Tối ưu quá trình nuôi cấy thu sinh khối Lactobacillus casei trên môi trường MRS cải biên

Nội dung text: Tối ưu quá trình nuôi cấy thu sinh khối Lactobacillus casei trên môi trường MRS cải biên

1. Journal of Thu Dau Mot University, No 5 (24) – 2015 TỐI ƯU QUÁ TRÌNH NUÔI CẤY THU SINH KHỐI LACTOBACILLUS CASEI TRÊN MÔI TRƯỜNG MRS CẢI BIÊN Đào Thị Mỹ Linh – Nguyễn Hải Nam – Nguyễn Thị Quỳnh Mai Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM TÓM TẮT Lactobacillus casei là lợi khuẩn được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực, vì vậy nhu cầu sử dụng sinh khối của vi khuẩn này là rất lớn. Trong nghiên cứu này, quá trình nuôi cấy thu sinh khối Lactobacillus casei trên môi trường MRS cải biên được tối ưu bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm. Thành phần glucose trong môi trường MRS được thay thế bằng dịch chiết dứa như một nguồn cung cấp cacbon cùng với một số vitamin và khoáng chất cần thiết cho vi khuẩn để giảm giá thành sản phẩm. 11 yếu tố ảnh hưởng đến lượng sinh khối được sàng lọc bằng phương pháp Plackett – Burman và chọn ra 3 yếu tố có ảnh hưởng nhiều nhất. Bằng phương pháp leo dốc Box – Wilson, điều kiện tối ưu được xác định bao gồm: dịch chiết dứa 55% (v/v), cao nấm men 47,5 (g/L) và tỷ lệ giống 9,5% (v/v). Kết quả cho thấy mật độ tế bào Lactobacillus casei sau 18h nuôi cấy trong môi trường cải biên tối ưu là 9,280 Log (CFU/mL), so với trong môi trường MRS broth là 9,178 Log (CFU/ml). Từ khóa: Lactobacillus casei, tối ưu hóa, sinh khối, probiotics, MRS, Plackett – Burman. 1. MỞ ĐẦU sung lợi khuẩn, thức ăn chăn nuôi có bổ Probiotics là những vi sinh vật sống có sung probiotics nhằm hạn chế việc sử dụng ảnh hưởng tốt đến vật chủ bằng cách giúp các chất kháng sinh, giảm tác động đến con cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột (Michail người. Việc tận dụng các nguyên liệu rẻ S, 2005). Phần lớn các chế phẩm probiotics tiền thay thế một phần hay hoàn toàn cho là các vi khuẩn lactic như Lactobacillus môi trường MRS để nuôi cấy thu nhận sinh acidophilus, Lactobacillus casei, Bifido- khối probiotics sẽ góp phần giảm bớt giá bacterium longum Probiotics giúp hoàn thành sản phẩm. Một số nghi n cứu cho thiện hệ tiêu hóa, kháng các vi khuẩn gây thấ rằng dịch cà rốt được sử dụng làm cơ bệnh thông qua các chất kháng khuẩn (acid, chất hả thi cho sản xuất sinh khối bốn bacteriocins, H2O2 ), tăng cường hệ thống chủng vi khuẩn Lactobacillus acidophilus, miễn dịch, giảm cholesterol trong máu, Lactobacillus casei, Lactobacillus delb- khắc phục hiện tượng không dung nạp rueckii, Lactobacillus plantarum (Yoon et lactose, giảm tiêu chảy al., 2005); bột chà là được sử dụng tha thế Do những tính năng hữu ích trên nên gluocose trong môi trường MRS như là sinh khối probiotics đã và đang được quan nguồn cacbon rẻ tiền để nuôi cấ thu sinh tâm nghiên cứu để ứng dụng rộng rãi trong hối Lactobacillus casei ATCC 334 nhằm việc sản xuất các loại sữa lên men có bổ giảm gi thành sản phẩm (A.Shahravy et al., 24
2. Tạp chí Đại học Thủ Dầu Một, số 5 (24) – 2015 2012); môi trường dịch chiết dứa được sử Xác định mật tế bào: Tiến hành dựng dụng để nuôi cấ Lactobacillus delbrueckii đường chuẩn thể hiện mối quan hệ tuyến cố định trong hạt canxi alginate để sản xuất tính giữa mật độ tế bào và giá trị D600nm acid lactic (Dr Roslina Rashid, 2008). (Michail S, 2005). Vi sinh vật được tăng Một quá trình nuôi cấy thường bị ảnh sinh trong môi trường MRS broth, sau đó hưởng bởi nhiều yếu tố h c nhau như c c được pha loãng ở các nồng độ và thời gian điều kiện nuôi cấy và thành phần dinh khác nhau, tiến hành đo OD600nm (A) bằng dưỡng của môi trường. Việc tối ưu c c ếu máy SP-3000 nano và trải đĩa tr n môi tố sẽ gi p tăng năng suất sản phẩm (Lim, trường MRS agar ủ ở 37oC, 48 giờ sau đó C.H et al., 2007). C ch đơn giản để thực tiến hành đếm khuẩn lạc (CFU). Sử dụng hiện việc tối ưu là tối ưu từng yếu tố trong phần mềm Excel của Microsoft để xử lý số khi giữ nguyên các yếu tố khác, tuy nhiên liệu, kết quả đường chuẩn: cách thực hiện này tốn thời gian và không CFU x c định được sự t c động đồng thời giữa Log 1.9791 8.2389 ml các yếu tố, do đó phương ph p quy hoạch Ở các thí nghiệm x c định mật độ tế thực nghiệm được áp dụng cho việc tối ưu. bào, tiến hành đo OD sau hi ết thúc thời Trong nghiên cứu này, quá trình nuôi gian nuôi cấy, dựa vào đường chuẩn để suy cấy Lactobacillus casei được tối ưu trên ra mật độ tế bào. môi trường MRS, với glucose được thay Xác định hàm lượng đường: Hàm thế bằng dịch chiết dứa như một nguồn lượng đường trong dịch chiết từ quả dứa và cung cấp cacbon đồng thời bổ sung các cùi dứa được định lượng dựa tr n phương vitamin, muối khoáng cần thiết cho vi sinh pháp DNS (dinitrosalicylic acid). Phương vật phát triển để thu nhận sinh khối và loại pháp DNS này dựa tr n cơ sở phản ứng tạo b đi c c thành phần c ng như ếu tố màu giữa đường khử với thuốc thử hông ảnh hưởng nhiều đến lượng sinh dinitrosalicylic acid. Cường độ màu của hối để tiết iệm hóa chất, thời gian. hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP đường khử trong một phạm vi nhất định. So NGHIÊN CỨU màu tiến hành ở bước sóng 540nm (Lê Chủng vi sinh vật: Lactobacillus casei Thanh Mai, 2009). (bộ sưu tập giống probiotic của Bộ môn Sàng lọc các yếu tố có ảnh hưởng Công nghệ sinh học, trường ĐH Công quan trọng đến sự tạo sinh khối bằng nghiệp Thực phẩm TP HCM) được phân lập thiết kế Plackett – Burman: Thí nghiệm từ hạt Kefir và định danh bằng phương ph p được thiết kế theo quy hoạch Plackett – rDNA 16s, giữ giống tr n môi trường MRS- Burman 11 yếu tố với 12 thí nghiệm (bảng agar ở 4oC và trong glycerol 10% ở -18oC. 2) để sàng lọc các yếu tố ảnh hưởng quan Chuẩn bị môi trường nuôi cấy: Dứa trọng nhất đến hàm mục tiêu là log gọt v , ép lấy dịch, lọc, đun sôi 5 ph t, để (CFU/mL). Mức thấp (-1) và cao (+1) của lắng và tiếp tục lọc để lấy dịch trong. Sử 11 yếu tố được thể hiện trong bảng 1. Sử ® dụng thành phần cơ bản của MRS-agar, bổ dụng phần mềm Design Expert 7.0.0 của sung dịch dứa và thiết kế c c môi trường Stat – Ease Inc. USA để phân tích số liệu. khác nhau để nuôi cấy Lactobacillus casei Tối ưu nồng độ các yếu tố được chọn thu sinh khối ở 37oC. bằng phương pháp leo dốc (phương pháp 25
3. Journal of Thu Dau Mot University, No 5 (24) – 2015 Box – Wilson): Sau khi sàng lọc, ba yếu tố ph p bình phương cực tiểu, kiểm định hệ số ảnh hưởng đến sinh khối nhiều nhất được hồi quy của mô hình và sự tương thích của chọn, thiết lập ở 3 mức (-1, 0, +1) (bảng 3) mô hình tối ưu 23 theo chuẩn Student và trong 12 thí nghiệm (bảng 4). chuẩn Fisher (Bùi Minh Trí, 2005; Nguyễn Hàm mục ti u được chọn là Cảnh, 2010). Sau hi xâ dựng được mô Log(CFU/mL). Mô hình hóa được biểu hình phù hợp, tiến hành thí nghiệm leo dốc diễn bằng phương trình bậc 1: nhằm mục đích tìm ra điểm tối ưu của c c ếu tố hảo s t. Chọn bước chu ển động = b0 + b1x1 + b2x2 + b3x3+b12x1x2 + một ếu tố và tính to n c c bước chu ển b13x1x3 + b23x2x3 + b123x1x2x3 động c c ếu tố h c (bảng 5) nhằm bố trí Trong đó: b1, b2, b3 là các hệ số bậc 1; thí nghiệm (bảng 6) và x c định gi trị tối b12, b13, b23 là các hệ số tương t c của từng ưu của c c ếu tố nuôi cấ . cặp yếu tố; x1, x2, x3 là các biến độc lập. Tính toán các hệ số hồi qu theo phương Bảng 1: Các biến trong ma trận Plackett – Burman và ảnh hưởng của chúng đến hàm mục tiêu Yếu tố Mức Mức độ ảnh hưởng Ký % Tác Tên yếu tố Thấp (-) Cao (+) Ảnh hưởng Prob>F hiệu động a X1 Dịch chiết dứa (%) 60 100 -0,170 <0,0001 55,36 a X2 Cao nấm men (g/L) 20 50 0,110 <0,0001 22,64 b X3 Triamoniumhydrogen citrate (g/L) 0 2 0,010 0,18 a X4 K2HPO4 (g/L) 0 2 0,022 0,0412 0,94 b X5 Sodium acetate (g/L) 0 5 -0,006 0,073 b X6 Tween 80 (ml) 0 1 0,005 0,039 b X7 MgSO4(g/L) 0 0,2 0,003 0,015 b X8 MnSO4(g/L) 0 0,2 0,010 0,20 a X9 pH 5 6 0,022 0,0435 0,91 b X10 Thời gian (giờ) 18 24 0,013 0,33 a X11 Tỷ lệ giống (%) 5 10 0,100 <0,0001 19,31 a Có ý nghĩa ở độ tin cậ α = 0,05; b Không có ý nghĩa ở độ tin cậ α = 0,05. (A.Shahravy et al., 2012; Carla Araya-Cloutier et al., 2012; Đào Minh Châu, 2012; J.C. De Man et al.1960) Bảng 2:Ma trận thiết kế thí nghiệm Plackett – Burman Các biến Log (CFU/mL) No Thực Mô X X X X X X X X X X X 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 nghiệm hình 1 +1 -1 +1 -1 -1 -1 +1 +1 +1 -1 +1 8,958 8,950 2 +1 +1 -1 +1 -1 -1 -1 +1 +1 +1 -1 8,989 8,980 3 -1 +1 +1 -1 +1 -1 -1 -1 +1 +1 +1 9,231 9,230 4 +1 -1 +1 +1 -1 +1 -1 -1 -1 +1 +1 8,963 8,950 5 +1 +1 -1 +1 +1 -1 +1 -1 -1 -1 +1 9,041 9,060 6 +1 +1 +1 -1 +1 +1 -1 +1 -1 -1 -1 8,940 8,940 7 -1 +1 +1 +1 -1 +1 +1 -1 +1 -1 -1 9,153 9,150 8 -1 -1 +1 +1 +1 -1 +1 +1 -1 +1 -1 9,035 9,020 9 -1 -1 -1 +1 +1 +1 -1 +1 +1 -1 +1 9,136 9,140 10 +1 -1 -1 -1 +1 +1 +1 -1 +1 +1 -1 8,849 8,850 11 -1 +1 -1 -1 -1 +1 +1 +1 -1 +1 +1 9,223 9,210 12 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 8,983 9,000 (+): Mức cao, (-): Mức thấp dựa theo bảng 1 của các yếu tố: X1: Dịch chiết dứa, X2: Cao nấm men, X3: Triamoniumhydrogen citrate , X4: K2HPO4 , X5: Sodium acetate, X6: Tween 80, X7: MgSO4, X8: MnSO4 , X9: pH, X10: Thời gian, X11: Tỷ lệ giống (Nguyễn Hữu Lộc, 2011). 26
4. Tạp chí Đại học Thủ Dầu Một, số 5 (24) – 2015 Bảng 3: Nồng độ của các yếu tố khảo sát Các yếu tố ảnh hưởng Các mức x1 (g/L) x2 (%) x3 (g/L) Mức thấp (-) 20 60 5 Mức cơ sở (0) 35 80 7,5 Mức cao (+) 50 100 10 Khoảng biến thiên ( ) 30 40 5 x1: cao nấm men; x2: dịch chiết dứa, x3: tỷ lệ giống Bảng 4: Kế hoạch thực nghiệm quy hoạch nhân tố toàn phần 23 x x x x x x x x x x x x y Thí nghiệm 1 2 3 1 2 1 3 2 3 1 2 3 j 1 + + + + + + + 9,069 2 - + + - - + - 8,967 3 + - + - + - - 9,244 4 - - + + - - + 9,152 5 + + - + - - - 8,982 6 - + - - + - + 8,868 7 + - - - - + + 9,164 8 - - - + + + - 9,011 9 0 0 0 0 0 0 0 9,086 10 0 0 0 0 0 0 0 9,076 11 0 0 0 0 0 0 0 9,084 (+): Mức cao, (-): Mức thấp dựa theo bảng 3 của các yếu tố: x1: Cao nấm men, x2: Dịch chiết dứa, x3: Tỷ lệ giống. yj: Hàm mục tiêu khảo sát log (CFU/mL). Bảng 5: Các điều kiện cần thiết để tiến hành thí nghiệm leo dốc Các chỉ tiêu x1 (g/L) x2 (%) x3 (%) Mức cơ sở 35 80 7,5 Khoảng biến thiên (∆j) 30 40 5 Hệ số bj 0,058 -0,086 0,051 1,74 3,44 0,255 2,53 -5,00 0,37 Bước chuyển động 2,5 -5,0 0,4 Làm tròn bước chuyển động x1(g/L): cao nấm men, x2 (%): dịch chiết dứa, x3 (%): tỷ lệ giống. Bảng 6: Thí nghiệm theo hướng leo dốc Các yếu tố ảnh hưởng Hàm mục tiêu Thí nghiệm x1 (g/L) x2 (%) x3 (%) Y 1 (TN tại tâm) 35 80 7,5 9.084 ± 0,011a 2 37,5 75 7,9 9.100 ± 0,006ab 3 40 70 8,3 9.120 ± 0,011b 4 42,5 65 8,7 9.154 ± 0,022c 5 45 60 9,1 9.229 ± 0,009d 6 47,5 55 9,5 9.277 ± 0,016e 7 50 50 9,9 9.237 ± 0,008d 8 52,5 45 10,3 9.223 ± 0,008d x1(g/L): cao nấm men, x2 (%): dịch chiết dứa, x3 (%): tỷ lệ giống. 27
5. Journal of Thu Dau Mot University, No 5 (24) – 2015 Kết quả được tính dựa trên giá trị trung Để x c định mức ảnh hưởng của các bình ± độ lệch chuẩn (n=2). abcde là giá trị yếu tố và chọn ra những yếu tố có ảnh trung bình cột, sự sai khác ký tự có ý nghĩa hưởng nhất đến hàm mục tiêu sai biệt về mặt thống kê (p 0,75 thể hiện mô hình tương thích với đối với K2HPO4 và điều chỉnh pH=6 trong thực nghiệm. Giá trị R2 ti n đo n là 0,9664 quá trình nuôi cấy vi sinh vật ở các thí phù hợp với R2 hiệu chỉnh là 0,9846 (độ nghiệm sau. Các yếu tố Triamo- lệch 0,0182 4 chỉ ra rằng tín hiệu đã Tween 80, MgSO4, MnSO4 và thời gian do đầ đủ. không có sự khác biệt ở độ tin cậy 0,05 nên 28
6. Tạp chí Đại học Thủ Dầu Một, số 5 (24) – 2015 sẽ được điều chỉnh cố định ở mức thấp (-) nhằm xây dựng mô hình tối ưu bậc 1 để tiết kiệm hóa chất, thời gian. (bảng 3, 4). Tối ưu nồng độ các yếu tố được chọn Từ kết quả thu được ở bảng 4, tiến bằng phương pháp leo dốc (phương pháp hành tính toán các hệ số hồi quy (bảng 7), Box – Wilson) kiểm định ý nghĩa của các hệ số hồi quy Ba yếu tố được lựa chọn là cao nấm theo chuẩn Student (bảng 8) để xây dựng men, dịch chiết dứa, tỷ lệ giống được thiết mô hình tối ưu và iểm định sự phù hợp lập ở 3 mức khảo sát với 12 thí nghiệm của mô hình theo chuẩn Fisher. Bảng 7: Giá trị của các hệ số b trong mô hình hồi quy Hệ số bo b1 b2 b3 b12 b13 b23 b123 Kết quả 9,057 0,058 -0,086 0,051 -0,004 -0,009 -0,004 0,006 Bảng 8: Giá trị các chuẩn Student thực nghiệm Hệ số tbo tb1 tb2 tb3 tb12 tb13 tb23 tb123 Kết quả 4841,17 31,00 45,97 27,26 2,13 4,81 2,13 3,20 Tra bảng phân bố vị chuẩn Student (tα) Vậy mô hình hồi quy phù hợp theo (Nguyễn Cảnh, 2010). chuẩn Fisher. t(α,f); với α = 0,05 và f = 2→ t0,05;2= 4,3 Kết quả thí nghiệm theo hướng leo dốc Trong đó: α là mức ý nghĩa và f là bậc Từ bảng 6 và hình 1 có thể nhận thấy tự do. giá trị log (CFU/mL) tại thí nghiệm 6 gồm: So sánh chuẩn Student thực nghiệm và x1 (cao nấm men): 47,5 g/L, x2 (dịch chiết chuẩn Student tra bảng, đối chiếu với các dứa): 55% và x3 (tỷ lệ giống): 9,5% đạt giá giá trị Student đã tính, ta thấy rằng:  tbo, trị cao nhất với log (CFU/mL) = 9,277. tb1, tb2, tb3, tb13> tα(f) nên hệ số bo, b1, b2, b3, Đồng thời kết quả phân tích phương sai b13 có ý nghĩa;  tb12, tb23, tb123< tα(f) nên One – Way ANOVA bằng phần mềm hệ số b12, b23, b123 hông có ý nghĩa, loại STATGRAPHICS Centurion XV.I cho các hệ số này ra kh i mô hình hồi quy. Mô thấy sự khác biệt của giá trị log (CFU/mL) hình hồi quy có dạng: tại 3 điểm trên so với c c điểm còn lại. = 9,057 + 0,058x1 – 0,086x2 + 0,051x3 – 0,009x1x3 Để đ nh gi tình phù hợp của mô hình, cần iểm định sự tương thích của mô hình theo ti u chuẩn Fisher (F): Suy ra: Chọn mức ý nghĩa α = 0.05, f = 3, f = 1 2 2, tra bảng phân bố Fisher (A. Shahravy et al.,2012) được kết quả: F(0,05; 3; 2) = 19,13. So sánh với F(0,05; 3; 2) ta thấ <F(0,05; Hình 1: Biểu đồ biểu diễn hàm mục tiêu theo 3; 2) thí nghiệm leo dốc 29
7. Journal of Thu Dau Mot University, No 5 (24) – 2015 Kết quả thu được trong thí nghiệm này Cao nấm men: 47,5 g/L, dịch chiết dứa: h tương thích với nghiên cứu của Lim, 55% và tỷ lệ giống: 9,5% . C.H. et al.(2007) nghiên cứu sản xuất sinh Kiểm chứng kết quả tối ưu với thể tích khối chủng Lactobacillus salivarius I 24 50 ml bằng phương ph p bề mặt đ p ứng (RSM) Thí nghiệm kiểm chứng với thành phần Tác giả đã x c định được điều kiện tối ưu ba môi trường tối ưu, cơ sở, MRS như bảng của các yếu tố cho sự phát triển của L. 9. Kết quả từ bảng 9 cho thấy hàm Log mật salivarius I 24 là glucose: 33,24 g/L, cao độ tế bào của môi trường tối ưu là Log nấm men: 43,1 g/L. (CFU/mL) = 9,280, cao hơn so với môi Căn cứ vào kết quả quy hoạch thực trường cơ sở có Log (CFU/mL) = 9,092 và nghiệm cho thấy rằng hướng leo dốc ở thí môi trường MRS với Log (CFU/mL) = nghiệm 6 (bảng 6) cho kết quả tốt nhất với: 9,178. Bảng 9: Các thông số và kết quả của ba môi trường nuôi cấy Giá trị của các yếu tố thành phần môi trường Yếu tố Tối ưu Cơ sở MRS Dịch chiết dứa (%) 55 80 - Glucose (g/L) - - 20 Cao nấm men (g/L) 47,5 35 5 Peptone (g/L) - - 10 Cao thịt bò (g/L) - - 10 Triamoniumhydrogen citrate (g/L) - - 5 K2HPO4 (g/L) 2 2 2 Sodium acetate (g/L) - - 5 Tween 80 (mL/L) - - 1 MgSO4(g/L) - - 0,2 MnSO4(g/L) - - 0,05 pH 6,0 6,0 6,0 Thời gian (giờ) 18 18 18 Tỷ lệ giống (%) 9,5 7,5 9,5 Log (CFU/ml) 9,280 ± 0,011a 9,092 ± 0,006c 9,178 ± 0,009b “-“: Các yếu tố không được bổ sung vào quá trình nuôi cấy. Kết quả được tính dựa trên giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (n=2). abc là giá trị trung bình cột, sự sai khác ký tự có ý nghĩa sai biệt về mặt thống kê (p<0,05). Hiện na để có 1 lít môi trường tối ưu VNĐ. Đối với môi trường MRS broth của cần phải có 3 quả dứa (12000 VNĐ/3 quả); hãng HIMEDIA® cần 55,15 gam cho 1 lít 47,5 gam cao nấm men (650000 VNĐ/500 môi trường, theo bảng báo giá của công ty gam theo bảng báo giá của công ty Hóa Hóa Nam 1150000 VNĐ/500 gam MRS Nam cho chế phẩm cao nấm men của hãng broth, chi phí cho 1 lít môi trường là HIMEDIA®), 2 gam K2HPO4 (70000 khoảng 127000 VNĐ. Vậy chi phí cho 1 lít VNĐ/500 gam theo bảng báo giá của công môi trường tối ưu rẻ hơn 53000 VNĐ so ty Hóa Nam của hãng Xi Long.) Vậy chi với môi trường MRS broth của hãng phí cho 1 lít môi trường tối ưu là 74030 HIMEDIA® 30
8. Tạp chí Đại học Thủ Dầu Một, số 5 (24) – 2015 Bảng 10. Tính toán giá thành cho 1 lít môi trường tối ưu và môi trường MRS Tối ưu MRS Môi trường Giá thành Thành phần Số lượng Giá thành (VNĐ) Số lượng (VNĐ) Dứa (quả) 3 12000 0 0 Cao nấm men (HIMEDIA®) (gam) 47,5 61750 0 0 K2HPO4 (Xi Long) (gam) 2 280 0 0 MRS Broth(HIMEDIA®) (gam) 0 0 55,15 127000 Tổng cộng thành tiền (VNĐ) 74030 127000 Dứa: 4000 VNĐ/quả, cao nấm men (HIMEDIA®): 650000 VNĐ/500 gam, K2HPO4 (Xi Long): 70000 VNĐ/500 gam, MRS Broth(HIMEDIA®): 1150000 VNĐ/500 gam. Tuy nhiên mục đích đề tài này muốn ti u đạt cực đại. Thực hiện c c phương hướng đến là tận dụng nguồn dịch chiết pháp này giúp loại b được các yếu tố ít dứa từ phế phẩm cùi dứa của các công ty ảnh hưởng và chọn được các yếu tố ảnh sản xuất dứa hoanh đóng hộp, hi đó thì hưởng chính, từ đó tiết kiệm được hóa chất gi thành cho 1 lít môi trường tối ưu sẽ tiết và thời gian, đồng thời khảo s t được sự tác kiệm được hơn nữa. Chúng tôi tiến hành động qua lại giữa các yếu tố, thu được kết x c định hàm lượng đường trong dịch chiết quả tốt hơn c c phương ph p tối ưu từng từ quả dứa và từ cùi dứa bằng phương ph p nhân tố. DNS, kết quả cho thấ hàm lượng đường Trong 3 nhân tố ảnh hưởng chính thì trong dịch chiết từ quả dứa là 70 g/L cao cao nấm men đóng vai trò quan trọng, tuy hơn so với dịch chiết từ cùi dứa với 50 g/L, nhiên giá thành của loại này khá cao so với để phù hợp với kết quả tối ưu u cầu 55% các nguồn cung cấp Nitrogen h c, điều dịch chiết từ quả dứa tương ứng với 38,5 này sẽ ảnh hưởng đến giá thành của chế g/L đường thì khi sử dụng dịch chiết từ cùi phẩm khi tiến hành mở rộng ở quy mô công dứa hàm lượng dịch chiết bổ sung vào môi nghiệp. Do đó cần tiến hành nghiên cứu và trường là 77%. khảo sát thêm các nguồn Nitrogen thay thế Kết quả kiểm chứng của môi trường tối để hạ giá thành sản phẩm. ưu là Log (CFU/mL) = 9,280 tương đương Do nhu cầu ứng dụng lớn nên với kết quả thí nghiệm leo dốc là Log Probiotics được sử dụng tạo nhiều loại chế (CFU/mL) = 9,277 và kết quả của môi phẩm vì vậy cần tiến hành mở rộng khảo trường tối ưu cao hơn so với môi trường cơ sát trên nhiều chủng lợi khuẩn khác nhau. sở và môi trường MRS. Giá thành của 1 lít 4. KẾT LUẬN môi trường tối ưu rẻ hơn 53000 VNĐ so với môi trường MRS broth của Bằng phương ph p qu hoạch Plackett HIMEDIA®. – Burman từ 11 yếu tố khảo sát sàng lọc được 3 yếu tố có ảnh hưởng nhiều nhất đến Qua kết quả thu nhận được chúng tôi sinh khối của Lactobacillus casei là dịch nhận thấy rằng phương ph p Plac ett – chiết dứa, cao nấm men và tỷ lệ giống. Burman và phương ph p leo dốc Box – Xây dựng được mô hình tối ưu hóa bậc 1 Wilson là những phương ph p có ứng dụng tương thích với thực nghiệm. Bằng phương tốt trong việc sàng lọc và tối ưu hóa gi trị pháp leo dốc (phương ph p Box – Wilson) đã của các yếu tố khảo sát làm cho hàm mục x c định được điểm tối ưu của các yếu tố là 31
9. Journal of Thu Dau Mot University, No 5 (24) – 2015 cao nấm men 47,5 (g/L), dịch chiết dứa 55% trường tối ưu cao hơn môi trường cơ sở và (v/v) và tỷ lệ giống 9,5% (v/v). môi trường MRS, giá thành của môi trường Kết quả kiểm chứng ở thể tích 50 ml tối ưu rẻ hơn MRS broth của HIMEDIA. cho thấy mật độ tế bào thu được từ môi OPTIMIZATION OF BIOMASS PRODUCTION BY LACTOBACILLUS CASEI USING THE MODIFIED- MRS MEDIUM Dao Thi My Linh – Nguyen Hai Nam – Nguyen Thi Quynh Mai Ho Chi Minh City University of Food Industry ABSTRACT Lactobacillus casei is applied in many fields, so the demand for its biomass is huge. This study was conducted to optimize culture conditions for economic production of Lactobacillus casei biomass on modified MRS medium. Glucose is replaced with pineapple extract, as a low-cost main carbon source with vitamins and minerals to provide nutrients. 11 factors on bacterial growth was investigated using the Plackett – Burman experimental design, and pineapple extract, yeast extract, inoculation rate were found to be the most significant parameters. The optimum conditions including pineapple extract concentration, 55%(v/v); yeast extract concentration 47,5 (g/L); and an inoculation rate of 9,5% (v/v) were determined by Box – Wilson method. The maximum log value of the viable cells Lactobacillus casei in the optimized alternative medium was 9,280 Log (CFU/mL) at 18 h of incubation which was comparable to that obtained in the complex and expensive MRS medium 9,178 Log (CFU/mL). TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] A.Shahravy, F. Tabandeh, B. Bambai, H.R. Zamanizadeh and M. Mizani (2012), Optimization of probiotic Lactobacillus casei ATCC 334 production using date powder as carbon source, Department of Industrial and Environmental Biotechnology, National Institute of Genetic Engineering and Biotechnology (NIGEB), Tehran, Iran Faculty of Food Science and Technology, Science and Research Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran. [2] Carla Araya-Cloutier, Carolina Rojas-Garbanzo, and Carmela Velázquez-Carrillo, (2012), Effect of initial sugar concentration on the production of l (+) lactic acid by simultaneous enzymatic hydrolysis and fermentation of an agro-industrial waste product of pineapple (ananas comosus) using lactobacillus casei subspecies rhamnosus, Centro Nacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos (CITA), Universidad de Costa Rica (UCR), Postal address 11501- 2060 San José, Costa Rica. [3] Nguyễn Cảnh (2010), Quy hoạch thực nghiệm, NXB Đại Học Quốc gia TP.HCM [4] Đào Thị Minh Châu (2012), Khảo sát ảnh hưởng của phương pháp vi gói bằng Natri alginate lên số lượng và hoạt tính probiotic của Lactobacillus casei trong quá trình tạo bột sữa chua, luận văn thạc sĩ, Trường Đại học Bách Khoa TP. HCM. [5] J.C. De Man et al, “A medium for cultivation of Lactobacilli,” Journal of Applied Bacteriology, vol. 23, no. 1, pp 130-135, Apr. 1960. 32
10. Tạp chí Đại học Thủ Dầu Một, số 5 (24) – 2015 [6] Nguyễn Hữu Lộc (2011), Quy hoạch và phân tích thực nghiệm, NXB Đại học Quốc gia TP.HCM. [7] Lim, C.H., Rahim, R.A.,Ho, Y.W. and Arbakariya, B.A, Optimization of Growth medium for Efficient Cultivation of Lactobacillus salivarius I 24 using Response Surface Method , Malaysian Journal of Microbiology, Vol 3(2) 2007, pp. 41-47. [8] Lê Thanh Mai (2009), Các phương pháp phân tích ngành công nghệ lên men, NXB Khoa học và Kỹ thuật. [9] Michail S (2005), The Mechanism of Action of Probiotics, Wright State University School of Medicine, The Children’s Medical Center, Da ton, Ohio [10] Trần Linh Thước (2011), Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm, NXB Giáo dục Việt Nam. [11] PGS. TS. Bùi Minh Trí (2005), Xác suất thống kê và quy hoạch thực nghiệm, NXB Khoa học và Kỹ thuật. 33