Thử giới hạn nhiễm khuẩn

Nội dung text: Thử giới hạn nhiễm khuẩn

1. THỬ GIỚI HẠN NHIỄM KHUẨN
2. THỬ GIỚI HẠN NHIỄM KHUẨN Thử giới hạn nhiễm khuẩn nhằm đánh giá số lượng vi khuẩn hiếu khí, nấm, mốc có khả năng sống lại được và phát hiện các vi khuẩn chỉ điểm y tế có trong thuốc. Thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện vô khuẩn. Trong khi làm thí nghiệm, chú ý không đưa chất khử khuẩn vào mẫu thử. Thử nghiệm được áp dụng cho tất cả các dược phẩm gồm cả nguyên liệu và thành phẩm của các thuốc không tiệt khuẩn trong quá trình sản xuất. Thử nghiệm sơ bộ Tìm chất ức chế có trong thuốc: Thử nghiệm giới hạn nhiễm khuẩn sẽ không có giá trị nếu chất ức chế có trong thuốc cản trở đến khả năng phát hiện các vi khuẩn. Vì vậy cần làm thí nghiệm kiểm tra trước bằng cách lấy dung dịch chế phẩm đã được pha ở nồng độ thích hợp vào môi trường chọn lọc cho Escherichia coli, Salmonella, Staphylococcus, Pseudomonas aeruginosa, rồi cấy vào đó 1ml canh khuẩn 24 h tuổi đã pha loãng với dung dịch đệm phosphat pH
3. 7,2 ít nhất tới 10-3 các vi khuẩn tương ứng. Nếu vi khuẩn không mọc, thí nghiệm cần thay đổi bằng cách: 1. Giữ nguyên lượng chất mang thử nhưng tăng thể tích môi trường. 2. Cho vào môi trường một lượng vừa đủ chất khử hoạt tính thích hợp. 3. Phối hợp cách làm (1) và (2) để vi khuẩn mang cấy có thể mọc được. Tuỳ theo thành phần và nồng độ của mẫu thử, có thể thêm vào môi trường để trung hoà chất ức chế các loại sau: lecithin đậu tương 0,5 %, polysorbat 20: 4 %. Làm lại thí nghiệm với điều kiện chất ức chế trong lượng mẫu mang kiểm tra đã được trung hoà. Môi trường Môi trường nuôi cấy có thể pha theo cách dưới đây hoặc có thể dùng môi trường khô do các hãng sản xuất môi trường vi sinh vật cung cấp. Các môi trường tự pha chế phải hấp tiệt khuẩn bằng nồi hấp ở nhiệt độ 115oC trong 30 phút trừ khi có những chỉ dẫn riêng đối với loại môi trường đặc biệt. Thạch dùng cho pha chế môi trường có độ ẩm dưới 15%. Nước và các chất dùng trong các công thức phải tinh khiết. Môi trường lỏng casein lecithin đậu tương polysorbat
4. Casein pancreatic 20,0 g Lecithin đậu tương 5,0 g Polysorbat 20 40,0 ml Nước 960 ml Hoà tan casein pancreatic và lecithin đậu tương vào 960 ml nước, đun cách thuỷ ở 48 - 50oC khoảng 30 phút cho tan hoàn toàn. Thêm 40 ml polysorbat 20, trộn đều, phân chia vào các dụng cụ thích hợp. Môi trường thạch casein đậu tương Casein pancreatic 15,0 g Natri clorid 5,0 g
5. Thạch 15,0 g Bột đậu tương thủy phân bởi 5,0 g papain 1000 ml Nước pH sau khi tiệt khuẩn: 7,3 + 0,2 Môi trường lỏng casein đậu tương Casein pancreatic 17,0 g Dikali hydrophosphat 2,5 g Bột đậu tương thuỷ phân bởi 3,0 g papain 2,5 g Glucose 5,0 g Natri clorid
6. Nước 1000 ml Hoà tan các chất rắn vào nước đun nóng nhẹ để tan hoàn toàn. Để nguội dung dịch ở nhiệt độ phòng, phân chia vào các bình thích hợp đã tiệt khuẩn. pH sau khi tiệt khuẩn:7,3 + 0,2. Môi trường thạch muối - manitol Casein pancreatic 5,0 g Thạch 15,0 g Pepton 5,0 g Cao thịt 1,0 g Natri clorid 75,0 g D - Manitol 10,0 g Đỏ phenol 0,025 g Nước 1000 ml Trộn, đun nóng, khuấy đều, đun sôi khoảng 1 phút để tan hoàn toàn, pH sau khi tiệt khuẩn : 7,4 + 0,2.
7. Môi trường thạch Baird - Parker Casein pancreatic 10,0 g Cao thịt 5,0 g Cao men bia 1,0 g Lithi clorid 5,0 g Thạch 20,0 g Glycin 12,0 g Natri pyruvat 10,0 g Nước 950 ml Đun nóng, khuấy đều sau đun sôi khoảng 1 phút, tiệt khuẩn, để nguội tới 45 - 50oC, thêm 10 ml dung dịch kali telurit 1% vô khuẩn và 50 ml nhũ dịch lòng đỏ trứng. Trộn kỹ, nhẹ nhàng rót vào các hộp. Chế tạo nhũ dịch lòng đỏ trứng bằng cách: Sát khuẩn toàn bộ bề mặt quả trứng, đập vỡ vô khuẩn quả trứng, lấy lòng đỏ trứng vào ống trụ chia vạch vô khuẩn. Thêm nước
8. muối vô khuẩn để có tỷ lệ lòng đỏ trứng so với nước muối là 3/7. Bỏ vào một cốc khuấy vô khuẩn, trộn với tốc độ lớn trong 5 phút. pH sau khi tiệt khuẩn 6,8 + 0,2. Môi trường thạch Vogel – Johnson Casein pancreatic 10,0 g Cao men bia 5,0 g Manitol 10,0 g Natri pyruvat 10,0 g Thạch 16,0 g Glycin 10,0 g Lithi clorid 5,0 g Dikali hydrophosphat 5,0 g Đỏ phenol 25,0 mg
9. Nước 1000 ml Đun sôi để hoà tan các chất rắn trong khoảng 1 phút. Tiệt khuẩn, để nguội đến 45 - 500C. Thêm 20 ml dung dịch kali telurit 1% vô khuẩn. pH sau khi tiệt khuẩn 7,2 + 0,2. Môi trường thạch cetrimid Gelatin pancreatic 20,0 g Cetrimid (Cetyl trimethylamoni 0,3 g bromid) 1,4 g Magnesi clorid 13,6 g Thạch 10,0 ml Glycerin 1000 ml Nước Hoà tan tất cả các chất rắn vào trong nước, thêm glycerin. Đun nóng, khuấy đều, đun sôi 1 phút cho tan hoàn toàn. pH sau khi tiệt khuẩn : 7,2 + 0,2
10. Môi trường thạch Pseudomonas để phát hiện Fluorescin Casein pancreatic 10,0 g Peton 10,0 g Dikali hydrophosphat khan 1,5 g Magnesi sulfat (MgSO4.7H2O) 1,5 g Thạch 15,0 g Glycerin 10,0 ml Nước 1000 ml Hoà tan tất cả các chất rắn vào nước trước khi thêm glycerin. Đun nóng, khuấy đều, đun sôi 1 phút cho tan hoàn toàn. pH sau khi tiệt khuẩn: 7,2 + 0,2. Môi trường thạch Pseudomonas để phát hiện Pyocyanin Gelatin pancreatic 20,0 g Kali sunfat khan 10,0 g
11. Thạch 15,0 g Magnesi clorid khan 1,4 g Glycerin 10,0 ml Nước 1000 ml Hoà tan các chất rắn trong nước trước khi thêm glycerin. Đun nóng, khuấy đều, đun sôi khoảng 1 phút để tan hoàn toàn. pH sau khi tiệt khuẩn: 7,2 + 0,2. Môi trường lỏng lactose Cao thịt 3,0 g Lactose 5,0 g Gelatin pancreatic 5,0 g Nước 1000 ml Làm lạnh rất nhanh môi trường sau khi tiệt khuẩn. pH sau khi tiệt khuẩn : 6,9 + 0,2
12. Môi trường lỏng selenit - cystin Casein pancreatic 5,0 g Natri selenit acid 4,0 g Dinatri phosphat 10,0 g Lactose 4,0 g L- Cystin 10,0 mg Nước 1000 ml Đun nóng để tan hoàn toàn. Đun tiếp 15 phút nữa. Không cần tiệt khuẩn tiếp theo. pH sau khi tiệt khuẩn : 7,0 +0,2 Môi trường lỏng tetrathionat Casein pancreatic 2,5 g Calci carbonat 10,0 g Muối mật 1,0 g Pepton 2,5 g
13. Natri thiosulfat 30,0 g Nước 1000 ml Đun nóng để hoà tan các chất rắn. Khi sử dụng thêm vào môi trường dung dịch gồm: 5,0 g kali iodid và 6,0 g iod trong 20 ml nước. Sau đó thêm 10ml dung dịch xanh brilliant 1% và trộn đều. Không đun nóng môi trường sau khi thêm dung dịch xanh brilliant. Môi trường thạch xanh brilliant Pepton 5,0 g Đường trắng 10,0 g Cao men bia 3,0 g Casein pancreatic 5,0 g Lactose 10,0 g Natri clorid 5,0 g Thạch 20,0 g Đỏ phenol 80,0 mg
14. Xanh brilliant 12,5 mg Nước 1000 ml Đun sôi để hoà tan tất cả các chất rắn trong 1 phút. Chỉ tiệt khuẩn trước khi dùng. Rót vào các hộp Petri và để nguội. pH sau khi tiệt khuẩn: 6,9 +0,2 Môi trường thạch xylose - lysin - desoxycholat Xylose 3,5 g Đỏ phenol 0,08 g L-Lysin 5,0 g Thạch 13,5 g Lactose 7,5 g Natri desoxycholat 2,5 g Đường trắng 7,5 g Natri thiosulfat 6,8 g
15. Natri clorid 5,0 g Săt (III) amoni citrat 0,8 g Cao men bia 3,0 g Nước 1000 ml Đun nóng, lắc tròn để trộn đều chất rắn với nước. Chú ý không để nóng quá. Chuyển ngay vào bình cách thuỷ và giữ ở nhiệt độ 50oC. Rót vào các đĩa ngay trước khi môi trường nguội hoàn toàn. pH sau khi tiệt khuẩn: 7,4 + 0,2 Môi trường thạch bismuth sulfit Cao thịt 5,0 g Sắt (II) sulfat 0,3 g Casein pancreatic 5,0 g Bismuth sulfit 8,0 g Pepton 5,0 g Thạch 20,0 g
16. Glucose 5,0 g Xanh brilliant 25,0 mg Dinatri hydrophosphat 4,0 g Nước 1000 ml Đun nóng, lắc tròn để hoà đều các chất rắn với nước, không để nóng quá. Chuyển ngay vào bình cách thuỷ và giữ ở nhiệt độ 500C. Rót vào các đĩa để nguội. pH sau khi tiệt khuẩn: 7,6 + 0,2 Môi trường thạch - sắt - ba đường Casein pancreatic 10,0 g Sắt (II) amoni sulfat 0,2 g Pepton 20,0 g Natri clorid 5,0 g Lactose 10,0 g
17. Natri thiosulfat 0,3 g Đường trắng 10,0 g Thạch 13,0 g D-Glucose monohydrat 1,0 g Đỏ phenol 0,025 g Nước 1000 ml Hoà nóng các chất rắn với nước, đun sôi một phút cho tan hoàn toàn. Chuyển vào các dụng cụ thích hợp để tiệt khuẩn. pH sau khi tiệt khuẩn: 7,3 + 0,2 Môi trường Mac - Conkey Casein pancreatic 1,5 g Natri clorid 5,0 g Gelatin pancreatic 17,0 g Thạch 13,5 g
18. Pepton 1,5 g Lactose 10,0 g Muối mật 1,5 g Đỏ trung tính 30,0 mg Tím tinh thể 1,0 mg Nước 1000 ml Hoà nóng các chất rắn với nước, đun sôi một phút cho tan hoàn toàn. pH sau khi tiệt khuẩn : 7,1 + 0,2 Môi trường thạch Levine - eosin - xanh methylen
19. Gelatin pancreatic 10,0 g Dikali hydrophosphat 2,0 g Thạch 15,0 g Lactose 10,0 g Eosin 0,4 g Xanh methylen 0,065 g Nước 1000 ml Hoà tan nóng các thành phần gelatin pancreatic, dikali hydrophosphat và thạch trong nước, để lạnh. Các thành phần còn lại chỉ thêm vào khi sử dụng bằng cách đun chảy môi trường rồi thêm vào theo tỷ lệ: Cứ 100 ml môi trường thêm 5 ml dung dịch lactose (1:5), 2 ml dung dịch eosin và 2 ml dung dịch xanh methylen (1:300). Môi trường sau khi hoà trộn phải trong. pH sau khi tiệt khuẩn: 7,1 + 0,2 Môi trường thạch Sabouraud Glucosa 40,0 g
20. Casein pancreatic 5,0 g Pepton 5,0 g Thạch 15,0 g Nước 1000 ml Hoà tan, đun sôi cho tan hoàn toàn. pH sau khi tiệt khuẩn : 5,6 + 0,2 Môi trường thạch - khoai tây - glucose Nấu 300 g khoai tây đã bóc vỏ và thái nhỏ trong 500 ml nước cất, lọc qua vải, thêm nước cất để được 1000 ml, rồi thêm vào các thành phần sau: thạch 15 g; glucose 20 g. Hoà tan nóng. Tiệt khuẩn. Khi dùng đun nóng chảy, để nguội đến 45oC. Điều chỉnh môi trường bằng dung dịch acid tartric (1:10) đến pH 3,5 + 0,1. Rót vào các đĩa. Chú ý: Không dùng môi trường đun nóng trở lại lần thứ 2 Để ức chế vi khuẩn thường gặp mọc trên môi trường phát hiện nấm, mốc và men (môi trường Sabouraud hoặc môi trường thạch - khoai tây- glucose) thêm vào một lít môi trường 0,1g tetracyclin hoặc 50 mg cloramphenicol, làm đều ngay trước khi dùng.
21. Dung dịch đệm Natri clorid – pepton pH 7,0 Kali dihydro phosphat 3,56 g Natri hydro phosphat 7,23 g Natri clorid 4,30 g Pepton 1,00 g Nước cất 1000 ml Có thể thêm chất hoạt động bề mặt hoặc chất khử tác dụng kháng khuẩn vào dung dịch này như Polysorbat 80 0,1 đến 1,0%. Hấp tiệt trựng 1210C trong 15 phỳt. Môi trường nước thịt Cao thịt 5,0 g Nước 1000 ml Môi trường thạch thường Pepton 10,0 g
22. Natri clorid 5,0 g Thạch 15 - 20 g Nước 1000 ml pH sau khi tiệt khuẩn 7,4 + 0,2 Môi trường pepton - natri clorid Pepton 10,0 g Natri clorid 5,0 g Nước 1000 ml pH sau khi tiệt khuẩn 7,0 + 0,2 Môi trường tăng sinh cho Clostridia Cao thịt 10,0 g Pepton 10,0 g Cao men bia 3,0 g Tinh bột dẽ tan 1,0 g
23. Glucose monohydrat 5,0 g Cystein hydroclorid 0,5 g Natri clorid 5,0 g Natri acetat 3,0 g Thạch 0,5 g Nước cất 1000 ml Hoà tan thạch bằng cách đun nóng tới sôi, khuấy đều liên tục. Hấp tiệt khuẩn 121oC trong 15 phút. Nếu cần điều chỉnh pH sao cho sau khi tiệt khuẩn khoảng 6,8. Môi trường thạch Columbia Casein pancreatic 10,0 g Thịt 5,0 g Dịch tim pancreatic 3,0 g Cao men bia 5,0 g Tinh bột ngô 1,0 g
24. Natri clorid 5,0 g Thạch bột 15,0 g Nước cất 1000 ml Hoà tan thạch bằng cách đun nóng tới sôi, khuấy đều liên tục. Nếu cần điều chỉnh pH sao cho sau khi tiệt khuẩn khoảng 7,3 + 0,2. Hấp tiệt khuẩn 121oC trong 15 phút. Làm lạnh tới 45oC đến 50oC. Khi cần có thể thêm 20 mg gentamycin base và rót vào các hộp Petri. Môi trường sulfit - lactose Casein pancreatic 5,0 g Cao men bia 2,5 g Cystein hydroclorid 0,3 g Natri clorid 2,5 g Lactose 10,0 g Nước cất 1000 ml
25. Hoà tan tất cả các thành phần trong nước và điều chỉnh để có pH 7,1 + 0,1. Đóng vào các ống nghiệm 16 x 160 mm mỗi ống 8 ml và một ống nhỏ Durham. Hấp tiệt khuẩn 121oC trong 15 phút. Bảo quản ở 4oC. Môi trường lỏng Enterobacteria - Mossel Genlatin pancreatic 10,0 g D-Glucose monohydrat 5,0 g Mật bò khô 20,0 g Kali dihydrophosphat 2,0 g Dinatri hydrophosphat 8,0 g Xanh brilliant 15 mg Nước cất 1000 ml Điều chỉnh pH sao cho sau khi đun là 7,0 - 7,4. Đun sôi trong 30 phút và làm lạnh ngay. Môi trường muối mật violet - red Cao men bia 3,0 g
26. Gelatin pancreatic 7,0 g Muối mật 1,5 g Lactose 10,0 g Natri clorid 5,0 g D-Glucose monohydrat 10,0 g Đỏ trung tính 30 mg Tím tinh thể 2 mg Thạch 15.0 g Nước cất 1000 ml Điều chỉnh pH sao cho sau khi đun là 7,2 - 7,6. Môi trường được đun sôi để tiệt trùng nhưng không được hấp tiệt trùng. Chuẩn bị thí nghiệm Lấy mẫu: Đối với các thử nghiệm dưới đây, mỗi thử nghiệm lấy 10ml hoặc 10g chế phẩm. Cách thử nghiệm:
27. Một mẫu chế phẩm cần xác định giới hạn vi khuẩn phải thực hiện đầy đủ các thử nghiệm sau: Đếm tổng số vi khuẩn hiếu khí sống lại được, tính ra số lượng vi khuẩn, nấm mốc có trong 1g hoặc 1ml chế phẩm. Thử nghiệm tìm những vi khuẩn gây bệnh sau: Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa Salmonella Escherichia coli Chuẩn bị mẫu Chế phẩm mang thử nghiệm trong quá trình hoà tan hoặc nhũ hoá phải đảm bảo không làm thay đổi chủng loại vi khuẩn, nấm mốc có trong thuốc. Để có một dung dịch hoặc nhũ dịch thích hợp cho thử nghiệm, tiến hành như sau: Đối với chế phẩm rắn, hoà tan trực tiếp hoặc nghiền mịn chế phẩm trong bình với dung môi hoặc chất nhũ hoá thích hợp.
28. Đối với chế phẩm ở dạng lỏng như dung dịch thực, nhũ dịch trong nước, chất rắn hòa tan dễ dàng và hoàn toàn trong nước , dùng dung dịch đệm phosphat pH 7,2 hoặc dung dịch natri clorid 0,9% để hoà loãng. Những chế phẩm lỏng không thể hoà lẫn trong nước như dầu, kem hoặc sáp: Chế tạo nhũ dịch bằng cách thêm một lượng vừa đủ tác nhân nhũ hoá vô khuẩn thích hợp như các loại polysorbat. Dùng phương pháp khuấy trộn cơ học hoặc đồng thời làm ấm bằng nhiệt nhưng không được vượt quá 45oC để có nhũ dịch chế phẩm đồng nhất. Các chế phẩm ở dạng khí dung - lỏng: Làm lạnh bình để các khí hoá lỏng rồi mở nắp để lấy một lượng thích hợp mang thử. Tiến hành Đếm tổng số vi khuẩn hiếu khí: Đối với chế phẩm hoà tan tốt hoặc tạo thành dung dịch hơi đục, dùng phương pháp đĩa thạch. Còn các chế phẩm khác dùng phương pháp hoà loãng trong ống nghiệm. Hoà tan hoặc làm nhũ hoá 10 g hoặc 10 ml chế phẩm vừa đủ trong 100 ml dung dịch đệm phosphat pH 7,2 hoặc trong 100 ml dung môi thích hợp với từng loại chế phẩm, để được dung dịch chế phẩm có độ pha loãng ở tỷ lệ 1/10. Đối với những chế phẩm dạng nhầy không thể lấy chính xác bằng pipet ở tỷ lệ 1/10, có thể pha loãng tiếp để lấy được chính xác, nghĩa là có thể pha loãng đến tỷ lệ 1/50 hoặc 1/100 v.v
29. Thực hiện thử nghiệm phát hiện chất ức chế trước khi xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí. Chế phẩm đã pha loãng phải cho ngay vào môi trường nuôi cấy mà không được để quá 1 giờ. Dung dịch đệm pH 7,2: Hoà 34g kali dihydrophosphat (KH2PO4) vào khoảng 500 ml nước cất trong bình định mức 1000 ml. Điều chỉnh pH tới 7,2 + 0,1 bằng cách thêm dung dịch natri hydroxyd 2%. Thêm nước cất tới vạch. Trộn đều, phân chia vào các bình, tiệt khuẩn, bảo quản ở lạnh. Khi dùng, hoà loãng với nước cất theo tỷ lệ 1: 800 và tiệt khuẩn. a) Phương pháp đĩa thạch Hoà loãng chế phẩm sao cho khi cấy 1 ml dịch chế phẩm vào môi trường trong một hộp Petri, số khuẩn lạc mọc khoảng 30 đến 300 khuẩn lạc. Lấy dung dịch có độ pha loãng cuối cùng cho vào 2 hộp Petri, mỗi hộp 1ml. Thêm vào mỗi hộp 15 - 20 ml môi trường thạch casein đậu tương hoặc môi trường thạch thường đã đun chảy và để nguội đến 45oC. Đậy hộp, trộn đều bằng cách xoay qua, xoay lại. Sau đó để yên cho thạch đông cứng ở nhiệt độ phòng. Lật ngược hộp, mang ủ ở 35oC từ 24 - 48 h. Sau thời gian ủ, kiểm tra vi khuẩn mọc ở đĩa, đếm số lượng khuẩn lạc. Lấy giá trị của đĩa có số lượng khuẩn lạc lớn nhất mà số khuẩn lạc trong đĩa không lớn hơn 300 và tính ra số lượng khuẩn lạc trong 1g hoặc 1ml chế phẩm. Nếu thấy không có khuẩn lạc mọc ở đĩa có độ pha loãng 1/10 thì kết luận chế phẩm có ít hơn 10 khuẩn lạc trong 1 g hoặc 1 ml. b) Phương pháp pha loãng trong ống nghiệm
30. Cho vào 14 ống nghiệm cỡ thông thường, mỗi ống 9,0 ml môi trường lỏng casein đậu tương. Lấy một dãy 12 ống chia thành 4 lô, mỗi lô 3 ống. Dùng một lô 3 ống để kiểm tra. Thêm vào lô 1 gồm 3 ống và một ống thứ 4 (ống A) 1 g (hoặc1 ml) chế phẩm và trộn đều. Thêm vào lô 2 gồm 3 ống và một ống thứ 4 (ống B) 1 ml dung dịch lấy từ ống A và trộn đều. Thêm vào lô 3 gồm 3 ống, mỗi ống 1 ml dung dịch lấy từ ống B và trộn đều. Bỏ không sử dụng ống A và ống B. Theo cách pha trên có lô 1, lô 2, lô 3, tương ứng với lượng chế phẩm là: 100; 10; và 1 mg hoặc l trong mỗi ống. Đậy kín các ống mang ủ ở 32 - 35oC trong 24 giờ, quan sát vi khuẩn mọc ở các ống chứa chế phẩm, mang đối chiếu với bảng 1 để biết số lượng vi khuẩn có trong 1 g hoặc 1ml chế phẩm. Bảng 1: Tổng số vi khuẩn trong chế phẩm. Số mg (hoặc l) chế phẩm cho mỗi ống 100 10 1 Số lượng vi khuẩn lớn nhất có thể có trong 1 g
31. hoặc 1 ml 3 3 3 >1100 3 3 2 1100 3 3 1 500 3 3 0 200 3 2 3 290 3 2 2 210 3 2 1 150 3 2 0 90 3 1 3 160 3 1 2 120 3 1 1 70 3 1 0 40
32. 3 0 3 95 3 0 2 60 3 0 1 40 3 0 0 23 c)Phương pháp màng lọc: Dùng các màng lọc có kích thước lỗ lọc không lớn hơn 0,45 µm, có khả năng giữ lại các vi khuẩn cần kiểm tra. Chọn loại màng lọc làm bằng nguyên liệu giữ lại vi khuẩn nhưng không ảnh hưởng đến mẫu thử. Thí dụ có thể dùng màng Cellulose nitrat để lọc các dung dịch nước, dầu và cồn thấp độ. Dùng màng cellulose acetat để lọc dung dịch cồn cao độ. Dùng hệ thống lọc có thiết kế cho phép chuyển được màng lọc vào môi trường nuôi cấy. Chuyển một lượng thích hợp dung dịch mẫu thử đó pha theo mục “Chuẩn bị mẫu”, (Tốt nhất là lấy một lượng dung dịch mẫu đó chuẩn bị tương đương với 1g hoặc 1ml mẫu cần thử; nếu lượng vi khuẩn có nhiều trong mẫu thử, có thể lấy lượng dung dịch mẫu ít hơn). Mỗi mẫu thử cần 2 màng lọc, dung dịch mẫu thử đó chuẩn bị phải lọc ngay qua màng. Rửa màng lọc 3 lần, mỗi lần khoảng 100ml dung dịch thớch hợp như dung dịch đệm natri clorid – pepton pH 7,0. Khi cần cú thể thờm chất hoạt động bề
33. mặt như polysorbat 80 hoặc cỏc chất khử hoạt tớnh của cỏc chất khỏng khuẩn vào dung dịch dùng để rửa. Cũng có thể rửa màng với số lần ít hơn, nếu thấy đủ loại hết thuốc và tác nhân ảnh hưởng đến kết quả thử nghiệm khỏi màng. Chuyển một màng lọc lên môi trường thạch dùng phát hiện vi khuẩn. Ủ ở 30° to 35°C, theo dừi, đếm số vi khuẩn mọc trên màng. Chuyển màng lọc cũn lại lờn mặt mụi trường phát hiện nấm. Ủ ở 20° to 25°C, theo dừi trong khoảng 5 ngày, đếm số nấm mọc trên màng. Nếu chắc chắn về thời gian mọc của nấm cần phát hiện thỡ cú thể theo dừi, đếm trong khoảng thời gian ngắn hơn. Chọn đếm các đĩa có số khuẩn lạc cao nhất ít hơn 100 khuẩn lạc trên màng. Tính số khuẩn lạc có trong 1 gam hoặc 1ml mẫu thử. Mẫu thử là thuốc dạng miếng đắp thấm qua da: Chuyển vô trùng 10 miếng dán vào bỡnh đó cú sẵn 500 ml dung dịch đệm natri clorid – pepton pH 7,0, Lắc đều trong 30 phút. Lọc qua 2 màng lọc để tỡm vi khuẩn và nấm mỗi màng 50ml dung dịch. Tiếp tục ủ, theo dừi, đếm vi khuẩn và nấm mốc như ở trên. Thử nghiệm tìm các vi khuẩn a) Tìm Staphylococcus aureus và Pseudomonas aeruginosa Cho chế phẩm vào 100 ml môi trường lỏng casein đậu tương, ủ ở 35 - 370C, kiểm tra vi khuẩn mọc ở môi trường. Nếu thấy mọc, dùng que cấy lấy môi trường, cấy lên đĩa thạch Vogel - Johnson (hoặc thạch Baird - Parker hoặc thạch manitol - muối) và môi
34. trường thạch cetrimid. Đậy đĩa, lật ngược hộp Petri, mang ủ. Sau khi ủ kiểm tra nếu không thấy có những khuẩn lạc với đặc tính như ghi trong bảng 2 và bảng 3 (nêu ở phần sau) đối với từng môi trường đã sử dụng thì chế phẩm không có Staphylococcus aureus và Pseudomonas aeruginosa. Nếu thấy có khuẩn lạc nghi ngờ thì tiếp tục làm các phản ứng sinh hoá của Staphylococcus aureus hoặc Pseudomonas aeruginosa như sau: *Phản ứng coagulase (đối với Staphylococcus aureus): Dùng que cấy chuyển khuẩn lạc nghi ngờ đặc trưng từ mặt thạch Vogel-Johnson (hoặc thạch Baird - Parket, hoặc thạch manitol - muối) thêm vào từng ống nghiệm, mỗi ống 0,5 ml huyết tương thỏ hoặc ngựa. Đem ủ 37oC, kiểm tra các ống sau 3 giờ ủ rồi tiếp tục ủ thêm 24h. Nếu thấy có đông huyết tương (ở bất kỳ mức độ nào), chế phẩm có Staphylococcus aureus. Bảng 2: Đặc điểm hình thái của Staphylococcus aureus trên các môi trường lựa chọn Môi Thạch Thạch Thạch trường Vogel - manitol - muối Baird - Parker Johnson
35. Đặc Màu đen được Khuẩn lạc màu Khuẩn lạc màu đen điểm bao bọc bằng vàng cùng với một bóng, viền quanh bằng hình thái một vùng vàng vùng vàng xung một vùng sáng rõ 2 - 5 khuẩn quanh mm lạc *Phản ứng oxydase và sinh sắc tố ( đối với Pseudomonas aeruginosa): Lấy những khuẩn lạc nghi ngờ đặc trưng từ mặt môi trường thạch cetrimid cấy ria trên mặt môi trường thạch Pseudomonas phát hiện Fluorescin và môi trường Pseudomonas phát hiện Pyocyanin trong hộp Petri. Nếu nhiều khuẩn lạc cần được cấy truyền, có thể chia bề mặt hộp thành bốn phần, mỗi phần cấy một loại khuẩn lạc lựa chọn. Đậy và lật ngược hộp môi trường đã cấy truyền và ủ ở 35 + 2oC ít nhất 3 ngày kiểm tra đường cấy dưới ánh sáng đèn tử ngoại. Kiểm tra các đĩa để xác định có khuẩn lạc đặc trưng theo bảng 3 hay không. Xác nhận bất kỳ khuẩn lạc nghi ngờ nào mọc trên một hoặc nhiều môi trường. Phát hiện Pseudomonas aeruginosa bằng phản ứng oxydase: Nhỏ ngay lên khuẩn lạc hoặc chuyển khuẩn lạc lên một mẩu (hoặc một khoanh) giấy đã tẩm trước N - dimethyl - phenylen diamin dihydroclorid. Nếu thấy hiện màu đỏ hồng chuyển sang màu tím, chế phẩm có Pseudomonas aeruginosa. Có thể xác định Pseudomonas aeruginosa bằng các phép thử sinh hoá và nuôi cấy thích hợp khác.
36. Bảng 3. Đặc điểm hình thái của Pseudomonas aeruginosa trên các môi trường lựa chọn Thạch Thạch Pseudomonas để Pseudomonas để Môi trường Thạch cetrimid phát hiện Fluorescin phát hiện Pyocyanin Đặc điểm hình Màu lục nhạt Không màu đến Màu vàng nhạt thái khuẩn lạc thông thường màu vàng nhạt Huỳnh quang ở Màu lục Màu hơi vàng Màu xanh nước ánh sáng tia cực biển tím Phản ứng oxydase Dương tính Dương tính Dương tính Nhuộm Gram Trực khuẩn Trực khuẩn Trực khuẩn Gram âm Gram âm Gram âm b) Tìm Salmonella và Escherichia coli
37. Cho chế phẩm vào khoảng 100 ml môi trường lỏng lactose, ủ. Kiểm tra nếu có vi khuẩn mọc, lắc nhẹ nhàng. Lấy 1ml cho vào một ống chứa sẵn 10 ml hỗn hợp môi trường lỏng selenit - cystin và môi trường lỏng tetrathionat, trộn đều, ủ trong 18 - 24 h. Phần còn lại của môi trường lactose sẽ dùng để tìm Escherichia coli. Tìm Salmonella: Lấy một quai cấy từ canh thang selenit cystin và tetrathionat ria lên mặt môi trường thạch xanh brilliant, môi trường thạch bismuth sulfit trong các đĩa Petri. Đậy đĩa, lật ngược, ủ. Kiểm tra, nếu không thấy có khuẩn lạc dạng như mô tả ở bảng 4, chế phẩm không chứa các nòi Salmonella. Bảng 4. Đặc điểm hình thái của Salmonella trên môi trường lựa chọn Môi trường Mô tả khuẩn lạc Thạch xanh brilliant Khuẩn lạc không màu hoặc màu hồng nhạt tới trắng đục, nhỏ, rõ nét (thường bao quanh bằng một vùng màu hồng tới đỏ) Thạch xylose - lysin Khuẩn lạc màu đỏ, có thể chấm đen ở trung tâm - desoxycholat
38. Thạch bismuth sulfit Khuẩn lạc màu đen hoặc màu xanh Nếu thấy khuẩn lạc, đem nhuộm soi thấy gồm những trực khuẩn hình gậy, Gram âm phù hợp với mô tả ở bảng 4, thực hiện tiếp bằng cách chuyển khuẩn lạc nghi ngờ riêng biệt sang ống môi trường thạch - sắt - ba đường (nghiêng). Trước tiên cấy ria trên mặt thạch nghiêng, sau cấy sâu xuống phần đứng của thạch, ủ. Kiểm tra không thấy môi trường bị kiềm hoá (màu đỏ) ở phần nghiêng và acid hoá (màu vàng) phần dựng đứng, có hoặc không có kèm theo màu đen ở phần dựng đứng do sinh H2S. Chế phẩm không chứa các nòi Salmonella. Tìm Escherichia coli: Cấy ria một quai cấy từ môi trường lactose đã có vi khuẩn mọc ở trên bề mặt môi trường thạch Mac - Conkey. Đậy nắp, lật ngược hộp, ủ. Kiểm tra nếu không có khuẩn lạc phù hợp với mô tả ở bảng 5 thì chế phẩm không có Escherichia coli. Nếu có khuẩn lạc phù hợp với mô tả ở bảng 5 thì chuyển khuẩn lạc nghi ngờ lên mặt thạch Levine - eosin - xanh methylen trong các đĩa Petri . Nếu có nhiều khuẩn lạc nghi ngờ, chia đĩa thành 4 phần, mỗi phần cấy một loại khuẩn lạc đã lựa chọn. Đậy đĩa, lật ngược, ủ. Kiểm tra nếu không có những khuẩn lạc thể hiện cả hai đặc tính ánh kim dưới ánh sáng phản chiếu, và màu đen xuất hiện ở ánh sáng truyền qua, mẫu chế phẩm
39. không có Escherichia coli. Kết hợp các phản ứng thử nghiệm sinh hoá và đặc điểm nuôi cấy để kết luận sự có mặt của Escherichia coli trong chế phẩm. Bảng 5: Đặc điểm hình thái của Escherichia coli trên thạch Mac - Conkey Đặc điểm hình thái khuẩn Khuẩn lạc màu đỏ gạch, có thể có lạc vùng mật kết tủa bao quanh Nhuộm Gram Trực khuẩn Gram âm c) Phát hiện Enterobacteria và các vi khuẩn Gram âm khác Làm đồng nhất chế phẩm đem kiểm tra bằng cách xử lý một lượng thích hợp như đã mô tả ở phần chế tạo mẫu thử nghiệm và ủ ở 35 - 37oC một thời gian thích hợp (th- ường từ 2 - 5 h) trong môi trường canh thang lactose để phục hồi lại vi khuẩn mà không làm tăng vi khuẩn. Lắc bình chứa và chuyển một lượng đã đồng nhất của chế phẩm tương đương khoảng 1 g hoặc 1 ml chế phẩm vào 100 ml môi trường lỏng Enterobacteria - Mossel và ủ ở 35 - 37oC trong 18 - 24 h. Cấy lên đĩa thạch muối mật
40. violet-red có chứa lactose và glucose ủ ở 35 -37oC trong 18 - 48 h. Chế phẩm không có Enterobacteria nếu không thấy mọc những khuẩn lạc vi khuẩn Gram âm trên đĩa. Đánh giá số lượng: ủ một lượng thích hợp môi trường lỏng Enterobacteria - Mossel với những lượng chế phẩm đem kiểm tra đã được làm đồng nhất chứa 1,0 g; 0,1 g và 10 mg hoặc 1,0 ml; 0,1 ml và 10 l. Nếu cần có thể pha loãng chế phẩm, ủ ở 35 -37oC trong 24 - 48 h. Các khuẩn lạc đã phát triển tốt thường đỏ hoặc đĩa đỏ, nhuộm vi khuẩn bắt màu Gram âm, chứng tỏ kết quả dương tính. Ghi lượng nhỏ nhất của chế phẩm mà ở đó cho kết quả dương tính và lượng lớn nhất của chế phẩm mà ở đó cho kết quả âm tính. Xác định số lượng Bacteria theo bảng 6. Bảng 6. Tính lượng Bacteria trong chế phẩm Kết quả đối với mỗi lượng sản phẩm Số Bacteria có trong 1 gam sản phẩm 1,0 g 0,1 g hoặc 0,01 g hoặc hoặc 0,01 ml 0,1 ml 1 ml + + + Lớn hơn 102
41. + + - ít hơn 102 nhưng lớn hơn 10 + - - ít hơn 10 nhưng lớn hơn 1 - - - ít hơn 1 Đếm tổng số nấm, mốc, và men Dùng phương pháp đĩa thạch tương tự như đếm tổng số vi khuẩn hiếu khí, nhưng sử dụng môi trường thạch Sabouraud hoặc môi trường thạch - khoai tây- glucose, ủ các đĩa ở nhiệt độ ở 20 - 25oC, theo dõi trong 5 ngày. Tìm Clostridia Thử nghiệm thứ nhất dùng cho những sản phẩm qui định không có Clostridia. Thử nghiệm thứ hai là bán định lượng đối với Clostridium perfringens ỏp dụng với những sản phẩm có tiêu chuẩn về số lượng Clostridium perfringens. Thử nghiệm tìm Clostridia Chuẩn bị mẫu thử như trong mục “ chuẩn bị thí nghiệm”. Lấy hai mẫu để kiểm tra khoảng 1 g (ml) mỗi mẫu, cho vào hai bình đã chứa sẵn 100 ml môi trường tăng sinh cho Clostridia. Một mẫu đem đun nóng tới 80oC trong 10 phút rồi làm lạnh ngay. Ủ cả hai mẫu ở điều kiện kỵ khí, ở 35 - 37oC trong 48h. Sau khi ủ từ mỗi bình cấy chuyển
42. sang một ống môi trường thạch Columbia đã thêm gentamycin và tiếp tục ủ ở 35 - 37oC trong 48h. Nếu không thấy có vi khuẩn mọc, mẫu thử đạt yêu cầu. Khi thấy vi khuẩn mọc, chọn một khuẩn lạc điển hình cấy chuyển sang môi trường thạch Columbia không có gentamycin và ủ ở hai điều kiện kỵ khí và hiếu khí. Khi chỉ thấy mọc ở điều kiện kỵ khí, trực khuẩn Gram dương (có hoặc không có nội bào tử); phản ứng catalase âm tính tức là có Clostridium spp. Nếu cần so sánh sự phát triển của khuẩn lạc trên hai đĩa và dùng thử nghiệm catalase để loại trừ những nòi Bacillus spp. kỵ khí và hiếu khí có phản ứng catalase dương tính. Thử nghiệm này cũng được dùng để phân biệt những khuẩn lạc cùng dạng trên thạch hoặc bằng cách chuyển vi khuẩn lên trên phiến kính và nhỏ dung dịch nước oxy già loãng, nếu thấy có sủi bọt nghĩa là phản ứng catalase dương tính. Đếm Clostridium perfringens Tạo mẫu thử như mô tả ở mục “chuẩn bị thí nghiệm”. Pha loãng bằng dung dịch đệm pepton-natri clorid có pH 7,0 đến các dung dịch chế phẩm có nồng độ 10-2, 10-3 . Tiến hành xác định tổng số vi khuẩn giống như xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí sống lại được mục “Tiến hành”. Mỗi lần chuyển 1ml đã làm đồng đều sang một ống chứa sẵn 9 ml môi trường sulfit - lactose và một ống nhỏ Durham. Lắc nhẹ nhàng và đem ủ ở 46 + 0,5oC trong khoảng 24 đến 48 h. Các ống có màu đen (sắt sulfid) và sinh hơi trong ống Durham (ít nhất 1/10 thể tích) là có Clostridium perfringens. Tính lượng Clostridium perfringens theo bảng 1. mục 13.6
43. Những nòi vi khuẩn dùng để kiểm tra: Thử nghiệm thứ 1: Clostridium sporogenes ATCC 19404 và NCTC 532 Thử nghiệm thứ 2: Clostridium perfringens ATCC 13124 và NCTC 6125 Nếu cần, kết hợp với dùng Clostridium perfringens để kiểm tra điều kiện nhạy cảm và điều kiện kỵ khí. Lặp lại thí nghiệm Khi nghi ngờ, cần được thử nghiệm lại như hướng dẫn ở trên với một lượng chế phẩm tăng gấp đôi. Yêu cầu giới hạn nhiễm khuẩn Nếu không có chỉ dẫn trong chuyên luận riêng thì giới hạn nhiễm khuẩn cho các loại thuốc có quá trình sản xuất không tiệt khuẩn như sau: Bảng 7. Yêu cầu giới hạn nhiễm khuẩn Loại chế phẩm Yêu cầu Mứ c
44. 1 Các chế phẩm dùng cho Không có các vi khuẩn có thể sống lại trong 1 g bỏng và các vết loét sâu (ml) mẫu thử 2 Các chế phẩm dùng tại Tổng số vi khuẩn hiếu khí sống lại đuợc không chỗ như chữa xưng tấy, quá 100 trong 1 g (ml) tổn thương, và các màng Mẫu thử phải không có Enterobacteria, nhầy (mũi, họng, tai, âm Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus đạo ) aureus, nấm và mốc trong 1 g (ml) 3 Các chế phẩm dùng tại Tổng số vi khuẩn hiếu khí sống lại được không chỗ cho da như kem bôi, quá 500 trong 1 g (ml) nước thơm, dầu, dung Mẫu thử phải không có Enterobacteria, dịch, bột Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, nấm và mốc trong 1 g (ml) 4 Các chế phẩm dùng Tổng số vi khuẩn hiếu khí sống lại được không uống; qua trực tràng; quá 104 trong 1 g (ml) thấm qua da. Tống số Enterobacteria không quá 500 trong 1
45. g (ml) Nấm và mốc không quá 100 trong1 g (ml) Không được có Salmonella trong 10 g(ml) Mẫu không có Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus. trong 1g(ml) 5 Các chế phẩm có chứa Tổng số vi khuẩn hiếu khí sống lại được 5.104 các nguyên liệu có trong 1 g (ml) nguồn gốc thực vật, Nấm và mốc không quá 500 trong 1 g (ml) động vật không thể xử lí theo qui trình làm giảm Tống số Enterobacteria không quá 500 trong1 lượng vi khuẩn. g (ml) Không được có Salmonella trong 10 g(ml) Mẫu không có Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus trong 1g(ml)