Một số ứng dụng trong Nông - Sinh - Y học

Nội dung text: Một số ứng dụng trong Nông - Sinh - Y học

1. MỘT SỐ ỨNG DỤNG TRONG NÔNG –SINH- Y HỌC 437
2. 1. Điện di (Electrophoresis) a) Nguyên lý: Dựa trên những tính chất hóa lý của biopolymer như sau:  Có phân tử lượng khác nhau  Mang điện tích nhất định đặc trưng.  Khi pH của môi trường thay đổi thì điện tích nầy cũng thay đổi theo. 438
3. Sự thay đổi nầy của các biopolymer khác nhau không như nhau . Do đó có thể chọn pH thích hợp để điện tích của biopolymer cần tách có điện tích khác nhau nhiều nhất. Dưới tác động của điện trường chúng sẽ chuyển động trên các giá (giấy hoặc gel) Vận tốc nầy không những tùy thuộc vào điện tích mà còn vào kích thước biopolymer và mao quản (capillar) của giá. Kết quả chúng sẽ được phân đoạn theo loại trên giá 439
4. b) Các loại điện di:  Macroelectrophoresis: - Điện di trên giấy (paper Electrophoresis) - Điện di trên thạch (Gel Electrophoresis) Mô phỏng quá trình điện di như sau: (Demo 1: Electrophoresis ) Standar # 1 beta-Galactosidase Standar # 2 Ovalbumin Standar # 3 Carbonic Anhydrasae Standar # 4 Troise Phophate Isomerase Standar # 5 Myoglobin 440 Standar # 6 Lysozyme
5. Unknown# 1 Aconitase 82512 Unknown# 2 Conconavalin A 25556 Unknown# 3 Glucose Oxydase 63058 Unknown# 4 Neuraminidase 43505 Unknown# 5 Phosphorylase b 26527 Unknown# 6 Pyruvate Kinase 56773 Unknown# 7 Ribonuclease A 13673 Unknown# 8 Chymotrypsinogen 23564 Unknown# 9 p-Hydroxybensoate43939 Unknown# 10 Ribonuclease H 16638 441
6. Thí dụ về tách các protein khác nhau: Thường sử dụng SDS-PAGE : (SDS: Sodium Dodecyl Sulfate ) (PAGE : PolyAcrylamide Gel Electrophoresis) Phương pháp nầy gồm 2 phần: SDS và PAGE - Phần SDS Nhiệm vụ của phần nầy là phá vỡ (denaturation) các cấu trúc từ bậc 2 trở lên của Protein 442
7. Trước khi phá vỡ cấu trúc,các nhóm kỵ nước giấu vào trong, nhóm háo nước hướng ra ngoài Sau khi SDS thì Protein chỉ còn cấu trúc bậc nhất Chúng đều tích điện âm 443
8. - Phần PAGE Polymer hóa Acrylamide thành Gel Các lỗ có đường kính khác nhau 444
9. Dưới tác độâng của diện trường, các Protein chuyển về Anod Tuy nhiên do kích thước khác nhau nên tốc độ dịch chuyển của chúng cũng khác nhau445
10. Kết quả chúng sẽ bị tách theo phân tử lượng của chúng 446
11. Thí dụ về điện di AND: (demo:gel electrophoresis) 447
12.  Microelectrophoresis: Simple microelectrophoresis: Cơ chế cũng dựa trên hiện tượng điện di (electrophoresis) Không đòi hỏi nhiều chất nghiên cứu Capillary electrophoresis Sự dụng đồng thời hai cơ chế hóa lý : Điện di (electrophoresis) và điện thẩm (electroosmosis) Ghi nhận cùng lúc các phân đoạn của nhiều mẫu mà không cần chờ đến khi thí nghiệm kết thúc. 450 Chỉ cần 1 lượng nhỏ chất nghiên cứu (
13. Capillary có :Þ 20-70 µm, dài 0,5-1m Điện thế : 20-30 kV 451
14. Bộ phận cảm ứng (Detector) nằm gần phía Anode Nó đa dạng: UV, fluorecence, electrochemistry . . . Nó ghi nhận các phân đọan ngay trong lúc điện di 452
15. Máy Capillary Electrophoresis thường có 46-96 Capilary Số lượng giếng tương ứng với số Capilary để chứa dung dịch nghiên cứu 453
16. P/ACE MDQ 454
17. Paragon CZE®2000 460
18.  Immunoelectrophoresis (Điện di miễn dịch ) (Còn có tên gọi Immunoglobulin Electrophoresis) Là sự kết hợp 2 kỹ thuật: điện di và miễn dịch để xác định kháng nguyên (Antigen) có trong hổn hợp có chứa các kháng nguyên. A ntibodies được dùng được gọi là Antiserum Antiserum là huyết thanh máu có chứa một loại Antibody (monovalent) hoặc nhiều antibody (polyvalent) chuyên biệt của từng Antigen 461
19. Antibodies trong Immunoglobulin Electrophoresis có các loại chủ yếu sau: - Immunoglobulin M (IgM), - Immunoglobulin G (IgG), - Immunoglobulin A (IgA ) - Immunoglobulin D (IgD ) - Immunoglobulin E (IgE ) Và một số khác 462
20. Giá điện di miễn dịch có thể làm từ những nguyên liệu khác nhau, nhưng thường dùng là: - Agar - Acrylamide, Polyacrylamide. Trong giá điện di do các chất trên tạo nên sẽ có rất nhiều mao quản. Nồng độ cơ chất càng cao thì đường kính các mao quản càng nhỏ và ngược lại. Kích thước mao quản là một trong các yếu tố tạo nên sự phân đoạn của Antigen khi điện di. 463
21. Một số kiểu điện di miễn dịch thông dụng: a)Immunoelectrophoresis (IEP): Nó gồm có 2 bước:  Các Antigen được tách theo loại bằng điện di  Được nhận diện bằng các Antibody tương thích 464
22. b) Counterimmunoelectrophoresis (CIP): Kiểu nầy được sử dụng trong trường hợp Antigen và Antibody tích điện trái dấu nhau, hoặc chọn dung dịch đệm sao cho Antibody không tích điện Antigen được rót vào rãnh (hoặc giếng) ở đầu giá điện di còn Antibody được rót vào đầu đối diện Khi gặp nhau trên đường đi chúng sẽ liên kết Ag/Ab tạo nên các vạch tại các vùng xác định 465
23. Trong trường hợp cả 2 đều mang điện tích trái dấu thì sự di chuyển của chúng do Electrophoresis Trong trường hợp Antibody không mang điện thì nó chuyển dời do điện thẩm (electroosmosis), còn Antigen do điện di (electrophoresis) 466
24. 2. Sắc ký ( Chromatography) Là kỹ thuật dùng để tách một hổn hợp các chất hóa học ra từng thành phần riêng lẻ. Nó có thể phân tách được hai chất có sự khác biệt nhau rất nhỏ Một hệ sắc ký bao gồm có 2 pha : - Pha động ( Mobile phase) dùng hòa tan hổn hợp các chất cần phân tách - Pha tĩnh( Stationary phase ) làm thành giá sắc ký 467
25. Các phân tử trong mẫu thử của pha động sẽ bị pha tĩnh làm chậm lại bỡi các tác nhân khác nhau Dựa vào đó mà sắc ký mang những tên sau: - Sắc ký hấp phụ (Adsorption Chromatography ) 468
26. - Sắc ký lớp mỏng (Partition Chromatograph y - Sắc ký trao đổi ion (Ion Exchange Chromatograph y 469
27. Sắc ký chon lọc (Molecular Exclusion Chromatograph y Sắc ký tương tác (Affinity Chromatograph y 470
28. Trong điều kiện cân bằng : Amobile Astationary noàng ñoä chaát tan trong pha tónh K noàng ñoä chaát tan trong pha ñoäng Hằng số cân bằng K gọi là hệ số phân chia (Partition coeffcient) Trong pha động nhất định, mỗi chất tan có một hệ số K của mình Hệ số K càng lớn thì các chất tan càng đi chậm trên giá sắc ký 471
29. Dựa vào thiết bị : Sắc ký giấy Sắc ký màng mỏng Sắt ký cột v.v Hiện nay sắc ký cột được sử dụng phổ biến trong phân tích sinh học, hóa học . . . Cột được làm bằng thủy tinh hoặc kim loại bền với các tác nhân hóa học và chịu đươc áp suất. Pha tĩnh sẽ được đóng gói trong cột và pha động sẽ đi qua đó 472
30. Lấy trường hợp cột cephadex làm thí dụ: 473
31. 3. ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbant Assay) Là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ chế miễn dịch (immunology) để xác định sự có mặt của kháng nguyên hoặc kháng thể trong mẫu thử. Nó dùng 2 kháng thể: * Kháng thể bậc nhất (First Antibody) chuyên biệt cho kháng nguyên tương ứng * Kháng thể bậc hai (Secodary Antibody) đã 475 được liên kết với Enzyme
32. Xéùt nghiệm ELISA được tiến hành trong những khai làm bằng nhựa PVC. Khai có 48 hoặc 96 giếng với đường kính khoảng 0.7 cm sâu khoảng 1 cm xếp thành 8 hàng 476
33. Có 2 loại ELISA: + ELISA cạnh tranh (Competitive ) 477
34. + ELISA xếp lớp (Sandwich): Trong phương pháp nầy cần có 2 kháng thể và chất tạo màu. Kháng thể sơ cấp (First Antibody) chuyên biệt cho kháng nguyên cần khảo sát Kháng thể thứ cấp (Secondary Antibody) có gắn Enzyme Cơ chất tạo màu khi gặp enzyme được gắn với kháng thể 478thứ cấp
35. Cho thêm các chất chỉ thị màu Demo : ELISA 480
36. MỘT SỐ ỨNG DỤNG PHÓNG XẠ 1. Chẩn đoán Dùng các chất được đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ Nguyên tắc của phương pháp nầy là thay thế nguyên tử đồng vị bền của một phân tử hoặc hợp chất bằng nguyên tử đồng vị phóng xạ của nó. Nó có ưu điểm: • Ghi nhận được trong trường hợp hàm lượng vô cùng nhỏ • Theo dõi được động học của một quá trình nào đó 481
37. Tuy nhiên nó cũng có những hạn chế : - Trang thiết bị kỹ thuật cao - Bảo đảm an toàn phóng xạ - Khắc phục hiệu ứng phụ do sự chiếu trong của phóng xạ Chúng ta làm quen với một số ứng dụng phổ biến của phương pháp nầy: 482
38. 1. Phóng xạ tự chụp ( Radioautography ): Dựa vào tính chất tác dụng lên Halide bạc trên giấy ảnh X-quang của tia  hoặc hạt ß. Tạo được hình ảnh phân bố của những phân tử, những cấu trúc . . .trong tế bào, cơ thể sinh vật. Mức độ đậm nhạt trên ảnh tùy thuộc mật độ của đồng vị trong mẫu. Vì độ dầy của mẫu rất nhỏ nên phải dùng các loại tia có năng lựợng thấp ( tia mềm ). 483
39. Đồng vị thường dùng trong autoradiogram <> 484
40. Demo:Autoradiograph y Thí dụ mẫu về sự tích tụ 14C của Chloroform ở gan và thận chuột sau khi ngâm 10 phút. 485
41. 1. RIA (Radioimmunoassay) Là kỹ thuật phân tích kết hợp giữa phương pháp thử nghiệm miễn dịch với phóng xạ đánh dấu Giúp xác định hàm lượng rất nhỏ của chất nghiên cứu (đóng vai trò của antigen). Các kháng nguyên (antigen) được đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ- Radioactive antigen 486
42. Trong môi trường có những kháng thể sơ cấp (First Antibody). Các kháng thể nầy sẽ được các kháng nguyên đánh dấu gắn vào 487
43. Cho thêm antigen không có gắn đồng vị vào mẫu Do sự cạnh tranh (Compatitive) một số antigen-phóng xạ bị đẩy ra khỏi liên kết 488
44. Bổ sung kháng thể thứ cấp (Secondary antibody) để tách antigen tự do ra khỏi antigen liên kết 489
45. Phức hợp antibody-antibody có khối lượng lớn sẽ được tách ra khỏi dung dịch mẫu 490
46. Tỉ số họat độ phóng xạ của antigen tự do trong dung dịch và antigen liên kết trong kết tủa tương quan với nồng độ antigen-không phóng xạ. Do đó có thể dựng đồ thị chuẩn về tỉ số họat độ theo nồng độ đã biết của antigen–không Dựpha óvngàoxạđây. để xác định nồng độ antigen- không phóng xạ491
47. 2. Xác định tuổi thọ cổ sinh vật Cơ sở của phương pháp nầy dựa trên mối tương quan giữa sự phân rã và thời gian theo biểu thức sau λt N t N0e • Nt – Số lượng nguyên tử ở thời điểm t • N0 - Số lượng nguyên tử ở thời điểm khởi đầu λ - Hằng số phân rã 492
48. Đồng vị phóng xạ được chọn để làm tiêu chí đánh giá là 14C với thời gian bán phân rã khoảng 5730 năm Thông qua quang hợp 14C đi vào cơ thể động thực vật. Tỉ lệ hàm lượng Carbon phóng xa trong khí quyển hầu như không thay đổi trong hàng triệu năm qua. Do đó tỉ lệ hàm lượng 14C trong cơ thể sinh vật cũng ổn định 493
49. Sau khi chết cơ thể sẽ không còn có sự trao đổi 14C với môi trường mà chỉ còn sự phân rã. Họat độ phóng xạ trong cơ thể suy giảm theo biểu thức sau: λt A t A0e A t e λ t A0 • A0 – Hoạt độ 14 C của cơ thể sinh vật lúc còn sống khoảng 0.25 Bq/gr • At - Hoạt độ 14 C của xác cơ thể sinh vật sau khi đã chết với thời gian t •  - Hằng số phân rã của 14C bằng 0.000121 494
50. Giả sử mẫu xác cổ sinh vật có hoạt đô khoảng 0.05 Bq/gr Vậy tuổi của mẫu sẽ là 0.05 ln -1.60943791 0.000121t 0.25 1.60943791 t 13305. naêm 0.000121 495
51. 3. Đánh giá khối lượng : Thí dụ: cần xác định khối lượng máu trong cơ thể . Đưa vào cơ thể một lượng máu với hồng cầu đã được đánh dấu bằng sắt đồng vị phóng xạ làm cho cơ thể có hoạt độ phóng xạ là A . 0 A A 0 s A* - Số lượng đồng vị phóng xạ 496
52. Sau khi sự pha loãng trong cơ thể hoàn tất, ta có hoạt độ phóng xạ là Acuối A Acuoáâi (S s) Tỉ số họat độ phóng xạ trước và sau khi pha loãng như sau A (S s) 0 Acuoái s Vậy thể tích của máu sẽ bằng: s(A A ) S 0 cuoái A cuoái 497