›
›

Thực hành phân tích vi sinh thực phẩm - Lê Thùy Linh

pdf 31 trang phuongnguyen 30
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Thực hành phân tích vi sinh thực phẩm - Lê Thùy Linh", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfthuc_hanh_phan_tich_vi_sinh_thuc_pham_le_thuy_linh.pdf

Nội dung text: Thực hành phân tích vi sinh thực phẩm - Lê Thùy Linh

  1. Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM 2010 THỰC HÀNH PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM ThS. Lê Thùy Linh 0 Lưu hành nội bộ
  2. Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM NỘI DUNG Trang Bài 1: Định lượng Coliforms và E. coli 2 1.1. Tóm tắt kiến thức cơ bản 2 1.2. Quy trình định lượng Coliforms và E. coli bằng phương pháp MPN 3 1.3. Cách tiến hành thí nghiệm 4 1.4. Cách tính kết quả 10 Bài 2. Định lượng Staphylococcus aureus 10 2.1. Tóm tắt kiến thức cơ bản 10 2.2. Quy trình định lượng Staphylococcus aureus bằng phương pháp MPN 10 2.3. Cách tiến hành và cách tính kết quả 11 Bài 3. Định tính Salmonella 14 3.1. Tóm tắt kiến thức cơ bản 14 3.2. Qui trình định tính Salmonella trong thực phẩm 14 Bài 4. Định lượng Bacillus cereus 20 4.1. Tóm tắt kiến thức cơ bản 20 4.2. Quy trình định lượng Bacillus cereus bằng phương pháp đếm khuẩn lạc 20 Bài 5. Định lượng tổng vi khuẩn hiếu khí và tổng nấm men-nấm mốc 24 5.1. Tóm tắt kiến thức cơ bản 24 5.2. Quy trình phân tích 26 Tài liệu tham khảo 1. Trần Linh Thước, Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mĩ phẩm, NXB Giáo dục, 2006 2. 3. 4. 5. Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 1 Homepage:
  3. Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM Bài 1: Định lượng Coliforms và E. coli 1.1 Tóm tắt kiến thức cơ bản Hình 1: phát hiện Coliforms và E. 1.1.1 Định nghĩa coli trong thực phẩm hay nước bằng môi trường CHROMagar ECC Coliforms là những trực khuẩn gram âm không sinh bào tử, hiếu khí hoặc kỵ khí tùy ý, có khả năng lên men lactose sinh acid và sinh hơi ở 370C trong 24 – 48 giờ. Coliforms được xem là nhóm vi sinh vật chỉ thị: số lượng hiện diện của chúng trong thực phẩm, nước hay các loại mẫu môi trường được dùng để chỉ thị khả năng hiện diện của các loại vi sinh vật khác. Nhóm Coliforms gồm 4 giống là: E. coli, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter. Tính chất sinh hóa đặc trưng của nhóm này được thể hiện qua các thử nghiệm Indol (I), Methyl Red (MR), Voges-Proskauer (VP) và Citrate (iC) thường được gọi là IMViC. Coliforms chịu nhiệt là những Coliforms có khả năng lên men lactose sinh hơi trong khoảng 24h khi ủ ở 440C trong môi trường canh EC. Coliforms phân (Faecal Coliforms) là Coliforms chịu nhiệt có khả năng sinh indole khi ủ khoảng 24h ở 440C trong canh Trypton. E. coli là Coliforms phân cho kết quả thử nghiệm IMViC là ++ (Indol +, Methyl Red +, Voges-Proskauer -, Citrate -) 1.1.2 Phương pháp Most Probable Number (MPN) Đây là phương pháp định lượng dựa trên kết quả định tính của một loạt thí nghiệm được lặp lại ở một số độ pha loãng khác nhau. Thông thường, việc định lượng này được thực hiện lặp lại 3 lần ở 3 độ pha loãng bậc 10 liên tiếp, tổng cộng 3 x 3 = 9 ống nghiệm. Quy trình thực hiện như sau: Pha loãng mẫu phân tích ở 3 nồng độ pha loãng bậc 10 liên tiếp. Ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp Kết quả biểu kiến chứng minh sự tăng trưởng của vi sinh vật cần kiểm định Ghi nhận số lượng ống nghiệm dương tính ở từng độ pha loãng. Tra bảng Mac Crady Mật độ vi sinh vật MPN/100 ml hay MPN/1g mẫu Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 2 Homepage:
  4. Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM Chú ý: Đa số các bảng MPN cung cấp số liệu ở dạng số MPN trong 100ml dung dịch được sử dụng để phân tích ở các liều lượng là 10ml, 1ml, 0.1 ml. Trên thực tế phân tích, người ta thường dùng 1ml cho mẫu đã pha loãng 10-1, 10-2, 10-3. Lượng mẫu với các độ pha loãng này tương đương với 1/100 lượng mẫu sử dụng theo bảng MPN/100ml tính theo lượng mẫu là 10ml, 1ml, 0.1 ml nêu trên. Vậy số liệu của bảng MPN/100ml tính theo lượng mẫu là 10ml, 1ml, 0.1 ml tương đương với MPN/ml mẫu chưa pha loãng khi 1ml của các dung dịch có độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3 được dùng để phân tích. Trường hợp mật độ vi sinh vật quá cao, cần phải sử dụng loạt nồng độ pha loãng tiếp theo cần phải nhân trị số tra bảng MPN nêu trên với hệ số pha loãng. Ví dụ: sử dụng 1ml cho mỗi độ pha loãng 10-2, 10-3, 10-4 tức là chỉ sử dụng 1/10 lượng mẫu ở mỗi nồng độ so với trường hợp dùng 1ml mẫu ở các độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3. Do vậy, trị số tra bảng MPN cần nhân thêm hệ số pha loãng là 10. 1.2 Quy trình định lượng Coliforms và E. coli bằng phương pháp MPN Chuẩn bị dịch đồng nhất hoặc pha loãng mẫu để có độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3 Chuyển 1ml dung dịch 10-1, 10-2, 10-3 vào ống 10ml canh LSB, mỗi nồng độ có 3 ống lặp lại, ủ ở 370C, 48 giờ Ghi nhận các ống LSB (+) (sinh hơi) ở mỗi nồng độ pha loãng Cấy vào ống canh BGBL, Cấy vào ống canh EC, ủ ủ ở 370C ± 10C, 48 giờ ở 44.50C ± 0.20C, 24 giờ Số ống (+)(sinh hơi )ở Số ống (+) ở mỗi độ pha loãng mỗi độ pha loãng Cấy lên thạch EMB, ủ ở 370C, 24 giờ Coliforms Xem trang sau Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 3 Homepage:
  5. Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM Tiếp theo Chọn khuẩn lạc (tròn, dẹt hình đĩa và có ánh kim xanh), cấy vào Trypton, MR-VP, SC Citrate, ủ ở 44.50C ± 0.20C, 24 giờ Thử nghiệm IMViC Đếm số ống canh EC (+) và IMViC ++ , tra bảng MPN E. coli 1.3 Cách tiến hành thí nghiệm Mẫu phân tích: nước mía nguyên chất (dùng 10ml cho một tổ) 1.3.1 Pha môi trường và khử trùng dụng cụ Bước 1: pha môi trường Tên môi trường Thành phần Tổng thể tích Ghi chú SPW NaCl : 42.5g 500 ml nước Phân phối cho mỗi tổ 27ml (Saline Pepton Pepton: 5g cất SPW (9ml/ống nghiệm) Water) trước khi khử trùng. (buổi 1) LSB Tryptose: 20g 1000 ml nước Phân phối 90ml LSB cho (Lauryl Sulphate Lactose: 5g cất mỗi tổ (10ml/ống nghiệm) Broth) Sodium chloride: 5g pH 6.8 ± 0.2 trước khi khử trùng. (buổi 1) KH2PO4: 2.75g K2HPO4: 2.75g Lauryl sulphate: 0.1g BGBL Peptone: 10g 1000 ml nước Phân phối 90ml BGBL cho Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 4 Homepage:
  6. Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM (Brilliant Green Lactose: 10g cất mỗi tổ (10ml/ ống nghiệm có Bile Lactose Mật bò: 20g pH 7.4 chứa ống Durham) trước khi Broth) Brilliant green: 0.0133g khử trùng. (buổi 1) EC Trypticase or tryptose: 1000 ml nước Phân phối 90ml BGBL cho (E.coli medium) 20g cất mỗi tổ (10ml/ ống nghiệm có Muối mật No.3: 1.5g pH 6.9 chứa ống Durham) trước khi Lactose: 5g khử trùng. (buổi 1) KH2PO4: 1.5g K2HPO4: 4g NaCl: 5g EMB Pancreatic digest of 1000 ml nước Phân phối 100ml EMB cho (Eosin Methylene gelatin: 10g cất. mỗi tổ (20ml/petri) (buổi 2) Blue Agar) Lactose: 10g pH 7.1 ± 0.2 K2HPO4: 2g Eosin Y: 0.4g Methylene blue: 65mg Agar: 15g Tryptone water Tryptone hoặc 1000ml nước Mỗi tổ chỉ dùng 20ml, phân trypticase:10g cất phối 10ml/ống nghiệm. pH 7.2 ± 0.2 (buổi 3) MR-VP Both Môi trường 1: 1000ml nước Mỗi tổ chỉ dùng 30ml, phân (Glucose Buffered peptone-water cất. phối 10ml/ống nghiệm. Phosphate) powder: 7g pH 6.9 ± 0.2 Kiểm tra lại môi trường cung Glucose: 5g cấp nào để pha môi trường. K2HPO4: 5g (buổi 3) Môi trường 2: Casein Pancreatic Digest: 3.5g Peptic digest of animal tissue:3.5g Dextrose: 5g Potassium phosphate: 5g Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 5 Homepage:
  7. Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM pH 6.9 ± 0.2 Môi trường 3: Peptone: 5g Glucose: 5g Phosphate buffer: 5g pH 7.5 ± 0.2 SCA Sodium citrate: 2g 1000ml nước Mỗi tổ chỉ dùng 50ml, phân (Simmons Citrate NaCl: 5g cất. Đun nóng phối 10ml/ống nghiệm. Agar) K2HPO4: 1g nhẹ và thỉnh (buổi 3) NH4H2PO4: 1g thoảng lắc. MgSO4: 0.2g Đun sôi 1-2 Bromothymol blue: phút cho đến 0.08g khi hòa tan Agar: 15g hết. pH 6.8 ± 0.2 Bước 2: khử trùng dụng cụ và môi trường đã pha. Bao gói dụng cụ và phân phối môi trường vào dụng cụ, gắn nút và bao gói. Hấp tiệt trùng ở 1210C trong 15 phút. 1.3.2 Cách tiến hành: Bước 3: pha loãng mẫu 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml ống 9ml mẫu 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 Độ pha loãng Hình 2: quy trình pha loãng mẫu Pha loãng mẫu thành 3 nồng độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3. Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 6 Homepage:
  8. Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM Bước 4: Cấy mẫu vào canh LSB Chuyển 1ml dung dịch 10-1, 10-2, 10-3 vào ống 10ml canh LSB, mỗi nồng độ có 3 ống lặp lại, ủ ở 370C, 48 giờ. Hình 3: Sơ đồ cấy mẫu từ các độ pha loãng 10-1 10-2 10-3 Bước 5: Định lượng Coliform và E. coli Định lượng Coliform Định lượng E. coli Ghi nhận số ống có sinh hơi (+) Ghi nhận số ống có sinh hơi (+) Dùng que cấy vòng cấy chuyển dịch mẫu Dùng que cấy vòng cấy chuyển dịch mẫu từ các ống LSB (+) sang các ống có chứa từ các ống LSB (+) sang môi trường canh canh BGBL và ủ ở 370C ± 10C, 48 giờ EC, ủ ở 44.50C ± 0.20C, 24 giờ Ghi nhận số ống có sinh hơi (+) ứng với Ghi nhận số ống có sinh hơi (+) ứng với mỗi độ pha loãng mỗi độ pha loãng Tính kết quả (xem 1.4) Dùng que cấy vòng ria dịch mẫu từ các ống (+) trên canh EC sang môi trường thạch đĩa EMB. Ủ ở 370C, 24 giờ. Chọn khuẩn lạc đường kính lớn hơn 1mm (tròn, dẹt hình đĩa và có ánh kim xanh) (xem hình 4), cấy vào Trypton, MR-VP, SC Citrate, ủ ở 44.50C ± 0.20C, 24 giờ Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 7 Homepage:
  9. Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM Hình 4: E.coli nuôi trên môi trường thạch EMB cho khuẩn lạc màu kim xanh (theo Naowarat Cheeptham, Thompson Rivers University, Kamloops, BC, Canada) Bước 6: thử nghiệm IMViC Hình 5: Kết quả IMViC của Escherichia coli sau 24giờ ủ ở 37°C. (Anne Hanson, University of Maine, Orono) Ống A: dương tính thử nghiệm indole trên môi trường tryptone. Xuất hiện lớp màu đỏ trên bề mặt môi trường sau khi nhỏ thuốc thử Kovács. Ống B: dương tính thử nghiệm methyl red xuất hiện màu đỏ của methyl red. Ống C: âm tính thử nghiệm Voges-Proskauer biểu hiện qua sự không thay đổi màu sau khi cho thuốc thử Barritt’s A và Barritt’s B. Ống D: âm tính thử nghiệm citrate biểu hiện qua sự thay đổi màu sắc và không có khuẩn lạc trong ống nghiệm. a. Thử nghiệm Indol (I): Nguyên tắc: Tryptophan là một acid amin có thể bị oxi hóa bởi một số vi sinh vật có hệ enzyme tryptophanase tạo nên các sản phẩm chứa gốc indol. Việc phát hiện indol được thực hiện bằng phản ứng của phân tử này với các thuốc thử chứa p- Dimethylaminbenzaldehyde (p-DMABA) tạo nên một phức chất dạng quinone có màu đỏ. Phương pháp tiến hành: Môi trường sử dụng cho thử nghiệm này là nước tryptone. Sinh khối chủng thuần được cấy vào môi trường lỏng tryptone, ủ ở nhiệt độ 370C trong 24-48 giờ. Bổ sung 1ml ether hoặc xylene vào ống nghiệm, lắc đều để chiết Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 8 Homepage:
  10. Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM tách indol lên lớp dung môi hữu cơ. Nhỏ 5 giọt thuốc thử vào ống dịch nuôi cấy, để yên vài phút, theo dõi sự tạo màu đỏ trong lớp dung môi hữu cơ. Đọc kết quả: (+) xuất hiện của lớp màu đỏ trên bề mặt môi trường. (-) lớp màu vàng của thuốc thử. Đôi khi có sự xuất hiện của màu cam do skatol, là tiền chất của methyl hóa của indol, tạo ra. Hình 6: thử nghiệm Indol b. Thử nghiệm Methyl Red (MR): Nguyên tắc: chỉ thị đỏ methyl red giúp phân biệt nồng độ H+ hiện diện trong môi trường sau khi vi sinh vật lên men glucose. Chỉ thị này thay đổi màu như sau: pH 6.0 màu vàng. Phương pháp tiến hành: Môi trường sử dụng cho thử nghiệm này là môi trường lỏng Glucose Phosphate (MR-VP Broth). Dùng que vòng cấy một lượng nhỏ khuẩn lạc trên môi trường MR-VP, ủ ở 370C trong khoảng 2-5 ngày. Thêm vào vài giọt thuốc thử đỏ methyl red (0.02% trong hỗn hợp cồn nước có tỷ lệ 3:2, bảo quản ở 40C) vào trong ống nghiệm dịch nuôi cấy, đọc kết quả ngay. Đọc kết quả: (+) môi trường có màu đỏ sau khi bổ sung thuốc thử. (-) khi có màu vàng. Trường hợp màu cam, cần tiếp tục ủ ống môi trường có giống trong 4 ngày và thực hiện lại thử nghiệm. Hình 7: thử nghiệm MR c. Thử nghiệm Voges-Proskauer (VP) (xem mục 3.3, bài 3) d. Thử nghiệm Citrate (iC) Nguyên tắc: sự biến dưỡng citrate bởi vi sinh vật sẽ tạo ra CO2 làm kềm hóa môi trường. Mặt khác mọi VSV có khả năng sử dụng citrate làm nguồn carbon duy nhất đều có khả năng dùng muối ammonium làm nguồn đạm duy nhất. Sự phân giải của muối ammonium dùng làm nguồn đạm trong môi trường sẽ sinh NH3 làm kiềm hóa môi trường. Sự gia tăng giá trị pH này được chỉ thị bằng sự đổi màu của chỉ thị pH trong môi trường. Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 9 Homepage:
  11. Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM Phương pháp tiến hành: Môi trường sử dụng cho thử nghiệm này là môi trường lỏng SCA. Dùng que vòng cấy ria một lượng nhỏ khuẩn lạc lên môi trường SCA rắn trong ống nghiệm thạch nghiêng, ủ ở 350C trong khoảng 24-48 giờ. Đọc kết quả: (+) khi xuất hiện khuẩn lạc và môi trường chuyển sang màu xanh dương. (-) khi không có khuẩn lạc và môi trường giữ nguyên màu xanh lục. 1.4 Cách tính kết quả Hình 8: thử nghiệm Citrate Từ số lượng các ống nghiệm có E. coli (+) ở mỗi độ pha loãng của mẫu, dùng bảng MPN loạt 3 ống nghiệm ở 3 nồng độ pha loãng liên tiếp để tính ra mật độ vi sinh vật trong mẫu và biểu diễn dưới dạng trị số MPN/ml mẫu ban đầu chưa pha loãng. Bài 2. Định lượng Staphylococcus aureus 2.1. Tóm tắt kiến thức cơ bản Staphylococcus aureus là vi khuẩn hiếu khí hay kị khí tùy ý, hình cầu, gram dương, có thử nghiệm coagulase, phản ứng DNAse, phosphatease (+) có khả năng lên men và sinh acid từ mannitol, trehalose, sucrose. Tất cả các dòng S. aureus đều mẫn cảm với novobiocine, có khả năng tăng trưởng trong môi trường chứa đến 15% NaCl. Một số dòng có khả năng tăng trưởng làm Hình 9: S. aureus trên BPA tan máu trên môi trường thạch máu. S. aureus có thể nhiễm vào thực phẩm qua con đường tiếp xúc với người thao tác trong quá trình chế biến thực phẩm. Sự hiện diện với mật độ cao của S. aureus trong thực phẩm chỉ thị điều kiện vệ sinh và kiểm soát nhiệt độ kém của quá trình chế biến. 2.2 Quy trình định lượng Staphylococcus aureus bằng phương pháp MPN Phương pháp này được dùng để định lượng S. aureus trong mẫu có mật độ S. aureus thấp nhưng mật độ vi sinh vật cạnh tranh cao. Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 10 Homepage:
  12. Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM Phương pháp tiến hành: Môi trường sử dụng cho thử nghiệm này là môi trường lỏng SCA. Dùng que vòng cấy ria một lượng nhỏ khuẩn lạc lên môi trường SCA rắn trong ống nghiệm thạch nghiêng, ủ ở 350C trong khoảng 24-48 giờ. Đọc kết quả: (+) khi xuất hiện khuẩn lạc và môi trường chuyển sang màu xanh dương. (-) khi không có khuẩn lạc và môi trường giữ nguyên màu xanh lục. 1.4 Cách tính kết quả Hình 8: thử nghiệm Citrate Từ số lượng các ống nghiệm có E. coli (+) ở mỗi độ pha loãng của mẫu, dùng bảng MPN loạt 3 ống nghiệm ở 3 nồng độ pha loãng liên tiếp để tính ra mật độ vi sinh vật trong mẫu và biểu diễn dưới dạng trị số MPN/ml mẫu ban đầu chưa pha loãng. Bài 2. Định lượng Staphylococcus aureus 2.1. Tóm tắt kiến thức cơ bản Staphylococcus aureus là vi khuẩn hiếu khí hay kị khí tùy ý, hình cầu, gram dương, có thử nghiệm coagulase, phản ứng DNAse, phosphatease (+) có khả năng lên men và sinh acid từ mannitol, trehalose, sucrose. Tất cả các dòng S. aureus đều mẫn cảm với novobiocine, có khả năng tăng trưởng trong môi trường chứa đến 15% NaCl. Một số dòng có khả năng tăng trưởng làm Hình 9: S. aureus trên BPA tan máu trên môi trường thạch máu. S. aureus có thể nhiễm vào thực phẩm qua con đường tiếp xúc với người thao tác trong quá trình chế biến thực phẩm. Sự hiện diện với mật độ cao của S. aureus trong thực phẩm chỉ thị điều kiện vệ sinh và kiểm soát nhiệt độ kém của quá trình chế biến. 2.2 Quy trình định lượng Staphylococcus aureus bằng phương pháp MPN Phương pháp này được dùng để định lượng S. aureus trong mẫu có mật độ S. aureus thấp nhưng mật độ vi sinh vật cạnh tranh cao. Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 10 Homepage:
  13. Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM Đồng nhất mẫu và pha loãng mẫu thành các dãy nồng độ thập phân 10-1, 10-2, 10-3 -1 -2 -3 Chuyển 1ml dung dịch 10 , 10 , 10 vào ống 10ml canh 0 MSB, mỗi nồng độ có 3 ống lặp lại, ủ ở 37 C, 48 giờ Chọn ống (+) đục ở mỗi độ pha loãng 0 Ria lên đĩa thạch BPA, ủ ở 37 C, 48 giờ Chọn khuẩn lạc đặc trưng (tròn lồi, đen bóng, có quầng trong và quầng sáng xung quanh (đôi khi chỉ xuất hiện 1 trong 2 quầng)) Cấy vào TSA, ủ ở 370C ± 10C , 24 giờ Thử nghiệm ngưng kết coagulase Ghi nhận số coagulase (+) ở mỗi độ pha loãng Tra bảng MPN Mật độ S.aureus (MPN/g hoặc MPN/ml) 2.3 Cách tiến hành và tính kết quả Mẫu phân tích: thịt heo sống, khối lượng 50g cho 1 lớp Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 11 Homepage:
  14. Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM Bước 1: pha môi trường Tên môi trường Thành phần Tổng thể tích Ghi chú SPW NaCl : 42.5g 500 ml nước Phân phối cho mỗi tổ 27ml (Saline Pepton Pepton: 5g cất SPW (9ml/ống nghiệm) Water) trước khi khử trùng. (buổi 2) MSB Cao thịt: 1g 1000 ml nước Phân phối 90ml MSB cho (Mannitol Salt Polypeptone: 10g cất mỗi tổ (10ml/ống nghiệm) Broth) NaCl: 75g pH 7.4 ± 0.2 trước khi khử trùng. (buổi 2) Mannitol: 10g Phenol red: 0.025g BPA Môi trường cơ bản 1000 ml nước Phân phối 100ml BPA cho (Baird Parker Tryptone:10g cất cho môi mỗi tổ (20ml/petri) (buổi 2) Agar) Cao thịt: 5g trường cơ bản Cao nấm men: 1g pH 7.0 ± 0.2 Sodium pyruvate: 10g Glycine: 12g Lithium chloride.6H2O: 5g Agar: 20g Môi trường hoàn chỉnh 5ml Bacto EY tellurite enrichment (45-500C) vào 95ml môi trường cơ bản được làm nóng chảy. Môi trường hoàn chỉnh phải đục. TSA Trypticase peptone: 15g 1000 ml nước Phân phối 50ml BGBL cho (Tryptone Soya Phytone peptone: 5g cất mỗi tổ (25ml/petri) (buổi 3) Agar) NaCl: 5g pH 7.3± 0.2 Agar: 15g Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 12 Homepage:
  15. Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM Bước 2: khử trùng dụng cụ và môi trường đã pha. Bao gói dụng cụ và phân phối môi trường vào dụng cụ, gắn nút và bao gói. Hấp tiệt trùng ở 1210C trong 15 phút. Bước 3: đồng nhất mẫu và pha loãng mẫu Cân 10g mẫu trong túi PE vô trùng, thêm 90ml dung dich SPW, đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu khoảng 30 giây. Pha loãng mẫu (xem bài 1, mục 1.3.2) Bước 4: Cấy mẫu vào canh MSB Chuyển 1ml dung dịch 10-1, 10-2, 10-3 vào ống 10ml canh MSB, mỗi nồng độ có 3 ống lặp lại, ủ ở 370C, 48 giờ. (xem bài 1, mục 1.3.2). Chọn các ống (+) có vi sinh vật phát triển làm đục môi trường để tiến hành phân lập khuẩn lạc đơn trên BPA Bước 5: phân lập khuẩn lạc đơn trên BPA Dùng kỹ thuật cấy ria lên đĩa thạch BPA, ủ ở 370C, 48 giờ. Chọn khuẩn lạc đặc trưng :tròn lồi, đen bóng, có quầng trong và quầng sáng xung quanh; đôi khi chỉ xuất hiện 1 trong 2 quầng (xem hình 10). Hình 10: hình dạng S. aureus trên BPA Chọn khuẩn lạc đặc trưng của S. aureus trên BPA để thử nghiệm sinh hóa coagulase Bước 6: thử nghiệm sinh hóa coagulase Nguyên tắc: các loài thuộc giống Staphylococcus có khả năng tiết ra môi trường enzyme coagulase có tác dụng làm kết tụ các thành phần của huyết tương, tạo thành các khối đông làm đông huyết tương. Phương pháp tiến hành: Huyết tương người hay thỏ đông khô thương phẩm được dùng cho thử nghiệm này. Cho vào ống nghiệm 0.5ml huyết tương người hay thỏ không pha loãng, bổ sung 0.5ml dịch nuôi cấy chủng thuần hoặc một lượng lớn sinh khối khuẩn lạc. Xoay nhẹ ống để trộn đều VSV. Ủ ống thử nghiệm ở 370C trong 4 giờ. Quan sát, ghi nhận sự ngưng kết mỗi 30 phút. Tiếp tục ủ đến 24 giờ nếu không thấy xuất hiện khối kết tụ. Đọc kết quả: (+) có sự kết tụ; (-) không có sự kết tụ, hỗn hợp vẫn đồng nhất Hình 11: thử nghiệm coagulase. Ống trên (+); ống dưới (-) Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 13 Homepage:
  16. Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM Bài 3. Định tính Salmonella 3.1 Tóm tắt kiến thức cơ bản Hình 12: Salmonella trên thạch XLD Salmonella là trực trùng gram âm, hiếu khí và kị khí tùy ý, có khả năng di động không tạo bào tử, lên men glucose và mannitol sinh acid nhưng không lên men saccharose và lactose, không sinh Indole, không phân giải ure, không có khả năng tách nhóm amine từ tryptophane, hầu hết các chủng đều sinh H2S. Salmonella có thể phân tích định tính bằng mộ quy trình gồm 4 bước: tăng sinh, tăng sinh chọn lọc, phân lập và khẳng định. Salmonella thường có mặt trong mẫu với số lượng nhỏ, bị tổn thương và cùng hiện diện chung với một số lượng lớn với các loài vi khuẩn khác thuộc họ Enterobacteriaceae có tính cạnh tranh mạnh và ức chế sự tăng trưởng của Salmonella. 3.2 Quy trình định tính Salmonella trong thực phẩm Đồng nhất 25g mẫu trong 225ml môi trường tăng sinh BPW, ủ ở 370C, 18-24 giờ Cấy 0.1ml dịch tăng sinh sang môi trường tăng sinh chọn lọc RV, ủ ở 420C, 18-24 giờ Phân lập khuẩn lạc đơn trên ít nhất 2 môi trường chọn lọc đặc biệt (XLD, HE, BS, SS ), ủ ở 370C, 24 giờ Chọn các khuẩn lạc đặc trưng cho Salmonella, cấy sang BHI hay TSA, ủ qua đêm Thử nghiệm sinh hóa cho kết quả: - Trên KIA/TSI: đỏ/vàng, có/không H2S, sinh hơi/không - Urea (-); Indol (-); VP (-); LDC (+); ODC (+); Manitol (+); Sorbitol (+) Salmonella dương tính/ âm tính trong 25g mẫu Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 14 Homepage:
  17. Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM 3.3 Cách tiến hành và tính kết quả Mẫu phân tích: cá hoặc ruột cá, khối lượng 25g cho 1 lớp Bước 1: pha môi trường Tên môi trường Thành phần Tổng thể tích Ghi chú BPW Pepton: 10g 1000 ml nước Phân phối cho mỗi tổ 20ml (Buffered Pepton NaCl : 5g cất BPW trước khi khử trùng. Water) Na2HPO4: 3.5g pH 7.2 ± 0.2 (buổi 2) KH2PO4: 1.5g RV Môi trường cơ bản 1110 ml Phân phối 30ml RV cho mỗi (Rappaport- Tryptone:5g pH 5.5 ± 0.2 tổ (10ml/ống nghiệm) trước Vassiliadis Soya Pepton) NaCl: 8g khi khử trùng. (buổi 2) KH2PO4: 1.6g Nước cất: 1000 ml Dung dịch MgCl2 MgCl2.6H2O: 400g Nước cất: 1000 ml Dung dịch Malachite green oxalate Malachite green oxalate: 0.4g Nước cất: 100 ml Môi trường hoàn chỉnh Môi trường cơ bản: 1000ml Dung dịch MgCl2: 100ml Dung dịch Malachite green oxalate: 10ml XLD Cao nấm men: 3g 1000 ml nước Phân phối 50ml XLD cho (Xylose Lysine L-lysine: 5g cất mỗi tổ (25ml/petri) (buổi 3) Desoxycholate) Xylose: 3.75g pH 7.4 ± 0.2 Lactose: 7.5g Đun sôi môi Sucrose: 7.5g trường. Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 15 Homepage:
  18. Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM Sodium deoxycholate: Không hấp. 2.5g Không giữ Ferric ammonium quá 1 ngày citrate: 0.8g Sodium thiosulfate: 6.8g NaCl: 5g Agar:15g Phenol red: 0.08g HE Proteose Peptone: 12.0g 1000 ml nước Phân phối 50ml HE cho mỗi (Hektoen Entric Yeast Extract: 3.0g cất tổ (25ml/petri) (buổi 3) Agar) Bile Salts No. 3: 9.0g pH 7.5± 0.2 Lactose: 12.0g Đun sôi môi Saccharose: 12.0g trường. Salicin: 2.0g Không hấp. Sodium Chloride: 5.0g Sodium Thiosulfate: 5.0g Ferric Ammonium Citrate : 1.5g Agar: 14.0g Bromthymol Blue: 65.0mg Acid Fuchsin : 0.1g TSA Trypticase peptone: 15g 1000 ml nước Phân phối 50ml TSA cho (Tryptone Soya Phytone peptone: 5g cất mỗi tổ (25ml/petri) (buổi 4) Agar) NaCl: 5g pH 7.3± 0.2 Agar: 15g KIA Polypeptone peptone: 1000 ml nước Phân phối 20ml KIA cho (Kliger Iron 20g cất mỗi tổ (10ml/ống nghiệm) Agar) Lactose: 20g pH 7.4± 0.2 (buổi 5) Dextrose: 1g NaCl: 5g Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 16 Homepage:
  19. Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM Ferric ammonium citrate: 0.5g Sodium thiosulfate: 0.5g Agar: 15g Phenol red: 0.025g MR-VP Both Môi trường 1: 1000ml nước Mỗi tổ chỉ dùng 40ml, phân (Glucose Buffered peptone-water cất. phối 10ml/ống nghiệm. Phosphate) powder: 7g pH 6.9 ± 0.2 Kiểm tra lại môi trường cung Glucose: 5g cấp nào để pha môi trường. K2HPO4: 5g (buổi 5) Môi trường 2: Casein Pancreatic Digest: 3.5g Peptic digest of animal tissue:3.5g Dextrose: 5g Potassium phosphate: 5g pH 6.9 ± 0.2 Môi trường 3: Peptone: 5g Glucose: 5g Phosphate buffer: 5g pH 7.5 ± 0.2 RSU Dipotassium Phosphate: 1000ml nước Mỗi tổ chỉ dùng 30ml, phân (Rustigian-Stuart 9.5g cất. phối 3ml/ống nghiệm. Urea Broth) Yeast Extract: 0.1g pH 6.8 ± 0.2 (buổi 5) Urea: 20g Monopotassium Phosphate: 9.1g Phenol Red: 0.01g Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 17 Homepage:
  20. Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM Bước 2: khử trùng dụng cụ và môi trường đã pha. Bao gói dụng cụ và phân phối môi trường vào dụng cụ, gắn nút và bao gói. Hấp tiệt trùng ở 1210C trong 15 phút. Bước 4: Tăng sinh Đối với các loại mẫu thông thường tiến hành cân 25g mẫu trong túi PE vô trùng, bổ sung 225ml dung dịch BPW và đồng nhất mẫu bằng Stomacher trong 15 hoặc 30 giây. Ủ ở 370C, 18-24 giờ. Đối với một số loại thực phẩm (mẫu gia cầm tươi sống, sữa khô, các gia vị hay các loại thực phẩm chứa nhiều gia vị, casein, pho mát, bơ, sản phẩm chứa cocoa, các sản phẩm của dừa) có chứa các chất có thể gây độc hoặc ức chế sự tăng trưởng của Salmonella cần thực hiện quy trình tăng sinh đặc biệt (xem TLTK). Bước 5: Tăng sinh chọn lọc Lắc để trộn đều dịch tăng sinh, và chuyển 0.1ml sang 10ml môi trường tăng sinh RV đã được ủ ấm 420C. Ủ ở 420C, 18-24 giờ. Khi cần thiết có thể kéo dài thời gian ủ thêm 24 giờ. Bước 6: Phân lập và nhận diện Dùng que cấy vòng thực hiện kỹ thuật cấy phân lập khuẩn lạc đơn với giống từ dịch tăng sinh chọn lọc lên đĩa môi trường chọn lọc phân biệt đặc trưng cho Salmonella như XLD và HE. Biểu hiện của Salmonella trên từng môi trường như sau: + Môi trường XLD: khuẩn lạc có màu hồng trong suốt, có hay không có tâm đen. Một số dòng Salmonella có thể có tâm đen bóng rất lớn có thể chiếm gần hết khuẩn lạc. Hình 13: khuẩn lạc Salmonella trên XLD Hình 14: khuẩn lạc Salmonella trên HE + Môi trường HE: khuẩn lạc Salmonella có màu thay đổi từ xanh dương đến màu xanh lục, có hay không có tâm đen. Một số dòng Salmonella có thể có tâm đen bóng rất lớn có thể chiếm gần hết khuẩn lạc. Bước 7: Khẳng định Từ mỗi môi trường chọn lọc phân biệt chọn và cấy chuyền ít nhất 5 khuẩn lạc nghi ngờ sang môi trường không chọn lọc TSA. Ủ ở 370C, 18-24 giờ. Các khuẩn lạc xuất hiện trên môi trường này được sử dụng cho các thử nghiệm sinh hóa như sau: Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 18 Homepage:
  21. Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM + Thử nghiệm sinh H2S trên môi trường KIA (Kligler Iron Agar): Môi trường KIA được sử dụng để thử nghiệm khả năng sử dụng các nguồn carbon khác nhau (glucose, lactose) và khả năng sinh H2S. Về nguồn carbon, môi trường KIA chứa 2 loại đường là 1% lactose và 0.1% glucose. Khi cấy chủng vi sinh vật lên môi trường này có 3 trường hợp xảy ra đối với sự tăng trưởng của VSV: chỉ sử dụng glucose, sử dụng glucose và lactose, không sử dụng cả hai đường này. Salmonella chỉ lên men được đường glucose vì thế phần nghiêng của môi trường có màu đỏ, phần sâu có màu vàng. Thời gian ủ từ 18-24 giờ. Về sinh hơi: đa số các dòng Salmonella đều có khả năng sinh H2S nên có xuất hiện các vệt màu đen trong môi trường này. Có thể thấy hiện tượng sinh hơi qua hiện tượng làm vỡ thạch môi trường hoặc môi trường bị đẩy lên trên tạo một khoảng không bên dưới đáy ống nghiệm. Hình 15: thử nghiệm KIA. Ống 1: môi trường KIA không có VSV. Ống 2: xuất hiện màu vàng chứng tỏ VSV lên men lactose tốt (lên men glucose cũng tốt). Ống 3: có sinh khí, chứng tỏ lên men có sinh khí. Ống 4: màu đỏ trên phần thạch nghiêng, màu vàng dưới đáy chứng tỏ VSV chỉ lên men glucose. Ống 5: màu đen xuất hiện chứng tỏ có quá trình khử lưu huỳnh và sinh H2S. + Thử nghiệm urea (-): được thực hiện trên môi trường urea lỏng RSU (Rustigian – Stuart’s Urea Broth), chứa chỉ thị đỏ phenol, chuyển màu từ vàng sang đỏ (vùng chuyển màu là pH 6.8-8.4). Dùng que cấy vòng cấy lượng sinh khối lớn từ khuẩn lạc của chủng thuần vào ống chứa 3ml môi trường vô trùng, lắc nhẹ ống để trộn đều vi khuẩn và ủ ở 370C trong 48 giờ. Salmonella không phân giải urea nên không làm thay đổi pH môi trường; sau khi nuôi cấy môi trường vẫn giữ nguyên Hình 16: kết quả thử nghiệm Urea màu vàng cam. + Thử nghiệm VP (-): môi trường được sử dụng là môi trường lỏng Clark-Lubs (môi trường MR-VP), pH 6.9. Dùng que cấy vòng cấy vào các ống môi trường MR-VP một ít sinh khối từ khuẩn lạc của chủng thuần đã ủ 18-24 giờ trên môi trường KIA. Sau thời gian ủ, bổ sung thuốc thử trực tiếp vào ống môi trường. Thuốc thử Barritt gồm dung dịch A là 5% α-naphthol trong cồn Hình 17: kết quả thử Biên songhiạn:ệm Lê VP Th ùy Linh Page | 19 Homepage:
  22. Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM tuyệt đối, dung dịch B là 40% NaOH hay KOH. Trước tiên nhỏ 6 giọt dung dịch A, sau đó nhỏ 2 giọt dung dịch B. Đọc kết quả sau 20 phút hoặc chậm nhất 4 giờ. Salmonella cho phản ứng âm tính với thử nghiệm VP có hiện tượng không đổi màu trên bề mặt môi trường. Thử nghiệm VP (+) khi có màu đỏ trên bề mặt môi trường. Bài 4. Định lượng Bacillus cereus 4.1 Tóm tắt kiến thức cơ bản B. cereus là những trực khuẩn, gram dương, hiếu khí và kỵ khí tùy ý, di động, tạo nội bào tử, lên men glucose sinh hơi, phản ứng VP (+), có khả năng sử dụng nitrate. Loài này tăng trưởng được trong khoảng nhiệt độ từ 50C – 500C, tối ưu ở 350C – 400C; pH dao động từ 4.5-9.3, dễ tạo bào tử và bào tử nảy mầm rất dễ dàng. Trên môi trường chọn lọc loài này tạo khuẩn lạc rất lớn, mọc lan, rìa nhăn. 4.2 Quy trình định lượng Bacillus cereus bằng phương pháp đếm khuẩn lạc Cân 25g mẫu, đồng nhất trong 225ml BPW, đồng nhất bằng Stomacher, độ pha loãng 10-1 -2 -3 Pha loãng đến các độ pha loãng 10 , 10 Trãi 0.1ml mỗi độ pha loãng lên môi trường thạch MYP, ủ ở 300C, 24 giờ Chọn 5 khuẩn lạc có màu hồng eosin, lecithinase dương tính (tủa lecithinase bao quanh khuẩn lạc) cấy sang thạch nghiêng MYP, ủ ở 300C, 24 giờ Nhuộm Gram và thử nghiệm sinh hóa như: lên men glucose, thử nghiệm VP. Kết luận B. cereus Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 20 Homepage:
  23. Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM tuyệt đối, dung dịch B là 40% NaOH hay KOH. Trước tiên nhỏ 6 giọt dung dịch A, sau đó nhỏ 2 giọt dung dịch B. Đọc kết quả sau 20 phút hoặc chậm nhất 4 giờ. Salmonella cho phản ứng âm tính với thử nghiệm VP có hiện tượng không đổi màu trên bề mặt môi trường. Thử nghiệm VP (+) khi có màu đỏ trên bề mặt môi trường. Bài 4. Định lượng Bacillus cereus 4.1 Tóm tắt kiến thức cơ bản B. cereus là những trực khuẩn, gram dương, hiếu khí và kỵ khí tùy ý, di động, tạo nội bào tử, lên men glucose sinh hơi, phản ứng VP (+), có khả năng sử dụng nitrate. Loài này tăng trưởng được trong khoảng nhiệt độ từ 50C – 500C, tối ưu ở 350C – 400C; pH dao động từ 4.5-9.3, dễ tạo bào tử và bào tử nảy mầm rất dễ dàng. Trên môi trường chọn lọc loài này tạo khuẩn lạc rất lớn, mọc lan, rìa nhăn. 4.2 Quy trình định lượng Bacillus cereus bằng phương pháp đếm khuẩn lạc Cân 25g mẫu, đồng nhất trong 225ml BPW, đồng nhất bằng Stomacher, độ pha loãng 10-1 -2 -3 Pha loãng đến các độ pha loãng 10 , 10 Trãi 0.1ml mỗi độ pha loãng lên môi trường thạch MYP, ủ ở 300C, 24 giờ Chọn 5 khuẩn lạc có màu hồng eosin, lecithinase dương tính (tủa lecithinase bao quanh khuẩn lạc) cấy sang thạch nghiêng MYP, ủ ở 300C, 24 giờ Nhuộm Gram và thử nghiệm sinh hóa như: lên men glucose, thử nghiệm VP. Kết luận B. cereus Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 20 Homepage:
  24. Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM 4.3 Cách tiến hành và tính kết quả Mẫu phân tích: tôm khô, khối lượng 50g cho 1 lớp Bước 1: pha môi trường Tên môi trường Thành phần Tổng thể tích Ghi chú BPW Pepton: 10g 1000 ml nước Phân phối cho mỗi tổ 50ml (Buffered Pepton NaCl : 5g cất BPW trước khi khử trùng. Water) Na2HPO4: 3.5g pH 7.2 ± 0.2 (buổi 4) KH2PO4: 1.5g MYP Môi trường cơ bản Môi trường Phân phối 100ml MYP cho (Mannitol-Egg Cao thịt: 1g cơ bản đem mỗi tổ (12.5ml/petri). (buổi Yolk-Polymycin) Pepton: 10g khử trùng, để 4) Mannitol: 10g nguội 500C. NaCl: 10g Sau đó trộn Phenol red (1% trong các thành ethanol 90%): 2.5ml phần còn lại Agar: 15g Nước cất: 900 ml Dung dịch Polymixin 0.1% Hòa tan 500 000 đơn vị polymixin B sulfate trong 50ml nước cất. Lọc vô trùng và cất trong tối 40C cho đến khi dùng. Egg yolk emulsion 50% (sản phẩm thương mại) Môi trường cuối cùng Môi trường cơ bản: 225ml (ở 500C) Dung dịch Polymixin B: Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 21 Homepage:
  25. Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM 2.5ml Egg yolk emulsion (lòng đỏ trứng): 12.5ml PRG Proteose peptone No. 3: 1000 ml nước Phân phối 30ml PRG cho (Phenol Red 10 g cất mỗi tổ (3ml/ống nghiệm) Glucose Broth) NaCl: 5 g pH 7.4 ± 0.2 (buổi 4) Beef extract (optional): 1 g Dextrose: 5 g Phenol red (7.2 ml of 0.25% solution): 0.018 g MR-VP Both Môi trường 1: 1000ml nước Mỗi tổ chỉ dùng 50ml, phân (Glucose Buffered peptone-water cất. phối 10ml/ống nghiệm. Phosphate) powder: 7g pH 6.9 ± 0.2 Kiểm tra lại môi trường cung Glucose: 5g cấp nào để pha môi trường. K2HPO4: 5g (buổi 4) Môi trường 2: Casein Pancreatic Digest: 3.5g Peptic digest of animal tissue:3.5g Dextrose: 5g Potassium phosphate: 5g pH 6.9 ± 0.2 Môi trường 3: Peptone: 5g Glucose: 5g Phosphate buffer: 5g pH 7.5 ± 0.2 Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 22 Homepage:
  26. Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM Bước 2: khử trùng dụng cụ và môi trường đã pha. Bao gói dụng cụ và phân phối môi trường vào dụng cụ, gắn nút và bao gói. Hấp tiệt trùng ở 1210C trong 15 phút. Bước 3: Pha loãng mẫu Cho 25g mẫu vào túi PE, bổ sung 225ml môi trường BPW đồng nhất để có độ pha loãng 10-1, đồng nhất bằng Stomacher trong 1 phút. Mẫu tiếp tục pha loãng thành 10-2, 10-3. Bước 4: Phát hiện bằng môi trường chọn lọc Trãi 0.1ml mỗi độ pha loãng trên môi trường thạch MYP, ủ ở 300C, 24 giờ. Do B. cereus không lên men mannitol, tạo lecithinase và kháng polymycin nên trên môi trường này khuẩn lạc B. cereus có màu hồng eosin, được bao quanh bởi vùng có tủa chứng tỏ lecithinase được tạo thành. Chọn 5 khuẩn lạc (+) cấy sang thạch nghiêng để chuẩn bị cho các phản ứng khẳng định. Hình 18: khuẩn lạc B. cereus trên MYP Bước 5: Các thử nghiệm khẳng định Hình 19: nhuộm gram B. cereus - Nhuộm Gram: nhỏ 1 giọt nước cất lên phiến kính sạch; dùng que cấy vòng lấy 1 ít sinh khối vi khuẩn chuyển vào giọt nước trên phiến kính, khuấy nhẹ. Cố định vệt bôi trên phiến kính bằng cách hơ trên ngọn lửa đèn cồn. Nhỏ vài giọt methyl violet lên vệt bôi, giữ yên 20 giây. Rửa sạch phẩm nhuộm bằng nước. Nhỏ vài giọt dung dịch KI/I2 lên vệt bôi, để yên 1 phút. Rửa bằng cồn 95% đến vừa mất màu. Rửa lại bằng nước. Nhuộm bằng dung dịch safranin 30 giây. Rửa sạch bằng nước. Thấm nước dư bằng giấy lọc. Quan sát vi khuẩn bằng vật kính 100X nhúng trong dầu, Gram dương có màu xanh tía, Gram âm có màu đỏ hồng. - Thử nghiệm lên men glucose: cấy vi khuẩn vào 3ml canh PRG, ủ ở 350C, 24 giờ trong điều kiện kỵ khí. Lắc ống nghiệm thật mạnh và quan sát sự phát triển thông qua độ đục và sự chuyển màu từ đỏ sang vàng, chứng tỏ sự sinh acid từ glucose trong điều kiện kỵ khí. Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 23 Homepage:
  27. Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM Hình 20: thử nghiệm lên men glucose. Ống a: đối chứng. Ống b: không lên men glucose. Ống c: lên men yếu. Ống d: lên men mạnh. - Thử nghiệm VP (xem bài 3) Bài 5. Định lượng tổng vi khuẩn hiếu khí và tổng nấm men-nấm mốc 5.1 Tóm tắt kiến thức cơ bản Vi khuẩn hiếu khí là những vi khuẩn tăng trưởng và hình thành khuẩn lạc trong điều kiện có oxi phân tử. Tổng số vi khuẩn hiếu khí hiện diện trong mẫu chỉ thị mức độ vệ sinh của thực phẩm. Chỉ số này được xác định bằng phương pháp đếm khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch dinh dưỡng từ một lượng mẫu xác định trên cơ sở xem 1 khuẩn lạc là sinh khối phát triển từ 1 tế bào hiện diện trong mẫu và được biểu diễn dưới dạng số đơn vị hình thành khuẩn lạc (colony forming unit, CFU) trong một đơn vị khối lượng thực phẩm. Nấm mốc là vi nấm dạng sợi, sinh sản bằng bào tử hoặc khuẩn ty. Nấm men là những tế bào đơn tính phát triển theo kiểu nảy chồi, thỉnh thoảng có thể tồn tại ở dạng khuẩn ty giả trong đó các tế bào kết nhau thành chuỗi. Đơn vị hình thành khuẩn lạc của nấm mốc và nấm men là mầm để tạo nên một khuẩn lạc khi nuôi cấy trong môi trường. Mầm có thể là một bào tử, một tế bào hay một đoạn của khuẩn ty. Trong thực phẩm, nấm mốc và nấm men hiện diện có thể tăng trưởng làm thay đổi màu của thực phẩm, làm phát sinh mùi hay vị lạ, làm hư hỏng hay thay đổi cơ cấu của thực phẩm. Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 24 Homepage:
  28. Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM Hình 20: thử nghiệm lên men glucose. Ống a: đối chứng. Ống b: không lên men glucose. Ống c: lên men yếu. Ống d: lên men mạnh. - Thử nghiệm VP (xem bài 3) Bài 5. Định lượng tổng vi khuẩn hiếu khí và tổng nấm men-nấm mốc 5.1 Tóm tắt kiến thức cơ bản Vi khuẩn hiếu khí là những vi khuẩn tăng trưởng và hình thành khuẩn lạc trong điều kiện có oxi phân tử. Tổng số vi khuẩn hiếu khí hiện diện trong mẫu chỉ thị mức độ vệ sinh của thực phẩm. Chỉ số này được xác định bằng phương pháp đếm khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch dinh dưỡng từ một lượng mẫu xác định trên cơ sở xem 1 khuẩn lạc là sinh khối phát triển từ 1 tế bào hiện diện trong mẫu và được biểu diễn dưới dạng số đơn vị hình thành khuẩn lạc (colony forming unit, CFU) trong một đơn vị khối lượng thực phẩm. Nấm mốc là vi nấm dạng sợi, sinh sản bằng bào tử hoặc khuẩn ty. Nấm men là những tế bào đơn tính phát triển theo kiểu nảy chồi, thỉnh thoảng có thể tồn tại ở dạng khuẩn ty giả trong đó các tế bào kết nhau thành chuỗi. Đơn vị hình thành khuẩn lạc của nấm mốc và nấm men là mầm để tạo nên một khuẩn lạc khi nuôi cấy trong môi trường. Mầm có thể là một bào tử, một tế bào hay một đoạn của khuẩn ty. Trong thực phẩm, nấm mốc và nấm men hiện diện có thể tăng trưởng làm thay đổi màu của thực phẩm, làm phát sinh mùi hay vị lạ, làm hư hỏng hay thay đổi cơ cấu của thực phẩm. Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 24 Homepage:
  29. Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM 5.2 Quy trình phân tích Đồng nhất và pha loãng mẫu để có độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3, 10-4 Xác định tổng số VK hiếu Xác định tổng số nấm men nấm khí bằng kỷ thuật hộp đổ mốc bằng kỷ thuật hộp trải Chọn 2 nồng độ pha loãng Trải 0.1ml mẫu lên đĩa thích hợp, chuyển 1ml mẫu DRBC, ủ ngửa đĩa ở 0 vào đĩa petri vô trùng (mỗi 25 C, 5-7 ngày (mỗi nồng độ cấy 2 đĩa) nồng độ cấy 2 đĩa) Rót vào mỗi đĩa petri 10- Đếm khuẩn lạc nấm 15ml môi trường PCA đã mốc, nấm men được làm nguội đến 450C, lắc cho mẫu phân tán đều vào môi trường, ủ ở 300C trong 72 giờ Tính kết quả: tổng số vi Chọn các đĩa có số khuẩn sinh vật hiếu khí và tổng số lạc trong khoảng 25-250 nấm men nấm mốc trong mẫu (CFU/g hoặc CFU/ml) khuẩn lạc/đĩa để đếm 5.3 Cách tiến hành thí nghiệm Mẫu phân tích: nước mía nguyên chất (dùng 10ml cho một tổ) 1.3.1 Pha môi trường và khử trùng dụng cụ Bước 1: pha môi trường Tên môi trường Thành phần Tổng thể tích Ghi chú SPW NaCl : 42.5g 500 ml nước cất Phân phối cho mỗi tổ 27ml (Saline Pepton Pepton: 5g SPW (9ml/ống nghiệm) Water) trước khi khử trùng. (buổi 5) Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 25 Homepage:
  30. Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM PCA Casein enzymic 1000 ml nước Phân phối 100ml PCA cho (Plate Count hydrolysate: 5g cất mỗi tổ (15ml/petri). (buổi Agar) Yeast extract: 2.5 g pH 7.0 ± 0.2 5) Dextrose: 1g Agar: 15g DRBC Glucose: 10g 1000 ml nước Phân phối 100ml DRBC (Dichloran Rose Peptone: 5g cất cho mỗi tổ (15ml/petri). Bengal KH2PO4: 1g pH 5.6 ± 0.2. (buổi 5) Chloramphenicol MgSO4: 0.5g Lưu ý: trộn lẫn Agar) Rose bengal (dung dịch các thành phần 5%, w/v): 0.5ml trừ Dichloran (0.2%(w/v) chloramphenicol, trong ethanol): 1ml đun nóng để hòa Chloramphenicol: 0.1g tan hết agar, hấp Agar: 15g khử trùng. Để nguội đến 500C, bổ sung 1ml dung dịch kháng sinh 100X vào 100ml môi trường. Bước 2: khử trùng dụng cụ và môi trường đã pha. Bao gói dụng cụ và phân phối môi trường vào dụng cụ, gắn nút và bao gói. Hấp tiệt trùng ở 1210C trong 15 phút. Bước 3: pha loãng mẫu (xem bài 1, mục 1.3.2) Bước 4: thực hiện như qui trình Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 26 Homepage:
  31. Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM Cách tính kết quả Đếm tất cả các khuẩn lạc xuất hiện trên các đĩa sau khi ủ. Chọn số đĩa có số đếm trong khoảng 25-250 để tính kết quả. Mật độ tổng vi khuẩn hiếu khí hay tổng số nấm men nấm mốc được tính như sau: N A (CFU/g hay CFU/ml)= n1 x V x f1+⋯+ni x V x i Trong đó: A: số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) vi khuẩn (hay nấm mốc nấm men) trong 1g hay 1ml mẫu. N: tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn ni: số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa fi: độ pha loãng tương ứng. Nếu ở độ pha loãng cao nhất, số khuẩn lạc đếm được trên một đĩa >250, ví dụ ở nồng độ 10-5 số đếm lớn hơn 250, kết quả được ghi: >2.5 x 107 CFU/g. Nếu ở độ pha loãng thấp nhất, số khuẩn lạc đếm được trên một đĩa <25, ví dụ ở nồng độ 10-1 số đếm nhỏ hơn 25, kết quả được ghi: <2.5 x 102 CFU/g. Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 27 Homepage: