Phân tích phả hệ phân tử nhằm hỗ trợ định danh các mẫu nấm DL0038A và DL0038B thuộc chi Cordyceps

Nội dung text: Phân tích phả hệ phân tử nhằm hỗ trợ định danh các mẫu nấm DL0038A và DL0038B thuộc chi Cordyceps

1. TAÏP CHÍ PHAÙT TRIEÅN KH&CN, TAÄP 19, SOÁ T1 - 2016 Phân tích phả hệ phân tử nhằm hỗ trợ định danh các mẫu nấm DL0038A và DL0038B thuộc chi Cordyceps Vũ Tiến Luyện Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM Đinh Minh Hiệp Trung tâm Nông nghiệp Công nghệ cao, TP.HCM Trương Bình Nguyên Trường Đại học Đà lạt Lao Đức Thuận Trịnh Văn Hạnh Lê Huyền Ái Thúy Trường Đại học Mở TP.HCM ( Bài nhận ngày 11 tháng 08 năm 2015, nhận đăng ngày 28 tháng 03 năm 2016) TÓM TẮT Công bố trước đây của chúng tôi đã tạm thời kết phân tích kết hợp dữ liệu đa gen, bao gồm nrLSU luận mẫu nấm DL0038A và B là Cordyceps (nuclear ribosomal large subunit) cùng với nrSSU takaomontana. Nhằm củng cố hơn nữa công tác và rpb1. Các kết luận phân tích phả hệ trong công phân loại định danh các mẫu nấm này, chúng tôi bố này một lần nữa ủng hộ quan điểm các mẫu nấm tiếp tục bổ sung phân tích phả hệ đơn gen từng gen DL0038A và B có quan hệ rất gần hoặc chính là nrSSU (nuclear ribosomal small subunit) hay rpb1 Cordyceps takaomontana – thể hữu tính và Isaria (largest subunit of RNA polymerase II), cũng như tenuipes – thể vô tính. Từ khóa: Cordyceps takaomontana, nrSSU, nrLSU, phát sinh chủng loài, rpb1 MỞ ĐẦU Trong công bố của Đinh Minh Hiệp và cộng sự y dược của các mẫu nấm này đã ghi nhận các kết quả (2014) [6], các tác giả cho biết: hai mẫu nấm ký sinh chính như sau: xác định sơ bộ thành phần hóa thực côn trùng DL0038A và DL0038B được thu nhận từ vật cho thấy sinh khối hệ sợi mẫu nấm này chứa chuyến đi thực địa ở vùng núi Langbian, Lâm Đồng. nhóm hợp chất triterpenoid tự do, saponin, acid hữu Các đặc điểm hình thái và giải phẫu học nhằm sơ bộ cơ, chất khử và hợp chất polyuronic. Cả hai mẫu nấm phân loại hai mẫu nấm được tóm lược trên các hình 1 được khảo sát đều cho thấy chúng có hoạt tính bắt và 2, lần lượt cho hai mẫu DL0038A và DL0038B. gốc DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) tự do và Dựa vào các đặc điểm hình thái, giải phẫu học, cũng năng lực khử, đồng thời có chứa polyphenol và như phân tích sơ bộ phát sinh chủng loài phân tử gen polysaccharide. Một số mẫu cao được chọn thử nrLSU (largest subunit of RNA polymerase II), cả hai nghiệm đều không gây độc tế bào HepG2 (ở dãy mẫu nấm đều đã được nhận định là loài Cordyceps nồng độ xử lý từ 2 – 10 mg/ml) và đều thể hiện khả takaomontana [6]. Bên cạnh đó, các kết quả nghiên năng bảo vệ tế bào này (DNA bộ gen của tế bào cứu về khảo sát tiềm năng ứng dụng của chúng trong HepG2 không bị gãy vỡ do tác nhân oxy hóa) [7]. Trang 55
2. Science & Technology Development, Vol 19, No.T1- 2016 Qua một số dẫn chứng trên đây, có thể thấy rằng các dược học trong việc phòng và trị các bệnh liên quan mẫu nấm này là rất tiềm năng để khai thác tính chất đến sự oxy hóa, suy giảm trí nhớ và ung thư, . A B C D E F G H Hình 1. Hình thái giải phẫu mẫu nấm DL0038A. (A) Quả thể nấm Cordyceps takaomontana (DL0038A) trong tự nhiên; (B) Ký chủ bị bao bọc bởi lớp sợi dày tạo giả hạch màu trắng; (C) Thể chén nhô cao; (D) Hệ sợi phát triển trên môi trường agar, màu vàng khi già; (E) Hệ sợi phân nhánh mạnh; (F) Thể bình; (G) Hình thành bào tử đốt; (H) bào tử đốt. A B C D E Hình 2. Hình thái giải phẫu mẫu nấm DL0038B. (A) Quả thể Cordyceps takaomontana (DL0038B) trong tự nhiên: quả thể còn non, được bao phủ bởi lớp bụi bào tử màu trắng, thể chén chưa nhô lên khỏi bề mặt quả thể; (B) Hệ sợi phát triển trên môi trường PGA; (C, D) Một số dạng bào tử vô tính; (E) Hệ sợi với nhiều cấu trúc thể bình. Những năm gần đây, một số công trình đã công [8]. Trong số đó, chúng tôi đặc biệt quan tâm đến bố việc sử dụng nhiều gen trong hỗ trợ công tác định công trình của Sung và cộng sự (2007) [12] bởi trong danh các mẫu nấm thuộc nhóm ký sinh côn trùng công trình này, các tác giả đã hệ thống lại các nhóm như: Chan và cộng sự (2011) [3, 10] phân tích trình nấm, đặc biệt thuộc họ Clavicipitaceae một cách rất tự vùng DNA ITS, nrLSU, EF-1α, rbp1, trong định tổng thể. Công trình của Sung và cộng sự (2007) đã danh loài Cordyceps gunnii tại Trung Quốc. Việc sử dụng các dữ liệu từ 5 – 7 các gen thuộc nhóm gen phân tích đa gen, bao gồm nrSSU, nrLSU, tef, rpb1 và thường trực (house-keeping genes) bao gồm: nrSSU rpb2 được ứng dụng trong định danh các mẫu nấm (nuclear ribosomal small subunit - tiểu đơn vị nhỏ thuộc chi Torrubiella bởi Johnson và cộng sự (2009) ribosome), nrLSU (nuclear ribosomal large subunit - Trang 56
3. TAÏP CHÍ PHAÙT TRIEÅN KH&CN, TAÄP 19, SOÁ T1 - 2016 tiểu đơn vị lớn ribosome), tef1 (elongation factor 1 - thêm rằng Isaria japonica cũng chính là nhân tố kéo dài 1 ), rpb1 (largest subunit of RNA Paecilomyces tenuipes hay còn gọi là Isaria tenuipes polymerase II - tiểu đơn vị lớn nhất của RNA Peck. Tổng hợp dữ liệu cho đến này, riêng đối với polymerase II), rpb2 (second largest subunit of RNA loài nấm này, chúng tôi ghi nhận các tên chính thức polymerase II - tiểu đơn vị lớn thứ hai của RNA như sau : Cordyceps takaomontana (telemorph), polymerase II), tub ( tubulin) và atp6 (mitochondrial Isaria tenuipes (anamorph), Isaria japonica ATP6) của 162 taxon. Qua công trình này, các tác (anamorph) và Paecilomyces tenuipes (anamorph). giả đã khẳng định các loài thuộc nhóm nấm này nên VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP được chia thành ba họ là họ Clavicipitaceae với các Vật liệu chi Metacordyceps, Hypocrella, Regiocrella và Torrubiella; họ Cordycipitaceae với chi Cordyceps; Mẫu hệ sợi nấm thuần được phân lập từ mẫu nấm họ Ophiocordycipitaceae với hai chi Ophiocordyceps ký sinh côn trùng Cordyceps takaomontana (ký hiệu và Elaphocordyceps. Dữ liệu phân tử của 5 – 7 gen DL0038A và DL0038B) do Khoa Sinh học, Trường của 162 taxon từ công trình này, đặc biệt là nhóm ba Đại học Đà Lạt cung cấp. gen nrLSU, nrSSU và rbp1 cũng chính là dữ liệu phân Tách chiết DNA, phản ứng PCR khuếch đại các tử lớn nhất về nấm ký sinh côn trùng cho đến thời gen mục tiêu điểm này mà chúng tôi ghi nhận được từ GenBank. Quy trình tách chiết DNA từ hệ sợi nấm được Chính vì vậy, trong nghiên cứu này, kế thừa phần thực hiện bằng phương pháp Phenol/Chloroform, lớn khối dữ liệu phân tử từ 162 trình tự trong công bố phỏng theo Chomczynski & Sacchi (1987) có biến của Sung và cộng sự (2007) [12], các cây phát sinh đổi cho phù hợp với mục tiêu thu nhận DNA (thay chủng loài khác nhau được xây dựng từ các phương đổi chỉ số pH của phenol từ 4 thành 8) [4]. Dùng que pháp neighbor joing (NJ), maximum parsimony (MP) cấy vô trùng tiến hành thu nhận một phần hệ nấm sợi và maximum likelyhood (ML) dựa trên các gen (khoảng 1,5 g) hòa tan trong ống eppendorf chứa sẵn nrSSU và rpb1 cũng như kết hợp phân tích đa gen 700 µL dung dịch ly giải tế bào, ủ qua đêm ở nhiệt độ bao gồm nrLSU, nrSSU và rpb1 được thực hiện nhằm 65 ºC. Mẫu sau khi ủ được tiến hành ly tâm thu nhận tiếp tục mục đích hỗ trợ định danh các mẫu nấm ký phần cặn, bổ sung 700 µL dung dịch PCI sinh côn trùng DL0038A và DL0038B. (Phenol/Chloroform/Isoamylalcohol). Sau đó, mẫu Một đặc điểm của các loài nấm thuộc chi nấm ký được tiến hành ly tâm thu nhận phần nổi và tiến hành sinh côn trùng và chính đặc điểm này gây không ít tủa bằng ethanol tuyệt đối. Sản phẩm DNA được xác khó khăn cho công tác phân loại cũng cần được nhắc định nồng độ bằng phương pháp đo mật độ quang ở đến ở đây, đó chính là đặc điểm lưỡng danh: tức là bước sóng 260 nm và độ tinh sạch thông qua tỷ số chúng có thể tồn tại ở thể hữu tính (teleomorph) và OD260/OD280. Mẫu DNA sau khi tách chiết được lưu thể vô tính (anamorph). Đối với Cordyceps giữ trong dung dịch TE và bảo quản ở - 20 ºC cho đến takaomontana, Kobayashi (1941) đã công bố thêm khi được sử dụng cho những thí nghiệm sau. Phản thể vô tính của loài nấm này có thể là Isaria japonica ứng PCR được thực hiện với hệ mồi (Bảng 1). Yasuda. Rất lâu sau đó, Samson (1974) đã công bố Trang 57
4. Science & Technology Development, Vol 19, No.T1- 2016 Bảng 1. Trình tự các mồi sử dụng khuếch đại các gen mục tiêu Gen mục Sản Tài liệu Tên mồi Trình tự (5’ – 3’) tiêu phẩm tham khảo Mồi NS1 GTAGTCATATGCTTGTCTC xuôi 1102 [15] nrSSU Mồi NS4 CTTCCGTCAATTCCTTTAAG bp ngược Mồi CRPB1 CCWGGYTTYATCAAGAARGT xuôi [2] rbp1 803 bp Mồi RPB1Cr CCNGCDATNTCRTTRTCCATRTA ngược Phản ứng PCR được thực hiện trên máy Mxpro- Cây phát sinh loài được xây dựng bằng phần Mx3005P (Stratagene) với chương trình nhiệt bao mềm MEGA phiên bản 6.0 [14]. Các phương pháp gồm 95 ºC trong 5 phút (1 chu kỳ), 40 chu kỳ lặp lại được sử dụng để xây dựng cây phát sinh loài bao với 95 ºC - 30 giây, 55 ºC - 30 giây, 72 ºC - 2 phút và gồm: Neighbor joining (NJ), Maximum parsimony 72 ºC - 5 phút (1 chu kỳ). Thể tích hỗn hợp phản ứng (MP) và Maximum likelyhood (ML) với các thông số là 25 µl bao gồm: 1 × dung dịch đệm PCR, 0,5 µM như sau: cây NJ được dựng với mô hình Tamura ba mỗi mồi, 200 μM dNTP, 2,5 đơn vị enzyme Taq thông số (Tamura’s three-parameter), phân phối DNA polymerase (Fermentas), 3 mM MgCl2. Sản chuẩn gamma, cây MP được dựng với thuật toán phẩm PCR được tiến hành điện di trên gel agarose 1 TBR (Tree bisection and reconnection branch % và được tiến hành giải trình tự tại công ty Nam swapping), cây ML được dựng với thuật toán NNI Khoa. Mồi sử dụng cho phản ứng giải trình tự cũng (Neareast Neighbor interchange) và mô hình tiến hóa chính là các mồi được sử dụng cho phản ứng PCR phù hợp nhất từ kết quả dò tìm bằng phần mềm Mega (Bảng 1), được cung cấp bởi IDT (Intergrated DNA 6.0; giá trị ủng hộ (bootstrap) lặp lại 1000 lần với Technologies, Mỹ). mức đạt ý nghĩa khi giá trị ủng hộ lớn hơn 50. Hiệu chỉnh trình tự, xây dựng cây phát sinh loài KẾT QUẢ - THẢO LUẬN Các trình tự sản phẩm PCR được tiến hành hiệu Kết quả phân tách các sản phẩm PCR khuếch đại chỉnh nhằm loại bỏ các tín hiệu không rõ ràng ở hai các gen mục tiêu trên gel agarose 1 % cho thấy xuất đầu, kiểm tra sự sai lệch giữa kết quả giải trình tự hiện các băng sáng rõ ứng với kích thước như mong bằng mồi xuôi và mồi ngược, so sánh với cơ sở dữ đợi: 1102 và 803 nucleotide, tương ứng lần lượt với liệu GenBank (NCBI). Các phần mềm sử dụng cho các gen nrSSU và rpb1 (dữ liệu không trình bày). Từ bước hiệu chỉnh bao gồm: Seaview phiên bản 4.2.12 đó, việc sử dụng các sản phẩm này để giải trình tự đã [5], Chromas Lite phiên bản 2.1.1 [13], công cụ cho các kết quả giải tốt, hai mạch DNA được giải đều BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) [1]. Bộ cho các đỉnh rõ ràng và có sự trùng khớp giữa hai mẫu được tiến hành đồng nhất trước khi được tiến mạch DNA khi một trong hai mạch được chuyển đổi hành dò tìm mô hình tiến hóa phù hợp nhất theo bằng Seaview, chỉ trừ những đoạn lân cận đầu 3’ của chuẩn Bayesian Information Criterion (BIC) bằng mồi bắt cặp với mạch khuôn (dữ liệu không trình phần mềm MEGA 6.0 [14]. bày). Độ dài trình tự từng gen sau hiệu chỉnh được trình bày trong Bảng 2. Trang 58
5. TAÏP CHÍ PHAÙT TRIEÅN KH&CN, TAÄP 19, SOÁ T1 - 2016 Bảng 2. Kết quả hiệu chỉnh và so sánh trình tự các gen thuộc hai mẫu nấm trên Genbank Kích thước sản Kích thước sản Max Ident Gen/mẫu phẩm PCR (bp) phẩm sau hiệu chỉnh Loài tương tự cao nhất (%) (bp) 38A 833 Isaria tenuipes 99 nrLSU* (AB027380) 950 38B 882 Isaria tenuipes 99 (AB027380) 38A 881 Isaria tenuipes 99 nrSSU (KC242706) 1102 38B 1017 Isaria tenuipes 100 (KC242706) 38A 689 Isaria tenuipes 99 rbp1 (HQ880899) 803 38B 712 Isaria tenuipes 99 (HQ880899) Chú thích : *Trình tự gen nrLSU được tham khảo từ kết quả giải trước đây [6]. Các trình tự đã hiệu chỉnh được kiểm tra độ trình tự (thuộc ba nhóm – clade A, B, C, họ tương tự bằng công cụ BLAST tích hợp trên cơ sở dữ Clavicipitaceae) tương ứng lần lượt cho các gen liệu GenBank. Chúng tôi trích sơ lược một số kết quả nrLSU, nrSSU và rpb1, cùng với Glomerella kiểm tra độ tương tự của các trình tự gen nrLSU, cingulata (Stoneman) Spauld. & H. Schrenk nrSSU và rpb1 của hai mẫu nấm DL0038A và (Glomerellaceae) và Verticillium dahliae Kleb. DL0038B bằng kết quả đồng nhất tối đa (Max ident) (Plectosphaerellaceae) được sử dụng làm nhóm tìm được trên GenBank trong Bảng 2. ngoại [5]. Khối dữ liệu hoàn chỉnh và đồng bộ cho cả Trình tự các gen sau hiệu chỉnh của hai mẫu ba gen được tiến hành dò tìm mô hình tiến hóa tối DL0038A và DL0038B cũng được so sánh với nhau thích ghi nhận các kết quả như sau: theo chuẩn thông và cho kết quả về mức độ giống nhau (identity) đạt 99 tin BIC, mô hình tiến hóa phù hợp nhất cho khối dữ % cho cả ba gen (tính trên độ bao phủ - coverage giữa liệu gen rbp1 là T92 (Tamura-3-parameter)+G+I (với từng cặp trình tự); sự khác biệt 1 % trong trình tự ba các thông số được MEGA 6.0 thông báo cho mô hình gen giữa hai mẫu nấm như sau: 1 khoảng trống (gap) T92+G+I như sau: parameters = 165, BIC (lowest và 3 mismatch (nrLSU), 1 khoảng trống (nrSSU) và 2 score) = 23521,693, lnL = -10888,472, (+I) = 0,34, mismatch (rbp1). (+G) = 0,86, R = 2,69, f(A) = 0,226, f(T) = 0,226, f(G) = 0,274, f(C) = 0,274, r(AT) = 0,030, r(AC) = Khối dữ liệu này được đồng nhất hóa và cân nhắc 0,037, r(AG) = 0,200, r(TA) = 0,030, r(TC) = 0,200, kết quả cẩn thận bằng mắt cho thấy: chiều dài trung r(TG) = 0,037, r(CA) = 0,030, r(CT) = 0,165, r(CG) bình của các nhóm trình tự đạt 695, 851 và 477 bp, = 0,037, r(GA) = 0,165, r(GT) = 0,030, r(GC) = tương ứng lần lượt cho các gen nrLSU, nrSSU và 0,037. rpb1. Cũng qua việc đồng nhất hóa này, dữ liệu trình tự tham chiếu tham khảo từ công trình của Sung và Cây phát sinh chủng loài ML được xuất ra từ mô cộng sự (2007) [12] được chúng tôi lọc và loại bỏ các hình cho kết quả như sau: xét về địa hình học trình tự có độ dài không phù hợp (chứa các khoảng (topology), cây ML này rất tương tự và tương thích trống liên tục được chèn vào ngay giữa hoặc hai đầu với địa hình học của các cây neighbor joining (NJ), trình tự), vì vậy số trình tự tham chiếu là 68, 56 và 80 maximum parsimony (MP) và cây phát sinh loài tham Trang 59
6. Science & Technology Development, Vol 19, No.T1- 2016 khảo từ công bố của Sung và cộng sự (2007) [12] (dữ chiếu của Sung và cộng sự (2007), và đây cũng là liệu trình bày là cây ML của gen rpb1– Hình 3). trình tự tham chiếu thuộc cùng nhóm nghiên cứu Điều này là phù hợp vì các trình tự trong công [11]. Từ các kết quả bước đầu này cho thấy phân tích trình của Sung và cộng sự (2007) [12] được đưa vào phát sinh chủng loài phân tử trên gen rpb1 ủng hộ làm tham chiếu để so sánh với các trình tự trong đề quan điểm định danh dựa trên hình thái: hai mẫu tài này. Trên cây ML này (Hình 3), 80 trình tự tham DL0038A, DL0038B và Isaria tenuipes (DQ522395) chiếu thuộc họ Clavicipitaceae, trong đó 27 trình tự có quan hệ rất gần hoặc chính là các mẫu nấm thuộc đại diện cho nhóm A, 30 trình tự đại diện cho nhóm B cùng loài với thể hữu tính Cordyceps takaomontana, và 20 trình tự đại diện cho nhóm C phân nhóm hoàn có thể vô tính là Isaria tenuipes. toàn hợp lý, so với công bố của Sung và cộng sự Các kết quả phân tích phát sinh chủng loại phân (2007) [12] và so với các trình tự nhóm ngoại (hai tử đơn gen khác sử dụng gen nrSSU đều cho kết quả trình tự thuộc loài Glomerella cingulata và một trình tương tự như đối với gen rbp1, nghĩa là ủng hộ quan tự thuộc loài Verticillium dahliae, là các loài nấm ký điểm định danh dựa trên hình thái: hai mẫu DL0038A sinh trên thực vật). và DL0038B là các mẫu nấm thuộc cùng loài Xét trong sự phân nhóm của nhóm C thuộc họ Cordyceps takaomontana (dữ liệu không trình bày). Clavicipitaceae, trước hết, hai trình tự DL0038A và Đặc biệt, đối với hai gen này, dữ liệu tham chiếu của DL0038B phân thành một nhóm với nhau được ủng Sung và cộng sự (2007) có đại diện thuộc Cordyceps hộ rất mạnh với các giá trị bootstrap lần lượt đạt takaomontana (AB044631/nrSSU và 96/98/96. Đồng thời, hai trình tự rbp1 của hai mẫu AB044637/nrLSU) [5]. Đây cũng chính là các tham nấm DL0038A và B phân thành một nhóm với trình chiếu phân thành đơn nhóm với các trình tự nrLSU và tự thuộc loài Isaria tenuipes (DQ522395) được ủng nrSSU của hai mẫu DL0038A và DL0038B (dữ liệu hộ rất mạnh với giá trị bootstrap đạt tuyệt đối 100 cho không trình bày). cả ba cây NJ/MP/ML (phần được đóng khung trên Để thực hiện phân tích đa gen, từ bộ dữ liệu tham Hình 3), so với các tham chiếu còn lại thuộc nhóm chiếu của Sung và cộng sự (2007) [12] cho từng gen này, bao gồm: các đại diện thuộc chi Cordyceps bao nrLSU, nrSSU và rbp1 thuộc cùng một mẫu nấm, gồm: C. bifusispora, C. militaris, C. scarabaeicola, trước hết chúng tôi tạo bộ dữ liệu trình tự tham chiếu C. tuberculata, đại diện thuộc chi Beauveria: B. của ba gen kết hợp lại và cũng thực hiện sự đồng nhất caledonica, các đại diện thuộc chi Isaria gồm I. hóa bộ mẫu trước khi dò tìm mô hình tiến hóa tối farinosa và I. cf. farinosa, đại diện thuộc chi thích. Độ dài trình tự sau đồng nhất hóa khoảng 1892 Lecanicillium bao gồm: L. tenuipes, L. attenuatum, L. nucleotide. Bộ dữ liệu gồm 45 trình tự này được dò psalliotae, L. fusisporum và L. lecanii, cùng với các tìm mô hình tiến hóa tối thích bằng MEGA 6.0. Kết đại diện thuộc chi Simplicium: S. lamellicola, S. quả cho thấy mô hình T92+G+I là mô hình tối ưu obclavatum, S. lanosoniveum (Hình 3). Isaria nhất, với các thông số được MEGA 6.0 thông báo cho tenuipes chính là thể vô tính (anamorph) của mô hình này như sau: parameters = 91, BIC (lowest Cordyceps takaomontana, theo công bố của Kobayasi score) = 29682,149, lnL = -14324,556, (+I) = 0,39, (1982) [9] và Sung và cộng sự (2007) [12]. Cũng rất (+G) = 0,34, R = 2,49, f(A) = 0,239, f(T) = 0,239, lấy làm tiếc là cho đến thời điểm này, chúng tôi vẫn f(G) = 0,260, f(C) = 0,260, r(AT) = 0,030, r(AC) = chưa tìm thấy trên cơ sở dữ liệu nào, kể cả trong công 0,040, r(AG) = 0,190, r(TA) = 0,030, r(TC) = 0,190, bố của Sung và cộng sự (2007) một trình tự rpb1 nào r(TG) = 0,040, r(CA) = 0,030, r(CT) = 0,170, r(CG) của Cordyceps takaomontana. Vì vậy, tham chiếu ở = 0,040, r(GA) = 0,170, r(GT) = 0,030, r(GC) = thể vô tính Isaria tenuipes cũng chính là tham chiếu 0,040. duy nhất làm đại diện được thêm vào bộ dữ liệu tham Trang 60
7. TAÏP CHÍ PHAÙT TRIEÅN KH&CN, TAÄP 19, SOÁ T1 - 2016 Cây phát sinh chủng loài ML được xuất ra từ mô lượt với các gen nrLSU, nrSSU và rbp1 thuộc mẫu hình này cho kết quả như sau: địa hình học của cây nấm được ký hiệu OSC111007, theo Sparafora và phát sinh chủng loài ML ba gen cũng rất tương tự với cộng sự (2007) [13] được ủng hộ rất mạnh với giá trị các cây NJ và MP cũng như tương thích so với các bootstrap đạt tuyệt đối 100 cho cả ba cây NJ/MP/ML cây đơn gen, và so với công bố của Sung và cộng sự (phần được đóng khung trên Hình 4), so với các tham (2007) [12]: các tham chiếu phân thành ba nhóm A, chiếu còn lại thuộc nhóm này. Như vậy, qua sự phân B, C cùng với nhóm ngoại (Hình 4). tích phát sinh chủng loài kết hợp ba gen, kết quả lại Xét trong sự phân nhóm của nhóm C thuộc họ một lần nữa cho thấy các mẫu nấm DL0038A, Clavicipitaceae, trước hết hai trình tự được ghép từ ba DL0038B và Isaria tenuipes có quan hệ rất gần hoặc gen của hai mẫu nấm DL0038A và DL0038B phân chính là cùng một loài. thành một nhóm với nhau được ủng hộ rất mạnh với Cùng với kết quả định danh dựa trên hình thái, sự các giá trị bootstrap lần lượt đạt 99/98/96 tương ứng hỗ trợ từ phân tích phát sinh chủng loài ở đây, lại một với các cây NJ/MP/ML (phần được đóng khung trên lần nữa ủng hộ quan điểm hai mẫu ký hiệu DL0038A Hình 4). Đồng thời, hai trình tự được ghép từ ba gen và DL0038B được định danh là các đại diện thuộc của hai mẫu nấm DL0038A và B phân thành một loài Cordyceps takaomontana (với thể vô tính là nhóm với trình tự thuộc loài Isaria tenuipes Isaria tenuipes) được sưu tập tại vùng núi Langbian, (DQ518774, DQ522559 và DQ522395 tương ứng lần Lâm Đồng, Việt Nam. Trang 61
8. Science & Technology Development, Vol 19, No.T1- 2016 Hình 3. Mối quan hệ phát sinh chủng loài bằng cây ML sử dụng gen rpb1 của 82 taxa thuộc Clavicipitaceae. Các con số được trình bày trên các nhánh là những giá trị bootstrap, ba giá trị được sắp xếp từ trái sang phải tương ứng với ba giá trị bootstrap lần lượt của các cây NJ, MP và ML. Chỉ những giá trị bootstrap > 50 được trình bày Trang 62
9. TAÏP CHÍ PHAÙT TRIEÅN KH&CN, TAÄP 19, SOÁ T1 - 2016 Hình 4. Mối quan hệ phát sinh chủng loài bằng cây ML sử dụng kết hợp ba gen nrLSU, nrSSU, rpb1 của 45 taxa thuộc Clavicipitaceae. Các con số được trình bày trên các nhánh là những giá trị bootstrap, ba giá trị được sắp xếp từ trái sang phải tương ứng với ba giá trị bootstrap lần lượt của các cây NJ, MP và ML. Chỉ những giá trị bootstrap > 50 được trình bày. KẾT LUẬN Chúng tôi đã áp dụng thành công công cụ phân cho nhóm chúng tôi tiếp tục hoàn thiện công tác định tích phát sinh chủng loài đơn gen hay phân tích đa danh các mẫu nấm này cũng như phát triển tiếp đối gen bao gồm nrSSU, nrLSU và rpb1 nhằm hỗ trợ với các mẫu nấm ký sinh côn trùng khác trong bộ sưu định danh các mẫu nấm ký sinh côn trùng DL0038A tập. và DL008B, thu nhận từ vùng núi Langbian, Lâm Lời cám ơn: Đề tài này được thực hiện nhờ kinh Đồng. Các kết quả phân tích phát sinh chủng loài phí của Sở Khoa học và Công nghệ TP. Hồ Chí Minh, phân tử này đã củng cố thêm kết luận về định danh Chương trình Vườn ươm 2014 – 2015, chủ nhiệm các mẫu nấm là Cordyceps takaomontana với thể vô ThS. Lao Đức Thuận. tính là Isaria tenuipes. Đây cũng là tiền đề hữu ích Trang 63
10. Science & Technology Development, Vol 19, No.T1- 2016 Molecular phylogenetic analysis to support the identification of samples DL0038A & DL0038B belonging to Cordyceps genus Vu Tien Luyen University of Science, VNU-HCM Dinh Minh Hiep Agricultural Hightech Park Truong Binh Nguyen University of Da Lat Lao Duc Thuan Trinh Van Hanh Le Huyen Ai Thuy Ho Chi Minh City Open University ABSTRACT In our previous publication, we have tentatively support the morphological identification of those concluded that our fungal specimen DL0038A and fungi. The results show that we successfully amplified DL0038B are Cordyceps takaomontana. In order to all genes. Sequencing method was then adopted and further support the identification, we continued to proofread before molecular phylogenetic analysis analyse the nrSSU (nuclear ribosomal small subunit) was applied with reference sequences obtained from and rpb1 (largest subunit of RNA polymerase II) the publication of Sung et al. (2007). Once again, this genes, as well as combined analysis the nrLSU analysis strongly supports the DL0038A and (largest subunit of RNA polymerase II) together with DL0038B specimen as Cordyceps takaomontana. nrSSU and rpb2 genes on these specimens in order to Keywords: Cordyceps takaomontana, molecular phylogenetics, nrLSU, nrSSU, rpb1. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. S.F. Altschul, W. Gish, W. Miller, E.W. Myers, thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal D.J. Lipman, Basic local alignment search tool. J Biochem, 162: 156-159 (1987). Mol Biol, 215, 403-10 (1990). [5]. M. Gouy, S. Guindon, O. Gascuel, SeaView [2]. L.A. Castlebury, A.Y. Rossman, G.H. Sung, version 4: a multiplatform graphical user A.S. Hyten, J.W. Spatafora, Multigene interface for sequence alignment and phylogeny reveals new lineage for Stachybotrys phylogenetic tree building. Mol Biol Evol, 27, chartarum, the indoor air fungus. Mycol. Res, 221-224 (2010). 108, 864-872 (2004). [6]. Đ.M. Hiệp, L.Đ. Thuận, V.T. Luyện, T.V. Hạnh, [3]. W.H. Chan, K.H. Ling, S.W. Chiu, P.C. Shaw, L.H.A. Thúy, T.B. Nguyên, Phát hiện loài nấm P. But, Molecular analyses of Cordyceps gunnii ký sinh côn trùng Cordyceps takaomontana tại in China, J. Food & Drug Anal. 19, 18-25 núi Langbian, Lâm Đồng, Việt Nam. Tạp chí (2011). Khoa học Công nghệ, (đang chờ in). [4]. P. Chomczynski, N. Sacchi, Single-step method [7]. Đ.M. Hiệp, T.B. Nguyên, Nghiên cứu nhóm nấm of RNA isolation by acid guanidinium Cordyceps ở Tây Nguyên và khảo sát tiềm năng Trang 64
11. TAÏP CHÍ PHAÙT TRIEÅN KH&CN, TAÄP 19, SOÁ T1 - 2016 ứng dụng của chúng trong y dược. Kỷ yếu Hội [11]. J.W. Spatafora, G.H. Sung, J.M. Sung, N.L. thảo Quốc tế Hợp tác Khoa học Công nghệ & Hywel-Jones, J.F.Jr. White, Phylogenetic Phát triển bền vững Nông nghiệp Lâm Đồng – evidence for an animal pathogen origin of ergot Tây Nguyên, 39 – 40 (2014). and the grass endophytes. Mol Ecol, 16, 1701-11 [8]. D. Johnson, G.H. Sung, N.L. Hywel-Jones, J.J. (2007). Luangsa-Ard, J.F. Bischoff, R. Kepler, J.W. [12]. G.H. Sung, N.L. Hywel-Jones, J.M. Sung, J.J. Spatafora, Systematics and evolution of the Luangsa-Ard, B. Shrestha, J.W. Spataforal, genus Torrubiella (Hypocreales, Ascomycota), Phylogenetic classification of Cordyceps and the Mycological Research, 113, 279-289 (2009). Clavicipitaceous fungi. Stud Mycol, 57, 5 – 59 [9]. Y. Kobayasi, Keys to the taxa of the genera (2007). Cordyceps, Torrubiella. Transactions of the [13]. Technelysium South Brisbane, Chromas Pro Mycological Society of Japan, 23, 329 – 354 version 1.7.4 QLD, Australia 2003-2012. (1982). [14]. K. Tamura, G. Stecher, D. Peterson, A. Filipski [10]. Z.Y. Liu, Y.J. Yao, Z.Q. Liang, A.Y. Liu, D.N. and S. Kumar, MEGA6: Molecular Evolutionary Pegler, M.W, Molecular evidence for the Genetics Analysis Version 6.0. Mol. Biol. Evol. anamorph-teleomorph connection in Cordyceps 30, 2725-2729 (2013). sinensis. Mycol. Res, 105, 7, 827-32 (2001). [15]. R. Vilgalys, B.L. Sun, Ancient and recent patterns of geographic speciation in the oyster mushroom Pleurotus revealed by phylogenetic analysis of ribosomal DNA sequences. PNAS, 91, 4599 – 4603 (1994). Trang 65