Tạo và thu nhận chọn lọc kháng thể IgG kháng protein màng của tế bào T Jurkat

Nội dung text: Tạo và thu nhận chọn lọc kháng thể IgG kháng protein màng của tế bào T Jurkat

1. Science & Technology Development, Vol 19, No.T1- 2016 Tạo và thu nhận chọn lọc kháng thể IgG kháng protein màng của tế bào T Jurkat Trịnh Minh Thượng Huỳnh Thị Xuân Mai Trần Văn Hiếu Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM ( Bài nhận ngày 12 tháng 10 năm 2015, nhận đăng ngày 28 tháng 03 năm 2016) TÓM TẮT Hiện nay, vật ghép chống chủ (GvHD) vẫn là rào tiên và 25 μg ở bốn lần nhắc sau. Huyết thanh thu cản lớn nhất trong ứng dụng ghép tủy dị cá thể để hỗ nhận được ở lần tiêm nhắc cuối được tủa trong dung trợ điều trị bệnh ung thư máu. Vật ghép chống chủ dịch 50 % ammonium sulfate bão hòa để thu kháng được gây ra do tế bào T trưởng thành của người cho thể. Theo đó, kháng thể được tinh sạch bằng cột sắc tấn công mô và cơ quan người nhận. Loại bỏ tế bào T kí ái lực protein A và phân tích độ tinh sạch bằng bằng hạt từ miễn dịch là một trong những phương điện di SDS-PAGE. Sau đó, kháng thể tinh sạch được pháp hiệu quả nhất để khắc phục GvHD. Trong nhuộm miễn dịch huỳnh quang trên tế bào T Jurkat nghiên cứu này, kháng thể đa dòng kháng tế bào T và quan sát kết quả dưới kính hiển vi huỳnh quang Jurkat được tạo ra như nguồn nguyên liệu cho việc nhằm xác định khả năng bắt tế bào T Jurkat. Cuối tạo hạt từ miễn dịch hỗ trợ loại bỏ tế bào T. Đầu tiên, cùng, kháng thể tiếp tục được chọn lọc âm tính với tế màng tế bào T Jurkat được thu nhận bằng phương bào TF-1, dòng tế bào gốc tạo máu, nhằm loại bỏ các pháp ly trích điểm sương sử dụng Triton X-114. Tiếp kháng thể kháng tế bào TF-1. Kết quả cho thấy kháng theo, phân đoạn màng được sử dụng để kích thích thể đa dòng thu được có khả năng nhận diện yếu tế đáp ứng miễn dịch ở thỏ với lượng 50 μg ở lần đầu bào TF-1 và nhận diện mạnh tế bào T Jurkat. Từ khoá: chọn lọc âm tính, GvHD, kháng thể kháng tế bào T, ly trích điểm sương, vật ghép chống chủ. MỞ ĐẦU Ước tính trong năm 2014, ở Hoa Kỳ, số bệnh ở giai đoạn hậu ghép tủy. Tính riêng ở Việt Nam, nhân mắc ung thư máu lên đến 1,129,813 và cứ mỗi theo thống kê, cứ 19 người ghép tủy sẽ có khoảng 11 10 phút sẽ có một người chết. Để điều trị ung thư người mắc GvHD sau cấy ghép. Người mắc GvHD máu thì liệu pháp được sử dụng hiện nay là hóa trị, xạ nếu nhẹ sẽ thường xuyên có triệu chứng như vàng da, trị kết hợp với cấy ghép tủy xương (ghép tủy). Ghép ban đỏ, nôn mửa, tiêu chảy, và nếu nặng hơn sẽ bị tủy là phương pháp thay thế tủy xương bị hư hỏng xơ cứng da, tróc vảy, loét ruột, xơ gan và tử vong. hoặc bị phá hủy bằng các tế bào gốc tạo máu khỏe Những triệu chứng này khiến các bệnh nhân sau ghép mạnh. Nguồn tế bào gốc khỏe mạnh có thể được thu tủy trải qua nhiều đau đớn và khó khăn trong đời nhận từ chính bệnh nhân (ghép tự thân) hoặc từ người sống sinh hoạt dẫn đến chất lượng cuộc sống suy khác (ghép dị cá thể). Nhìn chung, ghép dị cá thể cho giảm. kết quả tốt hơn trong việc kiểm soát bệnh với sự giảm Để ngăn ngừa GvHD, người ta hướng đến việc đáng kể tỉ lệ tái phát nên ngày càng được ứng dụng làm giảm hay ức chế hoạt động của các tế bào T của nhiều. Tính riêng ở Hoa Kỳ trong năm 2010 có đến người hiến tủy, là nguyên nhân gây ra GvHD, bằng 18,000 ca ghép tủy [1]. Tuy nhiên, ghép dị cá thể cách sử dụng các loại thuốc ức chế miễn dịch, các mang đến nguy cơ cao mắc bệnh vật ghép chống chủ liệu pháp sử dụng các cytokine hay thụ thể cytokine (Graft-versus-Host Disease – GvHD) cho bệnh nhân ức chế hoạt động của tế bào T, hay loại bỏ trực tiếp tế Trang 26
2. TAÏP CHÍ PHAÙT TRIEÅN KH&CN, TAÄP 19, SOÁ T1 - 2016 bào T ra khỏi mô ghép trước khi cấy ghép [2]. Tuy có khả năng kháng lại tế bào tuyến ức của người hoặc nhiên, khi sử dụng thuốc ức chế miễn dịch hay liệu dòng tế bào T người mà cụ thể là tế bào T Jurkat pháp cytokine thì hiệu quả mang lại trong khắc phục [11]. T Jurkat là một loại tế bào lympho T thu nhận GvHD thấp, chi phí rất cao và để lại nhiều hậu quả từ người bệnh bạch cầu. T Jurkat được xem như một nghiêm trọng cho bệnh nhân, nhiều bệnh nhân mô hình phổ biến nhất cho nghiên cứu các con đường (khoảng 20 %) phải sử dụng những loại thuốc ức chế truyền tín hiệu của tế bào T [15] nên hầu hết các miễn dịch suốt đời. Trong khi đó, nếu loại bỏ tế bào kháng nguyên bề mặt của chúng sẽ như tế bào T bình T trong mô tủy ghép từ người hiến tặng trước khi cấy thường. Dòng tế bào gốc tạo máu TF-1 là một mô ghép sẽ làm giảm đáng kể tỷ lệ mắc GvHD từ 53% hình phổ biến cho nghiên cứu các thụ thể truyền tín xuống còn 13 % [3]. hiệu của tế bào gốc tạo máu [16, 17] nên chúng mang Hiện nay, để loại bỏ tế bào T, một số phương hầu hết các đặc điểm bề mặt của các tế bào gốc tạo pháp được đưa ra như: phân đoạn theo gradient tỉ máu thông thường [17]. Qua đó, nhằm hướng đến trọng, kháng thể kết hợp bổ thể hay các chất độc như ứng dụng ngăn ngừa GvHD để nâng cao chất lượng ricin-A để tiêu diệt tế bào T, hoặc sử dụng các hạt từ cuộc sống của các bệnh nhân được chỉ định ghép tủy gắn kết kháng thể (hạt từ miễn dịch) kháng tế bào T xương, nghiên cứu này hướng đến việc sản xuất và trên bề mặt. Trong đó, phương pháp tạo hạt từ miễn phát triển hạt từ miễn dịch phục vụ cho phân tách tế dịch thu hút nhiều sự quan tâm do có khả năng loại bào T mà trước hết là sản xuất kháng thể kháng tế bỏ đặc hiệu tế bào T, hiệu quả cao trong phân tách bào T của người ở thỏ. Kháng thể sẽ được tạo thành riêng tế bào T khỏi tế bào gốc cần thu nhận (3–4 log bằng cách gây đáp ứng miễn dịch trên thỏ với kháng sau mỗi chu kỳ so với 1–2 log sau mỗi chu kỳ ở nguyên là tổ hợp protein màng tế bào T Jurkat và sẽ những nhóm phương pháp còn lại), đặc biệt chúng được chọn lọc âm tính loại bỏ các kháng thể có khả không gây độc hay ảnh hưởng cho tế bào gốc mục năng bắt tế bào gốc tạo máu thông qua tế bào TF-1. tiêu như phương pháp sử dụng kháng thể kết hợp chất VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP độc. Trên tế bào T có nhiều loại dấu ấn chuyên biệt Vật liệu cho chúng bao gồm CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD127, CD69, CD196, [4] trong đó CD3 với bản Dòng tế bào T Jurkat, tế bào lympho T thu nhận chất là một glycoprotein hiện diện thường trực và đặc từ người bệnh bạch cầu, được nuôi cấy huyền phù hiệu trên tế bào T từ những giai đoạn sớm (chưa trong môi trường RPMI-1640, 10% huyết thanh thai o trưởng thành) [5]. Do đó, hiện nay nhiều bộ kit phân bò, ở 37 C, 5 % CO2. Dòng tế bào này được sử dụng tách tế bào T sử dụng kháng thể kháng CD3 đã được trong việc thu nhận kháng nguyên màng để đáp ứng thương mại hóa. Trong ngăn ngừa GvHD, người ta đã miễn dịch ở thỏ. Dòng tế bào TF-1[17], một loại tế sử dụng nhiều loại kháng thể để loại bỏ tế bào T bào gốc tạo máu, được nuôi cấy huyền phù trong môi trước khi cấy ghép như CD3 và CD5 [6], CD25 và trường RPMI-1640, 10 % huyết thanh thai bò, 2 o CD69 [7, 8], CD52 (CAMPATH-1) [9, 10], hay các ng/ml hGM-CSF, ở 37 C, 5 % CO2. Dòng tế bào này kháng thể kháng globulin của tế bào tuyến ức (ATG) được sử dụng như là một tác nhân chọn lọc loại bỏ [11-14]. Trong đó, liệu pháp sử dụng ATG đã được hầu hết các kháng thể có khả năng bắt được tế bào sử dụng nhiều trong những năm gần đây và mang lại gốc tạo máu trong hỗn hợp kháng thể thu được sau nhiều hiệu quả ngăn ngừa GvHD hiệu quả [11-14]. khi gây đáp ứng miễn dịch ở thỏ bằng kháng nguyên ATG là kháng thể đa dòng sản xuất ở thỏ hay ngựa màng tế bào Jurkat T. Trang 27
3. Science & Technology Development, Vol 19, No.T1- 2016 Phương pháp Thu nhận phân đoạn màng tế bào Jurkat T có chứa được xử lý và phân tích bằng phương pháp điện di protein CD3 SDS-PAGE kết hợp nhuộm Coomassie Brilliant Blue. Sự hiện diện của protein CD3 trên màng tế bào T Kháng thể đa dòng sau tinh sạch được xử lý và Jurkat được kiểm tra bằng phương pháp nhuộm miễn tiến hành nhuộm miễn dịch huỳnh quang. Ủ tế bào dịch huỳnh quang dựa trên tương tác đặc hiệu giữa TF-1 với nồng độ 5x105 tế bào/ml với kháng thể tinh kháng thể kháng CD3 (Biolegend) và kháng thể thứ sạch ở nồng độ cuối 5μg/ml trong 30 phút ở 4oC. Ly cấp mang chất huỳnh quang Alexa488 (Sigma). tâm 1500 vòng/phút, trong vòng 5 phút, sau đó tiến Phân đoạn màng tế bào T Jurkat chứa protein hành thu phần dịch nổi. Tiến hành nhuộm miễn dịch CD3 được thu nhận bằng phương pháp ly trích điểm huỳnh quang bằng phần dịch nổi thu được trên hai sương dựa trên khả năng hòa tan protein màng và đặc mẫu tế bào Jurkat T và tế bào TF-1. điểm phân pha của Triton X-114 khi nhiệt độ trên 25 KẾT QUẢ - THẢO LUẬN o C [18]. Sau đó, protein trong các pha được xử lý Thu nhận phân đoạn màng tế bào Jurkat T có bằng phương pháp điện di SDS-PAGE và tiến hành chứa protein CD3 Western blot với kháng thể kháng CD3 epsilon Về lý thuyết, protein CD3 là dấu ấn bề mặt (Biolegend). chuyên biệt, hiện diện với mật độ lên đến 95 % trên tế Kiểm tra khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch ở thỏ bào lympho T [5]. Do đó, protein CD3 được xem như Phân đoạn màng tế bào T Jurkat thu nhận ở trên dấu ấn để xác định phân đoạn màng tế bào lympho T. được sử dụng để kích thích đáp ứng miễn dịch ở thỏ Trong xuyên suốt quá trình tạo kháng thể kháng tế với lượng 50 μg ở lần đầu tiên và 25 μg ở bốn lần bào T, tế bào T Jurkat được sử dụng như nguồn nhắc sau. Sau mỗi lần tiêm nhắc, huyết thanh thỏ nguyên liệu thu nhận kháng nguyên màng cũng như được thu nhận và được nhuộm miễn dịch huỳnh là mô hình tế bào T chuẩn cho các thí nghiệm nhuộm quang với tế bào T Jurkat để theo dõi quá trình đáp miễn dịch huỳnh quang thử nghiệm khả năng bắt tế ứng miễn dịch. Cuối cùng, phần dịch huyết thanh ở bào T của kháng thể thu được. Vì thế, việc đảm bảo lần tiêm nhắc thứ 4 được tủa trong 45-50 % dung quy trình nhuộm miễn dịch huỳnh quang thông qua dịch muối ammonium sulfate bão hòa nhằm thu nhận xác nhận sự hiện diện dấu ấn CD3 trên tế bào T kháng thể và loại bỏ các thành phần có trong huyết Jurkat là cần thiết. Kết quả được trình bày ở Hình 1. thanh. Kích thích với bước sóng 495 nm và thu nhận tín Thu nhận, tinh sạch và chọn lọc kháng thể đa dòng hiệu huỳnh quang ở bước sóng 519 nm, kết quả cho Kháng thể thu nhận bằng phương pháp tủa muối thấy tín hiệu huỳnh quang chỉ xuất hiện ở mẫu 1 ammonium sulfate được tinh sạch theo phương pháp (chứng dương) và không xuất hiện ở các mẫu chứng tinh sạch thông qua cột tinh chế HiTrap™ Protein A âm còn lại (mẫu 2, 3, 4). FF 1ml (GE Healthcare). Sau đó, các pha protein Trang 28
4. TAÏP CHÍ PHAÙT TRIEÅN KH&CN, TAÄP 19, SOÁ T1 - 2016 Hình 2. Xác nhận sự hiện diện của protein CD3 trên màng tế bào T Jurkat 1, Tế bào T Jurkat ủ với kháng thể kháng CD3; 2, Chứng âm, mẫu T Jurkat không nhuộm; 3, Chứng âm, mẫu T Jurkat chỉ ủ với kháng thể thứ cấp; 4, Chứng âm, mẫu Jurkat T ủ với kháng thể IgG isotype Để chuẩn bị nguồn kháng nguyên cho bước kích có sự hiện diện của các vạch protein tương ứng với thích đáp ứng miễn dịch, phân đoạn màng tế bào T các vạch của mẫu protein trước khi tiến hành phân Jurkat được thu nhận bằng phương pháp ly trích điểm pha (giếng 1). Điều này cho phép chúng tôi dự đoán sương. Kết quả thu được gồm hai phân đoạn giống đã có sự phân tách giữa hai pha protein ưa nước như mô tả ở công bố của Bordier [18]. Theo đó, (phân đoạn trên) và pha protein kị nước (phân đoạn những phân đoạn này được điện di SDS-PAGE và dưới) giống như những cơ sở được đề cập ở công bố Western blot nhằm theo dõi sự phân bố protein màng trước [18]. Dựa trên đó có thể giả định rằng phân tế bào T Jurkat. Kết quả được thể hiện trên Hình 2. đoạn chứa protein màng tế bào T Jurkat là phân đoạn Kết quả điện di SDS-PAGE cho thấy: ở phân dưới (giếng 3). đoạn trên (giếng 2) và phân đoạn dưới (giếng 3) đều Hình 3. Thu nhận phân đoạn màng tế bào T Jurkat có chứa protein CD3T, Thang protein phân tử lượng thấp; 1, Protein trước phân tách; 2, Protein phân đoạn trên sau phân tách; 3, Protein phân đoạn dưới sau phân tách Trang 29
5. Science & Technology Development, Vol 19, No.T1- 2016 Kết quả Western blot khi lai với kháng thể đặc Kiểm tra khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch ở hiệu kháng protein CD3 cho thấy rằng, đúng như dự thỏ đoán, ở giếng 1 và 3 có xuất hiện vạch tín hiệu tương Nhằm kiểm tra hiệu quả tạo kháng thể kháng tế ứng với vạch tín hiệu ở trên phim, trong khi ở giếng 2 bào T Jurkat nhờ kích thích đáp ứng miễn dịch bằng không có xuất hiện vạch tín hiệu. Điều này chứng tỏ phân đoạn màng tế bào T Jurkat thu được, thí nghiệm phân đoạn dưới chứa protein CD3 và những nhuộm miễn dịch huỳnh quang được tiến hành. protein với bản chất giống như CD3 (các protein Kháng thể đa dòng thu nhận được qua mỗi lần tiêm màng tế bào và các protein kị nước). Qua đó cho nhắc được thu nhận bằng phương pháp tủa muối thấy, phân đoạn protein màng tế bào T Jurkat đã được ammonium sulfate. Kết quả được trình bày ở Hình 3. thu nhận, sẵn sàng cho bước tiếp theo. Hình 4. Kết quả kiểm tra kích thích đáp ứng miễn dịch ở thỏ 1, Chứng dương, mẫu T Jurkat ủ với kháng thể kháng CD3; 2, Chứng âm, mẫu T Jurkat ủ với kháng thể trước tiêm; 3, 4, 5, 6, Mẫu T Jurkat ủ lần lượt với huyết thanh của lần tiêm nhắc thứ 1, 2, 3, 4 Trang 30
6. TAÏP CHÍ PHAÙT TRIEÅN KH&CN, TAÄP 19, SOÁ T1 - 2016 Kết quả cho thấy có tín hiệu huỳnh quang 519 Thu nhận, tinh sạch kháng thể đa dòng nm ở chứng dương, mẫu nhắc lần 3 và 4; trong khi Kháng thể đa dòng sau khi thu nhận bằng phương đó, không có tín hiệu huỳnh quang ở mẫu trước tiêm, pháp tủa muối ammonium sulfate vẫn còn lẫn nhiều nhắc lần 1 và 2. loại protein tạp trong huyết thanh nên đòi hỏi cần một Tín hiệu huỳnh quang xuất hiện ở mẫu nhắc lần bước tinh sạch tiếp theo nhằm đạt được độ tinh sạch 3, 4 mà không xuất hiện ở mẫu trước tiêm cho thấy cao hơn phục vụ cho những thí nghiệm sau đó một quá trình kích thích đáp ứng miễn dịch có hiệu quả. cách hiệu quả. Trong nghiên cứu này, kháng thể đa Việc tiêm phân đoạn màng chứa protein CD3 đã kích dòng sẽ được tiến hành tinh sạch bằng sắc ký ái lực thích thỏ tạo kháng thể kháng tế bào T Jurkat. với protein A. Kết quả được trình bày ở Hình 4. Hình 5. Tinh sạch kháng thể đa dòng bằng sắc kí ái lực protein AT, Thang protein phân tử lượng thấp; 1, Protein trước khi nạp cột; 2, Protein qua cột ở bước nạp mẫu; 3, Protein qua cột ở bước rửa mẫu; 4, Protein qua cột ở bước dung ly. So sánh giữa giếng 1 và giếng 4, kết quả điện di được trình bày trong Hình 5. Kết quả nhuộm trên tế SDS-PAGE cho thấy nhiều protein trước tinh sạch đã bào T Jurkat cho thấy, ở mẫu A-3 (mẫu tế bào T được loại bỏ ở các giai đoạn nạp mẫu (giếng 2) và rửa Jurkat nhuộm kháng thể tinh sạch sau khi tiêm) có sự cột (giếng 3). Qua đó cho thấy, sau bước tinh sạch xuất hiện của tín hiệu huỳnh quang 519 nm giống như bằng sắc kí ái lực cột protein A, hầu hết protein tạp đã mẫu A-1 (chứng dương). Trong khi đó, mẫu A-2 được loại bỏ. Hơn thế nữa, ở giếng 4 (protein qua cột (mẫu nhuộm với kháng thể prebleed tinh sạch) không bước dung ly) có hai vạch protein ở vị trí 45 – 60 kDa cho tín hiệu huỳnh quang 519 nm. Điều này chứng tỏ, và 20,1 – 30 kDa. Hai vạch protein này có kích thước kháng thể thu được có khả năng bắt với tế bào T tương ứng với chuỗi nặng (khoảng 50 kDa) và chuỗi Jurkat. Ngoài ra, kết quả nhuộm trên tế bào TF-1 cho nhẹ (25 – 30 kDa) của kháng thể thỏ. Điều này cho thấy, ở mẫu B-3 (mẫu tế bào TF-1 nhuộm kháng thể phép kết luận rằng kháng thể đa dòng từ thỏ đã được tinh sạch sau khi tiêm) có sự xuất hiện của tín hiệu thu nhận và tinh sạch. huỳnh quang 519 nm giống như mẫu A-1. Trong khi Tiếp theo, để kiểm tra khả năng nhận diện tế bào mẫu B-2 (tế bào TF-1 nhuộm với prebleed tinh sạch) T Jurkat, kháng thể sau bước tinh sạch được thử không có tín hiệu huỳnh quang 519 nm. Điều này nhuộm miễn dịch huỳnh quang. Thực hiện mẫu đối chứng tỏ, các kháng thể thu nhận được sau quá trình chứng sử dụng một dòng tế bào gốc tạo máu là TF-1 gây đáp ứng miễn dịch trên thỏ cũng có khả năng bắt nhằm kiểm tra độ đặc hiệu của kháng thể. Kết quả các tế bào TF-1. Trang 31
7. Science & Technology Development, Vol 19, No.T1- 2016 Hình 6. Kiểm tra khả năng nhận diện của kháng thể đa dòng A, Tế bào T Jurkat ; B, Tế bào TF-1; 1, Chứng dương, mẫu ủ với kháng thể kháng CD3; 2, Chứng âm, mẫu ủ với preblood đã tinh sạch; 3, Mẫu ủ với kháng thể đã tinh sạch sau khi tiêm. Các tế bào TF-1 và các tế bào T Jurkat đều là cần phải có bước chọn lọc để loại bỏ những kháng thể những tế bào có nguồn gốc từ người. Điều này dẫn bắt tế bào TF 1 đến việc những tế bào này có thể có một số dấu ấn bề Chọn lọc âm tính kháng thể đa dòng trên tế bào mặt giống nhau. Chính vì thế, khi gây đáp ứng miễn TF-1 dịch trên thỏ bằng phân đoạn màng tế bào T Jurkat, Nhằm hướng đến việc loại bỏ những kháng thể những dấu ấn bề mặt đó sẽ kích thích các tế bào B bắt các tế bào gốc tạo máu TF-1, bước chọn lọc âm của thỏ sản xuất kháng thể kháng lại chúng. Vì thế, tính trên tế bào TF-1 được thực hiện. Kết quả được một số dòng kháng thể thu được sau khi tiêm sẽ đồng trình bày trong Hình 6. thời bắt được cả tế bào TF-1 và tế bào Jurkat T; do đó Trang 32
8. TAÏP CHÍ PHAÙT TRIEÅN KH&CN, TAÄP 19, SOÁ T1 - 2016 Hình 7. Kết quả chọn lọc âm tính kháng thể đa dòng A, Tế bào T Jurkat; B, Tế bào TF-1; 1, Mẫu nhuộm với kháng thể trước chọn lọc; 2, Mẫu nhuộm với kháng thể sau chọn lọc. Phân tích kết quả thu được cho thấy rằng, đúng thấy các kháng thể đa dòng có khả năng nhận diện như dự đoán ở mẫu trước chọn lọc A-1 và B-1 đều có được các tế bào T Jurkat và nhận diện yếu các tế bào tín hiệu huỳnh quang 519 nm. Tuy nhiên, ở những TF-1. mẫu sau khi chọn lọc, A-2 và B-2 cho thấy rằng tín KẾT LUẬN hiệu huỳnh quang 519 nm có sự sụt giảm về cường Kết quả nghiên cứu cho thấy kháng thể kháng tế độ, đặc biệt là mẫu B-2 (mẫu tế bào TF-1 nhuộm với bào Jurkat T đã được tạo ra bằng việc gây đáp ứng kháng thể sau khi chọn lọc). Từ đó điều này có thể miễn dịch trên thỏ bằng phân đoạn màng tế bào T kết luận rằng phương pháp chọn lọc đang sử dụng có Jurkat. Kháng thể đa dòng kháng tế bào T Jurkat khả năng loại bỏ các kháng thể bắt được tế bào TF-1. được chọn lọc để có khả năng bắt yếu các tế bào TF-1 Tuy nhiên, những kháng thể thu được sau chọn lọc mà vẫn còn khả năng nhận diện tế bào T Jurkat. vẫn còn khả năng bắt được các tế bào TF-1. Điều này Lời cảm ơn: Nhóm tác giả xin chân thành cảm ơn có thể do các điều kiện chọn lọc chưa được tối ưu đến GS. Toshio Kitamura, Viện Y khoa, Đại học như số lượng tế bào sử dụng để chọn lọc chưa phù Tokyo đã cung cấp dòng tế bào TF-1. Đề tài được hợp, hay nồng độ kháng thể sử dụng quá cao Vì thực hiện bằng kinh phí của đề tài 376/2013 HĐ- vậy, việc tối ưu hóa quá trình loại bỏ kháng thể đa SKHCN của Sở Khoa học và Công nghệ Thành phố dòng kháng tế bào TF-1 là cần thiết. Tóm lại, ở thí Hồ Chí Minh. nghiệm chọn lọc âm tính, kết quả thu nhận được cho Trang 33
9. Science & Technology Development, Vol 19, No.T1- 2016 Generation and selective isolation of IgG antibodies against Jurkat T-cell membrane proteins Trinh Minh Thuong HuynhThi Xuan Mai Tran Van Hieu University of Science, VNU-HCM ABSTRACT Currently, Graft-versus-Host Disease (GvHD) priming and 25 μg for the next four boostings. Rabbit has been the major barrier to the application of serum was collected and partially precipitated in 50 allogeneic bone marrow transplantation for percent of saturated ammonium sulfate solution. hematopoietic disorders treatment, especially Next, precipitated polyclonal antibodies were purified leukemia. GvHD is caused by donor mature T cells’ by using protein-A affinity chromatography column attack on recipient’s tissues and organs. Recently, T and the purity was determimed by SDS-PAGE. cell depletion using immunomagnetic nanoparticles is Afterwards, the purified antibodies were used in one of the most effective methods to prevent GvHD. immune-fluorescent stainings and the recognition to In this present study, polyclonal antibodies against Jurkat T cells was evaluated via fluorescent Jurkat T cell membrane were generated as a microscopic imaging. Finally, the purified antibodies component of immunomagnetic particle. Firstly, were negatively selected by incubating with TF-1 cell, Jurkat T cell membrane was fractionated by cloud a hematopoietic stem cell, to eliminate cross-reacting point extraction using Triton X-114. Subsequently, antibodies. The immunocytofluorescent staining the fractionated membrane was used to results showed that the purified and selected subcutaneously immunize rabbits for polyclonal polyclonal antibodies weakly cross-reacted with TF-1 antibodies production with a dose of 50 μg for cells and strongly bound to Jurkat T cell Key words: anti-T cell polyclonal antibodies, cloud point extraction, Graft-versus-Host Disease, negative selection TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. F.R. Appelbaum, Haematopoietic cell complete remission, Biology of Blood and transplantation as immunotherapy, Nature, 411 Marrow Transplantation,19, 6, 898-903 (2013). (6835), 385-389 (2001). [4]. B. Biosciences, Human and Mouse CD Marker [2]. B. Hertenstein, L. Arseniev, et al., A Handbook, CD Marker Handbook, (2010). comparative review of methods for T cell [5]. R. Chetty and K. Gatter, CD3: structure, depletion in the prophylaxis of Graft-versus- function, and role of immunostaining in clinical Host Disease, BioDrugs, 9 (2), 105-123. (1998). practice, The Journal of Pathology, 173, 4, 303- [3]. U.D. Bayraktar, M. de Lima, et al., Ex Vivo T 307 (1994). cell–depleted versus unmodified allografts in [6]. J. Okunewick, D. Kociban, et al., Comparison of patients with acute myeloid leukemia in first the effects of CD3 and CD5 donor T cell depletion on graft-versus-leukemia in a murine Trang 34
10. TAÏP CHÍ PHAÙT TRIEÅN KH&CN, TAÄP 19, SOÁ T1 - 2016 model for MHC-matched unrelated-donor [13]. J. Finke, W.A. Bethge, et al., Standard graft- transplantation, Bone Marrow Transplantation, versus-host disease prophylaxis with or without 13 (1), 11-17. (1994) anti-T-cell globulin in haematopoietic cell [7]. J.H. Antin, B.E. Bierer, et al., Selective transplantation from matched unrelated donors: a depletion of bone marrow T lymphocytes with randomised, open-label, multicentre phase 3 anti-CD5 monoclonal antibodies: effective trial, The lancet oncology, 10, 9, 855-864 prophylaxis for graft-versus-host disease in (2009). patients with hematologic malignancies, Blood, [14]. P. Vo, J. Pantin, et al., Conditioning with rabbit 78, 8, 2139-2149 (1991). versus horse ATG dramatically alters clinical [8]. B. Fehse, M. Goldmann, et al., Depletion of outcomes in identical twins with severe aplastic alloreactive donor T cells using anemia transplanted with the same allogeneic immunomagnetic cell selection, Bone Marrow donor, Journal of Hematology & Oncology, 8, 1, Transplantation, 25 S39-42 (2000). 1-8 (2015). [9]. H. Waldmann and G. Hale, CAMPATH: from [15]. R.T. Abraham and A. Weiss, Jurkat T cells and concept to clinic, Philosophical Transactions of development of the T-cell receptor signalling the Royal Society B: Biological Sciences, 360, paradigm, Nature Reviews Immunology, 4, 4, 1461, 1707-1711 (2005). 301-308 (2004). [10]. G. Hale, S. Cobbold, et al., CAMPATH-1 [16]. T. Kitamura, T. Tange, et al., Establishment and antibodies in stem-cell transplantation, characterization of a unique human cell line that Cytotherapy, 3, 3, 145-164 (2001). proliferates dependently on GM‐CSF, IL‐3, or [11]. I.K. Na, F. Wittenbecher, et al., Rabbit erythropoietin, Journal of Cellular Physiology, antithymocyte globulin (Thymoglobulin®) 140, 2, 323-334 (1989). impairs the thymic output of both conventional [17]. T. Kitamura, A. Tojo, et al., Identification and and regulatory CD4+ T cells after allogeneic analysis of human erythropoietin receptors on a hematopoietic stem cell transplantation in adult factor-dependent cell line, TF-1, Blood, 73, 2, patients, Haematologica, 98, 1, 23-30. (2013). 375-380 (1989). [12]. M. Lopez, M.R. Clarkson, et al., A novel [18]. C. Bordier, Phase separation of integral mechanism of action for anti-thymocyte membrane proteins in Triton X-114 solution, globulin: induction of CD4+ CD25+ Foxp3+ Journal of Biological Chemistry, 256, 4, 1604- regulatory T cells, Journal of the American 1607 (1981). Society of Nephrology, 17, 10, 2844-2853. (2006). Trang 35