Nghiên cứu tác dụng kháng ung thư của chất CT-1 chiết xuất từ cây khổ sâm cho lá trên chuột thiếu hụt miễn dịch

Nội dung text: Nghiên cứu tác dụng kháng ung thư của chất CT-1 chiết xuất từ cây khổ sâm cho lá trên chuột thiếu hụt miễn dịch

1. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2014 NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG KHÁNG UNG THƢ CỦA CHẤT CT-1 CHIẾT XUẤT TỪ CÂY KHỔ SÂM CHO LÁ TRÊN CHUỘT THIẾU HỤT MIỄN DỊCH Trịnh Hồng Anh*; Cao Minh Hưng*; Hồ Anh Sơn ; Nguyễn Lĩnh Toàn Phương Thiện Thương*; Nguyễn Minh Khởi*; Lê Tuấn Anh* TÓM TẮT Với liều 50 mg/kg thể trọng, chất CT-1 chiết xuất từ cây Khổ sâm cho lá có tác dụng dự phòng và điều trị ung thư phổi người tế bào không nhỏ (UTPNTBKN) trên chuột thiếu hụt miễn dịch, thể hiện: - Sau khi ghép tế bào (TB) ung thư, nhóm dự phòng có 20% chuột không xuất hiện khối u, trong khi nhóm chứng và nhóm điều trị 100% xuất hiện khối u. - Kích thước khối u ở nhóm điều trị nhỏ hơn nhóm chứng ở mọi thời điểm theo dõi. - Sau 3 tháng theo dõi, tỷ lệ chuột chết ở nhóm chứng là 100%, nhóm dự phòng 60%, nhóm điều trị 40%. * Từ khóa: Khổ sâm cho lá; Độc tính cấp; Độc tính bán trường diễn. Research about Anticancer of CT-1 Extracted from Croton tonkinensis Gagnep on Nude Mice Summary CT-1 extracted from Croton tonkinensis Gagnep with dose of 50 mg/kg has the effective in prevention and treatment of lung cancer on nude mice: - After cancer cell transplantation, 20% of mice in control group had no tumor, 100% of mice in prevention and treatment groups had tumor. - The volume of tumor in treatment group was smaller than the other groups at any times. - After 3 months: control goup: 100% of nude mice dead, prevention group: 60% of nude mice dead, treatment group: 40% of nude mice dead. * Key words: C. tonkinensis; Acute toxicity; Semi-chronic toxicity. ĐẶT VẤN ĐỀ hữu của Việt Nam được sử dụng làm Cây Khổ sâm cho lá có tên khoa học là thuốc chữa sốt rét, mẩn ngứa, lở loét, Croton tonkinensis Gagnep, thuộc họ Thầu đau bụng đi ngoài (lỵ cấp tính), ăn không dầu (Euphorbiaceae), là một loại cây đặc tiêu, viêm loét tá tràng, đau dạ dày. * Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Học viện Quân y Viện Dược liệu Người phản hồi (Corresponding): Hồ Anh Sơn (hoanhsonhp@gmail.com) Ngày nhận bài: 10/11/2014; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 27/11/2014 Ngày bài báo được đăng: 28/11/2014 19
2. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2014 Các nghiên cứu về thành phần hóa VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP học của cây Khổ sâm cho lá bắt đầu NGHIÊN CỨU khoảng 20 năm trở lại đây cho thấy thành 1. Vật liệu nghiên cứu. phần hóa học chính của lá Khổ sâm cho - Chuột thiếu hụt miễn dịch: 30 con. lá là ent-kauranediterpenoid, điển hình là - TB UTPNTBKN (adenocarcinomic human ent-18-acetoxy-7β-hydroxy kaur-15-oxo- 16-ene (tạm gọi là chất CT-1), có hàm alveolar basal epithelial cells) A549 (Công lượng khoảng 293,05 µg/g [3]. Chất này ty ATCC, Hoa Kỳ). có tác dụng ức chế sự phát triển của - Môi trường nuôi cấy TB ung thư. nhiều dòng TB ung thư trên in vitro, g m - Thước đo kích thước khối u, tủ nuôi thư v MCF-7, ung thư phổi NCI-H460 cấy TB. [6], ung thư gan SK-HEP1 [7], ung thư đại - Chất CT-1 thu được từ quá trình chiết tràng Caco-2 và LS180 trên in vitro [8]. xuất, phân lập từ lá của cây Khổ sâm cho lá. Sử dụng chuột thiếu hụt miễn dịch (gọi 2. Phƣơng pháp nghiên cứu. tắt là chuột nude) là một bước đột phá * Nuôi cấy TB ung thư và tạo khối u trong nghiên cứu ung thư, cho phép trên chuột: nghiên cứu ung thư người trên cơ thể động vật. Chuột nude có một gen bị đột TB UTPNTBKN A549 được nuôi cấy biến đ ng hợp tử (homozygous), gen này trong môi trường Eagle’s minimum essential quy định sự phát triển của lông và tuyến medium, bổ sung fetal bovine serum 10%, ức. Do đó, với gen bị đột biến, chuột nude 1% penicillin và streptomycin (Invitrogen có tuyến ức bị suy giảm chức năng hoặc GmbH, Karlsruhe, CHLB Đức), 1,5 mcg thậm chí không có tuyến ức, không có insulin/ml môi trường. Mỗi chai nuôi cấy 2 6 lông và hệ thống đáp ứng miễn dịch TB bị diện tích 75 cm chứa 10 TB. TB được hạn chế do suy giảm mạnh số lượng TB nuôi cấy tăng sinh và thay môi trường 0 lympho T. Nhờ vậy, khi ghép TB ung thư 2 lần/tuần ở điều kiện nhiệt độ 37 C, CO2 người lên chuột nude, khối u phát triển 5%. Khi TB phát triển đạt 80% diện tích, không bị đào thải do yếu tố miễn dịch của tiến hành cấy chuyển sang chai mới. 7 chuột và khối u mang đặc tính sinh học Tách TB và đếm, thu TB với n ng độ 10 khá tương đ ng với khối ung thư trên cơ TB/ml để phục vụ các thử nghiệm tiếp thể người. theo. Để đánh giá tác dụng kháng ung thư Chuẩn bị TB trước ghép: TB trước khi trên mô hình in vivo, ch ng tôi thực hiện tách được rửa hai lần bằng dung dịch đề tài này nhằm: Đánh giá tác dụng PBS 1X, sau đó tách bằng dung dịch kháng ung thư của chất CT-1 chiết xuất trypsin-EDTA 1X. Dung dịch TB ung thư từ cây Khổ sâm cho lá trên mô hình chuột đã chuẩn bị được h t vào bơm tiêm 1 ml 7 thiếu hụt miễn dịch mang khối ung thư với số lượng 10 /ml. Cố định chuột nude 6 phổi người. và tiêm 0,1 ml vào dưới da đùi phải (10 TB/chuột). Quá trình thao tác thực hiện trong điều kiện vô trùng tuyệt đối. 20
3. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2014 * Đánh giá hiệu quả dự phòng và điều + Kích thước khối u: đo theo 2 kích trị ung thư của CT-1: thước dài x rộng bằng thước chính xác - Phân nhóm: 30 chuột nude, phân NSK (Nhật Bản) 01 lần/tuần. Kích thước 2 thành 3 nhóm: u được tính theo công thức: V = D x R x 0,5 (Yamaura và CS, 2000), trong đó: V: + Nhóm dự phòng: 10 con, uống CT-1 thể tích khối u; D: chiều dài khối u; R: với liều 50 mg/kg cân nặng/ngày, trong 2 chiều rộng khối u. tuần liên tục trước khi ghép TB tạo khối ung thư. Quá trình đánh giá kích thước khối u + Nhóm điều trị: 10 con, uống CT-1 với dừng lại khi có chuột chết ở bất kỳ nhóm liều 50 mg/kg cân nặng/ngày, trong 2 tuần nào, những con khác vẫn được theo dõi liên tục sau khi có khối ung thư. để xác định thời gian sống thêm. + Nhóm chứng: 10 con, uống nước cất + Thời gian sống của các nhóm: thời với thể tích 0,1 ml/10 g cân nặng/ngày, gian sống của chuột được tính từ sau khi trong 2 tuần liên tục sau khi có khối ung thư. ghép TB ung thư. Quá trình theo dõi thời gian sống của mỗi nhóm chuột dừng lại khi - Sau khi ghép TB, xuất hiện khối u, toàn bộ chuột của nhóm chứng đều chết. phân riêng chuột nhóm dự phòng, những chuột còn lại được chia ngẫu nhiên thành - Các chỉ tiêu đánh giá: 2 nhóm điều trị và nhóm chứng và bắt + Tỷ lệ xuất hiện khối u. đầu cho uống thuốc. + Kích thước khối u trung bình của các - Đánh giá theo dõi sự phát triển khối u nhóm. tại vị trí tiêm (đùi phải) 2 lần/tuần bằng + Tỷ lệ chết sau theo dõi. quan sát, sờ nắn và đo kích thước bằng thước chính xác NSK. KÕt qu¶ nghiªn cøu vµ bµn luËn 1. Tác dụng dự phòng ung thƣ của CT-1. 120% 100% 100% 100% 80% 80% 60% 40% 20% 0% Nhóm dự phòng Nhóm chứng Nhóm điều trị Biểu đồ 1: Tỷ lệ xuất hiện khối u sau ghép TB ung thư ở các nhóm (n = 10). 21
4. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2014 Cho chuột thiếu hụt miễn dịch uống chứng. Điều đó chứng tỏ, chất CT-1 chất CT-1 với liều 50 mg/kg/ngày trong không chỉ có tác dụng dự phòng ung thư 2 tuần liên tục, sau đó ghép 106 TB phổi mà còn có tác dụng ức chế sự phát A549/con. Trong số 10 chuột nhóm này, 8 triển của TB ung thư phổi trên chuột thiếu chuột phát triển khối u, 2 chuột (20%) hụt miễn dịch. không phát triển khối u (sau 2 tuần ghép - Hình ảnh đại thể: TB). Đối với nhóm chứng và nhóm điều trị, 100% chuột đều có khối u phát triển. Điều đó cho thấy chất CT-1 có thể có tác dụng dự phòng ung th• phæi. 2. Tác dụng của CT-1 lên kích thƣớc khối u. Nhóm chứng Biểu đồ 2: Kết quả theo dõi thể tích khối u qua các thời điểm nghiên cứu. Chuột sau khi hình thành khối u (ở ngày Nhóm dự phòng thứ 7), kích thước khối u ở 3 nhóm tương đương nhau. Tiếp tục theo dõi kích thước khối u ch ng tôi nhận thấy: nhóm điều trị bằng CT-1 có tác dụng cải thiện rõ rệt trong kìm hãm tốc độ phát triển của khối u, thể hiện kích thước khối u của nhóm điều trị luôn nhỏ hơn nhóm chứng và nhóm dự phòng ở mọi thời điểm theo Nhóm điều trị dõi. Nhóm dự phòng, kích thước khối u Ảnh 1: Hình ảnh khối u của 3 nhóm tại thời có xu hướng nhỏ hơn, tuy nhiên chưa điểm bắt đầu theo dõi. có sự khác biệt đáng kể so với nhóm 22
5. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2014 Khối u của các nhóm tại thời điểm bắt 3. Thời gian sống dƣ của chuột sau đầu theo dõi có kích thước tương đ ng. ghép TB ung thƣ. Khối u của nhóm chuột được phân ngẫu Thời gian sống dư của các nhóm: thời nhiên, có kích thước trung bình khoảng 70 gian sống dư của chuột tạm được coi từ 3 mm . Khối u có bờ rõ, cứng chắc, ít di sau khi ghép TB ung thư. Trong suốt thời động. Da phía trên không thay đổi màu sắc. gian này, ngoài việc đo kích thước khối u, ch ng tôi còn theo dõi các biểu hiện bất thường khác như liệt, chết. Quá trình theo dõi thời gian sống dư của mỗi nhóm chuột dừng lại khi toàn bộ chuột của nhóm chứng đều chết. Nhóm chứng Biểu đồ 3: Biểu diễn thời gian sống của các nhóm chuột. Sau 3 tháng, toàn bộ chuột ở nhóm Nhóm dự phòng chứng chết, thống kê thời gian sống dư của từng nhóm, so sánh tỷ lệ chuột chết. Nhóm điều trị còn 60% chuột sống (6 con), nhóm dự phòng còn 40% (4 con, trong đó 2 con không mọc u). Như vậy, chất CT-1 có tác dụng kéo dài thời gian sống dư đối với chuột nude mang khối ung thư phổi người. KẾT LUẬN Nhóm điều trị Đánh giá tác dụng của chất CT-1 chiết Ảnh 2: Hình ảnh khối u của các nhóm tại xuất từ cây Khổ sâm cho lá trên chuột thiếu thời điểm 35 ngày sau điều trị. hụt miễn dịch mang khối ung th• phæi người Sau 35 ngày điều trị, kích thước khối u ch ng tôi nhận thấy: khác biệt đáng kể giữa các nhóm. 23
6. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2014 Với liều 50 mg/kg thể trọng, chất CT-1 4. Phương Thiện Thương, Đào Trọng Tuấn, bước đầu cho thấy có tác dụng dự phòng Phạm Thị Hồng Minh, Nguyễn Thị Bích Thu, và điều trị ung thư phổi không biệt hóa TB Nguyễn Minh Khởi. Tổng quan các nghiên cứu nhỏ, thể hiện: về thành phần hóa học và tác dụng sinh học của cây Khổ sâm cho lá. Hà Nội. 2014. - Nhóm dự phòng có 20% chuột không 5. Phan Minh Giang, Phan Tong Son, xuất hiện khối u, trong khi nhóm chứng và Hamada Y, Otsuka H. Cytotoxic Diterpenoids nhóm điều trị 100% đều xuất hiện khối u. from Vietnamese medicinal plant Croton - Kích thước khối u ở nhóm điều trị nhỏ tonkinensis Gagnep. Chem Pharm Bull. 2005, hơn nhóm chứng ở mọi thời điểm theo dõi. 53 (3), pp.296-300. - Sau 3 tháng theo dõi, tỷ lệ chuột chết 6. Phan Minh Giang, Phan Tong Son, Lee JJ, ở nhóm chứng là 100%, nhóm dự phòng Otsuka H. Four ent-kaurane-type diterpenoids 60%, nhóm điều trị 40%. from Croton tonkinensis Gagnep. Chem Pharm Bull. 2004, 52, pp.879-882. TÀI LIỆU THAM KHẢO 7. ATCC. dvancedCatalogSearch/ProductDetails/tabid/452/ 1. Nguyễn Đình Bảng, Hồ Anh Sơn, Default.aspx?ATCCNum=30-500K&Template= Nguyễn Lĩnh Toàn. Nghiên cứu tạo khối ung bioproducts. thư tuyến tiền liệt người trên chuột nude 8. ATCC. “nude mice” bằng kỹ thuật ghép dị loài. Tạp chí CatalogSearch/ProductDetails/tabid/452/Default Y - Dược học Quân sự. 2011, 2. .aspx?ATCCNum=HTB- 2. Phan Minh Giang, Phan Tống Sơn. Xác 22&Template=cellBiology. định hoạt chất ent-kauranditerpenoid trong cây 9. Nguyen Minh Khoi, Phuong Thien Thuong, Khổ sâm cho lá (Croton tonkinensis Gagnep., Saho Ohta, Shinichiro Shiota, Hironori Kanta, Euphorbiaceae) bằng sắc ký lỏng hiệu năng Kenji Takeuchi, Fumiaki Ito. An ent-kauran cao. Tạp chí Dược học. 2011, 8, tr.29-33. diterpenoid from Croton tonkinensis Induce 3. Phan Minh Giang, Phan Tống Sơn. Hoạt Apoptosis in Colorectal cancer cell through the tính gây độc TB của các ent-kauranditerpenoid từ phosphorylation of JNK mediated by reactive cây thuốc Khổ sâm cho lá (Croton tonkinensis oxygen species and dual - specificity JNK Gagnep., Euphorbiaceae). Tạp chí Dược học. kinase MKK4. Anticancer Agent in Medicinal 2011, 419, tr.24-27. Chemistry. 2014, 14, pp.1051-1061. 24