Ứng dụng enzyme trong chuẩn đoán bệnh: phương pháp Elisa

Nội dung text: Ứng dụng enzyme trong chuẩn đoán bệnh: phương pháp Elisa

1. ỨNG DỤNG ENZYME TRONG CHUẨN ĐOÁN BỆNH
2. Định nghĩa elisa ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) hay EIA (Enzyme ImmunoAssay) là một kỹ thuật sinh hóa để phát hiện kháng thể hay kháng nguyên trong mẫu xét nghiệm.
3. Nguyên lý của phương pháp ELISA chính là dựa vào tính đặc hiệu kháng nguyên – kháng thể Kháng nguyên – kháng thể Kháng nguyên (antigen) là những chất có khả năng huy động hệ miễn dịch và gây một phản ứng miễn dịch. Kháng nguyên bao gồm protein lạ, acid nucleic, một số lipide và polysaccharide. Chưa biết gắn trên bề mặt. Kháng thể (antibody) tạo thành phần gramma globulin trong các protein máu. Kháng thể là những protein hòa tan do các tế bào B hay tương bào tiết ra để đáp ứng với một kháng nguyên và chúng có thể gắn đặc hiệu với kháng nguyên đó
4. Thêm vào một cơ chất (substance) của enzyme đó. Enzyme sẽ biến đổi cơ chất này và tạo tín hiệu có thể xác định được. Đối với các ELISA phát quang, ánh sáng sẽ được phát ra từ mẫu chứa kháng nguyên – kháng thể. Sự hiện diện của phức hợp kháng nguyên – kháng thể sẽ quyết định cường độ sáng phát ra
5. Các bước tiến hành Để tiến hành ELISA cần phải có ít nhất một KT đặc hiệu cho KN chưa biết. Thông thường KN được cố định tại các giếng của vi phiếm (polystyrene microtiter plate). - Phương thức cố đinh không đặc hiệu: KN gắn trực tiếp vào bề mặt của đĩa - Phương thức gắn đặc hiệu ("sandwich" ELISA): KN được gắn với một kháng thể đặc hiệu cho cùng kháng nguyên cần kiểm tra
6. KT đặc hiệu cho KN chưa biết. Phương thức cố đinh không đặc hiệu: KN gắn trực tiếp vào bề mặt của đĩa Phương thức gắn đặc hiệu : KN được gắn với một kháng thể đặc hiệu cho cùng kháng nguyên cần kiểm tra Đo OD tín hiệu quang học do enzyme làm biến đổi cơ chất sẽ giúp phát hiện KN cần kiểm tra. Kết quả
7. Nếu KT được gắn trực tiếp với enzyme, tín hiệu quang học do enzyme làm biến đổi cơ chất sẽ giúp phát hiện KN cần kiểm tra. Trong trường hợp sử dụng KT thứ cấp (secondary antibody) được gắn với enzyme thông qua các liên kết cộng hóa trị giữa các phân tử sinh học (bioconjugation), KN cần xác định sẽ được nhận biết qua KT thứ cấp này.
8. Enzyme sử dụng thường là : + Peroxidase + Beta – galactoxidase + Alkaline phosphatase Cơ chất (subtrate) là: + ODP: là cơ chất mà enzyme biến đổi tạo sản phẩm có màu vàng nhận bước sóng 492 nm ( bằng máy đọc elisa) + TMB: là cơ chất mà enzyme biến đổi tạo sản phẩm có màu xanh bước sóng 370-652nm chuyển màu vàng 450nm
9. Enzyme sử dụng trong phương pháp elisa Enzyme ở đây được sử dụng để xác định hỗn hợp kháng nguyên – kháng thể , tạo thành trong phản ứng miễn dịch. Ta có thể sử dụng máy so màu quang điện, huỳnh quang để xác định phản ứng. Enzyme alkaline phosphate Enzyme này được sử dụng trong phản ứng miễn dịch. Người ta thường sử dụng enzyme này với hoạt tính 2500UI/mg, ở nhiệt độ 37oC. Để xác định hoạt tính alkaline phosphate có thể sử dụng máy huỳnh quang với 4 – methylumbeliferyphosphate làm cơ chất
10. ß-galactosidase Người ta thường sử dụng enzyme này có hoạt tính riêng lớn hơn 250UI/mg với cơ chất là 4-nitrophenyl- ß-galactosidase, ở 37oC Hoạt tính của ß-galactosidase được đo bằng máy quang điện với 4-methylumbelliferyl- ß-galactosidase. Ngoài ra ta có thể sử dụng 5-bromo-4-chloro-3-indolyl- ß-galactosidase
11. Horseral peroxidase Enzyme này chứa hai đến ba nhóm hoạt động amine trong phân tử và chứa 12-14.5% carbohydrate. Xác định hoạt tính enzyme này bằng máy quang điện. cơ chất thường sử dụng là chromogen-2,2’-azinobis [3-ethylbenzothiazoline-sulfonate] (ABTS) và peroxidase có hoạt tính riêng là 1000u/c ở 25oC Trong miễn dịch người ta thường sử dụng cơ chất là 3,3’;5,5’- tetramethyl benzidine
12. Thiết bị sử dụng Khay nhựa 96 giếng
13. Thiết bị sử dụng Máy đọc elisa (máy quang phổ có các bước sóng khác nhau
14. Thiết bị sử dụng Micropipette Micropipette tips
15. Thiết bị sử dụng Máy rửa khay nhựa Micropipette multi tips
16. Ưu điểm phương pháp elisa +Dễ thực hiện + Có thể tiến hành đồng thời nhiều mẫu + Có thể phát hiện kháng thể IgM, IgG, IgA và IgE Nhược điểm + Đòi hỏi thời gian (có kết quả sau 5h) + Thiết bị mắc tiền
17. ELISA TRỰC TiẾP
18. Cố định các kháng nguyên chưa biết vào các giếng Bước “blockin” “Rửa” Thêm kháng thể có gắn enzyme “Rửa” Thêm cơ chất Ghi nhận sự thay đổi ( màu, huỳnh quang, OD )
19. 1. Elisa trực tiếp
20. Phát hiện trực tiếp: KN virus, axit nucleic hoặcVirus. Áp dụng: - Phát hiện nhiễm HIV ở trẻ sơ sinh được sinh ra từ mẹ nhiễm HIV. - Phát hiện sớm giai đoạn mới nhiễm HIV (giai đoạn cửa sổ) hoặc khi kết quả phát hiện KT không rõ ràng. - Theo dõi diễn tiến bệnh, đánh giá hiệu quả điều trị thuốc kháng virút và trong các mục đích nghiên cứu khác.
21. 2.Elisa gián tiếp
22. Cố định các kháng nguyên chưa biết vào các giếng Bước “blockin” “Rửa” Thêm kháng thể thứ cấp “Rửa” Thêm cơ chất Ghi nhận sự thay đổi ( màu, huỳnh quang, OD )
23. 2. Elisa gián tiếp
24. Độ nhạy cao huyết thanh cần thử ủ với bản nhựa đã gắn kháng nguyên, sau khi rửa để loại kháng thể thừa, không đặc hiệu, lại tiếp tục ủ với kháng thể kháng globulinngười gắn Enzym. Hoạt tính Enzym sẽ biến cơ chất không màu thành một sản phẩm có màu. Phản ứng màu được nhận định sơ bộ bằng mắt thường và đọc chính xác bằng quang kế.
25. 3. Sandwich Elisa
26. THAO TÁC Cố định các kháng nguyên, kháng thể chưa biết Thêm mẫu cần xác định KN ( hoặc KT ) KT dùng để phát hiện gắn với enzyme được thêm vào Thêm cơ chất Ghi nhận kết quả
27. 3. Sandwich Elisa: không sử dụng kháng thể thứ cấp
28. ELISA sandwich: độ đặc hiệu và độ nhạy cao. Cũng tương tự kỷ thuật ELISA gián tiếp chỉ khác là kháng nguyên virus có gắn Enzym được thay kháng thể globlin người gắn enzym. Như vậy hình thành 1 Sandwich của phức hợp KN_KT_KN_Enzym. Sự thay đổi này làm tăng độ nhạy và đô đặc hiệu của phản ứng, nó cũng cho cho phép phát hiện tất cả các lớp kháng thể vì không dùng Anti IgG người gắn Enzym.
29. 3. Sandwich Elisa: sử dụng kháng thể thứ cấp
30. 4. Elisa cạnh tranh + Đưa hỗn hợp này vào các giếng của vi phiếm có chứa kháng nguyên + “Ủ” kháng thể không được đánh dấu với kháng nguyên + Rửa đĩa, kháng thể không được gắn kết sẽ bị rửa trôi. Lượng kháng nguyên càng lớn, lượng kháng thể gắn thành công với kháng nguyên trong đĩa càng thấp do “cạnh tranh”
31. • Độ nhạy cao. Nguyên lý phản ứng tương tự như hai loại trên song chỉ khác là huyết thanh của mẫu thử có KT kháng HIV ủ cùng với kháng thể kháng HIV có gắn Enzym. Như vậy có sự tranh chấp giữa hai loại kháng thể trong phản ứng kết hợp với KN-KT đã gắn vào pha rắn, Đậm độ KT trong mẫu thử càng cao thì KT càng ít được cố định vào KN . Cơ chất sẽ cho 1 phản ứng màu tỉ lệ nghịch với đâm đô KT của màu phải thử.
32. Ứng dụng của phương pháp elisa -Xác định nồng độ của KT trong huyết thanh - Kiểm tra sự có mặt của KN -Phát hiện các yếu tố có khả năng gây dị ứng trong thực phẩm -Xác định sự có mặt của dược phẩm -Xác định hoạt tính một số hợp chất sinh học -Xét nghiệm HIV
33. Xét nghiệm HIV AIDS(Acquired Immuno-Deficiency Syndrome) là hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải gây ra bởi HIV (Human Immuno-Deficiency virus) AIDS xảy ra do sự tấn công HIV vào tế bào của hệ miễn dịch. Trước hết là T-CD4 làm suy giảm số lượng và rối loạn chức năng của tế bào này dẫn dến hàng loạt rối loạn khác của hệ miễn dịch, gây ra suy giảm miễn dịch nghiêm trọng, tạo điều kiện cho nhiễm trùng cơ hội phát triển, cuối cùng là tử vong
34. Lấy máu Huyết thanh của một người được pha loãng ra 400 lần vào các đĩa mà kháng nguyên HIV được cố định Rửa giải các thành phần khác trong huyết thanh.Nếu huyết thanh có kháng thể HIV sẽ được giữ lại
35. Một kháng thể thứ cấp đặc hiệu với kháng thể HIV được thêm vào đĩa Enzyme:Horseral peroxidase Rửa giải kháng thể thứ cấp có gắn enzyme sẽ được giữ lại nếu bề mặt có kháng thể HIV Cơ chất: TMB Cho cơ chất đặc hiệu với enzyme của kháng thể thứ cấp thay đổi màu sắc: “đầu tiên màu vàng Đo độ hấp thu quang: bước sống 450nm So sánh con số này với kết quả mẫu huyết thanh của người bình thường
36. Xét nghiệm HIV
37. Nhược điểm: Cơ thể đã nhiễm HIV → kháng thể ít→XN âm tính giả →XN lại 3 -6 tháng