lần tái sử dụng chế phẩm sản lượng lysine giảm khoảng 24%. Lần tái sử vi khuẩn cố định trên BC, tỷ lệ rửa trôi lên đến dụng thứ 10, sản lượng lysine giảm 40%. Chính 32%, tương ứng là sản lượng lysine giảm 40% vì sự khác biệt của sản lượng lysine qua các lần so với đối chứng. Đối với chất mang BC-A, sau lên men tái sử dụng, nên đối với chất mang BC, 13 lần tái sử dụng tỷ lệ rửa trôi là 27%, tương số lần tái sử dụng được xác định là 8 lần. ứng sản lượng lysine giảm 25% so với đối chứng. Kết quả khảo sát tỷ lệ rửa trôi tế bào thể hiện qua bảng 1. 35 30 25 20 15 Lysinl) (g/ 10 5 0 ĐC [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] Lần tái sử dụng lên men bằng chế phẩm vi khuẩn cố định Chất mang Alginat Chất mang BC Phức chất mang BC-A Đồ thị 2. Sản lượng L-lysine của các lần tái sử dụng lên men bằng các chế phẩm vi khuẩn cố định (ĐC: đối chứng lên men bằng tế bào tự do) Bảng 1. Tỷ lệ rửa trôi tế bào sau tái sử dụng lên men chế phẩm tế bào cố định (%) Chất Lần tái sử dụng mang [2] [4] [6] [8] [10] [12] [13] Alginate 8 35 x x x x x BC 12 15 19 25 32 x x BC-A 9 12 17 19 22 23 27 (x): không tiếp tục tái sử dụng 99
5. TẠP CHÍ KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ CÁC TRƢỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT . SỐ 70 - 2009 từ 1-12 (đối với phức chất mang BC-A) không - Đối với phức chất mang BC-A: có thể tái sử có ý nghĩa ở độ tin cậy 95%. Với chu kỳ 8-9 dụng 12 lần cho hiệu quả lên men không khác (đối với chất mang BC) và chu kỳ 12-13 (đối biệt so với đối chứng. Lần lên men tái sử dụng với chất mang BC-A), sự khác biệt có ý nghĩa thứ 13, sản lượng lysine giảm khoảng 25%. Lần ở độ tin cậy 95% . tái sử dụng thứ 14, sản lượng lysine giảm 38%. Do sự khác biệt của sản lượng lysine qua các IV. KẾT LUẬN lần lên men tái sử dụng, nên đối với phức chất - Chất mang BC có nhiều ưu thế hơn các chất mang BC-A, số lần tái sử dụng được xác định là mang truyền thống alginate trong kỹ thuật cố 12 lần. định tế bào vi khuẩn Corynebacterium sp. - Chất mang BC và phức BC-A, sau số lần theo - BC hoàn toàn phù hợp các yêu cầu của chất dõi tái sử dụng để lên men vẫn giữ nguyên mang trong kỹ thuật cố định tế bào vi khuẩn. trạng thái cấu trúc ban đầu. Đây cũng là một ưu điểm, thể hiện qua tính chất vật lý của BC [2] - Phức chất mang Bacterial Cellulose- Alginate và cũng là một yêu cầu quan trọng của chất (BC-A) phát huy được những ưu thế của chất mang trong kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật mang Bacterial Cellulose và Alginate. [2-6]. Với phức BC-A, các tế bào được nhốt bởi - Hiệu quả sử dụng chế phẩm Corynebacterium gel alginate trong mạng lưới BC, giúp giảm tỷ sp. cố định trên phức chất mang BC-A trong lên lệ rửa trôi tế bào trong quá trình tái sử dụng để men thu nhận lysine khá cao: có thể tái sử dụng lên men (bảng 1), vì vậy số lần tái sử dụng gia chế phẩm 12 lần mà vẫn đảm bảo về mặt thời tăng (đồ thị 2). gian lên men và sản lượng lysine so với đối - Các số liệu đồ thị 2 được xử lý thống kê cho chứng. thấy sự khác biệt về hàm lượng lysine trong các chu kỳ từ 1-8 (đối với chất mang BC) và chu kỳ TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Gunji Y., Yasueda H.; Enhancement of L-lysine production in methylotroph Methylophilus methylotrophus by introducing a mutant LysE exporter; Biotechnology 6, 2006, 126-132. 2. Krystynowicz A., Czaja W.; Factors affecting the yield and properties of bacterial cellulose; Industrial Microbiology and Biotechnology 29, 2002, 189-195. 3. Kiefer, Elmar Heinzle, Oskar Zelder, and Christoph Wittmann; Comparative metabolic flux analysis of lysinee-producing Corynebacterium glutamicum cultured on glucose or fructose; Applied and Environmental Microbiology 1, 2004, 229-239. 4. Lee K. Y.; Survival of Bifidobacterium longum immobilized in calcium alginatee beads in simulated gastric juices and bile salt solution; Applied and Environmental Microbiology 66, 2000, 869-873. 5. Sheu T.Y.; Microentrapment of Lactobacili in calcium alginatee gel; Food science 54, 1999, 557- 561. 6. Nguyễn Thúy Hương; Tuyển chọn và cải thiện các chủng Acetobacter xylinum tạo cellulose vi khuẩn để sản xuất và ứng dụng ở quy mô pilot; Luận án Tiến sỹ Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP.HCM, 2006. 7. Nguyễn Thúy Hương; Một số ứng dụng của cellulose vi khuẩn trong lĩnh vực thực phẩm; Tạp chí Sinh học, tập 30, số 1, 2008, 62-69. 8. Nguyễn Thúy Hương, Trần Thị Tưởng An; Cố định vi khuẩn Lactobacillus lactis để ứng dụng lên men thu nhận bacteriocine, Tạp chí Khoa học và Công nghệ các trường Đại học kỹ thuật, số 63, 2008, 82-86. 9. Vũ Kim Thoa; Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, trang 381-383, Hà nội - 2003: . Địa chỉ liên hệ: Nguyễn Thuý Hương - Tel: 0955.019.067, e-mail: nthuong13567@yahoo.com Bộ môn Công nghệ Sinh học- Trường Đại học Bách khoa - ĐHQG Tp.HCM 100