Sinh học phân tử (Southern blot)

Nội dung text: Sinh học phân tử (Southern blot)

1. Sinh học phân tử Southern blot Thực hiện: www.themegallery.com LOGO Đỗ Đức Anh - Ng.Thị Điểm - Ng.Phan Thị Hoàng Kim - Hồng Vĩnh Thành - Mai Hoàng Yến
2. Nội dung seminar I Giới thiệu về phương pháp Southern Blot 1 Khái niệm II Lai phân tử 2 Các kiểu lai phân tử 3 Các yếu tố ảnh hưởng 1 Nguyên lí và điều kiện III Southern blot 2 Mẫu dò 3 Qui trình IV Ứng dụng www.themegallery.com LOGO
3. Southern blot I. Giới thiệu chung về phương pháp Southern blot. - Đây là phương pháp cho phép xác định được sự có mặt của những trình tự nucleotide trên một đoạn ADN nào đó, trong hỗn hợp các đoạn ADN khác nhau - Do E.M.Southern đề xuất vào năm 1975, tại đại học Edingburd. - Được triển khai nhờ 1 số kĩ thuật nền tảng của công nghệ sinh học phân tử như: • Tách chiết gen. • PCR • Thẩm tích các phân tử acid nucleotide lên màng lai (blot). • Lai phân tử ( lai với mẫu dò đặc hiệu) • www.themegallery.com LOGO
4. II. Lai phân tử 1. Khái niệm ▪ Là hiện tượng 2 mạch DNA sau khi đã tách rời, sẽ kết hợp lại với nhau ở điều kiện nhiệt độ được làm giảm từ từ, kết hợp với điều kiện thí nghiệm thích hợp. ▪ Đặc điểm: – Đặc hiệu tuyệt đối: sự bắt cặp chỉ xảy ra giữa 2 trình tự hoàn toàn bổ sung cho nhau. – Các trình tự bổ sung có thể là DNA hay RNA → ptử DNA-DNA, RNA-RNA, các phân tử lai DNA-RNA www.themegallery.com LOGO
5. Southern blot Các kiểu lai phân tử Lai trong Lai tại chỗ pha lỏng Lai trên pha rắn www.themegallery.com LOGO
6. LAI TRÊN PHA RẮN Nguyên tắc -1 trình tự bổ Sự lai phân tử sung. xảy ra do: -1 trình tự cần -Chuyển động biết được gắn nhiệt. trên gía thể - Nhiệt độ môi trường thấp hơn Tm ít nhất vài độ www.themegallery.com LOGO
7. CÁC YẾU TỐ KĨ THUẬT TRONG LAI TRÊN PHA RẮN Màng Nitrocellulose: Màng nylon được sử được sử dụng đầu tiên, dụng phổ biến: nay ít dùng, do: - Có thể tiếp nhận - Độ bền cơ học 500µg/cm2. kém→khó thao tác. - Không thể tách rời - giữ DNA chắc hơn. các phân tử lai trên -Ít đứt gãy màng để lai trở lai với một mẫu dò -Cho phép lai nhiều khác. lần với mẫu dò khác nhau www.themegallery.com LOGO
8. Southern blot Diagram Lai trên màng rắn Thuận lợi: Khó khăn: - Dễ dàng trong - Định lượng thao tác. phân tử kém - Dễ dàng tách chính xác trình tự không lai - Hiệu quả lai ra khỏi phân tử lai. thấp (vận tốc - Ngăn cản sự tái lai chậm đi 10 bắt cặp giữa 2 lần so với vận mạch đơn của tốc lai trên pha cùng một phân tử. lỏng). www.themegallery.com LOGO
9. III. PHƯƠNG PHÁP SOUTHERN BLOT Diagram Nguyên lí - dựa trên nguyên - Dựa vào nguyên tắc tắc biến tính và bổ sung giữa các cặp mucleotide: A-T, G-C hồi tính của phân (các đoạn tử DNA polynucleotide mạch đơn có trình tự bổ sung) www.themegallery.com LOGO
10. Southern blot - Phản ứng lai cần nhiệt độ cao hoặc hóa chất gây biến tính DNA (NaOH, Formaldehyt). Đòi hỏi một đoạn DNA (RNA) đã biết được sử dụng làm mồi “Probe” được đánh dấu Nguyên tắc - Các vật liệu, trang thiết bị máy móc chính xác: màng lai, máy Blotting, buồng lai, máy PCR www.themegallery.com LOGO
11. TẠO MẪU DÒ Diagram Tạo Probe nhờ ứng dụng Tạo mẫu dò nhờ Plasmid PCR -Thiết lập mồi và đánh dấu -Cắt Plasmid và ADN đã tách phóng xạ vào các mồi. chiết từ tế bào bởi cùng một -Biến tính mẫu ADN thành các loại Enzym. sợi đơn. -Gắn ADN vào Plasmid trong -Gắn mồi vào các sợi đơn. điều kiện môi trường phù hợp. -Tổng hợp các sợi ADN mới. -Thực hiện biến nạp vào trong -Biến tính để tách chuỗi mới tế bào vi khuẩn. vừa tổng hợp thành các sợi -Nhân các tế bào vi khuẩn và đơn. chọn lọc. -Tiếp tục quay về gắn mồi vào -Tách plasmid từ các tế bào các sợi đơn. chọn lọc. -Tách mẫu dò (đoạn ADN). -Đánh dấu mẫu dò www.themegallery.com LOGO
12. Southern blot đồng vị phóng xạ (P32) Phát quang sinh học Đánh dấu probe Enzyme polynucleotide Kéo dài mồi kinase Phương pháp hóa học www.themegallery.com LOGO
13. ĐÁNH DẤU ĐỒNG VỊ PHÓNG XẠ - DNA dùng để tạo mẫu dò - Tạo ra các vết khía sau đó bổ xung các nucleotide tự do trong đó có các nucleotide, đã được đánh dấu phóng xạ. - DNA polymerase I được cho vào ống và bám vào các vết cắt. - Polymerase bắt đầu sửa chữa DNA theo chiều 5' - 3'. - DNA này sau đó được bằng nhiệt độ làm biến tính sợi kép thành hai sợi đơn. www.themegallery.com LOGO
14. ĐÁNH DẤU BẰNG PHÁT QUANG SINH HỌC - Mẫu dò được đánh dấu bằng enzyme peroxidase. - Sau khi cho màng lai tiếp xúc với mẫu dò (được đánh dấu phát quang sinh học), cơ chất của perpxidase bị biến đổi, ánh sáng phát ra sẽ được in trên phim → thu nhận được kết quả www.themegallery.com LOGO
15. QUI TRÌNH SOUTHERN BLOT Giai đoạn 3 Giai đoạn 2 Giai đoạn 1 Lai với probe Chuyển DNA và kiểm tra Tách chiết và từ agarose gel bằng kỹ thuật làm biến tính lên màng lai phóng xạ tự DNA thành các ghi sợi đơn www.themegallery.com LOGO
16. www.themegallery.com LOGO
17. www.themegallery.com LOGO
18. Giai đoạn 1 Tách chiết DNA cần nghiên cứu Cắt DNA nghiên cứu bằng enzyme cắt giới hạn Tiến hành điện di hỗn hợp DNA vừa được cắt, trên gel agarose Làm biến tính các dải băng DNA trên gel agarpose dd NAOH 0,4M thành các sợi đơn www.themegallery.com LOGO
19. www.themegallery.com LOGO
20. GIAI ĐOẠN II - Màng được sử dụng là màng nitocellulose hoặc màng nylon. - Nguyên tắc: dựa vào nguyên tắc mao dẫn • Đệm từ phía dưới được thấm một cách tự nhiên lên trên chuyển các mảnh DNA từ gel lên màng và bám chặt vào màng ( thời gian chuyển dựa vào các phương pháp chuyển khác nhau). - Cách tiến hành: • Đặt gel lên giá chuyển máy Blotting để chuyển nguyên vẹn các sợi ADN biến tính. • dung dịch dẫn chuyển là NaOH 0,4M. • màng lai sẽ giữ cố định các đoạn ADN được chuyển lên từ gel điện di www.themegallery.com LOGO
21. Máy bloting www.themegallery.com LOGO
22. www.themegallery.com LOGO
23. GIAI ĐOẠN III DNA có định trên màng lai kết hợp với probe(đã được đánh dấu) theo nguyen tắc bổ sung Rửa và loại bỏ mẫu không tham gia phản ứng lai trên màng lai Phát hiện vị trí lai nhờ phóng xạ tự ghi Đặt phim lên tấm lọc Tráng phim để thu các vạch đen tại nơi phát xạ www.themegallery.com LOGO
24. LAI VỚI MẪU DÒ → KẾT QUẢ www.themegallery.com LOGO
25. www.themegallery.com LOGO
26. LAI TRÊN MÀNG ĐẶT PHIM LÊN TẤM LỌC TRÁNG PHIM www.themegallery.com LOGO
27. ứng dụng southern blot KĨ THUẬT RFLP - Nghiên cứu mối quan hệ họ hàng của nhiều nhóm loài thực vật, động vật. - Phát hiện sự có mặt của gen cần tìm trong hệ genome sinh vật nghiên cứu - Phát hiện sự đa dạng DNA qua các cá thể khác nhau của 1 loài - Phát hiện các thể đột biến gen. www.themegallery.com LOGO
28. Kĩ thuật RFLP -là kĩ thuật phân tích sự đa hình VỀ CHIỀU DÀI, của các mảnh DNA bị cắt đoạn. Nguyên lí: - Dựa trên sự sai khác của phổ băng điện di và độ dài của các phân đoạn bị cắt bởi RE. - Số lượng đoạn cắt khác nhau được phân biệt bằng điện di đồ nên còn được gọi là dấu vân tay (finger printing) đặc trưng cho từng phân tử DNA. www.themegallery.com LOGO
29. Kỹ thuật RFLP Các bước tiến hành: ❖Tách chiết và tinh sạch DNA. ❖Cắt các mẫu DNA bằng một cặp RE ❖Điện di sản phẩm DNA sau khi đã xử lí ❖Làm biến tính DNA bằng nhiệt độ cao. ❖Chuyển lên màng lai nitrocellulose, hoặc màng nilon ❖Ủ màng lai với mẫu dò đã đánh dấu bằng P32. ❖Rửa màng lai ❖Hiển thị bằng phim phóng xạ tựwww.themegallery.comghi. LOGO
30. www.themegallery.com LOGO
31. www.themegallery.com LOGO
32. DNA FINGERPRINTING www.themegallery.com LOGO
33. SO SÁNH 2 MẪU → TÌM RA THỦ PHẠM www.themegallery.com LOGO
34. Tài liệu tham khảo - Trịnh Đình Đạt. Công nghệ sinh học. Tập 4. NXB Giáo dục . - Hồ Huỳnh Thuỳ Dương. Sinh học phân tử. NXB Giáo dục. - Phạm Thành Hổ. 2005. Nhập môn CNSH. NXB Giáo dục. - Diễn dàn nhà sinh học trẻ : nhasinhhoctre.com - youtube.com - báck khoa toàn thư mở: vi.wikipedia.org www.themegallery.com LOGO
35. Click to edit subtitle style www.themegallery.com LOGO