Sinh lý hô hấp thực vật

Nội dung text: Sinh lý hô hấp thực vật

1. SINH LÝ HÔ HẤP THỰC VẬT
2. SINH LÝ HÔ HẤP THỰC VẬT Quang hợp cung cấp các chất hữu cơ cơ bản cho thực vật (và gần như tất cả sự sống khác) phụ thuộc vào. Hô hấp, với sự trao đổi chất carbon liên quan của nó, giải phóng năng lượng lưu trữ trong các hợp chất carbon một cách kiểm soát để sử dụng. Đồng thời nó tạo ra nhiều tiền chất carbon cho sinh tổng hợp. Chuyên đề này sẽ xem xét về quá trình chuyển hoá của hô hấp, nhấn mạnh đến các đặc điểm đặc trưng ở thực vật. Một phần bản chất của hô hấp cũng sẽ được lí giải dựa trên những thành tựu gần đây về hoá sinh và sinh học phân tử ty thể thực vật. Đồng thời, xem xét đến những yếu tố ảnh hưởng đến quá trình hô hấp, từ đó ứng dụng vào bảo quản sản phẩm nông nghiệp. 1. KHÁI QUÁT VỀ HÔ HẤP THỰC VẬT Hô hấp hiếu khí (cần oxy phân tử) phổ biến gần như tất cả các sinh vật nhân chuẩn và nhiều cơ thể nhân sơ, và quá trình hô hấp ở thực vật cũng được tìm thấy tương tự ở động vật và vi sinh vật. Tuy nhiên, hô hấp thực vật có một số khía cạnh đặc trưng để phân biệt với hô hấp động vật. Hô hấp hiếu khí là quá trình sinh học, mà các chất hữu cơ được huy động và sau đó bị oxy hoá một cách kiểm soát. Trong quá trình hô hấp, năng lượng tự do được tạo ra và được lưu giữ trong một hợp chất là ATP – được sử dụng cho sự tồn tại và phát triển của thực vật. Glucose là cơ chất phổ biến nhất cho quá trình hô hấp. Tuy nhiên, trong một tế bào thực vật carbon được khử có thể từ sucrose, hexose phosphate và triose phosphate xuất phát từ phân giải tinh bột và quang hợp, polyme có chứa fructose (fructan), các loại đường khác, lipid (chủ yếu là triacylglycerol), các acid hữu cơ, và một vài trường hợp là protein (hình 1). 1
3. Hình 1: Khái quát về hô hấp. Cơ chất cho hô hấp được tạo ra bởi các quá trình khác nhau của tế bào và đi vào con đường hô hấp. Đường phân và con đường pentose phosphate trong tế bào chất và lạp thể (plastid) chuyển hóa đường thành các acid hữu cơ, thông qua hexose phosphate và triose phosphate, tạo ra NADH hoặc NADPH và ATP. Các acid hữu cơ được oxy hoá trong chu trình acid citric ty thể, và tạo ra NADH, FADH2 và cung cấp năng lượng cho tổng hợp ATP nhờ chuỗi vận chuyển điện tử và ATP synthase trong quá trình phosphoryl hoá oxy hoá. Trong sự hình thành đường glucose mới(gluconeogenesis), carbon từ lipid được chia nhỏ trong glyoxysome, chuyển hoá trong chu trình acid citric, và sau đó được sử dụng để tổng hợp đường trong tế bào chất bởi quá trình ngược với đường phân. Theo quan điểm hoá học, hô hấp thực vật có thể được thể hiện như là quá trình oxy hoá phân tử 12 carbon – đường sucrose và quá trình khử của 12 phân tử của O2: + - C12H22O11 + 13H2O Æ 12CO2 + 48H + 48e + - 12O2 + 48H + 48e Æ 24H2O 2
4. Quá trình hô hấp được khái quát theo sơ đồ dưới đây: Từ sơ đồ trên, đưa đến phản ứng thực sau: C12H22O11 + 12O2 Æ 12CO2 + 11H2O Phản ứng này “dường như” là ngược chiều của quá trình quang hợp, nó đại diện cho một phản ứng oxy hoá khử trong đó sucrose bị oxy hoá hoàn toàn tới CO2 trong khi O2 đóng vai trò như chất nhận (acceptor) điện tử cuối cùng, bị khử thành nước. Năng lượng tự do chuẩn cho các phản ứng là 5.760 kJ (1380 kcal)/mol (342g) đường sucrose bị oxy hoá. Kiểm soát việc giải phóng năng lượng tự do này, kết hợp với sinh tổng hợp ATP là nội dung chủ yếu của quá trình hô hấp. Để tránh nguy hại (đốt cháy) các cấu trúc tế bào, tế bào huy động số lượng lớn năng lượng tự do được giải phóng trong quá trình oxy hoá sucrose bằng cách thực hiện một dãy các phản ứng theo từng bước một (dạng bậc thang). Các phản ứng này có thể được chia thành các nhóm bốn quá trình chính: đường phân, chu trình acid citric, các phản ứng của con đường pentose phosphate, và phosphoryl hóa oxy hoá. Cơ chất của hô hấp đi vào quá trình hô hấp tại các điểm khác nhau trong các con đường, được tóm tắt trong hình 1. • Đường phân (glycolysis): liên quan đến một loạt các phản ứng được thực hiện bởi một nhóm các enzyme hoà tan nằm trong tế bào chất và cả các lạp thể 3
5. (plastid). Một loại đường - ví dụ, sucrose - một phần bị oxy hoá thông qua đường 6-carbon phosphate (hexose photphat) và đường 3-carbon phosphate (triose photphat) để tạo ra một hữu cơ acid – ví dụ như pyruvate. Hiệu suất năng lượng của quá trình này nhỏ gồm ATP, và một nucleotide pyridin khử - NADH. • Con đường pentose phosphate, cũng nằm trong tế bào chất và trong các lạp thể, đường 6-carbon (glucose-6-phosphate) ban đầu bị oxy hoá thành đường 5- carbon (ribulose-5-phosphate). Tạo thành CO2, và năng lượng tạo ra được tích luỹ dưới dạng hai phân tử của một nucleotide pyridin khử - NADPH. Trong các phản ứng sau gần trạng thái cân bằng, ribulose-5-phosphate được chuyển thành đường 3 đến 7 carbon. • Trong chu trình acid citric (citric acid cycle), pyruvate được oxy hoá hoàn toàn tới CO2, và tạo ra một lượng đáng kể lực khử tương đương (16 NADH + 4FADH2)/sucrose được tạo ra trong quá trình. Các phản ứng liên quan đến một loạt các enzyme nằm trong chất nền ty thể (xem hình 5) và chỉ có Succinate dehydrogenase nằm trên màng trong của ty thể. • Trong quá trình phosphoryl hoá oxy hoá, điện tử được vận chuyển nhờ một chuỗi vận chuyển điện tử gồm các protein vận chuyển điện tử nằm ở màng trong ty thể. Hệ thống này chuyển các điện tử từ NADH (và các loại có liên quan) - tạo ra trong đường phân, con đường pentose phosphate, và chu trình acid citric tới oxy. Sự vận chuyển điện tử này giải phóng một lượng lớn năng lượng tự do được tích lũy trong ATP (tổng hợp từ ADP và Pi - phosphate vô cơ) được xúc tác bởi enzyme ATP synthase. Tập hợp các phản ứng oxy hoá khử của chuỗi vận chuyển điện tử và sinh tổng hợp ATP được gọi là phosphoryl hóa oxy hoá. Đây là giai đoạn cuối cùng quá trình oxy hoá hoàn toàn sucrose. Nicotinamid adenine dinucleotide (NAD+/NADH) là một cofactor hữu cơ (coenzyme) gắn liền với nhiều enzyme xúc tác cho nhiều phản ứng oxy hoá khử trong tế bào. NAD+ là dạng cofactor oxy hoá và nó trải qua một phản ứng thuận nghịch, và trở thành dạng khử NADH khi phản ứng với 2 điện tử (hình 2): 4
6. NAD+ + 2e- + H+ Æ NADH Hình 2: Các cấu trúc và các phản ứng của các cofactor chủ yếu mang điện tử tham gia vào năng lượng sinh học hô + hấp. (A) Sự khử NAD(P) tới NAD(P)H; (B) Sự khử của FAD tới FADH2. FMN là giống hệt với một phần flavin và được hiển thị trong khung trên hình 2. Các khu vực màu xanh hiển thị phần của các phân tử được tham gia trong phản ứng oxy hoá khử. Thế năng khử chuẩn cho cặp phản ứng oxy hoá khử là khoảng -320mV, tạo ra một chất khử mạnh (tức là chất cho điện tử). Như vậy, NADH là một phân tử thuận tiện để tích lũy năng lượng tự do của các điện tử được giải phóng ra trong phản ứng oxy hoá của đường phân và chu trình acid citric. Một hợp chất có liên quan là nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADP+/NADPH), hoạt động trong các phản ứng oxy hoá khử của quang hợp và trong con đường pentose phosphate, nó còn tham gia vào sự trao đổi chất ty thể. 5
7. Sự oxy hoá NADH bởi oxy qua chuỗi vận chuyển điện tử giải phóng năng lượng tự do (220 kJ/mol-1, hoặc 52 kcal/mol-1) được sử dụng để tổng hợp ATP. Bây giờ chúng ta có thể xây dựng một bức tranh hoàn chỉnh hơn về mối liên quan giữa hô hấp và vai trò của nó trong quá trình chuyển hoá năng lượng tế bào qua hai phản ứng sau đây: C12H22O11 + 12O2 Æ 12CO2 + 11H2O 60ADP + 60Pi Æ 60ATP + 60H2O Không phải tất cả carbon đi vào con đường hô hấp đều kết thúc là CO2. Nhiều sản phẩm trung gian của hô hấp là tiền chất cho các quá trình chuyển hóa khác (xem hình 13). 2. ĐƯỜNG PHÂN: QUÁ TRÌNH DIỄN RA TRONG TẾ BÀO CHẤT VÀ LẠP THỂ Trong những bước đầu của đường phân (glycolysis bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp “glykos”: đường và “lysis”: tách), carbohydrate được chuyển thành hexose phosphate, sau đó được phân chia thành hai đường triose phosphate. Trong giai đoạn tiếp theo, năng lượng được tích luỹ trong đường triose phosphate được oxy hoá và sắp xếp lại để tạo ra hai phân tử pyruvate. Bên cạnh việc chuẩn bị cơ chất cho quá trình oxy hoá trong chu trình acid citric, hiệu suất năng lượng của đường phân nhỏ, năng lượng được tích luỹ trong các hợp chất hoá học gồm ATP và NADH. Khi phân tử oxy không có sẵn chẳng hạn như ở rễ cây trồng trong vùng đất ngập nước thì con đường lên men (fermentation pathway), với các phản ứng diễn ra trùng khớp với quá trình đường phân, diễn ra trong tế bào chất, khử pyruvate để tuần hoàn NADH được tạo ra từ đường phân. 6
8. 2.1. Đường phân chuyển hóa carbohydrate thành pyruvate, tạo ra NADH và ATP Đường phân xảy ra ở tất cả các cơ thể sống (sinh vật nhân sơ và sinh vật nhân chuẩn). Các phản ứng chính gắn liền với quá trình đường phân và lên men trong các ty thể gần như giống với trong tế bào động vật (hình 3). Tuy nhiên, đường phân thực vật có đặc trưng điều hoà riêng, ví dụ như một phần con đường đường phân diễn ra song song trong lạp thể và enzyme xúc tác thay đổi ở một vài bước trong tế bào chất. Trong động vật, cơ chất của đường phân là glucose và sản phẩm cuối cùng là pyruvate. Nhưng vì sucrose lại là đường chủ yếu trong hầu hết các loài thực vật, do đó đường này là cơ chất cho cây hô hấp ở các mô không quang hợp (không phải glucose). Sản phẩm cuối cùng của đường phân thực vật bao gồm acid hữu cơ gồm pyruvate và malate. Trước khi diễn ra đường phân, sucrose dễ dàng được “bẻ” thành hai monosaccharid (glucose và fructose) có thể đi vào con đường đường phân. Hai con đường cho sự phân giải sucrose được biết trong thực vật đều lấy sucrose từ libe. Trong hầu hết các mô thực vật, sucrose synthase có trong tế bào chất, được sử dụng để phân giải sucrose bằng cách kết hợp sucrose với UDP để sản xuất fructose và UDP-glucose. UDP-glucose pyrophosphorylase xúc tác chuyển UDP- glucose và pyrophosphate (PPi) thành UTP và glucose-6-phosphate theo sơ đồ dưới đây (và xem thêm ở hình 3). 7
9. Trong một số mô, sự có mặt của invertase ở trong thành tế bào, không bào, hoặc tế bào chất sẽ thuỷ phân sucrose để tạo thành hai thành phần của nó là đường 6-carbon (glucose và fructose). Các hexose này sau đó được phosphoryl hoá trong phản ứng có sử dụng ATP. Ngược lại, khi phản ứng xúc tác bởi sucrose synthase gần tới trạng thái cân bằng, phản ứng xúc tác bởi invertase giải phóng đủ năng lượng về cơ bản đây là phản ứng không thuận nghịch. Lạp thể (có thể là lục lạp hoặc bột lạp) cũng có thể cung cấp cơ chất cho đường phân. Tinh bột được tổng hợp và được phân giải chỉ trong các lạp thể, và carbon thu được từ sự phân giải tinh bột đi vào con đường đường phân trong tế bào chất chủ yếu như hexose phosphate (được di chuyển ra khỏi bột lạp) hoặc triose phosphate (được di chuyển ra khỏi lục lạp). Sản phẩm quang hợp cũng có thể trực tiếp vào con đường đường phân như triose phosphate. Các lạp thể chuyển tinh bột thành triose phosphate sử dụng một dãy isozyme riêng biệt xúc tác phản ứng chuyển hexose phosphate thành triose photphat. Tất cả các enzyme được thể hiện trong hình 3 đã được đánh giá ở mức 8
10. vừa đủ để hỗ trợ hô hấp và kết quả đã được quan sát trong các mô thực vật nguyên vẹn. Trong giai đoạn đầu tiên của đường phân, mỗi đơn vị hexose được phosphoryl hóa hai lần và sau đó chia tách, cuối cùng tạo ra hai phân tử triose phosphate. Các phản ứng này tiêu thụ 2-4 phân tử ATP trên một đơn vị sucrose, tuỳ thuộc vào việc sucrose được tách ra bởi sucrose synthase hoặc invertase. Các phản ứng này cũng bao gồm hai trong ba phản ứng cơ bản không thuận nghịch của con đường đường phân được xúc tác bởi hexokinase và phosphofructokinase (xem hình 3). Phản ứng phosphofructokinase là một trong những điểm kiểm soát (điều khiển) ở cả đường phân thực vật và động vật. 2.2. Phase tích lũy năng lượng của đường phân Các phản ứng chuyển carbon từ các “bể” (tạm dịch: “bể”) cơ chất khác nhau đến triose phosphate. Khi glyceraldehyde-3-phosphate được hình thành, con đường đường phân có thể bắt đầu trích xuất năng lượng để tích lũy. Enzyme glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase xúc tác quá trình oxy hóa aldehyde thành một acid carboxylic, khử NAD+ tạo NADH. Phản ứng này giải phóng năng lượng tự do để sử dụng cho phosphoryl hóa (sử dụng phosphate vô cơ) glyceraldehyde-3-phosphate để tạo ra 1,3-bisphosphoglycerate. Sự phosphoryl hóa acid carboxylic ở carbon số 1 của 1,3-bisphosphoglycrerate (xem hình 3) tạo ra một năng lượng tự do chuẩn lớn (-49,3 kJ/mol-1, hoặc -11,8 kcal.mol-1). Do đó, 1,3-bisphosphoglycerate là một chất khử mạnh của các nhóm phosphate. Trong bước tiếp theo của đường phân, được xúc tác bởi phospho glycerate kinase, phosphate ở carbon số 1 được chuyển tới một phân tử ADP, tạo ra ATP và 3-phosphoglycerate. Mỗi phân tử sucrose đi vào con đường này có 4 phân tử ATP được hình thành – mỗi phân tử ATP được hình thành từ một phân tử 1,3- bisphosphoglycerate. Loại tổng hợp ATP theo kiểu này được gọi là phosphoryl hóa ở mức cơ chất có nghĩa là diễn ra sự chuyển giao trực tiếp một nhóm phosphate từ một 9
11. phân tử cơ chất cho ADP để tạo thành ATP. ATP tổng hợp bằng cách phosphoryl hóa ở mức cơ chất có cơ chế khác biệt với ATP được tổng hợp bởi ATP synthase tham gia vào việc phosphoryl hóa oxy hóa trong ty thể hoặc quang phosphoryl hóa trong lục lạp. Trong phản ứng tiếp theo, phosphate ở 3-phosphoglyxerat được chuyển đến carbon số 2 và một phân tử nước bị loại bỏ, sự linh động của hợp chất phosphoenolpyruvate (PEP). Nhóm phosphate của PEP có năng lượng tự do chuẩn cao (-61,9 kJ / mol-1, hoặc -14,8 kcalmol-1), điều đó làm cho PEP là một chất khử rất tốt cho hình thành ATP. Bằng cách sử dụng PEP như là cơ chất, các enzyme pyruvate kinase xúc tác một phản ứng phosphoryl hóa ở mức cơ chất lần 2 để tạo ra ATP và pyruvate. Bước cuối cùng, đó là bước thứ ba về cơ bản không thể thuận nghịch trong đường phân, hiệu suất năng lượng là thêm bốn phân tử ATP cho mỗi phân tử sucrose vào con đường đường phân. 2.3. Thực vật có các phản ứng đường phân biến thể Trình tự của các phản ứng tạo thành pyruvate từ đường xảy ra ở tất cả các sinh vật nhờ thực hiện đường phân. Ngoài ra, các sinh vật có thể tổng hợp đường từ các acid hữu cơ. Quá trình này được gọi là tổng hợp đường mới - gluconeogenesis. Gluconeogenesis không phổ biến ở thực vật, nhưng nó hoạt động trong hạt của một số loài thực vật, chẳng hạn như đậu castor và hướng dương, lưu trữ số lượng đáng kể carbon dự trữ dưới dạng các loại dầu (triacylglycerol). Sau khi các hạt giống nảy mầm, dầu được chuyển theo gluconeogenesis tạo ra sucrose, mà sau đó sẽ được sử dụng để hỗ trợ cây giống. Trong giai đoạn đầu tiên của đường phân, gluconeogenesis trùng lặp với các lộ trình tổng hợp sucrose từ quang tổng hợp triose phosphate, là điển hình cho các thực vật. Bởi vì phản ứng phân giải đường được xúc tác bởi phosphofructokinase phụ thuộc ATP (ATP-dependent phosphofructokinase) cơ bản là không thuận nghịch (xem hình 3), thêm vào đó là một loại enzyme được bổ sung, fructose-1,6- 10
12. bisphosphatease, chuyển fructose-1,6-bisphosphate tạo thành fructose-6- phosphate và Pi trong suốt quá trình gluconeogenesis. Phosphofructokinase phụ thuộc ATP và fructose-1,6-bisphosphatease kiểm soát điểm chính của dòng carbon thông qua con đường phân giải đường /gluconeogenic trong cả thực vật và động vật, cũng như trong tổng hợp sucrose ở thực vật Trong thực vật, sự chuyển hóa qua lại giữa fructose-6-phosphate và fructose-1,6-bisphosphate phức tạp hơn bởi sự hiện diện của một enzyme (bổ sung trong tế bào chất) đó là phosphofructokinase phụ thuộc -PPi (pyrophosphate: fructose-6-phosphate 1-phosphotransferase), xúc tác phản ứng thuận nghịch (xem hình 3): Fructose-6-P + PPi ↔ Fructose-1,6-P2 + Pi Trong đó P là phosphate và P2 và bisphosphate phosphate. Phosphofructokinase phụ thuộc PPi được tìm thấy trong tế bào chất của hầu hết các mô thực vật với hàm lượng cao hơn đáng kể so với của phosphofructokinase phụ thuộc ATP. Sự ngăn cản của phosphofructokinase phụ thuộc PPi ở khoai tây biến đổi gen đã chỉ ra rằng của enzyme này giúp đường phân diễn ra mạnh mẽ, nhưng mà nó không phải là thiết yếu cho sự sống còn của thực vật, các enzyme khác có thể giữ chức năng này. Phản ứng xúc tác của phosphofructokinase phụ thuộc PPi là dễ dàng thuận nghịch, nhưng nó không hoạt động trong tổng hợp sucrose. Giống như phosphofructokinase phụ thuộc ATP và fructose bisphosphatease, enzyme này dường như xuất hiện để điều hòa quá trình chuyển hóa tế bào, điều đó gợi ý rằng trong một số trường hợp hoạt động của con đường phân giải đường ở thực vật có sự khác biệt với các sinh vật khác. Sản phẩm cuối cùng của quá trình đường phân trong tế bào chất của tế bào được xác định bởi hoạt động của 3 enzyme có liên quan, các enzyme này sử dụng phosphoenolpyruvate làm cơ chất. Hai enzyme pyruvate kinase và PEP phosphatase xúc tác phản ứng tạo thành pyruvate, riêng PEP carboxylase xúc tác 11
13. phản ứng tạo thành oxaloacetate. Pyruvate được chuyển trực tiếp vào trong ty thể. OAA có thể hoặc chuyển trực tiếp vào ty thể hoặc đầu tiên bị khử tới malate bởi enzyme malate dehydrogenase tế bào chất, theo phương trình sau: Màng trong của ty thể có chứa các chất mang riêng biệt nơi mà malate và pyruvate có thể được chuyển vào trong chất nền ty thể. Trong chất nền ty thể, malate có thể bị oxy hóa bởi hai enzyme: isoenzyme của malate dehydrogenase ty thể tạo thành OAA và NADH, và một enzyme nữa là NAD+ liên kết malic enzyme xúc tác hình thành pyruvate, CO2, và NADH, cả hai enzyme này đều nằm trong chất nền ty thể, phản ứng được chỉ ra theo phương trình dưới đây. Trước đó malate có thể đi vào trong ty thể từ tế bào chất nhờ sự khử tương đương (reducing equivalents). 12
14. Hình 3: Các phản ứng của đường phân và lên men ở thực vật (A). Trong con đường chính, sucrose bị oxy hóa thành acid hữu cơ pyruvic. Các mũi tên kép chỉ chiều phản ứng thuận nghịch; các mũi tên đơn, chủ yếu là phản ứng không thuận nghịch. (B) Các cấu trúc của chất trung gian chứa P, phosphate P2, biphosphate. + 2.4. Trong điều kiện thiếu (không có) O2, lên men tái sinh NAD cần thiết cho đường phân Nếu không có oxy, chu trình acid citric và phosphoryl hóa oxy hóa không thể hoạt động, đường phân do đó không thể tiếp tục vì cung cấp NAD+ của tế bào bị hạn chế vì tất cả các NAD+ chuyển lên trạng thái khử (NADH), các phản ứng xúc tác bằng glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase không thể xảy ra (NAD+ giống như con thuyền chở điện tử và proton). Để khắc phục vấn đề này, thực vật và các sinh vật khác có thể chuyển hóa pyruvate bằng cách thực hiện một hoặc nhiều hình thức trao đổi chất lên men (xem hình 3). Trong quá trình lên men rượu (phổ biến trong các thực vật, nhưng được biết đến rộng rãi hơn ở nấm men rượu), hai enzyme pyruvate decarboxylase và alcohol pyruvate dehydrogenase hoạt động trên pyruvate, cuối cùng tạo ra ethanol và khí CO2 và oxy hóa NADH trong quá trình. Trong quá trình lên men acid lactic (thường có ở bắp thịt động vật có vú và còn tìm thấy ở thực vật), các loại enzyme lactate dehydrogenase sử dụng NADH để khử pyruvate tới lactate, do đó tái sinh NAD+. Trong một số trường hợp, mô thực vật có thể chịu nồng độ thấp (hypoxic) hay không có (anoxic) oxy xung quanh, khiến chúng phải thực hiện 14
15. chuyển hóa lên men. Ví dụ tốt nhất để thực hiện nghiên cứu này bao gồm các loại đất bị ngập lụt hoặc no nước mà ở đó sự khuếch tán oxy giảm là nguyên nhân để các mô gốc bị thiếu oxy. Ở ngô, các phản ứng ban đầu với oxy thấp là quá trình lên men acid lactic, nhưng các phản ứng tiếp theo là lên men rượu. Ethanol được cho là một sản phẩm cuối cùng của quá trình lên men ít độc hại vì nó có thể khuếch tán ra khỏi tế bào, trong khi tích lũy lactate sự đẩy nhanh quá trình axit hóa tế bào chất. Trong nhiều trường hợp, chức năng thực vật tùy theo điều kiện gần/kỵ khí mà thực hiện một số hình thức lên men. 2.5. Lên men không phải giải phóng tất cả năng lượng có sẵn trong phân tử đường Trước khi chúng ta rời khỏi chủ đề của đường phân, chúng ta cần phải xem xét hiệu quả của quá trình lên men. Hiệu quả được xác định ở đây là năng lượng được chuyển như ATP liên quan đến năng lượng thế năng sẵn có trong một phân tử sucrose. Năng lượng tự do chuẩn (ΔG0’) thay đổi trong quá trình oxy hóa hoàn toàn sucrose là -5.760 kJmol-1 (1380 kcal.mol-1). Giá trị của ΔG0' để tổng hợp ATP là 32 kJ mol-1 (7,7 kcal.mol-1). Tuy nhiên, dưới các điều kiện bình thường không chuẩn tồn tại ở cả tế bào động vật có vú và các tế bào thực vật, tổng hợp ATP đòi hỏi phải cung cấp năng lượng tự do khoảng 50 kJ.mol-1 (12 kcal.mol-1). Đem lại sự tổng hợp thực là bốn phân tử ATP từ mỗi phân tử sucrose được chuyển thành ethanol (hoặc lactate), hiệu quả của quá trình lên men kỵ khí chỉ khoảng 4%. Hầu hết năng lượng có sẵn trong sucrose vẫn trong sản phẩm khử của quá trình lên men: lactate hoặc ethanol. Trong hô hấp hiếu khí, các pyruvate tạo ra qua đường phân được vận chuyển vào ty thể, nơi nó được tiếp tục bị oxy hóa, tạo ra năng lượng tự do nhiều hơn giá trị ban đầu có trong sucrose. Bởi vì hiệu quả tích lũy năng lượng qua lên men thấp, nên việc tăng tỷ lệ đường phân là cần thiết để duy trì sản xuất ATP rất cần thiết cho sự sống còn của tế bào. Điều này được gọi là hiệu ứng Pasteur sau khi Louis Pasteur nhà vi sinh Pháp, người đầu 15
16. tiên ghi nhận nó khi nấm men chuyển từ hô hấp hiếu khí tới lên men rượu kỵ khí. Tỷ lệ cao hơn của đường phân là kết quả từ những thay đổi trong mức độ chuyển hóa phân giải đường, cũng như từ các gia tăng biểu hiện của các gen mã hoá enzyme của đường phân và lên men. 2.6. Đường phân thực vật được điều khiển bởi các sản phẩm của nó Trong in vivo, đường phân dường như được điều hòa bởi mức độ của sự phosphoryl hóa fructose-6-phosphate và sự quay vòng PEP. Trái ngược với động vật, AMP và ATP không phải là phân tử chính trả lời kích thích của phosphofructokinase và pyruvate kinase thực vật. Nồng độ PEP của tế bào chất, là một chất ức chế mạnh phosphofructokinase phụ thuộc ATP thực vật, đóng vai trò quan trọng trong điều hòa đường phân của thực vật. Hiệu quả ức chế này của PEP lên phosphofructokinase bị giảm mạnh bởi phosphate vô cơ, làm cho tỷ lệ của PEP/Pi trong tế bào chất là một yếu tố quan trọng trong sự kiểm soát hoạt động phân giải đường ở thực vật. Pyruvate kinase và PEP cacboxylase, các enzyme chuyển hóa PEP trong các bước cuối cùng của đường phân (xem hình 3), nhạy cảm với ức chế ngược (feed-back) bởi các chất trung gian của chu trình acid citric và dẫn xuất của chúng, bao gồm malate, citrate, 2- oxoglutarate và glutamate. Trong thực vật, sự kiểm soát đường phân xuất phát từ “dưới lên" (bottom - up) (xem hình 12), với chuyển hóa PEP được điều hòa ở mức sơ cấp bởi pyruvate kinase và PEP carboxylase và điều hòa thứ cấp được thực hiện bởi PEP trong chuyển hóa của fructose-6-phosphate tạo fructose-1,6-bisphosphate (xem hình 3). Ở động vật, điều hòa sơ cấp có hiệu lực ở các phosphofructokinase, và điều hòa thứ cấp tại pyruvate kinase. Một lợi ích có thể được thấy ở kiểm soát từ “dưới lên” đối với đường phân là nó cho phép thực vật kiểm soát thực sự phân giải đường để pyruvate độc lập với các quá trình trao đổi chất có liên quan chẳng hạn như các chu trình Calvin và chuyển đổi qua lại sucrose ↔ triose phosphate ↔ tinh bột. Một lợi ích khác của 16
17. cơ chế kiểm soát này là đường phân có thể điều chỉnh cho nhu cầu sinh tổng hợp các tiền chất. Sự có mặt của hai enzyme trong chuyển hóa PEP trong các tế bào thực vật - pyruvate kinase và PEP carboxylase – dẫn tới sự kiểm soát của đường phân là không rõ ràng. Mặc dù hai enzyme bị ức chế bởi chất chuyển hóa tương tự, PEP carboxylase dưới một số điều kiện có thể thực hiện một phản ứng vượt qua pyruvate kinase. Kết quả là malate sau đó có thể nhập chu trình acid citric ty thể. Do vậy, điều hòa “dưới lên” cho phép một sự linh hoạt cao trong sự kiểm soát của đường phân thực vật. Thực nghiệm ủng hộ cho các con đường chuyển hóa PEP là các nghiên cứu về cây thuốc lá chuyển gen có pyruvate kinase trong tế bào chất ít hơn 5% so với mức bình thường trong lá của chúng. Trong thực vật đó, tỷ lệ của hô hấp lá và quang hợp đều không bị ảnh hưởng liên quan với việc điều khiển các mức độ của pyruvate kinase ở kiểu hình dại. Tuy nhiên, sự giảm tăng trưởng ở rễ các cây trồng chuyển gen chỉ ra rằng phản ứng pyruvate kinase không thể bị phá vỡ mà không có một số tác động có hại. Sự điều hòa của chuyển hóa fructose-6-phosphate tới fructose-1,6- bisphosphate cũng phức tạp. Fructose-2,6-bisphosphate, các hexose bisphosphate còn lại, có ở các mức độ khác nhau trong tế bào chất. Nó ức chế rõ rệt hoạt động của fructose-1,6-bisphosphatese tế bào chất nhưng kích thích hoạt động của phosphofructokinase phụ thuộc PPi. Những quan sát này cho thấy rằng fructose- 2,6-bisphosphate đóng một vai trò trung tâm trong dòng “thông” giữa con đường phụ thuộc ATP và con đường phụ thuộc PPi của chuyển hóa fructose phosphate tại điểm giữa tổng hợp sucrose và đường phân. 2.7. Con đường pentose phosphate tạo ra NADPH và sinh tổng hợp các sản phẩm trung gian Con đường đường phân + chu trình Krep không phải là con đường duy nhất cho quá trình oxy hóa đường trong tế bào thực vật. Con đường oxy hóa pentose 17
18. phosphate (còn được gọi là con đường hexose monophosphate) cũng có thể thực hiện nhiệm vụ này (hình 4). Hình 4: Các phản ứng oxy hóa theo con đường pentose phophat ở thực vật bậc cao. P, phosphate. 18
19. Các phản ứng được thực hiện bởi các enzyme hòa tan có trong tế bào chất và trong các lạp thể. Nói chung, các con đường trong các lạp thể chiếm ưu thế hơn con đường trong tế bào chất. Hai phản ứng đầu tiên của con đường này bao gồm các phản ứng oxy hoá chuyển đường 6-carbon: glucose-6-phosphate đến một đường 5-carbon, ribulose- 5-phosphate, một phân tử CO2 và sinh ra 2 phân tử NADPH (không phải NADH). Các phản ứng còn lại của con đường là chuyển ribulose-5-phosphate tới chất trung gian của phân giải đường glyceraldehyde-3-phosphate và fructose-6- phosphate. Bởi vì glucose-6-phosphate có thể được tái sinh từ glyceraldehyde-3- phosphate và fructose-6-phosphate bởi enzyme đường phân, trong sáu vòng của chu trình, chúng ta có thể viết những phản ứng như sau: + 6 glucose – 6 P + 12 NADP + 7H2O Æ + 5 glucose-6-P + 6CO2 + Pi + 12NADPH + 12H Kết quả thu được từ quá trình oxy hóa hoàn toàn của một phân tử glucose- 6-phosphate tới CO2 là tổng hợp đồng thời 12 phân tử NADPH. Nghiên cứu sử dụng đồng vị phóng xạ 14C của glucose đã chỉ ra rằng đường phân là con đường phổ biến, chiếm 80-95% tổng dòng carbon trong hầu hết các mô thực vật. Tuy nhiên, con đường pentose phosphate cũng góp phần vào chuyển hóa dòng carbon này, và những nghiên cứu về sinh học phát triển đã chỉ ra rằng vai trò của nó tăng cùng với sự phát triển của tế bào thực vật từ tế bào phân sinh đến trạng thái đã biệt hóa. Vai trò của con đường pentose phosphate được thể hiện: * Sản phẩm NADPH sẽ tham gia vào các phản ứng của các con đường sinh tổng hợp khác xảy ra trong tế bào chất. Con đường này cũng cung cấp NADPH cho quá trình sinh tổng hợp lipit và đồng hóa nitơ ở các thể vô sắc như bột lạp và lạp thể hoạt động trong tối. 19
20. * Do ty thể ở thực vật có khả năng oxy hóa NADPH trong tế bào chất nhờ enzyme NADPH dehydrogenase nằm trên bề mặt ngoài của màng trong nên một số phân tử NADPH tạo ra bởi con đường này sẽ tham gia vào quá trình trao đổi năng lượng của tế bào; cụ thể là các điện tử từ NADPH có thể khử O2 và tạo ra ATP. * Con đường này tạo ra ribose-5-phosphate, một phân tử tiền chất của đường ribose và deoxyribose cần thiết trong quá trình sinh tổng hợp ARN và ADN tương ứng. * Các chất trung gian khác trong con đường này, như đường erythrose-4- phosphate, kết hợp với PEP trong phản ứng khởi đầu để tạo ra các hợp chất phenolic thực vật bao gồm các acid amin thơm và các tiền chất của lignin, flavonid và phytoalexin. * Trong các giai đoạn đầu của phát triển, trước khi mô lá có khả năng thực hiện quang tự dưỡng hoàn toàn thì người ta cho rằng con đường pentose phosphate có vai trò trung gian tạo ra các chất cho chu trình calvin. Điều hòa con đường pentose phosphate Con đường oxy hóa pentose phosphate được điều hòa ở phản ứng đầu tiên xúc tác bởi enzyme glucose-6-phosphate dehydrogenase. Hoạt tính của enzyme này bị ức chế mạnh khi tỷ lệ NADPH/NADP+ cao. Tuy nhiên, dưới điều kiện ánh sáng con đường pentose phosphate ít xảy ra trong lạp thể bởi vì các sản phẩm cuối cùng của con đường này bao gồm fructose-6-phosphate và glyxeral-3- phosphate đang được tổng hợp bởi chu trình calvin. Vì vậy, mà sẽ hướng các phản ứng biến đổi trong pha không oxy hóa của con đường này theo chiều tổng hợp nên các đường pentose. Hơn nữa, enzyme glucose-6-phosphate dehydrogenase sẽ bị ức chế trong quá trình quang hợp do tỷ lệ NADPH/NADP+ cao ở lục lạp, cũng như bị bất hoạt do hệ thống ferredoxyn–thioredoxyn. 20
21. 3. CHU TRÌNH ACID CITRIC: QUÁ TRÌNH DIỄN RA TRONG CHẤT NỀN TY THỂ Trong thế kỉ thứ 19, các nhà sinh học đã phát hiện ra rằng trong điều kiện yếm khí tế bào sẽ sản sinh ethanol hoặc acid lactic còn trái lại trong điều kiện hiếu khí tế bào sẽ sử dụng oxy để tạo ra CO2 và H2O. Vào năm 1937, một nhà hóa sinh người Anh gốc Đức, tên là Hans A. Krebs đã công bố rằng phát hiện ra chu trình acid citric hay còn gọi là chu trình acid tricarboxylic (TCA) hoặc chu trình Krebs. Việc làm sáng tỏ chu trình acid citric không chỉ giúp giải thích quá trình pyruvate bị phân giải thành CO2 và H2O như thế nào mà nó còn giúp đánh giá vai trò của chu trình trong các con đường trao đổi chất. Nhờ công trình trên ông được giải Nobel về sinh lí và y học năm 1953. Bởi vì chu trình acid citric xảy ra trong chất nền của ty thể nên trước hết chúng ta sẽ xem xét cấu trúc và chức năng của ty thể. Sau đó chúng ta sẽ tìm hiểu các bước của chu trình acid citric, nhấn mạnh vào các đặc điểm đặc trưng với thực vật. 3.1. Đặc điểm siêu cấu trúc ty thể ở thực vật Phân giải đường sucrose thành pyruvate sẽ giải phóng ít hơn 25% năng lượng trong đường sucrose, phần năng lượng còn lại sẽ được dự trữ trong 2 phân tử pyruvate. Hai giai đoạn tiếp theo của quá trình hô hấp (đó là chu trình acid citric và phosphoryl hóa oxy hóa) sẽ xảy ra trong một cơ quan tử được gọi là ty thể. Quan sát dưới kính hiển vi điện tử thấy rằng, ty thể ở thực vật dù cho là trong tế bào hay trong in vitro có hình cầu hoặc hình que có đường kính 0,5 – 1 µm vào dài tới 3 µm. Trừ một số trường hợp ngoại lệ, thông thường các tế bào thực vật có số lượng ty thể ít hơn số ty thể của tế bào động vật. Số lượng ty thể trên mỗi tế bào là khác nhau liên quan trực tiếp đến hoạt động trao đổi chất của 21
22. mô và nó phản ánh mức độ trao đổi chất. Ví dụ như các tế bào bảo vệ thường không có nhiều ty thể. Giống với ty thể ở các mô không phải của thực vật. Ty thể thực vật có 2 màng một màng ngoài trơn bao bọc hoàn toàn một màng trong gấp khúc. Sự gấp khúc màng trong của ty thể được gọi là cristae (còn được gọi là lược). Việc gấp khúc này sẽ tạo ra một diện tích bề mặt lớn, do đó màng trong của ty thể chứa tới >50% protein của ty thể. Phần chất nhầy chứa trong màng trong được gọi là chất nhày ty thể và khoảng trống giữa hai màng được gọi là khoảng không (hình 5) Một ty thể ở trạng thái nguyên vẹn có tính chất thấm tích cực đó là chúng lấy nước và trương lên khi đặt trong môi trường nhược trương. Hầu hết các ion vô cơ và các phân tử hữu cơ tích điện không có khả năng qua lại tự do qua màng. Màng trong của ty thể là một vật cản thẩm thấu, còn màng ngoài là có khả năng thấm đối với các phân tử có khối lượng phân tử nhỏ hơn 10kDa. Phần lipid của cả hai Hình 5: Cấu trúc ty thể thực vật màng chủ yếu cấu tạo bởi phospholipid mà 80% trong số chúng là phosphateidylcholine hoặc phosphateidylethanolamine. 22
23. Giống như lạp thể, ty thể là một bào quan bán tự động, bởi vì chúng chứa ribosome, ADN và ARN và có khả năng tổng hợp nên một số lượng protein nhất định của ty thể. Vì vậy ty thể của thực vật có khả năng thực hiện nhiều bước trong quá trình tổng hợp protein và truyền thông tin di truyền của chúng. Ty thể tăng sinh qua quá trình phân chia một ty thể tồn tại trước đó mà không có sự tổng hợp mới ty thể. 3.2. Pyruvate có thể vào ty thể và được oxy hóa qua chu trình acid citric Như đã đề cập ở trên, chu trình acid citric hay còn gọi là TCA do phần quan trọng của acid citric và acid isocitric như là các chất trung gian ban đầu. Chu trình này cấu thành nên giai đoạn thứ hai của quá trình hô hấp xảy ra trong chất nền ty thể hoạt động của nó đòi hỏi pyruvate tạo ra trong quá trình đường phân ở trong tế bào chất phải được vận chuyển vào ty thể thông qua một protein đặc hiệu. Khi vào trong chất nền ty thể, pyruvate sẽ bị loại bỏ đi một phân tử carbon trong một phản ứng xúc tác bởi pyruvate dehydrogenase, sản phẩm của phản ứng này bao gồm NADH, CO2 và axetyl CoA (hình 6). Enzyme pyruvate dehydrogenase là một phức hệ lớn gồm ba enzyme khác nhau: pyruvate dehydrogenase (E1), dihydrolipoyl transacetylase (E2), và dihydrolipoyl dehydrogenase (E3). Trình tự các bước của phản ứng này gồm: 23
24. - Pyruvate phản ứng với thiamine pyrophosphate (TPP) ở vùng biên của pyruvate dehydrogenase (E1) dẫn đến tách CO2 khỏi phân tử pyruvate và tạo thành dẫn xuất của hydroxylethyl. - Pyruvate dehydrogenase chuyển hai điện tử và nhóm acetyl từ TPP tới dạng oxy hóa của nhóm lipoyllysyl của lõi enzyme dihydrolipoyl transacetylase (E2), để hình thành acetyl thioester của nhóm lipoyl khử. - Bước này là sự chuyển ester hóa mà nhóm –SH của CoA thay nhóm –SH của E2 tạo acetyl-CoA và dạng khử đầy đủ của (dithiol) nhóm lipoyl. - Dihydrolipoyl dehydrogenase (E3) định hướng chuyển hai nguyên tử hydro từ nhóm khử lipoyl của E2 tới FAD – được gắn vào E3, trở lại dạng oxy hóa của nhóm lipoyllysyl của E2. - + - FADH2 dạng khử của E3 chuyển một ion hydride (:H ) tới NAD hình thành dạng NADH. Phức hệ enzyme này xúc tác theo trình tự và quay vòng cho phản ứng xúc tác tiếp theo. Trong phản ứng tiếp theo của chu trình acid citric, enzyme citratesynthase kết hợp nhóm acetyl của acetyl-CoA với một phân tử 4 carbon là acid oxaloacetate (OAA) để tạo thành một phân tử 6-carbon là acid citric (citrate). Citrate sau đó được đồng phân hóa thành isocitrate, bởi enzyme asconitase. 24
25. Hai phản ứng tiếp theo là hai phản ứng decarboxyl hóa oxy hóa, mỗi phản ứng tạo ra một NADH và giải phóng một phân tử CO2 và một phân tử succinyl- CoA. Đến thời điểm này, mỗi phân tử pyruvate khi vào ty thể đã tạo ra 3 phân tử CO2 hoặc 12 phân tử CO2 khi mỗi phân tử sucrose bị oxy hóa. Trong phần còn lại của chu trình acid citric, succinyl-CoA sẽ được oxy hóa trở lại thành oxaloaccetate. Ban đầu, năng lượng tự do lớn trong liên kết thioeste của succinyl-CoA được tích lũy thông qua quá trình tổng hợp từ ADP và Pi trong một phản ứng phosphoryl hóa ở mức cơ chất, xúc tác bởi enzyme succinyl-CoA synthetase. Succinate tạo ra sẽ được oxy hóa tiếp tạo thành fumarate bởi enzyme succinate dehydrogenase đây là enzyme duy nhất của chu trình acid citric liên kết với màng và cũng là một phần của chuỗi truyền điện tử. Các điện tử và proton được tạo ra từ sucinate sẽ không chuyển tới NAD+ mà được chuyển tới FAD. FAD liên kết cộng hóa trị với vị trí hoạt động của enzyme sucinate dehydrogenase và diễn ra một phản ứng khử tạo thành FDAH2. Trong 2 phản ứng cuối cùng của chu trình acid citric, fumarate bị thủy phân tạo thành malate, malate sau đó sẽ được oxy hóa bởi enzyme malate dehydrogenase tái tạo oxaloacetate tạo ra một phân tử NADH. Oxaloacetate phản ứng với một phân tử acetyl-CoA khác và tiếp tục chu trình. Như vậy, quá trình oxy hóa một phân tử pyruvate sẽ tạo ra 3 phân tử CO2, và năng lượng tự do giải phóng trong những phản ứng oxy hóa này sẽ được tích lũy trong 4 phân tử NADH và 1 phân tử FADH2. Ngoài ra, một phân tử ATP được tạo ra ở mức phosphoryl hóa cơ chất trong chu trình. Tất cả các enzyme tham gia trong chu trình TCA đều được tìm thấy trong ty thể của thực vật. Một vài trong số chúng sẽ liên kết với nhau thành phức hệ enzyme, điều này sẽ giúp quá trình vận chuyển các chất trao đổi giữa các enzyme. 25
26. Hình 6: Các phản ứng và enzyme trong chu trình acid citric ở thực vật. 3.3. Chu trình TCA của thực vật có những nét độc đáo Các phản ứng của chu trình acid citric nêu trong hình 6 không phải tất cả giống hệt với các phản ứng xảy ra ở ty thể động vật. Ví dụ, bước xúc tác của succinyl-CoA synthetase sản xuất ATP ở thực vật và GTP ở động vật. Một đặc trưng của chu trình acid citric thực vật mà không có mặt trong các sinh vật khác là hoạt động quan trọng của enzyme NAD+ malic, đã được tìm thấy trong chất nền của tất cả ty thể được phân tích. Enzyme này xúc tác decarboxyl hóa oxy hoá của malate: 26
27. + Malate + NAD Æ Pyruvate + CO2 + NADH Sự hiện diện của enzyme NAD+ malic cho phép ty thể thực vật hoạt động con đường “biến thể” (alternative pathways) chuyển hóa PEP bắt nguồn từ đường phân. Như đã mô tả, malate có thể được tổng hợp từ PEP trong tế bào chất thông qua các enzyme PEP carboxylase và malate dehydrogenase (xem hình 3). Malate sau đó được vận chuyển vào trong chất nền ty thể, nơi enzyme NAD+ malic có thể oxy hóa nó thành pyruvate. Phản ứng này có thể làm cho quá trình oxy hóa hoàn toàn các trung gian trong chu trình acid citric như malate (hình 7A) hoặc citrate (hình 7B). Nói cách khác, malate được sản xuất thông qua PEP carboxylase có thể thay thế chu trình acid citric trung gian được sử dụng trong sinh tổng hợp. Phản ứng có thể bổ sung sản phẩm trung gian trong một chu trình trao đổi chất được gọi là anaplerotic. Ví dụ, tạo ra 2-oxoglutarate cho đồng hóa nitơ trong lục lạp sẽ gây thiếu malate cần thiết trong phản ứng tổng hợp citrate. Malate có thể được tạo ra thông qua các con đường PEP carboxylase (hình 7C). Sự hiện diện của một con đường “biến thể” cho quá trình oxy hóa của malate là phù hợp với quan sát ở nhiều thực vật, ngoài ra nó còn thực hiện chu trình chuyển hóa acid ở họ Xương rồng (thực vật CAM), malate được lưu trữ trong không bào trung tâm của chúng. Hình 7: Enzyme malic và PEP carboxylase cung cấp cho thực vật với sự linh động trong chuyển hóa phosphoenolpyruvate. enzyme malic làm cho ty thể thực vật có thể oxy hóa cả malate (A) và citrate (B) tới CO2 mà không liên quan đến pyruvate qua đường phân. Các hoạt động chung của PEP cacboxylase và pyruvate kinase có thể chuyển đổi PEP đường phân đến 2-oxoglutarate, được dùng để đồng hóa nitơ (C). 27
28. 3.4. Chu trình acid citric có thể oxy hóa các amino acid và các acid béo Pyruvate và malate là một dạng cơ chất phổ biến cho ty thể in vitro, đặc biệt các mô trong bóng tối hoặc các mô không quang hợp. Tuy nhiên, các hợp chất khác cũng được chuyển hóa trong chất nền ty thể và tương tác với chu trình acid citric. Glycine được tạo ra trong suốt quá trình quang hô hấp là một trường hợp đặc biệt, nhưng các amino acid khác có thể cung cấp cơ chất cho hô hấp thực vật ở một số mô cụ thể là ở hạt giàu protein tích lũy. Sự oxy hóa amino acid có thể trước đó diễn ra sự chuyển amin để hình thành nên một chất trung cho chu trình acid citric, hoặc có thể oxy hóa trực tiếp. Một ví dụ của sự oxy hóa trực tiếp trong ty thể bao gồm phản ứng thuận nghịch được xúc tác bởi glutamate dehydrogenase theo phản ứng: + + Glutamate + NAD + H2O ↔ α-ketoglutarate + NADH + NH4 Vai trò của enzyme này vẫn chưa biết được rõ ràng trong tất cả các mô thực vật. Trong lá mầm của cây ho Đậu (chẳng hạn như đậu Hà Lan, đậu tương), glutamate dehydrogenase và aspartate aminotransferase ty thể tham gia vào biến tính protein tích lũy, oxy hóa glutamate như nguồn năng lượng. Amon được giải phóng bởi phản ứng này được đồng hóa trở lại. Trong lá, glutamate dehydrogenase cũng tham gia hoạt động theo hướng ngược lại như một enzyme phụ thuộc trong quá trình đồng hóa lại amon trong suốt quá trình quang hô hấp, mặc dù những sàng lọc gần đây ở thể đột biến với quang hô hấp cây lúa mạch và Arabidosis chưa được nhận thấy vai trò glutamate dehydrogenase. Cũng có bằng chứng cho rằng β-oxy hóa các acid béo thành acetyl-CoA có thể diễn ra trong ty thể thực vật. Tuy nhiên, gần như sự oxy hóa acid béo ở thực vật dường như chỉ xảy ra ở peroxisome. 28
29. 4. VẬN CHUYỂN ĐIỆN TỬ VÀ TỔNG HỢP ATP Ở MÀNG TRONG CỦA TY THỂ ATP là chất mang năng lượng được tế bào sử dụng cho tất cả các quá trình sống, và hóa năng tích lũy trong suốt chu trình acid citric ở dạng NADH và FADH2 (quá trình oxy hóa – khử tương đương với các điện tử mang năng lượng cao) được chuyển sang cho ATP để thực hiện công hữu ích trong tế bào. Quá trình này phụ thuộc vào O2, được gọi là phosphoryl hóa oxy hóa, xảy ra ở màng trong ty thể. Trong phần này, chúng ta sẽ mô tả quá trình mà theo đó mức năng lượng của các điện tử được giảm theo bậc thang và tích lũy dưới hình thức một gradient proton điện hóa qua màng trong ty thể. Mặc dù về cơ bản là tương tự như trong các tế bào hiếu khí, chuỗi vận chuyển điện tử của thực vật (và nấm) có chứa nhiều NAD(P)H dehydrogenase và một oxidase biến thể không được tìm thấy trong ty thể động vật có vú. Chúng ta cũng sẽ xem xét các enzyme sử dụng năng lượng của gradient proton để tổng hợp ATP: FoF1-ATP synthase. Sau khi kiểm tra các giai đoạn khác nhau trong sản phẩm của ATP, chúng ta sẽ tóm tắt các bước tích lũy năng lượng ở từng giai đoạn, cũng như các cơ chế điều hòa phối hợp các con đường khác nhau. 4.1. Chuỗi vận chuyển điện tử xúc tác một dòng “chảy” điện tử từ NADH tới O2 Đối với mỗi phân tử sucrose bị oxy hóa thông qua con đường đường phân và chu trình acid citric, 4 phân tử NADH được tạo ra trong tế bào chất và 16 phân tử của NADH cộng với 4 phân tử FADH2 (liên kết với succinate dehydrogenase) được tạo ra trong chất nền ty thể. Các hợp chất khử này phải bị oxy hóa lại hoặc toàn bộ quá trình hô hấp sẽ ngưng. 29
30. Chuỗi vận chuyển điện tử xúc tác một dòng điện tử từ NADH (và FADH2) tới oxy, chất nhận điện tử cuối cùng của quá trình hô hấp. Đối với quá trình oxy hóa toàn bộ NADH là chuyển được hai điện tử có thể được viết như sau: + + NADH + H + 1/2O2 Æ NAD + H2O + Sự giảm thế năng khử từ cặp NADH-NAD (-320 mV) và cặp H2O-1/2O2 (+810 mV), nó có thể được tính toán bằng năng lượng tự do chuẩn được giải phóng trong suốt quá trình phản ứng (-nFΔE0') khoảng 220 kJ mol-1 (52 kcal mol- 1) trên hai điện tử. Vì thế năng khử của succinate - fumarate cao hơn (+30 mV), chỉ có 152 kJ mol-1 (36 kcal mol-1) năng lượng được giải phóng cho mỗi cặp điện tử được tạo ra trong quá trình oxy hóa succinat. Vai trò của chuỗi vận chuyển điện tử là để thực hiện các quá trình oxy hóa NADH (và FADH2), và trong quá trình, sử dụng năng lượng tự do được giải phóng ra để tạo ra một gradient proton điện hóa (Δμ%H+ ) qua màng trong ty thể. Chuỗi vận chuyển điện tử bao gồm tập hợp các chất vận chuyển điện tử hoạt động liên tục, gần như chúng đều là các protein xuyên màng với các nhóm được gắn vào có khả năng nhận và cho một hoặc hai điện tử (hình 8). Có ba kiểu vận chuyển điện tử diễn ra trong quá trình phosphoryl hóa oxy hóa: (1) chuyển trực tiếp các điện tử như dạng khử của Fe3+ thành Fe2+; (2) chuyển một nguyên tử hydro (H+ + e-); (3) chuyển một ion hydride (:H-) có mang 2 điện tử. Các protein vận chuyển điện tử riêng biệt được tổ chức thành phức hệ (được xác định bởi chữ số La Mã từ I đến IV), tất cả đều được định vị ở màng trong ty thể. Phức hệ I (NADH dehydrogenase): Điện tử từ NADH được sinh ra trong chất nền ty thể trong chu trình acid citric được oxy hóa bởi phức hệ I (NADH dehydrogenase). Các chất mang điện tử trong phức hệ I bao gồm một cofactor liên kết chặt chẽ (flavin mononucleotide [FMN], về mặt hóa học tương tự như FAD; xem hình 2B) và một số trung tâm Fe-S. Sau đó phức hệ này chuyển điện tử tới ubiquinone. Bốn proton được bơm từ chất nền vào gian màng khi mỗi cặp 30
31. điện tử đi qua phức hệ này. Ubiquinone (hay còn gọi là coenzyme Q hoặc đơn giản hơn là Q) là một lipid tan trong benzoquinone với một chuỗi isoprenoid dài có cấu trúc gần giống với plastoquinone (của thực vật) và menaquinone (của vi khuẩn) đóng vai trò tương tự ubiquinone, đó là vận chuyển điện tử trong màng- liên kết với chuỗi vận chuyển điên tử. Ubiquinone có thể nhận một điện tử và trở . thành gốc semiquinone ( QH) hoặc hai điện tử để hình thành ubiquinol (QH2) Và giống như flavoprotein, nó có thể hoạt động trung gian giữa một chất cho và một chất nhận điện tử. Vì kích thước phân tử nhỏ và kỵ nước, nên linh động trong màng lipid kép của màng trong ty thể và có thể khử tương đương kiểu “con thoi” giữa các chất vận chuyển điện tử trong màng. Và với khả năng vận chuyển cả điện tử và proton nên CoQ đóng vai trò trung tâm trong dòng điện tử và sự vận chuyển proton. Phức hệ II (Succinate dehydrogenase): Sự oxy hóa succinate trong chu trình acid citric được xúc tác bởi phức hệ này, và sự khử tương đương được chuyển qua FADH2 và một nhóm Fe-S của các protein vào “bể” ubiquinone. Phức hệ này không bơm proton. 31
32. Phức hệ III (phức hệ cytocrome bc1): Phức hệ oxy hóa này khử ubiquinone (ubiquinol) và vận chuyển các điện tử qua trung tâm Fe-S, của hai loại cytochrome b (b565, b560), và một cytochrome c1 ở biên của màng tới cytochrome c. 4 proton được bơm bởi phức hệ III khi có 1 cặp điện tử chuyển qua. Cytocrom C là một protein nhỏ nằm phía mặt ngoài của màng trong ty thể và hoạt động linh động để vận chuyển điện tử giữa phức hệ II và III. Phức hệ IV (cytochrome c oxydase): phức hệ này chứa hai trung tâm Cu (CuA và CuB) và cytochrome a và a3. Phức hệ IV là oxidase cuối cùng và mang 4 điện tử khử tới O2 tạo thành 2 phân tử nước. Hai proton được bơm qua khi mỗi cặp điện tử được vận chuyển qua (hình 8). Cả về cấu trúc và chức năng, ubiquinone và hệ thống cytochrome bc1 tương tự plastoquinone và hệ thống cytochrome b6f, tương ứng ở chuỗi vận chuyển điện tử quang hợp. Hình 8: Tổ chức của chuỗi vận chuyển điện tử và tổng hợp ATP ở màng trong ty thể thực vật. Ngoài 5 phức hệ protein chuẩn gần như được tìm thấy ở hầu hết các ty thể, chuỗi vận chuyển điện tử của ty thể thực vật còn chứa 5 enzyme được đánh dấu màu xanh lá cây. Không có enzyme nào trong 5 enzyme đó bơm proton. Sự ức chế cụ thể: rotenon ức chế phức hệ I, antimycin ức chế phức hệ II, xyanua ức chế phức hệ III và acid salicylhydroxamic 32
33. (SHAM) cho oxidase biến thể , là các công cụ rất quan trọng để nghiên cứu chuỗi vận chuyển điện tử của ty thể thực vật 4.2. Một số enzyme vận chuyển điện tử duy nhất có trong ty thể thực vật Ngoài các enzyme của chuỗi vận chuyển điện tử được mô tả trong phần trên, ty thể thực vật còn chứa một số thành phần không có trong ty thể động vật có vú (xem hình 8). Lưu ý rằng không có enzyme nào bơm proton và do đó sự tích lũy năng lượng là thấp hơn bất cứ khi nào chúng được sử dụng: • Cả hai enzyme NAD(P)H dehydrogenase đều phụ thuộc Ca2+, gắn liền với bề mặt ngoài của màng trong ty thể phía tiếp xúc với không gian gian màng (gian màng) có thể oxy hóa NADH và NADPH tạo ra trong tế bào chất. Các điện tử từ enzyme NAD(P)H dehydrogenase ở bề mặt ngoài của màng trong ty thể -NDex (NADH) và NDex (NADPH)- đi vào chuỗi vận chuyển điện tử tại các “bể” ubiquinone. • Ty thể thực vật có hai con đường oxy hóa NADH chất nền ty thể. Điện tử đi qua phức hệ I, được mô tả trong phần trước, nhạy cảm với sự ức chế bởi một số hợp chất, bao gồm rotenone và piericidin. Ngoài ra, ty thể thực vật có một dehydrogenase kháng rotenone - NDin (NADH), giúp quá trình oxy hóa của NADH xuất phát từ cơ chất chu trình acid citric. Vai trò của cơ chế này có lợi và xảy ra khi phức hệ I quá tải chẳng hạn như trong điều kiện hô hấp sáng. • Một enzyme NADPH dehydrogenase, NDin (NADPH), hiện diện trên bề mặt chất nền ty thể. Sự hiểu biết về enzyme này còn rất hạn chế. • Phần lớn, nếu không phải tất cả, thực vật có một con đường hô hấp “biến thể” để khử oxy. Con đường này được gọi là oxidase biến thể (alternative oxidase), không giống như cytochrome c oxidase, nhạy cảm với ức chế bởi xyanua, azide, hoặc carbon monoxyde (CO). 4.3. Sinh tổng hợp ATP trong ty thể diễn ra cùng với vận chuyển điện tử 33
34. Trong phosphoryl hóa oxy hóa, sự vận chuyển các điện tử tới oxy qua phức hệ I đến IV đi đôi với tổng hợp ATP từ ADP và Pi qua ATP synthase (thường gọi là phức hệ V). Số ATP tổng hợp phụ thuộc vào bản chất của chất khử điện tử. Trong thí nghiệm được tiến hành với việc sử dụng các ty thể được phân lập, điện tử được xuất phát từ NADH phía chất nền ty thể (tạm gọi là NADH thuộc ty thể), cho giá trị của tỷ lệ ADP:O (số lượng ATP tổng hợp trên hai điện tử được chuyển cho oxy) từ 2,4-2,7 (Bảng 1). Succinate và NADH phía xoang gian màng ty thể (tạm gọi là NADH thuộc tế bào chất) cho giá trị trong khoảng 1,6- 1,8, trong khi ascorbate, thực hiện như là một chất cho điện tử nhân tạo tới cytochrome c cho các giá trị 0,8-0,9. Kết quả như nhau cho cả ty thể thực vật và động vật, đã dẫn đến khái niệm chung có ba điểm tích lũy năng lượng dọc theo chuỗi vận chuyển điện tử, tại phức hệ I, III, và IV. Bảng 1: Lý thuyết và thực nghiệm của tỉ lệ ADP:O trong ty thể độc lập Tỉ lệ ADP:O Cơ chất Lí thuyếta Thực nghiệmb Malate 2,5 2,4-2,7 Succinate 1,5 1,6-1,8 NADH (bên trong) 1,5 1,6-1,8 Ascorbate 1,0b 0,8-0,9 a: giả định rằng phức hệ I, II, IV bơm tương ứng 4, 4 và 2 H+ trên 2 điện tử; giá trị để tổng hợp 1ATP là 4H+ được bơm vào tế bào chất; và các con đường không phosphoryl không hoạt động. b: cytochrome c oxidase chỉ bơm 2 proton khi nó được đánh giá với ascorbate là chất cho điện tử. Tuy nhiên, 2 điện tử di chuyển từ bề mặt ngoài của màng trong (nơi cho điện tử) qua màng trong ty thể tới mặt trong, phía chất nền ty thể. Kết quả là 2H+ được tiêu thụ ở mặt chất nền ty thể. Điều này có nghĩa rằng, sự di chuyển thực của H+ và năng lượng chi phí tương đương với sự di chuyển của tổng số 4H+, tạo ra một tỷ lệ ADP:O là 1,0. Các thực nghiệm cho thấy tỷ lệ ADP:O gần đúng với các giá trị tính toán trên cơ sở số lượng proton H+ được bơm bởi phức hệ I, III, IV và 4 proton H+ tổng hợp được một ATP (xem phần kế tiếp và bảng 1). Ví dụ, các điện tử từ NADH thuộc tế bào chất chỉ qua phức hệ III, IV, do đó có tổng cộng 6 proton H+ được bơm, cho 1,5 ATP (khi con đường oxidase biến thể không được sử dụng). 34
35. Cơ chế tổng hợp ATP trong ty thể là dựa trên thuyết hóa thẩm thấu (chemiosmotic), được đề xuất lần đầu tiên vào năm 1961 bởi Peter Mitchell, đây là một cơ chế chung về tích lũy (bảo tồn) năng lượng qua màng sinh học. Theo thuyết hóa thẩm thấu, sự định hướng của các chất mang điện tử màng trong ty thể cho phép chuyển proton (H+) qua màng trong khi dòng điện tử “chảy” qua chuỗi vận chuyển. Nhiều nghiên cứu đã xác nhận rằng ty thể vận chuyển điện tử kết hợp với việc chuyển proton từ chất nền ty thể tới khoang gian màng (xem hình 8). Bởi vì màng trong ty thể không thấm H+, một gradient proton điện hóa có thể hình thành. năng lượng tự do kết hợp với sự hình thành của một gradient proton điện hóa Δμ%H+ (Δμ%H+ , còn gọi là động lực proton -Δp, khi biểu diễn bằng đơn vị volt) được tạo thành bởi một thành phần thế năng vận chuyển điện tử qua màng (electric transmembrane potential) (ΔE) và thành phần thế năng hóa học (ΔpH) theo phương trình sau đây: ∆p = ∆E - 59∆pH trong đó ∆E = Emặt trong – Emặt ngoài và ∆pH = pH mặt trong – pH mặt ngoài ΔE nhận được do sự phân bố không đối xứng của H+ qua màng, và ΔpH là do sự chênh lệch nồng độ proton qua màng tế bào. Bởi vì proton được chuyển từ chất nền ty thể tới xoang gian màng ty thể, từ kết quả trên ΔE qua màng trong ty thể mang giá trị âm. Theo phương trình này cho thấy, cả ΔE và ΔpH đóng góp vào động lực proton trong ty thể thực vật, mặc dù ΔE luôn tìm thấy có cường độ lớn hơn, có lẽ nhờ khả năng đệm lớn của cả tế bào chất và chất nền ty thể, trong đó ngăn ngừa những thay đổi lớn độ pH. Trạng thái này ngược lại trong lạp lục, nơi mà hầu như tất cả các động lực proton qua màng thylakoid được tạo thành bởi một gradient proton. Năng lượng tự do cần thiết để tạo Δμ%H+ lấy từ năng lượng tự do giải phóng trong quá trình vận chuyển điện tử. Nhưng làm thế nào vận chuyển điện tử đồng 35
36. thời với chuyển proton chưa được hiểu rõ trong mọi trường hợp. Do tính thấm thấp của màng trong với proton, nên tồn tại gradient proton điện hóa là hợp lý ổn định, khi được tạo ra, năng lượng tự do Δμ%H+ có thể được sử dụng để thực hiện quá trình hóa học (tổng hợp ATP). Δμ%H+ kết hợp với tổng hợp ATP nhờ một phức hệ protein bổ sung liên kết với các màng bên trong, enzyme F0F1-ATP synthase. Enzyme F0F1-ATP synthase bao gồm hai thành phần chính, F1 và F0 (xem hình 8). F1 là một protein màng ngoại vi phức tạp bao gồm ít nhất năm tiểu đơn vị khác nhau và có chứa các vị trí xúc tác để chuyển đổi ADP và Pi tạo ATP. Phức hệ này là thuộc phía chất nền ty thể của màng trong. F0 là một phức hệ protein màng tế bào bao gồm ít nhất ba chuỗi polypeptide khác nhau hình thành các kênh để proton đi qua màng trong. Sự di chuyển của các proton qua kênh kết hợp với chu trình xúc tác của thành phần F1 của ATP synthase, cho phép tổng hợp liên tục ATP và đồng thời sử + dụng Δμ%H+ . Đối với mỗi ATP tổng hợp, 3H đi qua F0 từ xoang gian màng tới chất nền ty thể, làm giảm gradient proton điện hóa. Cấu trúc và chức năng của ATP synthase ty thể là tương tự như CF0-CF1 ATP synthase trong phosphoryl hóa quang hợp. Các hoạt động theo cơ chế hóa thẩm thấu trong tổng hợp ATP có nhiều ý nghĩa. Trước tiên, các vị trí thực sự hình thành ATP trên màng trong ty thể là ATP synthase, không phải phức hệ I, III, hoặc IV. Những phức hệ thực hiện là các vị trí tích lũy năng lượng nhờ sự vận chuyển điện tử luôn kết hợp với sự hình thành Δμ%H+ . Thứ hai, lý thuyết hóa thẩm thấu giải thích những cơ chế hoạt động không cặp đôi của một loạt các hợp chất hóa học không liên quan (bao gồm cả 2,4-dinitrophenol và FCCP [p- trifluoromethoxycarbonylcyanide phenylhydrazone]) làm giảm tổng hợp ATP ty thể nhưng thường kích thích tỷ lệ vận chuyển điện tử. Tất cả các hợp chất này làm cho các màng trong ty thể có “kẽ hở” với proton, ngăn ngừa sự tích tụ của Δμ%H+ đủ lớn để tổng hợp ATP. 36
37. Trong thí nghiệm trên ty thể được phân lập cho thấy, tỷ lệ “dòng” điện tử di chuyển cao hơn (được đánh giá như tỷ lệ hấp thụ oxy trong sự hiện diện của một cơ chất như succinate) được quan sát khi có mặt của ADP (gọi là trạng thái 3) hơn là khi không có ADP (hình 9). ADP như là cơ chất kích thích “sự tiêu tan” của Δμ%H+ qua F0F1-ATP synthase trong suốt quá tổng hợp ATP. Sau khi tất cả các ADP đã được chuyển thành ATP, các Δμ%H+ xây dựng lại một lần nữa và làm giảm tỷ lệ của dòng chảy điện tử (trạng thái 4). Tỷ lệ với các mức trạng thái có và không có ADP (trạng thái 3: trạng thái 4) được gọi là kiểm soát tỷ lệ hô hấp. Hình 9: Sự điều hòa tỷ lệ hô hấp bởi ADP trong suốt quá trình oxy hóa Succinate trong ty thể phân lập từ đậu xanh (Vigna radiata). Các con số dưới đây là những dấu hiệu diễn tả tỷ lệ oxy hấp thụ cũng như O2 tiêu thụ (nmol min-1 mg protein-1) (1) bổ sung succinate là chất mang điện tử đầu tiên của ty thể, đánh giá thông qua tỉ lệ O2 bị khử thành nước (2) Bổ sung xyanua chất ức chế dòng điện tử thông qua con đường cytochrome chính và chỉ cho dòng điện tử tới oxy thông qua con đường biến thể (alternative pathway), mà sau đó bị ức chế bởi việc bổ sung SHAM (3) Bổ sung ADP chất kích thích vận chuyển điện tử (trạng thái 3) bởi sự “tiêu tan” dễ dàng của gradient proton điện hóa. Tỷ lệ này cao hơn sau khi bổ sung lần thứ 2 ADP bởi vì sự hoạt hóa của succinate dehydrogenase (4) khi tất cả ADP được chuyển thành ATP thì tỷ lệ chất vận chuyển điện tử trở lại trạng thái ban đầu (trạng thái 4) 4.4. Các phân tử vận chuyển thực hiện trao đổi các cơ chất và các sản phẩm Gradient proton điện hóa cũng đóng một vai trò trong sự di chuyển của các acid hữu cơ trong chu trình acid citric và của cơ chất và các sản phẩm của tổng hợp ATP trong và ngoài ty thể. Mặc dù ATP được tổng hợp trong chất nền ty thể, hầu hết nó được sử dụng ở bên ngoài các ty thể, do đó, một cơ chế hiệu quả là cần thiết để di chuyển ADP vào và ATP ra khỏi các bào quan. 37
38. Vận chuyển adenylate liên quan đến các protein khác của màng trong ty thể, chất vận chuyển ADP/ATP (adenine nucleotide), mà xúc tác trao đổi ADP và ATP trên màng trong ty thể (Hình 10). Sự chuyển động của các ATP4 – (chất mang điện âm hơn) ra khỏi ty thể trao đổi cho ADP3- được điều khiển bởi gradient điện thế (ΔE, dương mặt ngoài) được tạo ra bởi bơm proton. Sự hấp thu phosphate vô cơ (Pi) liên quan đến một protein vận chuyển tích cực phosphate có sử dụng các gradient proton thành phần (ΔpH) của các động lực proton để điều khiển trao đổi của Pi- (vào) cho OH- (ra) không có sự tham gia của điện tử (trung tính về điện). Nghĩa là, một ΔpH được duy trì qua màng trong ty thể lượng Pi trong phạm vi chất nền ty thể còn lại cao. Lý luận tương tự áp dụng đối với sự hấp thu của pyruvate, được thúc đẩy bởi sự trao đổi không có sự tham gia của điện tử giữa pyruvate và OH-, dẫn đến tiếp tục sự hấp thu pyruvate từ tế bào chất (hình 10). 38
39. Hình 10: Vận chuyển qua màng trong ty thể của thực vật. Một gradient proton điện hóa ( Δμ%H+ ) bao gồm một thế năng màng (ΔE,-200mV, tích điện âm ở mặt trong) và một ΔpH (bên trong kiềm) được thành lập trên màng trong ty thể trong quá trình vận chuyển điện tử như đã nêu. Chất chuyển hóa cụ thể được chuyển qua bên trong màng trong ty thể bởi các protein chuyên hóa, được gọi là phân tử vận chuyển hoặc chất mang. Tổng chi phí cho hấp thụ 1 phosphate (OH- ra, cũng như là một H+ vào) và sự trao đổi ADP cho ATP là 1proton H+. Proton này cũng được thuộc vào việc chi phí cho tổng hợp ATP. Như vậy tổng chi phí là 3 H+ được sử dụng bởi ATP synthase cộng với 1H + cho việc trao đổi qua màng. Màng bên trong ty thể cũng chứa chất vận chuyển acid dicarboxylic 2- (malate hay succinate) trao đổi cho Pi và cho các acid tricarboxylic citrate trao đổi cho malate (xem hình 10) 4.5. Hiệu suất hô hấp hiếu khí khoảng 60 phân tử ATP trên 1 phân tử Sucrose Quá trình oxy hóa hoàn toàn một phân tử sucrose dẫn đến hình thành: • 8 phân tử ATP do phosphoryl hóa mức độ cơ chất (4 trong đường phân và 4 trong chu trình acid citric) • 4 phân tử NADH tế bào chất • 16 phân tử NADH cộng thêm 4 phân tử FADH2 (thông qua succinat dehydrogenase) trong chất nền ty thể. Trên cơ sở lý thuyết các giá trị ADP:O (xem bảng 1), tổng cộng khoảng 52 phân tử của ATP sẽ được tạo ra trên 1 phân tử sucrose bởi phosphoryl hóa oxy hóa. Kết quả tổng cộng là khoảng 60 phân tử ATP được tổng hợp khi 1 phân tử sucrose được oxy hóa hoàn toàn (bảng 2) 40
40. Bảng 2: Hiệu suất tích lũy ATP khi oxy hóa hoàn toàn sucrose tới CO2 qua đường phân hiếu khí và chu trình acid citric. Các giai đoạn Cơ chất Sản phẩm Hiệu suất ATP (số phân tử) Đường phân 1Sucrose 4Pyruvate 4ADP + 4Pi 4ATP 4 4NAD+ (thuộc tế bào chất) 4NADH (thuộc tế bào chất) Chu trình acid citric 4Pyruvate 12CO2 4ADP + 4Pi 4ATP 4 16NAD+ (thuộc ty thể) 16NADH (thuộc ty thể) 4FAD 4FADH2 Phosphoryl hóa oxy hóa 12O2 24 H2O 4 NADH (thuộc tế bào chất) 4 NAD+ (thuộc tế bào chất 6-10a,b hoặc ty thể)a 16 NADH (thuộc ty thể) + 16 NAD (thuộc ty thể) 40b 4 FADH 2 4 FAD 6b Hiệu suất tích lũy ATP 60-64a,b a Oxy hóa NADH (thuộc tế bào chất) bởi NADH dehydrogenase bên ngoài (external NADH dehydrogenase – xem hình 8) cho mức tổng hợp ATP tương tự như oxy hóa FADH2. Tuy nhiên, nếu NADH (thuộc tế bào chất) được đi vào ty thể nhờ trao đổi “con thoi” giữa malate-aspartate, nó có thể cho mức tổng hợp ATP tương tự oxy hóa NADH (thuộc ty thể) b Giả định rằng quá trình oxy hóa 1 NADH thuộc ty thể cho mức 2,5 ATP, và oxy hóa 1 FADH2 sẽ tổng hợp 1,5 ATP (xem bảng 1) 41
41. Trao đổi con thoi giữa malate-aspartate (the malate-aspartate shuttle) được thể hiện dưới sơ đồ sau: Sử dụng 50 kJ /mol-1 (12 kcal mol -1) như năng lượng tự do thực tế của sự hình thành ATP trong in vivo, chúng ta thấy rằng khoảng 3.010 kJ mol-1 (720 kcalmol -1) của năng lượng tự do được tích lũy ở dạng ATP cho mỗi mol sucrose bị oxy hóa trong quá trình hô hấp hiếu khí. Số năng lượng này chiếm khoảng 52% tổng năng lượng tự do chuẩn có sẵn từ oxy hóa hoàn toàn sucrose; phần còn lại là bị mất dưới dạng nhiệt. Đây là một cải tiến lớn trong việc chuyển hóa chỉ 4% năng lượng có sẵn trong sucrose tới ATP được thực hiện nhờ lên men. 4.6. Một vài tiểu đơn vị của phức hệ hô hấp được mã hóa bởi hệ gen của ty thể Với trình tự hoàn chỉnh đầu tiên của ADN ty thể thực vật (mtDNA) ở Arabidopsis thaliana (cải dại thuộc họ Cải Brassicaceae). Một số đặc điểm của hệ thống di truyền của ty thể thực vật nói chung không tìm thấy trong ty thể của động vật, động vật nguyên sinh, hay thậm chí là nấm. Đáng chú ý nhất, quá trình chế biến ARN khác giữa ty thể thực vật và ty thể từ hầu hết các sinh vật khác. Một số gen ty thể thực vật chứa các Intron, và một số gen thậm chí được cắt ngay giữa các phân tử phiên mã riêng biệt, chúng phải được nối bằng quá trình ghép nối liên tục. mtDNA thực vật cũng thiếu sự bổ sung chặt chẽ để dịch mã mARN. Bộ gen ty thể thực vật nói chung là lớn hơn nhiều so với của động 42
42. vật. mtADN thực vật trong khoảng 200-2.400 kilobase (kb) về kích thước, với các khác biệt lớn thậm chí chặt chẽ giữa các loài thực vật liên quan. Kích thước này so sánh với bộ gen 16 kb nhỏ gọn và đồng bộ được tìm thấy trong ty thể động vật có vú. Sự khác biệt kích cỡ chủ yếu là do sự hiện diện của các trình tự không mã hóa nhiều trong mtADN thực vật. mtADN động vật có vú mã hóa chỉ có 13 protein, trái ngược với 35 protein mã hóa được biết bởi các mtADN Arabidopsis. Cả ty thể thực vật và động vật có vú mã hóa cho rARNs và tARNs. Các gen của mtADN có thể được chia thành hai nhóm chính: những gen cần thiết cho biểu hiện của gen ty thể (tRNA, rRNA, và protein ribosome) và những gen cho phức hệ phosphoryl hóa oxy hoá. mtADN mã hóa cho 9 tiểu đơn vị của phức hệ I, một cho phức hệ III, ba cho phức hệ IV, và ba cho ATP synthase, và năm protein cho sinh tổng hợp của cytochrome. Các tiểu đơn vị được ty thể mã hóa là rất cần thiết cho hoạt động của chuỗi hô hấp. Bộ gen nhân mã hóa tất cả các protein không được mã hóa trong mtADN, và nhân mã hóa cho số lượng lớn các protein - ví dụ như tất cả các protein trong chu trình acid citric. Nhân – mã hóa protein ty thể được tổng hợp bởi ribosome tế bào chất và được chuyển vào trong màng ngoài và màng trong ty thể. Sau đó, quá trình phosphoryl hóa oxy hóa phụ thuộc vào sự biểu hiện của gen định vị trên 2 hệ gen riêng biệt. Bất kì sự thay đổi nào trong biểu hiện đáp ứng với nguyên nhân là một sự kích thích hoặc cho sự phát triển phải được điều phối. Trong khi sự biểu hiện của gen nhân cho protein ty thể xuất hiện được điều hòa bởi các gen nhân khác, nhiều ít được biết về biểu hiện gen ty thể. Vòng tròn chính của mtADN thực vật thường chia ra một số nhỏ hơn đơn vị dưới gen phân đoạn, và gen có thể được điều hòa xuôi bởi sự giảm số lượng bản sao cho một phân đoạn của các mtADN. Gen khởi động tại mtADN gồm một vài loại khác nhau trong hoạt động phiên mã. Tuy nhiên, sự điều khiển chính của biểu hiện gen ty thể diễn ra ở mức độ sau dịch mã, bởi sự suy thoái của polypeptide dư thừa. 43
43. 4.7. Thực vật có một số cơ chế làm giảm hiệu suất sản sinh ATP Như chúng ta đã thấy, một cơ chế phức tạp là cần thiết cho sự tích lũy năng lượng cao trong phosphoryl hóa oxy hóa. Vì vậy, có lẽ là đáng ngạc nhiên vì ty thể thực vật có một vài protein chức năng giúp giảm hiệu quả này. Có lẽ thực vật ít bị hạn chế bởi nguồn cung cấp năng lượng (ánh sáng mặt trời) hơn bởi các yếu tố khác trong môi trường (ví dụ nitơ hoặc phosphate). Kết quả là, sự điều chỉnh linh hoạt này có thể quan trọng hơn so với hiệu suất năng lượng. Trong các phần sau đây chúng tôi sẽ thảo luận về vai trò của các cơ chế không phosphoryl hóa, có thể có tính hữu dụng trong đời sống thực vật. Oxidase biến thể (alternative oxidase) Nếu xyanua (1 mM) được thêm vào các mô động vật để hoạt hóa hô hấp của mô, cytochrome c oxidase bị ức chế và tỷ lệ hô hấp nhanh chóng giảm xuống dưới 1% so với mức độ ban đầu của nó. Tuy nhiên, hầu hết các mô thực vật cho thấy một mức độ hô hấp kháng xyanua có thể từ 10-25%, và trong một số mô lên đến 100%, tỷ lệ kiểm soát mất ức chế. Các enzyme chịu trách nhiệm cho sự hấp thu oxy đã được xác định là - thành phần oxidase kháng xyanua của chuỗi vận chuyển điện tử trong ty thể thực vật được gọi là oxidase biến thể (xem hình 8). Nguồn cung cấp điện tử chính chuỗi vận chuyển điện tử của con đường biến thể ở mức độ “bể” ubiquinone, oxidase biến thể là thành phần chỉ có ở con đường biến thể, xúc tác bốn điện tử khử oxy tới nước và đặc biệt là ức chế bởi một vài hợp chất, nhất là acid salicylhydroxamic (SHAM). Khi các điện tử vượt qua các con đường biến thể từ “bể” ubiquinone, hai vị trí của bơm proton (ở phức hệ III, IV) được bỏ qua. Vì không có tích lũy năng lượng ở trong con đường biến thể giữa ubiquinone và oxy, năng lượng tự do bình thường được tích lũy trong ATP bị mất dưới dạng nhiệt khi các điện tử được phân dòng thông qua con đường này. 44
44. Có thể đây là một quá trình dường như lãng phí năng lượng?, nhưng con đường biến thể đóng góp cho chuyển hóa thực vật như thế nào? Một ví dụ về tính hữu ích của các chức năng biến thể của oxidase là hoạt động của nó trong quá trình phát triển hoa ở một số loài trong họ Araceae (họ arum) - ví dụ, loài voodoo lily (Sauromatum guttatum). Chỉ cần trước khi thụ phấn, các mô của cụm hoa hình chùy, được gọi là “phần thêm vào” (appendix), mà quy định giới tính hoa đực hay hoa cái, biểu hiện sự tăng đột biến mức độ hô hấp, kết quả là nhiệt độ của phần appendix phía trên tăng tới hơn 250C cao hơn nhiệt độ môi trường trong vòng 7 giờ. Trong quá trình bùng nổ sản sinh nhiệt bất thường này một số amin indol, và các tecpen sẽ bị bay hơi vì vậy mà tạo ra mùi thơm để thu hút côn trùng giúp thụ phấn. Acid salysilic, một hợp chất aspirin đã được xác định như là phân tử truyền tín hiệu đóng vai trò trong quá trình này ở hoa rồng (voodoo lily). Tuy nhiên trong hầu hết các thực vật cả mức độ hô hấp và mức độ hô hấp kháng với xyanua là quá thấp để có thể tạo ra đủ nhiệt để làm tăng nhiệt độ của cây vì vậy một câu hỏi đặt ra là con đường biến thể còn đóng một vai trò gì khác? Người ta cho rằng con đường biến thể có thể thực hiện chức năng như là một con đường “tràn năng lượng” (energy overflow), oxy hóa các cơ chất hô hấp mà tích lũy khi vượt quá nhu cầu dự trữ và phát triển ATP của thực vật. Quan điểm này cho thấy rằng, các điện tử chỉ đi qua con đường này khi hoạt động của các con đường chính đã bị bão hòa. Sự bão hòa đặt tới trong các ống thí nghiệm ở trạng thái 4, quá trình bão hòa có thể xảy ra khi mức độ hô hấp vượt quá nhu cầu của tế bào với ATP. Tuy nhiên, hiện nay người ta đã rõ rằng các enzyme oxidase của con đường biến thể có thể được hoạt hóa trước khi con đường cytochromee đạt đến bão hòa. Vì vậy mà các oxidase của con đường biến thể giúp ty thể điều chỉnh mức độ sản xuất ATP và tổng hợp khung carbon sử dụng trong các phản ứng sinh tổng hợp. Một chức năng khác của con đường thay thế đó là trong phản ứng của thực vật với các stress (thiếu P, lạnh giá, hạn hán ), có thể ức chế quá trình hô hấp 45
45. của ty thể. Bằng cách lấy các điện tử từ chuỗi truyền điện tử, con đường thay thế có thể ngăn ngừa việc sản xuất quá mức các ubiquinone mà nếu thừa chúng có thể - - tạo ra các gốc tự do oxy như là H2O2 , OH . Bằng cách này mà con đường thay thế có thể làm giảm tác động của stress lên quá trình hô hấp. Protein không ghép cặp Một protein được tìm thấy ở màng trong ty thể của động vật có vú được gọi là protein không ghép cặp có thể làm tăng mạnh độ thấm proton của màng. Kết quả là có ít ATP và nhiệt tạo ra. Quá trình sản xuất nhiệt rõ ràng là một trong những chức năng chính của protein không ghép cặp ở các tế bào của động vật có vú. Một thời gian dài người ta đã cho rằng, các oxidase của con đường thay thế ở thực vật và protein không ghép cặp ở động vật có vú chẳng qua chỉ là hai phương tiện để đạt đến mục đích chung. Vì vậy một điều ngạc nhiên là khi một protein tương tự như protein không ghép cặp đã được phát hiện trong ty thể thực vật. Protein này bị cảm ứng bởi stress và giống như các oxidase ở con đường thay thế, nó có chức năng ngăn ngừa việc khử quá mức của chuỗi truyền điện tử. Tuy nhiên người ta vẫn chưa rõ tại sao thực vật lại cần cả hai cơ chế này. Phức hệ NADH dehydrogenase nhạy cảm với rotenon - NDin(NADH) Đây là một trong số nhiều enzyme NADH dehydrogenase được tìm thấy trong ty thể thực vật. Người ta cho rằng nó có vai trò thực hiện như là một kênh bơm proton khi mà phức hệ I bị quá tải. Phức hệ I có một ái lực cao hơn với NADH (nhỏ hơn 10 phút) hơn đối với NDin (NADH). Khi mức NADH trong chất nền ty thể thấp hơn thì phức hệ I sẽ xảy ra là chủ yếu, trái lại khi mà ADP bị giới hạn thì hàm lượng NADH sẽ tăng và NADH dehydrogenase nhạy cảm với rotenon sẽ được hoạt hóa. Tuy nhiên người ta vẫn chưa rõ chức năng sinh lí của enzyme này. 4.8. Hô hấp ty thể được kiểm soát bởi các chất trao đổi quan trọng 46
46. Các cơ chất của quá trình sinh tổng hợp ATP bao gồm ADP và Pi là các phân tử điều hòa quan trọng mức độ đường phân cũng như chu trình acid citric và phosphoryl hóa oxy hóa trong ty thể. Các điểm kiểm soát xảy ra ở ba giai đoạn của quá trình hô hấp tuy nhiên ở đây chúng ta chỉ xem xét ở một vài điểm chính. Vị trí điều hòa của chu trình acid citric mà đã được mô tả kĩ nhất đó là ở phức hệ pyruvate dehydrogenase. Pyruvate dehydrogenase ở trạng thái bất hoạt khi bị phosphoryl hóa bởi các kinase, và các kinase này sẽ bị ức chế bởi pyruvate, dẫn tới hoạt hóa enzyme khi cơ chất sẵn có. Mặt khác nhiều enzyme trong con đường chu trình acid citric bao gồm pyruvate dehydrogenase và oxaloglutarat dehydrogenase bị ức chế trực tiếp bởi NADH (hình 11) Hình 11: Điều hòa hoạt động pyruvate dehydrogenase bởi phosphoryl hóa thuận nghịch và các chất chuyển hóa khác Các phản ứng oxy hóa của chu trình acid citric bị kiểm soát bởi hàm lượng adenin nucleotit trong tế bào. Khi nhu cầu của tế bào đối với ATP tế bào chất giảm tương ứng với mức độ tổng hợp ATP trong ty thể thì sẽ có ít ADP, và chuỗi truyền điện tử sẽ hoạt động ở trạng thái khử. Điều này sẽ được truyền tới tín hiệu tới các enzyme của chu trình acid citric thông qua việc tăng NADH của chất nền từ đó ức chế hoạt tính của nhiều enzyme dehydrogenase. Các thành phần của chu trình acid citric cũng như dẫn xuất của chúng chẳng hạn như citrate và glutarate cso khả năng ức chế hoạt động của pyruvate 47
47. dehydrogenase trong tế bào chất từ đó làm tăng hàm lượng phosphoenolpyruvate trong tế bào chất, làm giảm mức độ biến đổi fructose-1,6-bisphosphate từ đó ức chế quá trình đường phân. Tóm lại quá trình hô hấp ở thực vật sẽ được kiểm soát từ dưới lên bởi mức độ ADP trong tế bào (hình 12). ADP ban đầu sẽ điều hòa tỷ lệ vận chuyển điện tử và tổng hợp ATP từ đó sẽ điều hòa hoạt động của chu trình acid citric và cuối cùng sẽ điều hòa đường phân. Hình 12: Điều hòa hô hấp ở thực vật 48
48. 4.9. Hô hấp được ghép chặt với các con đường khác Đường phân, con đường pentose phosphate, chu trình acid citric liên kết với nhiều con đường trao đổi chất quan trọng khác. Các con đường hô hấp là trung tâm sản xuất nhiều chất trao đổi ở thực vật bao gồm các acid amin, lipit và các hợp chất liên quan, isoprenoit và porphyrin (hình 13). Vì vậy, nhiều chất trao đổi của con đường đường phân và chu trình acid citric sẽ được sử dụng cho các quá trình sinh tổng hợp chứ không phải oxy hóa thành CO2. 49
49. Hình 13: Đường phân, con đường pentose phosphate và chu trình acid citric tạo ra nhiều tiền chất cho nhiều con đường chuyển hóa ở thực vật bậc cao. 5. HÔ HẤP TRONG CÁC MÔ VÀ CƠ THỂ THỰC VẬT NGUYÊN VẸN Nhiều nghiên cứu về hô hấp và quá trình điều hòa của chúng ở thực vật đã được tiến hành trên các cơ quan tử riêng biệt và trên các dịch chiết phi tế bào của các mô thực vật. Nhưng những hiểu biết này liên quan đến chức năng của cơ thể thực vật nguyên vẹn trong tự nhiên như thế nào? Trong phần này chúng ta sẽ xem xét quá trình hô hấp và chức năng của ty thể ở cơ thể thực vật nguyên vẹn dưới nhiều điều kiện khác nhau. Đầu tiên là khi mô xanh tiếp xúc với ánh sáng, quá trình hô hấp và quá trình quang hợp đồng thời hoạt động và phối hợp với nhau theo những cách phức tạp, tiếp theo chúng ta sẽ thảo luận về mức độ khác nhau trong hô hấp của mô, cuối cùng chúng ta sẽ xem xét ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến mức độ hô hấp. Nhiều yếu tố có thể ảnh hưởng tới mức độ hô hấp ở cơ thể thực vật nguyên vẹn hoặc các cơ quan riêng biệt của nó. Các yếu tố ảnh hưởng như là loài, môi trường phát triển, và tuổi của cơ quan và các yếu tố môi trường bao gồm nồng độ oxy bên ngoài, nhiệt độ môi trường, nguồn nước và dinh dưỡng. Mức độ hô hấp của toàn bộ cơ thể thực vật, cụ thể khi xem xét trên cơ sở trọng lượng tươi nhìn chung là thấp hơn ở động vật. Sự khác nhau này là do ở thực vật có không bào và thành tế bào không chứa ty thể. Vì vậy mức độ hô hấp ở một số mô ở thực vật cũng cao như đối với các mô ở động vật, thực ra ty thể ở thực vật có mức độ hô hấp cao hơn ty thể động vật khi ở trạng thái tách biệt nếu như biểu hiện theo mg protein. Mặc dù thực vật nhìn chung có mức độ hô hấp thấp hơn nhưng vai trò của chúng vẫn tương đương như ở động vật. Trái lại khi các mô xanh quang hợp thì tất cả các mô khác hô hấp và chúng thực hiện điều này trong 24 giờ một ngày. Thậm chí trong các mô mà ở đó quá trình quang hợp đang hoạt động thì quá trình hô hấp vẫn xảy ra với một phần rất nhỏ. Một khảo sát ở các loài thảo dược đã chỉ 50
50. ra rằng có tới 30-60% lượng carbon đạt được trong quang hợp sẽ được sử dụng vào hô hấp mặc dù giá trị này có thể giảm ở thực vật già hơn. Đối với các thực vật non thì mất gần một phần ba các chất đạt được trong quang hợp vào hoạt động hô hấp và điều này đối với thực vật già sẽ gấp đôi. Ở các vùng nhiệt đới, 70-80% các chất thu được trong quang hợp sẽ đi vào hô hấp do mức độ hô hấp tối cao liên quan đến nhiệt độ ban đêm cao. 5.1. Hô hấp hoạt động trong quá trình quang hợp Ty thể liên quan đến quá trình trao đổi trong các lá đang quang hợp. Glyxin tạo ra bởi quá trình quang hô hấp được oxy hóa thành xerin trong ty thể. Vào thời điểm này ty thể trong các mô dang quang hợp cũng tiến hành chu trình acid citric (thường được gọi là hô hấp tối bởi vì chúng không cần ánh sáng). Giả sử rằng mức độ quang hô hấp có thể đạt từ 20-40% quang hợp tổng số thì quá trình hô hấp trong ty thể cũng xảy ra với mức độ thấp hơn mức độ quang hô hấp. Một vấn đề mà hiện nay người ta vẫn chưa hiểu hoàn toàn đó là bao nhiêu phần trăm hô hấp ở ty thể hoạt động đồng thời với quá trình quang hợp trong các mô được chiếu sáng. Hoạt động của pyruvate dehydrogenase trong ánh sáng thấp hơn 25% so với trong tối. Tuy nhiên người ta đã hiểu rõ rằng ty thể là nguồn cung cấp chính ATP cho các hoạt động trong tế bào chất của lá khi được chiếu sáng. Một vai trò khác của hô hấp ở ty thể trong quá trình quang hợp là để cung cấp các chất trao đổi trung gian cho các phản ứng sinh tổng hợp chẳng hạn như hình thành hai oxoglutarat cho quá trình đồng hóa nitơ. Thông thường ty thể của lá có khả năng cao đối với các con đường không phosphoryl hóa trong chuỗi truyền điện tử. Bằng cách oxy hóa NADH với hiệu suất sản sinh ATP thấp, ty thể có thể duy trì việc sản xuất 2 oxoglutarat ở mức cao. Một bằng chứng khác về hô hấp ở ty thể với quang hợp đó là ở các lá có đột biến trong các phức hệ hô hấp của ty thể có sự biểu hiện phát triển lá chậm và hoạt động quang hợp cũng bị giảm. 5.2. Hô hấp xảy ra ở mức độ khác nhau ở mô và các cơ quan khác nhau 51
51. Một điều cho thấy rằng ở những mô hoạt tính trao đổi chất càng cao thì hoạt động hô hấp của nó càng lớn. Ở những chồi đang mọc có hoạt động hô hấp xảy ra rất cao và thường giảm ở thời kì sinh trưởng. Một ví dụ đã được nghiên cứu kĩ lá lúa mạch đang sinh trưởng trong các mô trưởng thành thì gốc nhìn chung có hoạt động hô hấp thấp nhất còn hoạt động hô hấp ở lá và thân sẽ khác nhau ở những loài thực vật khác nhau dưới những điều kiện khác nhau. Khi mô ở thực vật đã đạt đến độ trưởng thành thì hoạt động hô hấp có thể vẫn được duy trì khá ổn định hoặc giảm chậm. Một ngoại trừ đối với mô hình này việc tăng đột biến trong hô hấp mà xảy ra trong giai đoạn đầu của quá trình chín của nhiều loại quả và xảy ra khi trong quá trình rụng của lá và hoa. Nhìn chung quá trình hô hấp cảm ứng bởi ethylen liên quan tới con đường thay thế tuy nhiên vai trò của con đường này trong quá trình chín vẫn chưa rõ? 6. CÁC NHÂN TỐ ẢNH HƯỞNG TỚI HÔ HẤP Ở THỰC VẬT Cường độ hô hấp Cường độ hô hấp là lượng khí oxy do mô hấp thụ hoặc lượng khí carbonic do mô thải ra trong một đơn vị khối lượng trong một đơn vị thời gian. Đối với các mô chứa diệp lục cần phải hô hấp cao ở trong tối để tránh ảnh hưởng của sự trao đổi CO2 trong quá trình quang hợp.Cường độ hô hấp thay đổi tùy theo loài và đặc điểm của từng mô và cơ quan và giai đoạn phát triển cá thể (bảng 3) Bảng 3: Cường độ hô hấp của một số loài thực vật ở nhiệt độ 10 – 150C (mg CO2/1g chất khô trong 24 giờ) Đối tượng Cường độ hô hấp Lá lúa mì 138,70 Củ khoai tây 2,45 Rễ củ cải đường 6,70 Quả chanh 12,40 Hạt hướng dương nảy mầm 43,70 52
52. Sợi nấm Aspergillus niger 343,20 2 ngày tuổi 54,10 4 ngày tuổi Các cây thuộc các nhóm phân loại khác nhau hô hấp khác nhau nhiều. Các vi khuẩn, thực vật bậc thấp có cường độ hô hấp cao, đặc biệt nấm mốc sử dụng chất khô cho hô hấp bằng khối lượng của chúng trong một ngày đêm. Thực vật ở các vùng sinh thái khác nhau hô hấp khác nhau. Những cây chịu bóng hô hấp kém hơn những cây ưa sáng. Những cây mọng nước mà các mô xốp của chúng được bao bọc bởi lớp cutin dày không thấm khí và nói chung cả cây thủy sinh có hoạt tính hô hấp thụ. Những cây ở miền Bắc hô hấp mạnh hơn những cây ở miền Nam trong điều kiện nhiệt độ thấp. Những cây ở vùng cao đặc trưng mạnh bởi cường độ hô hấp và hoạt tính của các enzyme oxy hóa tạo cho những cây này tính thích nghi với áp suất oxy thấp của các vùng núi cao. Trong giới hạn một cây, các cơ quan khác nhau cũng có cường độ hô hấp khác nhau. Những cơ quan sinh sản hô hấp mạnh hơn những cơ quan sinh dưỡng (nhị và nhụy hô hấp mạnh gấp 2 lần lá). Những mô và cơ quan có mức độ hoạt động sống thấp thì có hoạt tính hô hấp yếu. Đó là những cơ quan dự trữ, những cơ quan sinh dưỡng và sinh sản đang trong thời kì nghỉ. Đặc biệt là hạt khô có cường độ hô hấp yếu hơn lá tới hàng vạn lần. Những hạt nảy mầm có cường độ hô hấp gấp hàng trăm lần so với hạt khô liên quan đến sự hình thành các tế bào phân sinh mới. Trong từng cơ quan, các mô đang hoàn thành chức năng sinh lí, các mô phân sinh đang phân chia mạnh, tầng phát sinh mạch hô hấp mạnh. Các mô bên ngoài và ngoại biên có hoạt tính hô hấp cao liên quan với sự cung cấp oxy tốt hơn Hô hấp và ánh sáng Cơ chế tác động của ánh sáng chưa rõ ngoài ảnh hưởng gián tiếp thông qua ảnh hưởng lên quang hợp. Ngoài ra một số tác giả còn cho rằng ánh sáng làm 53
53. tăng sự hình thành axit glicolic mà sự oxy hóa nhanh của chất này sẽ làm tăng sự thải carbonic và hấp thụ oxy. Các nghiên cứu cho thấy những tia có bước sóng ngắn (300-500nm) hoạt hóa hô hấp mạnh hơn cả. Ánh sáng không chỉ ảnh hưởng đến cường độ mà còn ảnh hưởng đến hệ số hô hấp (ngoài sáng RQ thấp hơn trong tối) Hô hấp và nhiệt độ Cường độ hô hấp tăng khi nhiệt độ tăng trong giới hạn chưa làm tổn thương màng sinh chất và hoạt động sống bình thường của tế bào. Nhiệt độ tối ưu cho hô hấp vào khoảng 350C. Nhiệt độ tối thiểu phụ thuộc vào loài và vùng sinh thái. Hô hấp và độ ẩm của mô Ảnh hưởng của hàm lượng nước trong mô lên hô hấp phụ thuộc vào đặc điểm sinh thái của mô. Đối với đại bộ phận cây, hoạt tính hô hấp giảm khi thiếu nước. Riêng các mô mọng nước, hô hấp lại tăng khi cây bị héo. Ảnh hưởng của độ ẩm lên hô hấp thể hiện rõ hơn cả là ở hạt. Hạt khô có cường độ hô hấp rất thấp, ví dụ như hạt lúa mì có độ ẩm 12% có cường độ hô hấp là 1,5 mg CO2/kg hạt.h. Khi độ ẩm tăng 30-35% hô hấp tăng hàng nghìn lần. Độ ẩm mà ở đó xuất hiện nước tự do và hô hấp tăng mạnh gọi là độ ẩm tới hạn. Đối với đại bộ phận các cây họ Lúa (ngũ cốc) độ ẩm tới hạn là 14,5 = 15,5%, còn đối với cây có dầu từ 8-9%. Hô hấp và thành phần không khí Khi hàm lượng oxy giảm sẽ làm hô hấp giảm. Thường thì hàm lượng oxy thấp hơn 5% hô hấp hướng về yếm khí và con đường đường phân chiếm ưu thế. Hàm lượng oxy tối ưu là khoảng 20%. Theo quy luật chung khi tăng hàm lượng CO2 sẽ làm giảm hô hấp. Có điều đáng lưu ý là thành phần khí trong mô khác thành phần khí ngoài khí quyển, ở trong mô hàm lượng oxy thấp (7-18%) còn hàm lượng CO2 cao (0,9-7,5%). 54
54. Ngoài các yếu tố trên thì chế độ dinh dưỡng, các yếu tố vật lí, hóa học, các chất có hoạt tính sinh học cũng ảnh hưởng đến quá trình hô hấp. 7. TRAO ĐỔI CHẤT LIPID Trong khi động vật sử dụng chất béo để tích lũy năng lượng thì thực vật chúng chủ yếu sử dụng nguồn dự trữ carbongydrate. Mỡ và dầu là nguồn tích lũy quan trọng của carbon dạng khử của nhiều loại hạt ở những loài nông nghiệp quan trọng như đậu tương, hoa hướng dương, lạc và bông. Dầu thường sử dụng như một nguồn tích lũy chính ở nhiều cây hoang dại mà tạo ra các hạt nhỏ. Một số quả như oliu và lê tàu (avocados) cũng tích lũy chất béo và dầu. Trong phần sau của chuyên đề này chúng ta sẽ bàn đến sinh tổng hợp hai loại glicerolipid: tracylglycerol (chất béo và dầu tích lũy trong hạt) và glycerollipid phân cực (hình 14). Chúng ta sẽ thấy rằng sinh tổng hợp triacylglycerol (mỡ trung tính) và glycerollipid phân cực cần thiết cho sự hợp tác của hai bào quan: lạp thể và màng lưới nội chất. Thực vật có thể sử dụng chất béo và dầu để sinh năng lượng như vậy chúng ta sẽ xem xét quá trình phức tạp mà hạt nảy mầm thu được năng lượng trao đổi chất nhờ oxy hóa mỡ và dầu. Hình 14. Cấu trúc triacylglycerols và glycerolipid phân cực ở thực vật bậc cao Mỡ và dầu tích lũy một lượng năng lượng lớn Mỡ và dầu thuộc vào cùng một lớp lipid, về mặt cấu trúc là một nhóm đa dạng các hợp chất kỵ nước và hòa tan trong các dung môi hữu cơ, không tan 55
55. trong nước. Lipid thể hiện một dạng carbon khử hơn nhiều so với carbongydrate, vì thế khi oxy hóa hoàn toàn 1g mỡ hoặc dầu tạo ra nhiều ATP (khoảng 40 kJ hoặc 9,3 kcal) hơn oxy hóa 1g tinh bột (khoảng 15,9 kJ hoặc 3,8 kCal). Ngược lại sinh tổng hợp mỡ và dầu và các phân tử liên quan như phospholipid màng cần đầu tư một lượng đáng kể năng lượng trao đổi chất. Các lipid khác quan trọng cho cấu trúc và chức năng của thực vật nhưng không được sử dụng tích lũy năng lượng của thực vật. Đó là sáp, tạo ra lớp cutin để giảm sự mất nước của các mô thực vật lộ ra ngoài, và terpenoid (hay còn gọi là isoprenoid), chúng gồm cả carotenoid tham gia trong quang hợp và sterol có ở nhiều màng thực vật. Triacylglycerol được tích lũy trong olesome Mỡ và dầu tồn tại chủ yếu ở dạng triacylglycerol (acyl là nói về phần acid béo), hoặc trglycerid ở đó các phân tử acid béo được liên kết ester với 3 nhóm hydroxyl của glycerol. Các acid béo trong thực vật thường là những acid carboxylic mạch thẳng có số carbon chẵn. Chuỗi carbon có thể biến động từ 12-20 nhưng chủ yếu là 16 hoặc 18. Dầu chủ yếu ở dạng lỏng ở nhiệt độ bình thường do sự có mặt của các liên kết đôi trong thành phần acid béo của nó; mỡ có thể tỷ lệ cao các acid béo no, và ở thể rắn ở nhiệt độ bình thường. Các acid béo chủ yếu được trình bày trong bảng 3. Thành phần acid béo của lipid thực vật thay đổi theo loài ví dụ dầu lạc acid palmitic chiếm 9%, acid olecic 59% và acid linoleic 21% và dầu bông có acid palmitic 20%, acid oleic 30%, và acid linoleic 45%. Sự tổng hợp các acid béo này sẽ được thảo luận ngắn gọn. Triacylglycerol ở nhiều hạt được tích lũy trong tế bào chất của tế bào thuộc lá mầm và tế bào nội nhũ. ở trong các bào quan gọi là olesome (hoặc là thể cầu, thể dầu). Olesome có màng ngăn không bình thường để cách ly triglyceride với tế bào chất. Một lớp phospholipid bao quanh thể dầu với các đuôi ưa nước của phospholipid hướng về tế bào chất và chuỗi hydrocarbon kỵ nước quay về bên 56
56. trong. Olesome được ổn định bởi sự có mặt của các protein đặc trưng gọi là oleosin, chúng bao bề mặt và ngăn ngừa phospholipid của thể dầu tiếp xúc với nhau và hợp nhất. Cấu trúc màng độc đáo của olesome là kết quả theo cách tổng hợp triacylglycerol. Sinh tổng hợp triacylglycerol được thực hiện nhờ các enzyme ở màng của lưới nội chất, và các chất béo tạo thành tích lũy giữa hai lớp màng đơn của màng lưới nội chất. Lớp màng kép của lưới nội chất phồng ra khi càng nhiều chất béo được bổ sung vào cấu trúc đang hình thành và cuối cùng một thể dầu trưởng thành được tách ra từ lưới nội chất. Glycerollipid phân cực là lipid cấu trúc chủ yếu trong màng Mỗi màng trong tế bào là một màng kép có tính phân cực (amphipathic- một đầu ưa nước và một đầu ghét nước) mà ở đó có đầu phân cực tương tác với pha nước trong khi đó chuỗi acid béo kỵ nước tạo ra lõi của màng. Lõi kỵ nước này ngăn ngừa sự khuếch tán ngẫu nhiên của các chất hòa tan giữa các khoang tế bào vì thế cho phép các phản ứng sinh hóa trong tế bào có tính tổ chức. Lipid cấu trúc cơ bản ở màng là các glycerolipid phân cực (hình 14) mà phần kỵ nước gồm 2 phân tử chuỗi acid béo 16 hoặc 18 carbon được ester hóa với carbon số 1 và số 2 của glycerol. Nhóm của đầu phân cực được liên kết với carbon số 3 của glycerol có hai dạng glycerollipid phân cực : 1. Glyceroglycolipids ở đó đường tạo ra nhóm đầu (hình 15A) 2. Glycerophospholipids có nhóm đầu chứa phosphate (hình 15B). 57
57. Hình 15. Một số lipid phân cực của màng tế bào thực vật Màng thực vật có các lipid cấu trúc bổ sung bao gồm sphingolipids và sterol, nhưng chúng là thành phần không đáng kể. Các lipid khác thực hiện nhưng vai trò đặc trưng trong quá trình quang hợp và quá trình khác. Trong số những 58
58. lipid này có chlorophyll, plastoquinone, carotenoid, và tocopherol chúng chiếm 1/3 lipid bổ sung lipid của lá. Hình 15 chỉ ra 9 lớp glycolipid chủ yếu ở thực vật, mỗi lớp có thể tổ hợp với nhiều loại acid béo khác nhau. Các cấu trúc nêu ở hình trên minh họa cho một số lớp phân tử thường gặp. Màng của lục lạp chứa đến 70% lipid của màng trong các mô quang hợp chủ yếu là glyceroglycolipid, các màng khác của tế bào là glycerophospholipid (bảng 4). Trong các mô không quang hợp, phospholipid là glycerolipid chủ yếu của màng. Bảng 4. Thành phần glycerolipid của màng tế bào Sinh tổng hợp acid béo gồm các chu trình thêm 2 carbon Sinh tổng hợp acid béo gồm các phản ứng trùng ngưng có tính tuần hoàn của các đơn vị 2 carbon mà acetyl-CoA là tiền chất. Ở thực vật, acid béo được tổng hợp chủ yếu ở lạp thể, còn ở động vật acid béo được tổng hợp chủ yếu trong tế bào chất. Các enzyme của con đường có thể liên kết với nhau tạo thành một phức như fatty acid synthase. Có lẽ phức này cho phép một chuỗi các phản ứng diễn ra một cách hiệu quả hơn nếu như các enzyme này được tách rời nhau về mặt vật lý. Bên cạnh đó, việc kéo dài chuỗi acyl được liên kết cộng hóa trị với nhau với một protein acid có phân tử thấp gọi là chất mang protein mang acyl ký hiệu ACP. Khi liên kết với ACP, acid béo được nhắc đến như acyl-ACP. Bước đầu tiên xảy ra trong con đường (là bước độc đáo đầu tiên để tổng hợp acid béo) là tổng hợp malonyl –CoA từ acetyl-CoA và CO2 nhờ enzyme 59
59. acetyl-CoAcarboxylase (hình 16). Sự điều hòa chặt chẽ của acetyl- CoAcarboxylase hình như kiểm soát toàn bộ tốc độ tổng hợp acid béo. Sau đó Malonyl-CoA tác dụng với ACP để sinh ra malonyl-ACP: 1. Trong chu kỳ đầu của sinh tổng hợp acid béo, nhóm acetate của acetyl- CoA được chuyển cho cysteine của enzyme trùng ngưng (3-ketoacyl- ACPsynthase) sau đó liên kết với malonyl-ACP để tạo ra acetoacetyl-ACP. 2. Tiếp theo nhóm keto của carbon thứ 2 được tách ra (bị khử) qua hoạt động của 3 enzyme để tạo ra một chuỗi acyl mới (butyryl-ACP) có 4 carbon (hình 16). 3. Acid 4 carbon và các phân tử malonyl –Acp sau đó trở thành cơ chất mới để cho enzyme trùng ngưng (kết hợp phân tử) kết quả thêm 2 carbon vào nữa vào chuỗi đang kéo dài, cứ tiếp tục như vậy cho đến chuỗi 16 hoặc 18 carbon. 4. Một số phức chuỗi acyl 16:0 (bão hòa) carbon-ACP được giải phóng từ bộ máy tổng hợp acid béo nhưng phần lớn các phân tử là được kéo dài đến 18:0-ACP được chuyển thành 18:1-ACP là nhờ các enzyme desaturase (tạo liên kết đôi). Sự lặp lại của các sự kiện tạo 16:0-Acp và 18:1-ACP là sản phẩm chính của sinh tổng hợp acid béo trong lạp thể (hình 17). Các acid béo có thể trải qua những biến đổi sau khi chúng liên kết với glyceol để tạo thành glycrlipid. Các liên kết đôi bổ sung ở acid béo 16:0 và 18:1 nhờ một loạt các isozyme. Desaturase isozyme là những protein liên kết hoàn toàn với màng được tìm thấy ở lục lạp và lưới nội chất. Mỗi desaturase gắn một liên kết đôi ở một vị trí đặc trưng ở chuỗi acid béo, các enzyme tác động một cách trình tự để tạo ra các sản phẩm acid béo 18:3 hoặc 16:3. 60
60. Hình 16. Chu kỳ sinh tổng hợp acid béo trong lạp thể thực vật 61
61. Hình 17. Hai con đường sinh tổng hợp glycerolipid trong lục lạp và màng lưới nội chất của Arabidosis Glycerolipids được tổng hợp ở trong lạp thể và lưới nội chất Các acid béo được tổng hợp ở lạp thể sau đó được sử dụng để tổng hợp Glycerolipidscủa màng và oleosome. Bước đầu tiên của tổng hợp Glycerolipids là 2 phản ứng acyl hóa chuyển acid béo từ acyl-ACP hoặc acyl-CoA đến glycerol-3- phosphate để tạo ra acid phosphatidic. Sự hoạt động đặc hiệu của phosphatase tạo ra diacylglycerol (ADG) từ acid phosphatidic. Acid phosphatidic cũng có thể được chuyển trực tiếp thành phosphatidylinositol hoặc phosphatidylglycerol; DAG có thể làm tăng to phosphatidylethanolamine hoặc phosphatidylcholine (hình 17). Sự định vị của các enzyme sinh tổng hợp glycerolipid cho thấy một sự tương tác chặt chẽ và phức tạp giữa lục lạp – nơi acid béo được tổng hợp với các hệ thống màng sinh học khác của tế bào. Theo một thuật ngữ đơn giản, quá trình sinh hóa có hai con đường như con đường nhân sơ prokaryot (hoặc chloroplast) và con đường nhân chuẩn eukaryot (con đường ER). Sơ đồ đơn giản của mô hình này được trình bày ở hình 17. 1. Ở lục lạp, con đường prokaryot sử dụng 16:0 và 18:1 ACP của acid béo được tổng hợp trong lục lạp để tổng hợp acid phosphatidic và các dẫn xuất. Các acid béo có thể đưa ra tế bào chất dưới dạng ester của CoA. 62
62. 2. Ở tế bào chất, con đường Eukaryot sử dụng một loạt các acyltransferase khác nhau ở màng lưới nội chất đưa acid béo vào acid phosphatidic và các dẫn xuất của chúng. Ở một số thực vật bậc cao, gồm Arabidopsis và rau bina, hầu như hai con đường thực hiện với mức độ như nhau đối với tổng hợp lipid ở lục lạp. Tuy nhiên ở nhiều cây hạt kín khác, phosphatidylglycerol (phospholipid) là sản phẩm duy nhất của con đường nhân sơ, và lipid còn lại của diệp lục được tổng hợp theo con đường nhân chuẩn. Hóa sinh của tổng hợp triacylglycerol trong hạt chứa dầu được mô tả như đối với glycerolipid. 16:0 và 18:1-ACP được tổng hợp trong lạp thể của tế bào sau đó được đưa ra như dưới dạng thioester CoA để đưa vào DAG trong lưới nội chất (hình 17). Lipid tích lũy được chuyển hóa thành carbonhydrate trong hạt nảy mầm Sau khi nảy mầm, hạt chứa dầu chuyển hóa triacylglucerol tích lũy bằng chuyển lipid thành sucrose. Thực vật không có khả năng chuyển chất béo từ nội nhũ tới mô rễ và chồi của hạt nảy mầm, vì thế chúng phải chuyển lipid dự trữ thành dạng carbon linh động hơn phổ biến là sucrose. Quá trình này gồm một chuỗi các bước ở các khoang khác nhau trong tế bào: oleosome, glyosome, ty thể và tế bào chất. Tổng quan chuyển hóa lipid thành đường. Sự chuyển đổi lipid thành sucrose trong hạt có dầu được khởi đầu bởi sự nảy mầm và bắt đầu với sự thủy phân triacylglycerol dự trữ trong các thể dầu thành các acid béo tự do, sau đó nhờ sự oxy hóa acid béo thành acetyl-CoA (hình 18). Acid béo được oxy hóa trong một loại peroxisome được gọi là gluoxisome, một bào quan được bao quanh bởi màng kép đơn giản được tìm thấy ở các mô tích lũy nhiều dầu của hạt. Acetyl-CoA được chuyển hóa trong glyoxisome (hình 18A) tạo ra succinate, nó được chuyển từ glyoxisome đến ty thể, ở đó nó được chuyển thành oxaloacetate và sau đó là malate. Quá trình kết thúc ở tế bào chất 63
63. với việc chuyển malate thành glucose qua gluconeogenesis, và sau đó đến sucrose. Mặc dù một số carbon từ các acid béo này được tách ra và đi vào các phản ứng trao đổi chất khác ở một số hạt dầu, trong đậu castor (Ricinus communis) quá 64
64. trình này rất là hiệu quả mà mỗi g lipid được oxy hóa và kết quả tạo ra 1g carbongydrate, nó tương đương với 40% phục hồi năng lượng tự do của dạng liên kết carbon ([15,9kJ/40kJ]x 100 = 40%). Enzyme thủy phân lipase Bước đầu tiên của sự chuyển hóa chất béo thành carbongydrate là phá vỡ triglyceride tích lũy trong các hạt dầu nhờ lipase, mà ít nhất ở nội nhũ đậu castor, nó nằm ở một nửa màng mà nó thể hiện như ranh giới bên ngoài của thể dầu. Lipase thủy phân triacylglycerol đến 3 phân tử acid béo và glycerol. Ngô và bông cũng chứa hoạt tính lipase trong các thể dầu, trong khi đó ở lạc, đậu tương và dưa chuột thể hiện hoạt tính lipase ở glyoxisome. (hình 18B). β- oxy hóa acid béo Sau thủy phân triacylglycerol, các acid béo được tạo ra đi vào glyoxisome, nơi đó chúng được hoạt hóa đến fatty-acyl-CoA bởi enzyme fatty-acyl-CoA synthase. fatty-acyl-CoA là cơ chất đầu tiên cho một loạt phản ứng β-oxy hóa, mà các acid béo Cn (gồm acid béo n số C) từng bước phân cắt đến đến n/2 phân tử acetyl-CoA (hình 18A). trình tự phản ứng gồm khử ½ O2 đến nước và tạo ra một NADH và 1 FADH2 cho mỗi acetyl-CoA được tạo ra. Trong mô động vật có vú, bốn enzyme liên quan đến β-oxy hóa có mặt trong ty thể; trong mô hạt thực vật, chúng định vị trong glyoxisome. Sự thú vị là trong mô sinh dưỡng thực vật (chẳng hạn như củ khoai tây), phản ứng β-oxy hóa diễn ra trong peroxisome. Chu kỳ glyoxylate Chức năng của chu kỳ glyoxylate là chuyển hai phân tử acetyl-CoA tới succinate. Acetyl-CoA được tạo ra bởi β-oxy hóa chuyển hóa trong glyoxisome thông qua một dãy các phản ứng tạo ra chu kỳ glyoxylate (hình 18A). Đầu tiên, acetyl-CoA phản ứng với oxaloacetate để tạo citrate, sau đó nó được chuyển đến tế bào chất để đồng phân hóa thành isocitrate bởi aconitase. Isoncitrate chuyển trở lại vào trong peroxisome và được chuyển thành malate bởi hai phản ứng đặc trưng cho con đường glyoxylate: 65
65. 1. Đầu tiên isocitrate (C6) được phân cắt bởi enzyme isocitratelyase tạo succinate (C4) và glyoxylate (C2). Succinate này được chuyển vào ty thể. 2. Tiếp theo, malate synthase kết hợp với phân tử acetyl-CoA thứ hai với glyoxylate tạo ra malate. Malate sau đó bị oxy hóa bởi malate dehydrogenase tới oxaloacetate, nó có thể kết hợp với phân tử acetyl-CoA khác để tiếp tục chu kỳ (hình 18A). Glyoxylate được tạo ra tham gia hoạt động của chu trình glyoxylate trong glyoxisome nhưng succinate thì chuyển sang ty thể cho quá trình khác. Vai trò của ty thể Succinate chuyển từ glyoxisome đến ty thể sau đó được chuyển thành malate bởi phản ứng acid citric. Malate sau đó bị oxy hóa tới oxaloacetate bởi malate dehydrogenase trong tế bào chất, và kết quả là oxaloacetate được chuyển thành carbonhydrate. Sự chuyển đổi này cần phá bỏ phản ứng không thuận nghịch của pyruvate kinase (hình 3) và là dễ dàng bởi enzyme PEP carboxylase, nó sử dụng khả năng phosphoryl hóa của ATP để chuyển oxaloacetate thành PEP và CO2 (hình 18A). Từ PEP, gluconeogenesis có thể phát triển để sản xuất ra glucose. Sucrose là sản phẩm cuối cùng của quá trình này và là dạng chủ yếu của carbon khử chuyển từ lá mầm tới mô của cây con. Không phải tất cả hạt đều chuyển hóa chất béo thành đường. Tài liệu tham khảo chính 1. Nguyễn Như Khanh, Cao Phi Bằng (2008), Sinh lý học thực vật, Nxb Giáo dục. 2. B.Buchanan., W.Gruissem., R.Jones (2000), Biochemistry & Molecular Biology of Plants. American Society of Plant Physiologists. 3. Albert L.Lehninger (2005).Biochemistry.4e. 4. Taiz.L., Zeiger. E (2006). Plant physiology. 4th edition. 66