›
›

Một số phản ứng sinh hóa định danh vi sinh vật

pdf 66 trang phuongnguyen 4620
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Một số phản ứng sinh hóa định danh vi sinh vật", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfmot_so_phan_ung_sinh_hoa_dinh_danh_vi_sinh_vat.pdf

Nội dung text: Một số phản ứng sinh hóa định danh vi sinh vật

  1. MỘT SỐ PHẢN ỨNG SINH HÓA ĐỊNH DANH VI SINH VẬT
  2. Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4 MỘT SỐ PHẢN ỨNG SINH HÓA ĐỊNH DANH VI SINH VẬT 1. Thử nghiệm khả năng chuyển hóa citrate Nguyên tắc: Xác định vi sinh vật có khả năng sử dụng citrat là nguồn hydratcarbon duy nhất. Sản phẩm chuyển hóa làm kiềm hóa môi trường và thay đổi màu của chỉ thị màu – Cấy vi khuẩn vào môi trường Citrat Simmons, ủ 35 – 37oC/24 h – Phản ứng dương tính: màu xanh nước biển – Phản ứng âm tính: môi trường không đổi màu • E. coli • Enterobacter aerogenes • Dương tính: môi trường đổi màu xanh lá cây sang xanh nước biển • Âm tính: không đổi màu 2. Thử nghiệm Catalase Nguyên tắc: Phát hiện men catalase chuyển hóa năng lượng theo phương thức hô hấp với oxy là chất nhận điện tử cuối cùng ở các vi khuẩn hiếu khí và kỵ khí tùy ý - Lấy một ít vi khuẩn vào que cấy và nhúng vào giọt H2O2 . Phản ứng (+): có bọt khí xuất hiện Phản ứng âm tính (-): không có bọt khí xuất hiện - Không nên sử dụng vi khuẩn cấy trên thạch máu vì dễ dương tính giả 3. Thử nghiệm Oxydase Nguyên tắc: Phát hiện khả năng sinh enzym cytochrome c oxidase của vi khuẩn - Pseudomonas aeruginosa , Neisseria gonorrhoeae và Campylobacter jejuni là những vi khuẩn gây bệnh có Oxydase (+) - Lấy một ít chủng vi khuẩn nuôi cấy thuần bôi lên một tờ giấy lọc. Nhỏ thuốc thử(N,N,N',N'-tetramethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride) - Phản ứng dương tính: có màu tím. Đọc kết quả trong vòng 10 giây đầu • Phản ứng Oxydase sử dụng thuốc thử (N,N,N',N'-tetramethyl-p- phenylenediamine dihydrochloride) • Phản ứng dương tính: có màu tím. • Phản ứng xuất hiện trong vòng 10 giây đầu. 1
  3. Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4 4. Thử nghiệm phân giải Ure Nguyên tắc: phát hiện enzym urease phân giải urea thành ammonia và carbondioxide. Ammonia sinh ra làm kiềm hóa môi trường. – Là phản ứng đặc trưng cho các loài Proteus. – Cấy vi khuẩn vào canh thang Ure. Ủ 37oC/24 – 48 h – Phản ứng dương tính: môi trường có màu tím đỏ. Phản ứng âm tính: không chuyển màu • Dương tính: môi trường chuyển thành màu tím • Âm tính: không màu 5. Thử nghiệm Coagulase (đông huyết tương) Nguyên tắc: Phát hiện sự có mặt của men Coagulase bằng phản ứng đông huyết tương thỏ – Là phản ứng phân biệt tụ cầu gây bệnh và không gây bệnh – Cho vào ống nghiệm 0,5 ml huyết tương thỏ và 0,5 ml dịch cấy vi khuẩn. Ủ ấm 37oC/4-24h – Phản ứng dương tính: xuất hiện khối đông tụ. Nếu sau 24h không thấy xuất hiện khối đông tụ: phản ứng âm tính. Dương tính: hình thành khối đông huyết tương 6. Thử nghiệm sinh Idol Nguyên tắc: phát hiện các vi sinh vật có enzym tryptophanase chuyển hóa trypton tạo thành indol - Cấy vi khuẩn vào nước trypton, ủ 37oC/24 h - Nhỏ vài giọt thuốc thử Kovacs, phản ứng dương tính: có vòng màu đỏ cánh sen nổi lên trên (do Indol kết hợp với p-dimethylaminobenzal dehyde trong thuốc thử Kovacs), nếu không có màu hoặc màu vàng: phản ứng âm tính - Với các chủng sinh Indol chậm: thử sau 48 h – Dương tính: màu đỏ cánh sen – Âm tính: màu vàng 7. Thử nghiệm MR Nguyên tắc: phát hiện các vi khuẩn lên men glucose tạo sản phẩm acid bền. - VK có phản ứng MR dương tính: pH môi trường ngày càng giảm 2
  4. Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4 - VK có phản ứng MR âm tính: pH môi trường tăng dần (các sản phẩm có tính acid tạo thành lại chuyển hóa tạo thành các sản phẩm trung tính) - Cấy vi khuẩn vào canh thang MR-VP. Ủ 37oC từ 2-5 ngày - Nhỏ vài giọt đỏ methyl 0,02%, đọc kết quả ngay. Phản ứng (+) có màu đỏ, âm tính màu vàng 8. Thử nghiệm VP Nguyên tắc: phát hiện các vi khuẩn có hai loại enzym chuyển hóa 2,3 butanediol thành acetoin khi có ô xy và chuyển hóa tiếp acetoin thành diacetyl – Diacetyl kết hợp với guanidin trong pepton tạo phức diacetyl – guanidin có màu đỏ – Cấy vi khuẩn vào môi trường MR – VP. Ủ 37oC/24 – 48 h – Nhỏ 6 giọt thuốc thử A (5% α naphtol) và 2 giọt thuốc thử B( KOH 40%). Lắc nhẹ – Đọc kết quả sau 20 phút, chậm nhất là 4 h – Phản ứng (+): có màu đỏ trên mặt môi trường 9. Thử nghiệm lên men đường Nguyên tắc:Vi khuẩn có khả năng lên men đường sẽ làm giảm pH dẫn đến thay đổi màu của môi trường * PHƯƠNG PHÁP MPN: - Định lượng các vi khuẩn có khả năng lên men đường lactose sinh hơi - Cấy vi khuẩn trong môi trường lỏng chọn lọc có ống Durham. Ủ 37oC/24 – 48 h - Vi khuẩn lên men đường lactose sinh hơi sẽ làm thay đổi màu môi trường và có bóng hơi trong ống Durham * Thử khả năng lên men đường A. Lactose broth • Escherichia coli • Proteus vulgaris • Phản ứng dương tính: màu vàng, sinh hoặc không sinh hơi • Phản ứng âm tính: không đổi màu • Sinh hơi hình thành bóng hơi trong ống durham 3
  5. Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4 * LÊN MEN ĐƯỜNG, SINH H2S (TSI) • Gồm ba đường: Lactose, succrose, glucose • Cấy hai bước - Đầu tiên cấy trên mặt nghiêng - Thứ hai: cấy đâm sâu vào chân thạch. Ủ 37oC/24h • Nếu chỉ lên men Glucose. - Một lượng nhỏ glucose trong môi trường lên men trong giờ đầu nuôi cấy. - Sau đó, vi khuẩn lấy năng lượng trong quá trình oxy hóa peptone phần thạch nghiêng có màu đỏ (hiện tượng kiềm hóa môi trường) - Peptone ở phần chân thạch không được sử dụng vì không có O2 phần chân vẫn giữ nguyên màu vàng * LÊN MEN ĐƯỜNG TRÊN TSI • Nếu lên men cả glucose, sucrose và/hoặc lactose - Từ 18 – 24h, toàn bộ phần chân và mặt nghiêng thạch có màu vàng - Sau 24 h: kiềm hóa môi trường do vi khuẩn sử dụng pepton, môi trường chuyển màu đỏ (chỉ ở phần mặt nghiêng vì pepton chuyển hóa trong điều kiện hiếu khí. - Nếu lên men sinh hơi sẽ thấy các bọt khí hoặc nứt thạch - Phân giải sodium thiosulfate thành hydrogen sulfide: phần chân thạch có màu đen (H2S +) 10. Thử nghiệm khử nitrat Nguyên tắc: Phát hiện enzym nitratase xúc tác khử nitrat thành nitrit và ni tơ phân tử - Một số vi khuẩn có khả năng khử NO3 thành NO2 và các hợp chất chứa Nitơ khác như amonia (NH3) và khí Nitơ (N2) NO3 > NO2 > NH3 or N2 - Nuôi cấy vi khuẩn trong canh thang nitrat,ủ ở 370 C/24h. Sau đó nhỏ thuốc thử có chứa alpha-napthylamine và sulfanilic acid . Hai hợp chất này kết hợp với nitrit để tạo thành HC có màu đỏ (phản ứng dương tính). * Tuy nhiên, nếu sản phẩm phân giải là amoniac và khí nitơ, ống thử nghiệm sẽ không chuyển màu nhưng vẫn được báo cáo là phản ứng nitrat dương tính. Trường hợp này cần tiến hành tiếp bước sau: 4
  6. Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4 - Cho thêm một ít bột kẽm vào ống thử, kẽm sẽ chuyển hóa nitrat thành nitrit và ống thử sẽ có màu đỏ. Như vậy, kết luận phản ứng âm tính - Nếu ống thử không chuyển màu, phản ứng dương tính (vi khuẩn đã chuyển hóa hết nitrat có trong môi trường) 11. Thử nghiệm phân giải hồng cầu (tan máu) - Một số vi khuẩn có khả năng phân giải hồng cầu có thể quan sát thấy trên thạch máu.Vùng tan máu được hình thành xung quanh khuẩn lạc. Có ba dạng tan máu: Tan máu (ß): vùng trong suốt xung quanh khuẩn lạc Tan máu (α): vùng xám xanh xung quanh khuẩn lạc Tan máu (γ): không có vùng tan máu 12. Thử nghiệm khả năng di động Nguyên tắc: phát hiện khả năng di của vi khuẩn nhờ có roi ở đầu tế bào. – Có thể thử khả năng di động bằng cách cấy đâm sâu trong thạch mềm, khoảng 2/3 độ dài thạch. Ủ 37oC từ 18-24h – Phản ứng dương tính: Vi khuẩn có thể di động xung quanh đường cấy, xoắn ốc hoặc làm đục toàn bộ ống thạch 13. Thử nghiệm hóa lỏng gelatin Nguyên tắc: phát hiện vi khuẩn có men gelatinase phân giải và hóa lỏng gelatin, quan sát thấy ngay cả khi nhiệt độ thấp hơn 28oC • Có hai phương pháp xác định sự có mặt của men gelatinase - Cấy vi khuẩn vào thạch dinh dưỡng gelatin, ủ nhiệt độ phòng trong 14 ngày • Phương pháp gelatin Strip - Sử dụng dải màu có phủ gelatin. Nếu phản ứng dương tính, có sự thay đổi màu. Một số chủng có khả năng hóa lỏng gelatin chậm nên giữ lại thử nghiệm trong hai tuần. 5
  7. Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4 TỔNG SỐ BÀO TỬ NẤM MEN - NẤM MỐC NGUYÊN LÝ PHƯƠNG PHÁP Sử dụng kỹ thuật đổ đĩa đếm khóm nấm trên môi trường thạch, sau khi ủ hiếu khí ở nhiệt độ 28 ±1oC trong thời gian từ 5 - 7 ngày. Số lượng bào tử nấm men, nấm mốc trong 1g(ml) mẫu sản phẩm thực phẩm kiểm nghiệm được tính theo số khóm nấm đếm được từ các đĩa nuôi cấy theo các đậm độ pha loãng PHẠM VI ÁP DỤNG: Thực phẩm và thức ăn chăn nuôi THIẾT BỊ - DỤNG CỤ • Đĩa petri thuỷ tinh đường kính 90 -100 mm • Pipet có chia độ loại 1ml, 5ml, 10 ml đã tiệt khuẩn. • Nồi cách thuỷ điều chỉnh nhiệt độ 45 ±1oC. • Tủ ấm điều chỉnh nhiệt độ 30 ±1oC. • Tủ sấy khô. • Nồi hấp áp lực . • Bình thuỷ tinh dung tích 250- 500ml. • Ống nghiệm loại 16-160 mm và lớn hơn . • pH met hoặc giấy đo pH. HÓA CHẤT – MÔI TRƯỜNG • Thạch dùng cho Vi sinh vật • Pepton dùng cho Vi sinh vật • Muối tinh khiết (NaCl) • Glucoza tinh khiết • Natri hydrophotphat tinh khiết (Na2HPO4) • Kalidihydrophotphat tinh khiết (KH2PO4) • Axit lactic dung dịch 20% hoặc 40% • Axit xitric dung dịch 20% • Dung dịch NaOH 0,1N CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG VÀ MẪU THỬ • Chuẩn bị môi trường 6
  8. Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4 - Môi trường nuôi cấy, nước pha loãng và dung dịch cần thiết được điều chế theo công thức. Các môi trường được đóng sẵn vào bình nón, ống nghiệm và được hấp tiệt trùng (110oC/30 phút hoặc 121oC/15 phút). • Chuẩn bị mẫu và dung dịch mẫu thử - Chuẩn bị mẫu Mẫu thực phẩm được cắt nhỏ hoặc xay nhuyễn bằng máy trong điều kiện vô trùng cho tới khi được thể đồng nhất. • Chuẩn bị dung dịch mẫu thử - Cân chính xác 10g thực phẩm đã được chuẩn bị (hoặc hút 10ml thực phẩm lỏng) cho vào bình nón có chứa 90 ml nước pepton, lắc đều 2-3 phút thu được dung dịch mẫu thử 10-1. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH • Pha loãng mẫu - Chọn môi trường pha loãng: Sử dụng nước pepton hoặc nước đệm pepton nếu chỉ cần tính tổng số bào tử nấm men. - Sử dụng nước thạch hoặc nước pepton có thạch, nếu cần tính tổng số cả nấm men và nấm mốc hoặc chỉ có nấm mốc - Hút chính xác 1ml dung dịch mẫu thử 10-1 cho sang ống nghiệm có chứa sẵn 9 ml nước pepton, đều 2-3 phút thu được dung dịch mẫu thử 10-2. Tiếp tục làm tương tự để có dung dịch pha loãng tiếp theo. Pha loãng mẫu cho đến khi có đậm độ pha loãng cần thiết đếm được số khóm nấm trên đĩa theo dự tính. • Đổ đĩa: - Đối với một mẫu kiểm nghiệm phải nuôi cấy ít nhất 3 đậm độ, mỗi đậm độ dùng 2 đĩa petri và một pipet đã tiệt khuẩn riêng. - Lấy 1ml sản phẩm lỏng hoặc dung dịch pha loãng ở những đậm độ khác nhau cho vào giữa từng đĩa petri - Thạch đã đun nóng chảy, để nguội đến 45 ±1oC trong điều kiện vô khuẩn, điều chỉnh pH môi trường đến 4,5 - 5,5 bằng dung dịch axit lactic 20%, 40% hoặc dung dịch axit xitric 20% - Rót vào từng đĩa 12-15 ml môi trường thạch, trộn đều dung dịch mẫu với môi ttrường bằng cách lắc nhẹ sang phải và sang trái mỗi chiều 3 lần - Để các đĩa thạch đông tự nhiên trên mặt phẳng ngang - Thời gian bắt đầu pha loãng đến khi rót môi trường vào đĩa không được quá 30 phút 7
  9. Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4 • Ủ ấm: - Khi thạch đã đông, để các đĩa nuôi cấy vào tủ ấm ở nhiệt độ 28±1oC hoặc khi nhiệt độ phòng tương ứng trong 5 -7 ngày. Không lật ngược đĩa - Sau 3 ngày, đếm kết quả sơ bộ, đếm tổng số các khóm nấm men và nấm mốc mọc trên các đĩa (chú ý nhẹ tay, không di chuyển mạnh hay lật ngược đĩa). - Sau 5-7 ngày đếm toàn bộ số nấm đã mọc và ghi nhận kết quả chính thức. • Đọc kết quả - Chọn tất cả các đĩa có số khóm nấm men từ 15 - 150, số khóm nấm mốc từ 5-50 của 2 đậm độ pha loãng liên tiếp để tính kết quả. - Sự phân bố các khóm nấm trên các đĩa petri phải hợp lý. Độ pha loãng càng cao thì số khóm nấm càng ít. Nếu kết quả không hợp lý phải tiến hành lại các bước nuôi cấy. TÍNH KẾT QUẢ a. Nếu chênh lệch giá trị ở 2 đậm độ nhỏ hơn hoặc bằng 2 lần, tính số (N) bào tử cho 1g(ml) sản phẩm bằng cách tính tổng số có khóm nấm đếm dược trên các đĩa theo công thức sau: ΣC N = (n1+ 0,1.n2) d - C: Số khóm nấm men hoặc nấm mốc đếm được trên các đĩa đã chọn - n1,n2: Số đĩa ở 2 đậm độ pha loãng liên tiếp đẫ chọn thứ 1 thứ 2 - d: Hệ số pha loãng của đậm độ pha loãng đã chọn thứ 1 (Làm tròn số kết quả có được, chỉ giữ lại 2 số có nghĩa) b. Nếu chênh lệch các giá trị ở 2 đậm độ pha loãng lớn hơn 2 lần, lấy giá trị pha loãng thấp hơn để tính kết quả theo trung bình cộng c. Nếu 2 đĩa của sản phẩm lỏng nguyên chất hoặc đậm độ pha lãng ban đầu (10-1) có ít hơn 15 khóm nấm men hoặc ít hơn 5 khóm nấm mốc, tính kết quả theo trung bình cộng . d. Nếu tất cả các đĩa không có khóm nấm nào mọc, đánh giá kết quả như sau: - Ít hơn 1 bào tử nấm men, nấm mốc trong 1ml sản phẩm loãng - Ít hơn 1x1/d bào tử nấm men, nấm mốc trong 1g sản phẩm khác. d: hệ số pha loãng của đậm độ pha loãng ban đầu 10-1 8
  10. Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4 BÁO CÁO KẾT QUẢ - Trong báo cáo kết quả kiểm nghiệm phải nêu phương pháp và kết quả tính được tổng số BT nấm men–nấm mốc có trong 1g hoặc 1ml sản phẩm kiểm tra - Sai lệch của phương pháp :Trong 95% trường hợp, sai lệch của phương pháp từ 12 đến 37% . 9
  11. Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4 TỔNG SỐ VI SINH VẬT HIẾU KHÍ NGUYÊN LÝ PHƯƠNG PHÁP -Sử dụng kỹ thuật đổ đĩa đếm số khuẩn lạc trên môi trường thạch, sau khi ủ hiếu khí ở nhiệt độ 37 1oC trong thời gian từ 24- 48 giờ. Số lượng vi khuẩn hiếu khi trong 1g hoặc 1ml mẫu sản phẩm thực phẩm kiểm nghiệm được tính theo số khuẩn lạc đếm đựơc từ các đĩa nuôi cấy theo các đậm độ pha loãng. PHẠM VI ÁP DỤNG: Thực phẩm và thức ăn chăn nuôi THIẾT BỊ DỤNG CỤ Các thiết bị thông thường của phòng VSV thực phẩm: • Đĩa petri thuỷ tinh đường kính 90 -100 mm • Pipet có chia độ loại 1ml, 5ml, 10 ml đã tiệt khuẩn. • Nồi cách thuỷ điều chỉnh nhiệt độ 45 1oC. • Tủ ấm điều chỉnh nhiệt độ 37 1oC. • Tủ sấy khô. • Nồi hấp áp lực . • Bình thuỷ tinh dung tích 250- 500ml. • Ống nghiệm loại 16-160 mm và lớn hơn . • pH met hoặc giấy đo pH. HÓA CHẤT MÔI TRƯỜNG • Thạch dùng cho vi sinh vật • Pepton dùng cho vi sinh vật • Muối tinh khiết (NaCl) • Natri hydrophotphat tinh khiết (Na2HPO4) • Kalidihydrophotphat tinh khiết (KH2PO4) • Natri hydroxit tinh khiết (NaOH) • Cao thịt. • Cao men • Trypton • Glucose tinh khiết 10
  12. Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4 CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG VÀ MẪU THỬ • Chuẩn bị môi trường - Môi trường nuôi cấy, nước pha loãng và dung dịch cần thiết được điều chế theo công thức. Các môi trường được đóng sẵn vào bình nón, ống nghiệm và được hấp tiệt trùng (110oC/30 phút hoặc 121oC/15 phút). • Chuẩn bị mẫu - Mẫu thực phẩm được cắt nhỏ hoặc xay nhuyễn bằng máy trong điều kiện vô trùng cho tới khi được thể đồng nhất. • Chuẩn bị dung dịch mẫu thử - Cân chính xác 10g thực phẩm đã được chuẩn bị (hoặc hút 10ml thực phẩm lỏng) cho vào bình nón có chứa 90 ml pepton, lắc đều 2-3 phút thu được dung dịch mẫu thử 10-1. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH • Pha loãng mẫu - Hút chính xác 1ml dung dịch mẫu thử 10-1 cho sang ống nghiệm có chứa sẵn 9 ml nước pepton, trộn đều để thu được dung dịch mẫu thử 10-2. Tiếp tục làm tương tự để có dung dịch pha loãng tiếp theo • Đối với một mẫu kiểm nghiệm phải nuôi cấy ít nhất 3 đậm độ, mỗi đậm độ cấy 2 đĩa petri và dùng một pipet đã tiệt khuẩn riêng. • Lấy 1ml sản phẩm lỏng hoặc dung dịch pha loãng ở những đậm độ khác nhau cho vào giữa từng đĩa petri, mỗi đậm độ nuôi cấy vào 2 đĩa petri • Thạch đã đun nóng chảy, để nguội đến 45 1oC trong điều kiện vô khuẩn. Rót vào từng đĩa 12-15ml môi trường thạch, trộn đều dung dịch mẫu với môi trường bằng cách lắc nhẹ sang phải và sang trái mỗi chiều 3 lần. • Để các đĩa thạch đông tự nhiên trên mặt phẳng ngang. • Thời gian bắt đầu pha loãng đến khi rót môi trường vào đĩa không được quá 30 phút • Nếu dự đoán trong sản phẩm có chứa vi sinh vật mọc lan trên mặt thạch thì sau khi môi trường đã đông đổ tiếp 4ml thạch màng lên trên bề mặt • Để thạch đông, lật ngược đĩa và ủ ấm ở 37 1oC từ 24- 48 giờ. 11
  13. Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4 ĐỌC KẾT QUẢ • Sau 48 giờ tính kết quả sơ bộ bằng cách đếm những khuẩn lạc đã mọc trên các đĩa nuôi cấy, sau 72 giờ tính kết quả chính thức, đếm toàn bộ số khuẩn lạc đã mọc và ghi nhận kết quả chính thức. • Sự phân bố các khuẩn lạc trên các đĩa petri phải hợp lý. Độ pha loãng càng cao thì số khuẩn lạc càng ít. Nếu kết quả không hợp lý phải tiến hành lại các bước nuôi cấy. TÍNH KẾT QUẢ Chọn những đĩa có từ 15-300 khuẩn lạc của hai đậm độ pha loãng liên tiếp để tính kết quả C N = (n 0,1.n )d 1 2 TÍNH KẾT QUẢ • C:Số khuẩn lạc trên các đĩa đã chọn • n1,n2: Số đĩa ở 2 đậm độ pha loãng liên tiếp đã chọn thứ nhất và thứ hai • d: hệ số pha loãng của đậm độ pha loãng đã chọn thứ nhất • Sau đó làm tròn số kết quả có được, chỉ giữ lại 2 số có nghĩa và biểu thị kết quả dưới dạng thập phân giữa 1,0 và 9,9 nhân với 10n ( n là số mũ thích hợp của 10). VD: - Ở đậm độ pha loãng 10-2 có 150 và215 khuẩn lạc - Ở đậm độ pha loãng 10-3 có 16 và 25 khuẩn lạc 150+215+16+25 N = = 18480 = 1,8 x 104 CFU/g/ml (2+0,1 x 2) x 10-2 * Nếu chênh lệch các giá trị ở 2 đậm độ pha loãng lớn hơn 2 lần, lấy giá trị pha loãng thấp hơn để tính kết quả theo trung bình cộng, VD - Ở đậm độ pha loãng 10-2có 180 và 250 khuẩn lạc - Ở đậm độ pha loãng 10-3 có 60 và 75 khuẩn lạc 12
  14. Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4 Chọn đậm độ pha loãng thấp hơn (10-2 )để tính kết quả. 180 + 250 N = = 21500 2 x 10-2 Kết quả: 2,0 x102 CFU/1g hoặc 1ml sản phẩm * Nếu 2 đĩa của sản phẩm lỏng nguyên chất hoặc đậm độ pha loãng ban đầu (10-1) có ít hơn 15 khuẩn lạc, tính kết quả theo trung bình cộng các khuẩn lạc đếm được ở cả 2 đĩa tính cho 1g hay 1ml sản phẩm. VD - Ở đậm độ pha loãng 10-1của sản phẩm đặc có 12 và 8 khuẩn lạc - Ở đậm độ pha loãng 10-2 có 6 và 7 khuẩn lạc Chọn đậm độ pha loãng thấp hơn 10-2 để tính kết quả. 12 + 8 N = = 100 2 x 10-1 Kết quả :1,0 x 102 CFU/1g hoặc 1ml sản phẩm * Nếu tất cả các đĩa không có khuẩn lạc nào mọc, đánh giá kết quả như sau: - Ít hơn 1 vi sinh vật hiếu khí trong 1ml sản phẩm loãng - Ít hơn 1x1/d vi sinh vật hiếu khí trong 1g sản phẩm khác d: hệ số pha loãng của đậm độ pha loãng ban đầu (thường là10-1) BÁO CÁO KẾT QUẢ • Trong báo cáo kết quả kiểm nghiệm phải nêu phương pháp và kết quả tính được số vi khuẩn hiếu khí có trong 1g hoặc 1ml sản phẩm kiểm tra • Sai lệch của phương pháp :Trong 95% trường hợp, sai lệch của phương pháp từ 12 đến 37% 13
  15. Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4 ĐỊNH LƯỢNG COLIFORMS KỸ THUẬT ĐẾM SỐ CÓ XÁC SUẤT LỚN NHẤT (MPN) Định nghĩa Coliform cổ điển Coliforms: Lên men lactose sinh acid và gas - Escherichia coli - Klebsiella - Enterobacter - Citrobacter Sinh acid và gas do lên men lactose ở 37°C: 95% là coliform Sinh acid và gas ở 44°C : 90 % là E.coli Định nghĩa Coliform mới - Coliforms thuộc họ Enterobacteriaceae, lên men lactose sinh acid và gas (24-48h/36±2°C) - Fecal coliform : có khả năng phát triển và lên men lactose ở 44,5±2°C; bao gồm E.coli, Klebsiella, Enterobacter và Citrobacter (E.coli thủy phân tryptophan tạo thành Indol) Coliforms được coi là VSV chỉ điểm vệ sinh Acid production from lactose Enzyme based •Escherichia coli methods •Klebsiella Old defnition duction •Enterobacter •Escherichia coli from lactose • Citrobacter Klebsiella • Yersinia • • Serratia •Enterobacter Escherichia • • Hafnia coli •Citrobacter • Klebsiella •Pantoea •Yersinia • Enterobacter • • Citrobacter •Serratia 14
  16. Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4 Coliforms – Nơi cư trú và phát triển Nhóm coliform bao gồm cả VSV sống tự do và trong đường ruột động vật Fecal coliform chỉ phát triển ở đường ruột động vật máu nóng •E. coli chỉ phát triển ở đường ruột động vật. Khái niệm chung - Trực khuẩn Gram âm - Không sinh bào tử - Kỵ khí không bắt buộc - Lên men Lactose Vai trò - Chỉ điểm sự nhiễm phân - Đánh giá tình trạng vệ sinh nước và vệ sinh môi trường Nguyên lý phương pháp - Định lượng vi sinh vật lên men lactose có sinh khí khi nuôi cấy trong môi trường tăng sinh chọn lọc ở 30°C và phù hợp trong phép thử khẳng định Phạm vi áp dụng: Thực phẩm và thức ăn chăn nuôi. Tài liệu trích dẫn: TCVN 4882 : 2001 Dụng cụ - Thiết bị - Máy đồng nhất mẫu - Tủ sấy 180 – 200°C - Nồi hấp áp lực - Tủ ấm 30 ±1°C - Đĩa petri đường kính 90 – 100mm 15
  17. Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4 - Pipet có vạch đã vô trùng loại xả hết 1 và 10 ml - Nồi cách thuỷ, nhiệt độ 45 ±1°C - Bình thuỷ tinh vô trùng, dung tích 250 – 500ml - Ống nghiệm vô trùng 16 – 18 mm - pH met, chính xác tới 0,1 đơn vị pH ở 25°C - Ống Durham Môi trường - Dung dịch pepton – muối - Canh thang Tryptose Lauryl sulfat ( Môi trường tăng sinh chọn lọc) - Canh thang mật lactose lục sáng (Lactose Bile Brilliant Green Broth – môi trường thử khẳng định) Các bước tiến hành  Chuẩn bị mẫu thử và đậm độ pha loãng ban đầu: - Sản phẩm dạng đặc: Cân 10g mẫu thử đã đồng nhất cho vào 90 ml dung dịch pepton – muối để được đậm độ pha loãng ban đầu (10-1). Từ đó pha loãng các đậm độ tiếp theo tuỳ từng mẫu thử nhưng phải ước lượng rằng các ống tương ứng với độ pha loãng cuối cùng sẽ cho kết quả âm tính. - Sản phẩm dạng lỏng: Hút 10ml sản phẩm ban đầu cho vào bình đã có sẵn 90ml nước pepton – muối để được đậm độ pha loãng ban đầu. Từ đó pha loãng các đậm độ tiếp theo tuỳ từng mẫu thử nhưng phải ước lượng rằng các ống tương ứng với độ pha loãng cuối cùng sẽ cho kết quả âm tính.  Cấy mẫu và ủ ấm: - Canh thang tăng sinh nồng độ kép: Dùng pipet vô trùng hút 10 ml mẫu ban đầu (sản phẩm dạng lỏng) hoặc 10ml đậm độ 10-1 (sản phẩm dạng khác) cho vào một ống canh thang tăng sinh chọn lọc. Mỗi mẫu cấy 3 ống. Trộn đều mẫu với môi trường, mỗi ống dùng một pipet riêng. Ủ ấm ở 30°C / 24h ± 2h - Canh thang tăng sinh nồng độ đơn: Dùng pipet vô trùng hút 1ml mẫu ban đầu (sản phẩm dạng lỏng) hoặc 1ml đậm độ pha loãng 10-1 (sản phẩm dạng khác) cho vào một ống canh thang tăng sinh chọn lọc. Mỗi đậm độ cấy 3 ống. Tiến hành tương tự với các đậm độ pha loãng tiếp theo(nếu có). Trộn đều mẫu với môi trường, mỗi ống dùng một pipet riêng. Ủ ấm ở 30°C / 24h ± 16
  18. Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4 2h. Nếu sau 24h mà thấy môi trường không đục hoặc không sinh khí thì để tiếp 24h ± 2h nữa và quan sát lại.  Phép thử khẳng định: Từ mỗi ống canh thang tăng sinh chọn lọc nồng độ đơn hoặc nồng độ kép đã nuôi cấy có hiện tượng đục và sinh khí cấy chuyển sang một ống môi trường thử khẳng định, mỗi ống cấy một ăng( một vòng que cấy). Ủ ấm ở 30°C / 24h ± 2h. Quan sát lần 1 mà không đục hoặc không sinh khí thì để thêm 24h ± 2h nữa và quan sát lại Biểu thị kết quả - Lựa chọn các độ pha loãng Trường hợp 1: có ít nhất một độ pha loãng cho ba ống dương tính VD: 3 3 2 1 0 Trường hợp 2: Không có độ pha loãng nào cho ba ống dương tính VD: 2 2 1 1 0 Các trường hợp đặc biệt VD: 3 3 0 0 0 2 2 0 1 0 - Xác định chỉ số MPN - Tính số có xác suất lớn nhất Nhân chỉ số MPN với số đảo của độ pha loãng thấp nhất được chọn. Với nồng độ kép:chia chỉ số MPN cho 10. 17
  19. Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4 STAPHYLOCOCCUS AUREUS HÌNH THÁI • Vi khuẩn hình cầu, đường kính 0.8-1.0 µ • Đứng riêng rẽ, thành đôi, hoặc tụ thành đám như chùm nho. • Tụ cầu thường không có vỏ, không có lông, không di động • Không sinh nha bào • Bắt màu Gram dương ĐẶC TÍNH NUÔI CẤY • Hiếu khí, kỵ khí tuỳ tiện, mọc dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường • Phát triển được trong điều kiện nhiệt độ và pH chênh lệch nhiều (từ 10 – 45oC). • Trong môi trường canh thang, sau 5 – 6 giờ vi khuẩn đã làm đục môi trường, sau 24 giờ, môi trường đục rõ, vi khuẩn phát triển nhiều nhưng nếu để lâu, canh thang trở nên trong, bề mặt có váng mỏng, dễ lắng xuống. • Trên môi trường thạch thường, sau 24 giờ vi khuẩn đã phát triển mạnh, khuẩn lạc dạng S, trơn, lồi, sáng bóng, bờ đều, có sắc tố vàng nhạt hoặc vàng thẫm. Sắc tố có thể thay đổi khác nhau, nhiều chủng màu da cam, những chủng kháng kháng sinh sắc tố thường màu vàng, mọc nhiều trên thạch, đục, trơn, ẩm ướt và trắng, vàng hoặc da cam. • Trên môi trường thạch máu, khuẩn lạc đục, dạng S, thường gây tan máu và có sắc tố vàng. TÍNH CHẤT SVHH • Lên men sinh acid các đường glucoza, lactoza, maltoza và manitol. • Không lên men sinh axit các đường arabinoza, inositol, raffinoza, rhamnoxa hoặc xyloza. • Không thủy phân Esculin và tinh bột, khử nitrat, thuỷ phân arginin, gluamat và khử nhóm cacboxyl của lysin (có men lysin decacboxylase). • Sinh ra proteaza, lipaza, phosphataza,. Một số chủng sinh ra lecithinaza. • Tất cả các chủng đều sinh ra coagulaza, ít nhất có 3 yếu tố tan huyết (α, β và δ). • Thường gặp tan máu β bởi các chủng phân lập từ động vật. • Nhiệt độ thích hợp nhất cho sự phát triển là 30-37oC, pH là 7.0-7.5. 18
  20. Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4 Enzym • Coagulase: làm đông huyết tương người và thỏ. Nó là một protein vững bền với nhiệt độ, tính chất kháng nguyên yếu, có thể gây thành huyết cục trong tĩnh mạch, yếu tố để tạo nên nhiễm khuẩn huyết. • Fibrinolysin: đặc trưng cho các chủng gây bệnh ở người. Men này làm tan các cục máu, tạo nên sự rời chỗ và hình thành những vật tắc mạch nhỏ tạo ra nhiễm khuẩn di căn. • Desoxyribonuclease: là men có thể thuỷ phân AND, có thể gây ra tổn thương các tổ chức • Hyaluronidase: gây tan vỡ chất cơ bản của mô liên kết bởi sự thuỷ phân của acid hyaluronic • Penicillinase: tụ cầu gây bệnh có thể tiết ra men này làm mất tác dụng của Penicillin ĐỘC TỐ Độc tố tan máu (hemolysin) có ba loại chính: - Độc tố tan máu α, gây tan hồng cầu thỏ ở nhiệt độ 37oC. độc tố này gây hoại tử da và gây chết, là ngoại độc tố, có tính kháng nguyên cao và có thể trở thành giải độc tố. - Độc tố tan máu β có tác dụng làm tan hồng cầu cừu ở 40C, ít độc hơn độc tố α. - Độc tố tan máu δ có tác dụng lên hồng cầu người đã rửa và gây hoại tử da. - Độc tố diệt bạch cầu(Leucocidin): làm bạch cầu mất tính di động và bị phá huỷ nhân. - Các độc tố ruột: các độc tố này gây nhiễm độc thức ăn và viêm ruột cấp. Các độc tố ruột chỉ do một số chủng tụ cầu tiết ra, gồm bốn loại, trong đó mới có hai loại được biết rõ là: độc tố ruột A do chủng gây nhiễm độc thức ăn, độc tố ruột B do chủng gây viêm ruột sinh ra KHẢ NĂNG GÂY BỆNH • Các bệnh ngoài da: gây viêm nhiễm các vết xước tạo thành mụn, nhọt đầu đinh, đinh râu • Nhiễm khuẩn huyết do tụ cầu: thường xảy ra ở những người đề kháng yếu hoặc trẻ em. Bệnh thường nặng, có thể gây chết người hoặc trở thành mạn tính gây nên viêm xương, viêm khớp, viêm phổi, viêm cơ 19
  21. Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4 • Nhiễm độc thức ăn và viêm ruột cấp tính: bệnh thường xảy ra nhanh, trầm trọng với các dấu hiệu nôn mửa dữ dội NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM • Do độc tố • Triệu chứng: là nôn mửa, đau quặn bụng, mệt lả và đi ỉa lỏng. Những triệu chứng này thường có trong một vài giờ và ít trường hợp kéo nhiều ngày. Thường bệnh nhân hồi phục không có biến chứng. • Liều gây bệnh: 100 000CFU/g). Độc tố của tụ cầu rất bền vững với nhiệt độ, không bị phá huỷ khi đun sôi ở 100oC trong 30 phút nên vẫn có thể gây ngộ độc khi các tế bào sinh dưỡng đã bị tiêu diệt trong quá trình chế biến. • Độc tố của tụ cầu rất bền vững với nhiệt độ, không bị phá huỷ khi đun sôi ở 100oC trong 30 phút nên vẫn có thể gây ngộ độc khi các tế bào sinh dưỡng đã bị tiêu diệt trong quá trình chế biến. • Thời gian ủ bệnh: từ 1 -7h, thông thường 3 – 6h • Thức ăn thích hợp cho tụ cầu phát triển và sinh độc tố: loại có độ ẩm cao • Những thực phẩm có nguy cơ cao ô nhiễm do tụ cầu là thịt và sản phẩm thịt, gia cầm và trứng, các món xalat, rau trộn, sữa và sản phẩm sữa NƠI CƯ TRÚ VÀ NGUỒN LÂY NHIỄM • Trong đất, nước, các dụng cụ sản xuất, chế biến, cư trú ở người và động vật (nguồn lây nhiễm quan trọng nhất) • 50% người bình thường mang vi khuẩn này ở trong mũi họng. Vì thế đầu móng tay thường nhiễm những vi khuẩn này. • Trong quá trình chế biến, thực phẩm có thể bị ô nhiễm tụ cầu có thể qua tiếp xúc trực tiếp, đặc biệt là khi tay người chế biến có những vết trầy xước hoặc có mụn mủ Nếu những thực phẩm này để hàng giờ ở 6.6oC, tụ cầu sẽ phát triển và sinh độc tố. 20
  22. Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4 PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG S.AUREUS 1.Nguyên lý phương pháp Dựa trên khả năng sinh Lecithinase phân giải Lecithin của Staphylococcus aureus trên môi trường chọn lọc có bổ sung lòng đỏ trứng và Kali tellurit, nuôi cấy ở 35- 37oC/24 – 48h. Số lượng Staphylococcus aureus trong một ml hoặc một g mẫu kiểm nghiệm được tính bằng số khuẩn lạc điển hình trên môi trường chọn lọc và có phản ứng đông huyết tương dương tính. 2. Phạm vi áp dụng: Định lượng Staphylococcus aureus trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi. NỘI DUNG 1.Thiết bị, dụng cụ - Tủ sấy 180 – 200oC - Nồi hấp áp lực - Tủ ấm 25 ±1oC - Đĩa petri đường kính 90 – 100mm - Pipet có vạch đã vô trùng loại 1,5,10 ml - Nồi cách thuỷ, nhiệt độ 45 ±1oC - Máy đếm khuẩn lạc - Bình thuỷ tinh vô trùng, dung tích 250 – 500ml - Ống nghiệm vô trùng 16 – 18 mm - pH met hoặc giấy đo pH 2.Dung dịch pha loãng, môi trường, hoá chất • Nước đệm pepton • Môi trường Bair parker • Dung dịch Kali Tellurit 1% • Dung dịch sulphamezatin (sulphadimidin, INH) 0,2% • Dung dịch Natri pyruvat 20% • Dung dịch lòng đỏ trứng • Canh thang tim óc ( Brain Heart Infusion) • Huyết tương thỏ 21
  23. Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4 3.Các bước tiến hành 3.1 Chuẩn bị mẫu thử và đậm độ pha loãng ban đầu: Sản phẩm dạng lỏng: Hút 10ml mẫu thử cho vào bình 90ml nước đệm pepton(đậm độ 10-1). Từ đậm độ này pha loãng các đậm độ tiếp theo tùy từng mẫu thử. • Sản phẩm dạng khác: caan 10g mẫu thử cho vào 90 ml nước đệm pepton (đậm độ10-1). Từ đó pha loãng các đậm độ tiếp theo tùy từng mẫu thử. 3.2 Cấy mẫu • Sản phẩm dạng lỏng: cấy vào 2 đĩa thạch Bair parker, mỗi đĩaa 0,1ml mẫu thử ban đầu. Lặp lạii với các đậm độ pha loãng khác. • Sản phẩm dạng khác: cấy vào 2 đĩa thạch Bair parker, mỗi đĩaa 0,1ml đậm độ pha loãng ban đầu (đậm độ 10 –1) Lặp lại với các đậm độ pha loãng khác. • Dùng que cấy gạt thuỷ tinh dàn đều mẫu trên mặt thạch, lưu ý làm càng nhanh càng tốt để mẫu không bị khô. • Để 15 phút ở nhiệt độ phòng, sau đó lật ngược đĩa thạch và để vào tủ ấm 35-37 ± 1oC/ 24-48h 3.3 Đếm khuẩn lạc • Chỉ tính những đĩa có từ 15-150 khuẩn lạc. • Đếm tất cả những khuẩn lạc điển hình (màu đen, bóng, lồi, đường kính từ 1-1,5 mm, bao quanh bởi một vùng đục sát khuẩn lạc và vùng trong phía bên ngoài) và không điển hình (không có vùng trong). 3.4 Thử khẳng định • Từ mỗi đĩa chọn 5 khuẩn lạc điển hình để làm phản ứng sinh hóa, mỗi khuẩn lạc cho vào một ống canh thang tăng sinh BHI, nuôi ở 35- 37oC/20 -24h • Cho 0,1ml môi trường đã nuôi cấy vào 0,3ml huyết tương thỏ, để ở 35-37oC / 4-6h. Phản ứng được coi là dương tính khi phần đông huyêt tương chiếm 1/2 thể tích dung dịch. 22
  24. Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4 ĐÞnh l­îng S.aureus trong thùc phÈm 1. Đồng nhất mẫu 225 ml NaCl 8,5‰ 25 g ( ml) thực phẩm 1 ml 1 ml 2. Pha loãng mẫu 9 ml NaCl 8,5‰ 0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml 3. Cấy và ủ ấm Baird- Parker 35OC- 37OC/ 48 h 4. Thử đông huyết tương thỏ 5. Tính kết quả và báo cáo Phản ứng đông huyết tương 1. Chuyển KL sang CT BHI ủ 37oC/ 24h Baird Parker agar 2. Cấy 0,1 ml canh khuẩn/ 0.3 ml HT Canh thang BHI thỏ ủ 37oC/ 6- 24h Huyết tương 3. Đọc kết quả thỏ 23
  25. Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4 Số lượng S.aureus có phản ứng dương tính với coagulase đã nhận dạng trên mỗi đĩa bc bnc a = Cc + Cnc Ac Anc • Ac là số lượng khuẩn lạc điển hình đã qua phép thử coagulase • Anc là số lượng khuẩn lạc không điển hình đã qua phép thử coagulase • bc số lượng khuẩn lạc điển hình cho thấy có phản ứng dương tính với coagulase • bnc số lượng khuẩn lạc không điển hình cho thấy có phản ứng dương tính với coagulase • Cc là tổng số khuẩn lạc điển hình nhìn thấy trên đĩa • Cnc là tổng số khuẩn lạc không điển hình nhìn thấy trên đĩa Số lượng S.aureus có phản ứng dương tính với coagulase đã nhận dạng trên có mặt trong mẫu thử Σa N = V (n1+ 0,1 n2) d • Σa là tổng số khuẩn lạcc Staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase được nhận dạng có mặt trong mẫu thử • V là thể tích của chất cấy trên mỗi đĩa, tính bằng ml • n1 là số đĩa đã được chọn ở độ pha loãng thứ nhất • n2 là số đĩa đã được chọn ở độ pha loãng thứ hai • d là độ pha loãng tương ứng với dung dịch pha loãng thứ nhất đã chọn (huyền phù ban đầu là một độ pha loãng) 24
  26. Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4 4 Biểu thị kết quả • Độ pha loãng 10-2 Đĩa 1: 65 KLĐH, 5KL có coagulase(+), a=65 Đĩa 2: 85 KLĐH, 5KL có coagulase(+), a=85 • Độ pha loãng 10-3 Đĩa 1:3 KLĐH, 3KL có coagulase(+), a=3 Đĩa 2: 7 KLĐH, 5KL có coagulase(+), a=7 N= 65+85+3+7/0,1(2+ 0,1x2) 10-2 = 57272 = 5,7 x 104 CFU/g(ml) CHUẨN BỊ DUNG DỊCH LÒNG ĐỎ TRỨNG • Dung dịch Kali Tellurit - Kali Tellurit 1g - Nước cất VT 100ml Làm ấm để hòa tan, bảo quản 0-5oC/vài tháng • Dung dịch Natri Pyruvat - Natri Pyruvat 20g - Nước cất VT 100ml Cho Natri Pyruvat vào một phần nước, sau đó thêm cho đủ 100ml, hòa tan, lọc vô trùng, bảo quản ở 0-5oC/1 tháng • Rửa sạch vỏ trứng • Ngâm trong cồn 70o/5-10 phút • Tách đôi vỏ trứng, đổ từ vỏ nọ sang vỏ kia để loại phần lớn lòng trắng • Dùng pipet hút hết lòng rắng còn lại • Hút lòng đỏ trứng, pha với nước cất VT theo tỷ lệ ¼ • Dùng ngay hoặc để cách thủy ở 45oC/2h rồi để ở 0-5oC/18-24h, lấy phần dung dịch nổi phía trên. Bảo quản ở 0-5oC/72h MÔI TRƯỜNG BAIR-PARKER LÒNG ĐỎ TRỨNG • Môi trường BP 90ml • Dung dịch Kali Tellurit 1ml • Dung dịch Natri pyruvat 5ml • Dung dịch lòng đỏ trứng 5ml Đun tan thạch, để nguội khoảng 50oC, thêm các thành phần, trộn đều (không tạo thành bọt) Đổ đĩa, làm khô mặt thạch trước khi sử dụng. 25
  27. Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4 ĐỊNH LƯỢNG B.CEREUS ĐẶC ĐIỂM • Họ Bacillusaceae • Trực khuẩn Gram (+) • Hiếu, kỵ khí tùy ý • Di động • Sinh nội bào tử • Lên men Glucose sinh hơi • VP(+) • Nitrat (+) ĐỘC LỰC • Sinh độc tố ruột bền và không bền nhiệt • Độc tố tan máu (haemolysin GÂY BỆNH • Nôn mửa • Tiêu chảy • Viêm dạ dày ruột • Hoại tử sau chấn thương, đặc biệt ở mắt • Các nhiễm trùng cơ hội khác • Ngộ độc thực phẩm: thể nôn (do độc tố chịu nhiệt) và thể tiêu chảy (do thức ăn bị nhiễm khuẩn) • Thời gian ủ bệnh trên 6 giờ, thường từ 10 – 12 giờ DỊCH TỄ • Phân bố rộng rãi trong tự nhiên • Có nhiều trong đất và thực phẩm bị ô nhiễm • Thực phẩm nguy cơ cao: gạo, các loại ngũ cốc, thịt, rau ĐỊNH LƯỢNG B.CEREUS Nguyên lý phương pháp - Định lượng VSV có khả năng phân giải Lecithin lòng đỏ trứng gà trên MT thạch MYP chọn lọc khi ủ ở 30oC /24h và có phản ứng VSHH phù hợp trong phép thử khẳng định Phạm vi áp dụng: Thực phẩm và thức ăn chăn nuôi 26
  28. Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4 THIẾT BỊ DỤNG CỤ • Đĩa petri thuỷ tinh đường kính 90 -100 mm • Pipet có chia độ loại 1ml, 5ml, 10 ml đã tiệt khuẩn. • Nồi cách thuỷ điều chỉnh nhiệt độ 45 1oC. • Tủ ấm điều chỉnh nhiệt độ 37 1oC. • Tủ sấy khô. • Nồi hấp áp lực . • Bình thuỷ tinh dung tích 250- 500ml. • Ống nghiệm loại 16-160 mm và lớn hơn . • pH met hoặc giấy đo pH. HÓA CHẤT MÔI TRƯỜNG • Nước đệm pepton . • Thạch Mannitol-Egg Yolk-Polymycin (MYP) hoặc thạch Cereus Selective Agar (MOSSEL). • Nhũ tương lòng đỏ trứng, 50% • Canh thang Phenol Red Glucose. • Môi trường Voges-Proskauer. • Canh thang Nitrate –(Nitrat Broth). • Thạch dinh dưỡng • Thạch máu cừu hoặc thỏ. • Môi trường kiểm tra sự di động. • Thuốc thử nitrate (dung dịch A, dung dịch B). • Thuốc nhuộm Gram CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG VÀ MẪU THỬ • Chuẩn bị môi trường - Môi trường nuôi cấy, nước pha loãng và dung dịch cần thiết được điều chế theo công thức. Các môi trường được đóng sẵn vào bình nón, ống nghiệm và được hấp tiệt trùng (110oC/30 phút hoặc 121oC/15 phút). Môi trường chọn lọc được bổ sung nhũ tương lòng đỏ trứng theo công thức. • Chuẩn bị mẫu - Mẫu thực phẩm được cắt nhỏ hoặc xay nhuyễn bằng máy trong điều kiện vô trùng cho tới khi được thể đồng nhất. 27
  29. Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4 • Chuẩn bị dung dịch mẫu thử - Cân chính xác 25g thực phẩm đã được chuẩn bị (hoặc hút 10ml thực phẩm lỏng) cho vào bình nón có chứa 225 ml đệm pepton, lắc đều 2-3 phút thu được dung dịch mẫu thử 10-1. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH • Pha loãng mẫu - Hút chính xác 1ml dung dịch mẫu thử 10-1 cho sang ống nghiệm có chứa sẵn 9 ml nước pepton, trộn đều để thu được dung dịch mẫu thử 10-2. Tiếp tục làm tương tự để có dung dịch pha loãng tiếp theo • Đối với một mẫu kiểm nghiệm phải nuôi cấy ít nhất 3 đậm độ, mỗi đậm độ cấy 2 đĩa petri và dùng một pipet đã tiệt khuẩn riêng. • Lấy 0,1ml sản phẩm lỏng hoặc dung dịch pha loãng ở những đậm độ khác nhau cho vào đĩa thạch chọn lọc • Dùng que cấy thủy tinh vô trùng trải đều mẫu thử. • Lật ngược đĩa và ủ ở 30 1oC /24 giờ. ĐỌC KẾT QUẢ • Do B.cereus không lên men mannitol, tạo lecithinase và kháng polymycin nên trên môi trường MYP khuẩn lạc B.cereus có màu hồng eosin, được bao quanh bởi vùng có tủa (có mặt lecithinase). • Trường hợp sử dụng môi trường MOSSEL, khuẩn lạc B.cereus to, màu hồng, xung quanh có vòng sáng. • Chọn từ mỗi đĩa 5 khuẩn lạc điển hình cấy sang thạch dinh dưỡng ở 30 1oC /24 giờ. để thử các phản ứng khẳng định THỬ KHẲNG ĐỊNH • Gram (+) • Lên men kỵ khí Glucose • Khử Nitrat – nitrit (+) • VP (+) • Tan máu ß • Di động (+) (Các phản ứng thử ở 35 1oC /24 giờ) TÍNH KẾT QUẢ: Như đối với S.aureus 28
  30. Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4 CLOSTRIDIUM PERFRINGENS (C.WELCHII) Clostridium perfringens (C.welchii) Lớp: Clostridia Bộ: Clostridiales Họ: Clostridiaceae Giống: Clostridium Loài: perfringens * Đặc điểm và phân bố - Trực khuẩn Gram dương,đầu vuông - Sinh bào tử - Kỵ khí chịu nhiệt - Phân bố rộng rãi trong tự nhiên: đất, nước, đường ruột của người và các loại động vật có xương sống * Khả năng gây bệnh và sinh độc tố: - Gây hoại tử - Nhiễm trùng huyết - Viêm túi mật - Hoại thư sinh hơi - Đôi khi dẫn tới tử vong - Sinh độc tố ruột α- toxin xâm nhập màng tế bào, hình thành các lỗ hổng trên bề mặt và phá hủy chức năng của màng tế bào - Sinh độc tố β-toxin gây loét hoại tử * Khả năng gây ngộ độc thực phẩm - Do typ C sinh α-toxin - Thời gian ủ bệnh: 8 – 12 giờ - Triệu chứng: đau quặn bụng, nôn mửa, tiêu chảy, đôi khi có sốt - Liều gây bệnh: khoảng 10 triệu TB/gam - Thực phẩm nguy cơ cao: thịt và sản phẩm thịt, thực phẩm chế biến có thời gian bảo quản dài, thực phẩm đông lạnh * Đặc điểm nuôi cấy - Trên thạch máu:khuẩn lạc phẳng, lan, dạng R, mờ, mép không đều, tan máu β - Trên thạch trứng: có vùng phân giải trứng mờ xung quanh khuẩn lạc - Trên thạch chọn lọc TSC: khuẩn lạc có màu đen, tròn - Phát triển tối ưu ở 40oC 29
  31. Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4 * Tính chất sinh vật hóa học - Gram dương - Không di động - Lecithinase (+) - Nitrit (+) - Lên men sinh hơi lactose (+) - Hóa lỏng gelatin (+) Clostridium perfringens (C.welchii)- Phương pháp định lượng * Nguyên lý: C.perfringens là vi khuẩn có màu đen khi nuôi cấy trên môi trường chọn lọc Tryptose – sunfit – cycloserin trong điều kiện kỵ khí ở 35 – 37oC/ 20h và có những tính chất sinh hoá đặc trưng trong phép thử khẳng định, được tính theo số lượng có trong một ml hay một g sản phẩm kiểm nghiệm. * Phạm vi áp dụng Định lượng Cl.perfringens trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi. * Thiết bị - dụng cụ - Sử dụng các thiết bị thông thường của phòng thí nghiệm vi sinh, các thiết bị cần thiết để xử lý mẫu thử: - Tủ sấy 180 – 2000C - Nồi hấp áp lực - Tủ ấm 25 ±1oC- Đĩa petri đường kính 90 – 100mm - Pipet có vạch đã vô trùng loại 1,5,10 ml - Nồi cách thuỷ, nhiệt độ 45 ±1oC - Máy đếm khuẩn lạc - Bình thuỷ tinh vô trùng, dung tích 250 – 500ml - Ống nghiệm vô trùng 16 – 18 mm - pH met hoặc giấy đo pH * Môi trường nuôi cấy và thuốc thử - Thạch Tryptose- sulfit-cycloserin (TSC) - Canh thang Thioglycolat - Môi trường nitrat di động - Môi trường gelatin-lactose - Thuốc thử phát hiện nitrit - Bụi kẽm 30
  32. Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4 * Các bước tiến hành  Chuẩn bị mẫu thử và đậm độ pha loãng ban đầu -Sản phẩm dạng lỏng: Thường dùng mẫu nguyên cho đậm độ nuôi cấy ban đầu. Hút 25ml mẫu thử cho vào BÌNH 225ml dung dịch đệm pepton để có đậm độ pha loãng 10-1, tương tự với các đậm độ pha loãng tiếp theo tuỳ từng mẫu thử. - Sản phẩm dạng khác: Cân 25g mẫu thử đã đồng nhất cho vào bình có 225ml nước đệm pepton. Từ đậm độ pha loãng ban đầu này (10-1) pha loãng các đậm độ tiếp theo tuỳ từng mẫu thử.  Cấy mẫu - Sản phẩm dạng lỏng: cho vào 2 đĩa petri, mỗi đĩa 1ml mẫu nguyên. Tiến hành tương tự nếu cần có các đậm độ pha loãng tiếp theo, mỗi đậm độ cấy hai đĩa. - Sản phẩm dạng khác: cho vào 2 đĩa petri, mỗi đĩa 1ml đậm độ pha loãng ban đầu (10-1), tương tự với các đậm độ pha loãng tiếp theo, mỗi đậm độ cấy hai đĩa. Rót vào mỗi đĩa 10-15 ml thạch TSC( Đã đun chảy và để nguội tới 450), trộn đều bằng cách xoay nhẹ đĩa theo hai chiều trái, phải. Để đông tự nhiên, sau đó phủ lên trên bề mặt thạch của mỗi đĩa 10ml thạch màng TSC. Để đông. Ủ ám trong điều kiện kỵ khí ở 35 – 37oC / 20h ± 2h  Đếm và chọn khuẩn lạc - Chọn tất cả các đĩa có ≤ 150 khuẩn lạc. - Nếu hai đĩa của cùng một đậm độ có ít hơn hoặc bằng 150 khuẩn lạc điển hình, đếm tổng số khuẩn lạc trên cả hai đĩa và lấy giá trị trung bình. - Nếu bốn đĩa của hai đậm độ liên tiếp có từ 15-150 khuẩn lạc điển hình, tính giá trị trung bình của hai đậm độ. Nếu tỷ số giữa giá trị trung bình cao hơn của hai đĩa cùng một đậm độ trên giá trị trung bình thấp hơn của đậm độ liền kề lớn hơn 2 thì lấy giá trị trung bình thấp hơn. - Nếu đĩa cấy bị đen hoặc không thể đếm được các khuẩn lạc riêng rẽ thì đếm các đĩa của độ pha loãng cao hơn kế tiếp. Đếm số khuẩn lạc điển hình trên mỗi đĩa và chọn ra 5 khuẩn lạc để thử khẳng định sinh hoá.  Thử khẳng định sinh hoá a) Khả năng di động: trên môi trường nitrat di động, nuôi cấy trong điều kiện kỵ khí, 35-37oC/ 24h. Sau đó thử phản ứng chuyển nitrat thành nitrit: 31
  33. Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4 - Nhỏ 0,2-0,5 ml thuốc thử phát hiện nitrit lên môi trường nitrat di động / 15 phút. Nếu sau 15 phút mà không thấy xuất hiện màu đỏ thì thêm một lượng nhỏ bụi kẽm và để yên 10 phút.Nếu vẫn không thấy xuất hiện màu thì kết luận phản ứng dương tính . Lưu ý: phản ứng này phải làm trong hốt. b) Khả năng lên men lactose và hoá lỏng gelatin: cấy vi sinh vật vào môi trường lactose – gelatin. Nuôi cấy kỵ khí ở 35 – 37oC / 24h. Nếu môi trường chuyển sang màu vàng là vi khuẩn đã lên men đường lactose. Làm lạnh 1h các ống nuôi cấy ở 5oC và kiếm tra sơ bộ sự hoá lỏng gelatin Nếu môi trường vẫn ở dạng đặc thì để thêm 24 h nữa.  Tính kết quả: - Nếu số khuẩn lạc thử khẳng định sinh hoá đúng lớn hơn hoặc bằng 80% tổng số khuẩn lạc đã đếm thì toàn bộ số khuẩn lạc này được coi là Cl. perfringens. - Trong tất cả các trường hợp khác, số khuẩn lạc Cl. perfringens được tính như sau: - Ví dụ: Số khuẩn lạc trung bình trên hai đĩa là 75 Số khuẩn lạc chọn để thử khẳng định là 10 Số khuẩn lạc xác định đúng là 6 (60%) Số khuẩn lạc Cl. perfringens = 75 x 0,60 = 45 - Chỉ để lại hai chữ số có nghĩa trong kết quả cuối cùng: - Nếu số đó nhỏ hơn 100 thì làm tròn bằng bội số của 5 gần nhất. - Nếu số đó lớn hơn 100 và tận cùng bằng 5 thì làm tròn bằng bội số của 20 gần nhất. - Nếu số đó lớn hơn 100 nhưng không tận cùng bằng 5 thì làm tròn bằng bội số của 10 gần nhất. - Để đánh giá những số thấp, lấy giá trị trung bình của phép đếm khuẩn lạc điển hình đã xác định và làm tròn tới số nguyên lớn nhất liền đó và đem nhân với giá trị nghịch đảo của độ pha loãng.  Báo cáo kết quả - Nêu rõ phương pháp đã áp dụng, nhiệt độ nuôi cấy và kết quả ghi nhận được cũng như tất cả các chi tiết có thể có ảnh hưởng đến kết quả. 32
  34. Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4 SƠ ĐỒ ĐỊNH LƯỢNG C. PERFRINGENS Clostridium perfringens (C.welchii)- Phương pháp định lượng SƠ ĐỒ ĐỊNH LƯỢNG C. PERFRINGENS Mẫu thử dạng lỏng Mẫu thử dạng khác nguyên (10-1) 1ml 1ml 2 đĩa thạchTSC 2 đĩa thạch TSC 35 – 370C/ 20h 35 – 370C/20h Kỵ khí Kỵ khí Đếm khuẩn lạc 5 khuẩn lạc/đĩa Khẳng định sinh hoá Di động(-) Nitrat thành nitrit(+) Lên men sinh hơi lactose (+) Hoá lỏng gelatin(+) 35-370C/24h, 10-15 phút 35 – 370C/24 – 48h Tính kết quả 33
  35. Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4 SHIGELLA SPP SHIGELLOSIS - Là bệnh nhiễm trùng do Shigella gây nên - 1994: 500 000 - 800 000 người Rwanda mắc S.dysenteriae typ 1, chỉ tháng đầu đã có 20 000 người chết (kháng kháng sinh) - Khoảng 18000 người mắc/năm (Mỹ) - Xảy ra ở mùa hè nhiều hơn mùa đông - Thường gặp ở trẻ nhỏ, đặc biệt từ 2 – 4 tuổi LỊCH SỬ - Phát hiện cách đây hơn 100 năm - Người phát hiện: nhà khoa học Nhật bản (Shiga) PHÂN LOẠI Lớp: Gamma Proteobacteria Bộ: Enterobacteriales Họ: Enterobacteriaceae Giống: Shigella Loài: - S. boydii thuộc nhóm C - S. dysenteriae thuộc nhóm A(typ I đặc biệt nguy hiểm vì lan truyền thành dịch, có thể tử vong) - S. flexneri thuộc nhóm B - S.sonnei thuộc nhóm D KHẢ NĂNG GÂY BỆNH - Sinh hai loại độc tố ruột ShET1 và ShET2 - S.dysenteriae typ 1 sinh độc tố tế bào độc tính cao là Shigatoxin (verotoxin): phá hủy màng trong mao quản dẫn tới thiếu máu cục bộ tại các mô của ruột non DỊCH TỄ HỌC Tác nhân: Giống Shigella  4 loài: • S. sonnei, (D) • S. boydii, (C) • S. flexneri, (B) • S. dysenteriae (A) 34
  36. Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4 Nơi cư trú: Người - S.flexneri là nguyên nhân chính ở các nước đang phát triển( 60%) - S.sonnei (15%), thường gặp ở các nước công nghiệp phát triển - S.dysentariae thường gặp ở Nam Á, Phi 6%) - Các type khác nhau phân bố khác nhau: S.dysenteriae typ 1 thường gặp ở Ấn độ, Malaysia, Guatemala, typ 4,5,6,7,9,10 thường gặp ở các nước đang phát triển Kiểu lây truyền • Người – Người – Phân- Miệng, Miệng – Sinh dục • Nguồn lây nhiễm: nước/thực phẩm ô nhiễm Thời gian ủ bệnh • Trung bình: 1-3 (tới 4) ngày • Triệu chứng có thể kéo dài từ 12 đến 96 giờ hoặc đến hàng tuần Tính chất lây nhiễm • Dễ dàng truyền từ người sang người • Liều gây bệnh thấp: 10 đến 100 vi khuẩn • Có khả năng lây nhiễm qua người lành mang vi khuẩn Kháng sinh • Trường hợp nhẹ không cần sử dụng  Hầu hết tự khỏi sau 48-72 h • Vai trò của kháng sinh:  Giảm thời gian đi tiêu chảy, ngăn ngừa thải vi khuẩn qua phân  Ngăn chặn bệnh lây lan Các vấn đề liên quan đến sức khỏe cộng đồng • Có thể xảy ra thành dịch  Điều kiện sống, mật độ dân số  Lý do: tính chất lây nhiễm • Gia tăng mức độ kháng kháng sinh • Không có Vacxin BIỂU HIỆN LÂM SÀNG Bệnh sinh, tỷ lệ mắc và chết phụ thuộc vào: – Vật chủ – Type huyết thanh của vi khuẩn 35
  37. Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4 Lâm sàng – Không biểu hiện triệu chứng – Sốt,nôn, đau quặn bụng, nôn mửa, ỉa máu mũi – Co giật, thủng ruột – Hội chứng Reiter’s: khoảng 3% người mắc bệnh do S.flexneri bị đau mắt, viêm đường tiết niệu hàng tháng /hàng năm sau, và có thể dẫn tới viêm khớp cấp (người dễ nhiễm, có tính di truyền) SHIGELLA SPP * ĐIỂM VÀ PHÂN BỐ - Trực khuẩn Gram âm - Không di động - Không sinh bào tử - Không lên men đường lactose - Có quan hệ gần gũi với E.coli (E.coli (EHEC) đặc biệt là E.coli O157 :H7 sinh độc tố shiga giống S.dysenteriae - Phân bố rộng rãi trong tự nhiên * KHẢ NĂNG GÂY BỆNH - Gây hội chứng lỵ: đau bụng, ỉa máu, sốt, nôn - Gây bệnh ở người và loài linh trưởng - Nguồn lây nhiễm: các loại rau củ bón phân tươi, nước ô nhiễm phân PHÁT HIỆN SHIGELLA SPP * Nguyên lý phương pháp - Phát hiện Shigella spp. trong mẫu thử bằng cách xác định khuẩn lạc điển hình trên môi trường chọn lọc, có các phản ứng sinh hóa và huyết thanh đặc trưng trong phép thử khẳng định * Phạm vi áp dụng - Thực phẩm và thức ăn gia súc * Thiết bị, dụng cụ - Sử dụng các thiết bị thông thường của phòng thí nghiệm vi sinh, các thiết bị cần thiết để xử lý mẫu thử : 36
  38. Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4 - Tủ sấy 180 – 2000C - Nồi hấp áp lực - Tủ ấm 25 – 30 ±1oC - Đĩa petri đường kính 90 – 100ml - Pipet có vạch đã vô trùng loại xả hết 1,5,10 ml - Nồi cách thuỷ, nhiệt độ 42 70 ±1oC - Bình thuỷ tinh vô trùng, dung tích 250 – 500ml - Ống nghiệm vô trùng 16 – 18 mm - pH met, chính xác đến 0,1 đơn vị pH ở 25oC * Môi trường, thuốc thử - Canh thang Shigella - Thạch Macconkey - Thạch Xylose Lysine Desoxycholate (XLD) - Thạch Hektoen Enteric - Thạch dinh dưỡng - Thạch Triple Ion Sugar (TSI) - Môi trường LDC, ODC - Môi trường Bromocresol tía - Thuốc thử Kovacs, β-galactosidase, ONPG - Kháng huyết thanh Shigella * CÁCH TIẾN HÀNH 1. Chuẩn bị mẫu thử và dung dịch huyền phù ban đầu: - 25g mu thử đã đồng nhất trong 225 ml canh thang Shigella hoặc trypton soya có bổ sung 0,5 µg/ml novobiocin để được dung dịch huyền phù ban đầu - Lưu ý: mẫu thử cần được phân tích ngay vì Shigella spp. dễ chết trong điều kiện không thuận lợi 2. Tăng sinh - Ủ canh thang Shigella ở 41,5 ± 1oC từ 16 – 24 giờ 3. Cấy chuyển lên môi trường chọn lọc - Macconkey - XLD - Hektoen Enteric - Ủ ở 37 ± 1oC từ 20 – 24 giờ 37
  39. Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4 4. Nhận dạng khuẩn lạc trên môi trường chọn lọc - Trên Macconkey: KL nâu đỏ, trong mờ, không lên men đường lactose. Riêng Shigella sonnei có thể có màu hồng nhạt - Trên XLD: trong mờ, tâm màu đỏ, không lên men đường lactose - Trên HE: khuẩn lạc ướt, màu xanh lá cây. Riêng Shigella sonnei có khuẩn lạc lồi. - Trên môi trường Deoxycholate Citrate Agar, khuẩn lạc Shigella có màu đỏ nhạt (môi trường có màu đỏ cam, hơi đục). 5. Phép thử khẳng định - Mỗi đĩa chọn 5 khuẩn lạc nghi ngờ - Cấy các khuẩn lạc riêng rẽ lên thạch dinh dưỡng, ủ ở 37 ± 1oC từ 18 – 24 giờ để thử khẳng định sinh hóa và huyết thanh * Thử khẳng định sinh hóa: - Lên men đường và sinh H2S: cấy vào thạch ống TSI, ủ ở 37 ± 1oC/24 ± 3 giờ - Di động: cấy vào ống thạch mềm, ủ ở 37 ± 1oC/ 18 - 24 giờ - Phân giải Ure: cấy vào thạch ống hoặc canh thang Ure, ủ ở 37 ± 1oC/24 ± 3 giờ - Phát hiện Lysinedecarboxylase: cấy vào MT LDC, ủ ở 37 ± 1oC/24 ± 3 giờ - Phát hiện Ornithinedecarboxylase: cấy vào MT ODC, ủ ở 37 ± 1oC/24 ± 3 giờ - Sinh Indol: Cấy khuẩn lạc cần xác định vào MT trypton/tryptophan, ủ ở 37 ± 1oC/24 ± 3 giờ, sau đó cho thêm 1 ml thuốc thử Kovacs - Phát hiện β- galactosidase: cấy một ăng khuẩn lạc vào 0,25 ml NaCl 0,85%. Nhỏ 1 giọt Toluen và lắc đều, để ở 37oC/vài phút. Sau đó thêm 0,25 ml thuốc thử ONPG và lắc đều, để ở 37 ± 10C/24 ± 3 giờ - Sử dụng Carbonhydrate: cấy vào canh thang Carbonhydrate, ở 37 ± 1oC/24 ± 3 giờ * Thử khẳng định với kháng huyết thanh đặc hiệu:KN O(A,B,C,D) - Shigella spp. Không di động, không có kháng nguyên lông. Việc phân biệt các chủng dựa trên phản ứng ngưng kết với kháng nguyên O đa giá và đơn giá đặc hiệu - Cấy chuyển khuẩn lạc cần xác định lên thạch dinh dưỡng, ủ ở 37 ± 1oC/24 giờ 38
  40. Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4 * Loại trừ các chủng tự ngưng kết: - Nhỏ 1 giọt NaCl 0,85% lên lam kính - Dùng que cấy lấy một ít KL, nghiền đều - Lắc nhẹ trong 30 – 60 giây - Nếu thấy có hạt ngưng kết thì bỏ đi không thử tiếp * Ngưng kết với kháng nguyên O - Làm tương tự, thay NaCl 0,85% bằng kháng nguyên O đa giá - Nếu ngưng kết với kháng nguyên O đa giá thì thử tiếp với các loại kháng nguyên đơn giá để định typ nếu có điều kiện (A,B,C,D) - Nếu có kháng nguyên bề mặt K: đun sôi dịch vi khuẩn 30 phút, sau đó thử lại với KN O đa giá và đơn giá - Báo cáo kết quả - Nêu rõ phương pháp sử dụng và kết quả thu được, kể cả những thông tin chi tiết về phép thử ShigellaShigella spp. Thử nghiệm sinh Kết quả Thử nghiệm sinh Kết quả hóa hóa Simmon citrate - Salicine - Arginine - Xylose - decarboxylase Lisine decarboxylase - Cellobiose - Urease - Adonitol - Malonate - Dulcitol - MR + Inositol - VP - 39
  41. Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4 SALMONELLA ĐẶC ĐIỂM PHÂN BỐ - Trực khuẩn Gram (+) - Di động - Không sinh nha bào - Phân bố rộng rãi trong tự nhiên - Nguồn lây nhiễm: động vật nuôi, đặc biệt gia cầm, đất nước - Thực phẩm nguy cơ cao: thịt và sản phẩm từ thịt, sữa và sản phẩm từ sữa, rau, quả bị ô nhiễm trong quá tình sản xuất, chế biến KHẢ NĂNG GÂY BỆNH - Là nguyên nhân gây nhiễm trùng máu, sốt thương hàn, viêm dạ dày ruột - Triệu chứng: đau quặn bụng, ỉa chảy, sốt đau đầu, đôi khi viêm khớp sau 3-4 tuần - Thời gian ủ bệnh: 6 - 48h PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN SALMONELLA NGUYÊN LÝ PHƯƠNG PHÁP Phát hiện Sal trong mẫu thử bằng cách xác định các khuẩn lạc điển hình trên môi trường chọn lọc và có các PƯSH và huyết thanh đặc trưng cho phép thử khẳng định. PHẠM VI ÁP DỤNG: Thực phẩm và thức ăn chăn nuôi TÀI LIỆU TRÍCH DẪN DỤNG CỤ - THIẾT BỊ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY, THUỐC THỬ VÀ HUYẾT THANH - Nước đệm pepton - Môi trường Magie clorua – lục malachit - Môi trường Selenit – cystin - Thạch đỏ phenol – lục sáng 40
  42. Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4 - Thạc Hektoen enteric ( Hektoen Enteric Agar) - Thạch dinh dưỡng ( Nutrient agar) - Thạc 3 đường sắt ( TSI agar) - Thạch Ure (Ure christensen Agar) - Thạc dinh dưỡng bán đặc - Môi trường L – Lysin decacboxyl - Thuốc thử - Galactosidase - Thuốc thử Voges – Proskauer ( VP ) - Thuốc thử Indol - Thuốc thử Kovacs Tiền tăng sinh trong môi trường lỏng không chọn lọc: 25g mẫu thử đã đồng nhất cấy vào 225ml nước đệm pepton, ủ ở 35- 37oC/ 16-20h. Tăng sinh trong môi trường lỏng chọn lọc: - Cấy chuyển 0,1ml dịch nuôi cấy trong môi trường lỏng không chọn lọc vào ống nghiệm có sẵn 10ml môi trường Rappaport Vassiliadis (RV), ủ ở 42oC/ 24h. - Cấy chuyển 10ml dịch nuôi cấy trong môi trường lỏng không chọn lọc vào bình có sẵn 100ml môi trường Selenit Cystin, ủ ở 35-37oC/ 24-48h. Nhận dạng khuẩn lạc Sallmonella trên môi trường thạc chọn lọc: - Trên thạch đỏ phenol lục sáng: khuẩn lạc đục, làm thay đổi màu môi trường từ hồng sang đỏ. - Trên thạch Nektoen Enter: khuẩn lạc Salmonella điển hình thường màu xanh, có tâm đen hoặc không. - Lưu ý: Nếu Salmonella mọc yếu hoặc không có khuẩn lạc điển hình o thì phải ủ tiếp ở 35-37 C/ 24h nữa và kiểm tra lại. Thử phản ứng sinh hóa: - Cấy chuyển từng khuẩn lạc đã chọn vào các môi trường TSI, thạch Ure , môi trường Lysin decacboxyl, môi trường VP, Trypton – Tryptonphan o và NaCl 0,85%, ủ ở 37 C/ 24h để thử các tính chất sau: + Lên men đường glucose, saccarose, lactose + Khả năng sinh H2S 41
  43. Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4 + Khả năng phân giải Ure + Phát hiện – galactosidase + Phản ứng VP + Khả năng sinh Indol Thử khẳng định với kháng huyết thanh đặc hiệu: 42
  44. Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4 LISTERIOSIS MONOCYTOGENES LISTERIOSIS Triệu chứng: - Giống triệu chứng ban đầu của cúm - Nhiễm trùng huyết, viêm màng não, viêm não, nhiễm trùng tử cung và cổ tử cung ở người có thai LISTERIA VÀ LISTERIOSIS - Là bệnh nhiễm trùng, nhiễm độc;Có một vài hội chứng ở những người nhạy cảm - Thời gian ủ bệnh:7-60 ngày - Thời gian mắc bệnh có thể ngắn hoặc dài - Hầu hết là ca mắc lẻ tẻ , đôi khi trở thành vụ ngộ độc - Không xâm nhập dạ dày ruột:nhẹ, giống cúm, không có đặc điểm rõ ràng - Xâm nhập dạ dày ruột:nhiễm trùng huyết, viêm não -màng não, xảy thai,đẻ non, viêm màng trong tim, viêm khớp,viêm tủy xương, viêm màng phổi, viêm phúc mạc - Thực phẩm nguy cơ: xúc xích không xử lý nhiệt, thịt hộp, pho mat mềm, xà lách trộn sữa tươi, kem, rau, hải sản - Kiểm soát: vệ sinh chế biến, ngăn ngừa ô nhiễm chéo, chế biến TP đúng cách NƠI CƯ TRÚ - Cư trú tự nhiên trong đất, nước, nước thải, thực vật thối rữa, thức ăn gia súc ủ - Tồn tại trong môi trường cao hơn các vi khuẩn không sinh bào tử khác - Có thể cư trú, tồn tại và nhân lên trong môi trường; gắn và hình thành màng sinh học NGUỒN LÂY NHIỄM • Môi trường, dụng cụ, thiết bị, sản xuất, bao gói, thực hành vệ sinh người chế biến • Nguồn lây nhiễm chính:quá trình sản xuất bị ô nhiễm 43
  45. Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4 ĐƯỜNG LÂY TRUYỀN • Qua đường tiêu hóa • Nhiều động vật mang vi khuẩn nhưng không có triệu chứng • Nguy cơ cao: các loại thực phẩm chưa chế biến như sữa tươi, thịt, cá và các loại đã chế biến như cá hun khói, phomat, xúc xích PHÁT TRIỂN • Có khả năng chịu đựng cao với tác động của nhiệt độ cao, lạnh, khô so với các vi sinh vật không sinh bào tử khác • Phát triển được ở nhiệt độ bảo quản lạnh • Có thể hình thành màng sinh học và tạo thành chỗ náu NUÔI CẤY • Hiếu khí • Nhiệt độ phát triển: -0.4 to 45°C • pH 4.39 – 9.4 • Nước hoạt tính ≥ 0.92 • Nồng độ muối ≤ 10% PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN LISTERIA MONOCYTOGENES Nguyên lý phương pháp Phát hiện những vi sinh vật tạo thành những khuẩn lạc điển hình trên môi trường thạch chọn lọc, có những đặc tính về hình thái, sinh lý, sinh hoá đặc trưng phù hợp Phạm vi áp dụng: Phát hiện Listeria monocytogenes trong thực phẩm và thức ăn gia súc. THIẾT BỊ - DỤNG CỤ Sử dụng các thiết bị thông thường của phòng thí nghiệm vi sinh, các thiết bị cần thiết để xử lý mẫu thử: - Tủ sấy 180 – 200°C - Nồi hấp áp lực 44
  46. Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4 - Tủ ấm 25 ±1°C, 30 ±1°C, 35 ±1°C hoặc 37 ±1°C - Đĩa petri đường kính 90 – 100ml - Pipet có vạch đã vô trùng loại xả hết, dung tích 1,10 ml - Nồi cách thuỷ, nhiệt độ 47 ± 2°C - Que cấy platinum/iridum hoặc nikel/chromium, đường kính 3 mm. - Bình thuỷ tinh vô trùng, dung tích 250 – 500ml - Ống nghiệm vô trùng 16 – 18 mm - pH met, chính xác đến 0,01 đơn vị pH ở 25°C. - Xy lanh dung tích 50 ml tới 1000 ml - Bình nuôi cấy kỵ khí. - Túi tạo khí trường vi hiếu khí: 5% - 12% CO2 , 5 – 15% O2, 75 % N2 MÔI TRƯỜNG – THUỐC THỬ • Môi trường thạch Oxford • Môi trường thạch Palcam • Canh thang Fraser • Thạch Trypton soya yeast extract • Canh thang Trypton soya yeast extract • Môi trường thạch máu • Thạch di động • Canh thang Rhamnose và Xylose • Dung dịch hydrogen peroxit • Dung dịch đệm phosphat CÁCH TIẾN HÀNH Chuẩn bị mẫu thử và đậm độ pha loãng ban đầu: - Thực phẩm lỏng: Hút 25 ml mẫu thử cho vào bình có sẵn 225 ml canh thang Fraser (Đậm độ 10-1). Lắc đều. - Thực phẩm dạng khác: Cân 25 g mẫu thử cho vào bình có sẵn 225 ml canh thang Fraser (Đậm độ 10-1). Lắc đều. Nuôi cấy: Tăng sinh lần 1: Ủ ấm dung dịch huyền phù ban đầu (Đậm độ 10-1) ở 30°C trong 24 h ± 2 h Lưu ý: Dung dịch huyền phù có thể xuất hiện màu đen trong quá trình ủ ấm 45
  47. Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4 Tăng sinh lần 2: Dùng pipet chuyển 0,1 ml dung dịch huyền phù ban đầu đã ủ ấm ở 30°C trong 24h ± 2h vào ống nghiệm sẵn có 10 ml môi trường tăng sinh Fraser, ủ ấm ở 35 - 37°C trong 48 h ± 2h Nuôi cấy trên môi trường thạch chọn lọc - Dùng que cấy lấy một ăng môi trường tăng sinh Fraser đã ủ ấm ở 35 - 37°C trong 48 h ± 2 h cấy lên hai đĩa thạch chọn lọc sao cho các khuẩn lạc mọc riêng rẽ và có thể dễ dàng quan sát hình thái: - Thạch đĩa Oxford: ủ ấm ở 30°C, 35°C hoặc 37C từ 18 – 24h trong điều kiện hiếu khí. - Thạch đĩa PALCAM: ủ ấm ở 30°C, 35°C hoặc 37°C từ 18 – 24h trong điều kiện vi hiếu khí. - Lặp lại quá trình trên với hai đĩa thạch chọn lọc ( Oxford agar và PALCAM agar) bằng phương pháp cấy láng, sử dụng que cấy gạt. Nhận định khuẩn lạc trên môi trường chọn lọc: • Trên thạch đĩa Oxford: - Khuẩn lạc Listeria spp điển hình sau 24 h nuôi cấy thường nhỏ, đường kính khoảng 1 mm, màu xám có quầng đen bao quanh. Sau 48 h khuẩn lạc sẫm màu hơn, có thể hơi lục sáng, đường kính khoảng 2 mm, có quầng đen và lõm ở tâm. • Trên thạch đĩa PALCAM: - Những đĩa nuôi cấy trong điều kiện vi hiếu khí, sau thời gian ủ ấm bỏ ra ngoài 1 h để môi trường trở lại màu hồng hoặc tím đỏ. Sau 24 h, khuẩn lạc Listeria spp thường nhỏ hoặc rất nhỏ, màu hơi lục hoặc vàng lục, đường kính khoảng 1,5 - 2 mm, có quầng đen bao quanh, đôi khi có tâm đen. Sau 48 h, khuẩn lạc Listeria spp có màu xanh lá cây, đường kính khoảng 1,5 – 2 mm, tâm lõm, có quầng đen bao quanh. Thử khẳng định: Chọn khuẩn lạc • Trên mỗi đĩa thạch chọn 5 khuẩn lạc nghi ngờ để xác định Listeria spp. Nếu trên một đĩa, số khuẩn lạc nghi ngờ ít hơn 5 thì chọn tất cả số khuẩn lạc để thử khẳng định. 46
  48. Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4 Xác định trên môi trường thạch Tryptone soya yeast extract • Dùng que cấy cấy chuyển các khuẩn lạc nghi ngờ lên thạch đĩa Tryptone soya yeast extract sao cho các khuẩn lạc có thể mọc riêng rẽ. Ủ ấm ở 300C, 350C hoặc 370C từ 18 – 24 h. • Khuẩn lạc Listeria spp trên môi trường Tryptone soya yeast extract có đường kính từ 1 – 2 mm, lồi, màu nhạt, đục, bờ đều. Thử tính chất SVHH: - Catalase (+) - Di động: hình ô hướng lên trên ở 25°C/48h - Trực khuẩn Gr (+) - Phân giải hồng cầu cừu dạng beta ở 35 – 37°C/ 24h - Lên men đường Rhamnose và Xylose - CAMP test (+) CAMP Test - Là tên viết tắt của ba tác giả: Christie, Atkins, and Munch-Petersen) phát hiện ra Streptococci nhóm B có một loại protein gọi là yếu tố CAMP hoặc “Protein B”, protein này có khả năng tương tác với beta – hemolysin được sinh ra bởi Staphylococcus aureus, kết quả là làm tăng kích thước vùng tan máu - Trong số các loài Listeria, có một vài loài có phản ứng CAMP dương tính nhưng chỉ có L. monocytogenes gây bệnh ở người - Trong số các loài Listeria, có một vài loài có phản ứng CAMP dương tính nhưng chỉ có L. monocytogenes gây bệnh ở người - Phản ứng CAMP được thực hiện trên thạch máu cừu với các chủng không tan máu và tan máu beta - Độ sâu của đĩa thạch máu dùng cho phản ứng CAMP vào khoảng 1.5mm - Các chủng vi khuẩn sử dụng cho phản ứng CAMP là L. ivanovii, Rhodococcus equi, S. aureus. - Kết quả dương tính khi quan sát thấy vùng tan máu hình mũi tên ở khu vực giáp giới giữa đường cấy Listeria monocytogenes và chủng vi khuẩn tan máu beta. 47
  49. Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4 CAMP Test • Sơ đồ nuôi cấy trên thạch máu. Đường thẳng đứng R: nuôi cấy R. equi. Đườn thẳng đứng S: nuôi cấy S. aureus. Đường thẳng ngang là các nuôi cấy thử nghiệm. Vùng gạch bóng là vùng phân giải hồng cầu. • Vùng có đường chấm chấm là ảnh hưởng do nuôi cấy S. aureus • Narrow band of haemplysis: Dải mũi tên biểu thị phân giải hồng cầu kiểu ß • No haemolysis:Không phân giải hồng cầu • Wide band of haemolysis: Dải rộng do phân giải hồng cầu kiểu ß 48
  50. Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4 CAMPYLOBACTER PHÂN LOẠI - Thuộc họ Campylobacteriaceae - Có 5 loài Campylobacter thường gặp. C. sputorum, biovar sputorum – là một phần của hệ VSV miệng ở người C. fetus, ssp. fetus C. fetus, ssp. venerealis C. jejuni C. coli Kích thước quá nhỏ nên có thể đi qua lọc vi khuẩn Là nguyên nhân phổ biến gây viêm dạ dày ruột do vi khuẩn ở các nước phát triển Riêng ở Mỹ:~2.5 million cas mắc/năm Các vụ ngộ độc thực phẩm thường liên quan với tiêu thụ gia cầm, thịt và sữa không thanh trùng • 1998–2002: 61 vụ với 1,440 người mắc • Vụ lớn nhất do nguồn nước ô nhiễm ~3,000 cas • Vụ lớn nhất do sữa ô nhiễm ~1,600 cas ở California 2006 ĐẶC ĐIỂM • Hình dấu phảy, chữ S hoặc hình cánh chim, Gram âm. • Di động bằng roi ở một đầu • Không có vỏ và bào tử • Phát triển trong điều kiện vi hiếu khí NƠI CƯ TRÚ • 3 loài Campylobacter C. jejuni, C. coli,và C. lari chiếm 99% nguyên nhân gây bênh ở người • Campylobacter thường cư trú ở đường ruột, ống mật của động vật nuôi, đặc biệt là gà, trâu bò, và lợn (nhiễm trùng không triệu chứng) ĐƯỜNG LÂY TRUYỀN • Phân • Thực phẩm nguy cơ cao: thịt, sữa NUÔI CẤY • Điều kiện vi hiếu khí (5% O2) và (10% CO2) • Nhiệt độ 42℃ • Trên các môi trường chọn lọc 49
  51. Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4 • Hai dạng khuẩn lạc Ướt, lan Khô và lồi • Sau 48 giờ nuôi cấy có thể xuất hiện khuẩn lạc nhỏ, trong mờ ĐỘC TỐ - TRIỆU CHỨNG • Hai loại độc tố: - Enterotoxin - Endotoxin • Triệu chứng: - Viêm dạ dày ruột: C.jejuni, C.coli - Nhiễm trùng: C.fetus KHẢ NĂNG GÂY BỆNH Ở NGƯỜI • Thường gây tiêu chảy ở trẻ em • 90% do C.jejuni và C.coli • Liều gây bệnh thấp • Thời gian ủ bệnh: 2 – 5 ngày, đôi khi có thể tới 10 ngày KHẢ NĂNG PHÁT TRIỂN • Dễ chết ở điều kiện khô, lạnh và trên 48oC • Phát triển được ở pH 4,9 • Phát triển tốt ở pH 5,5 – 8,0 • Phát triển tối ưu ở pH 6,5 – 7,5 PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CAMPYLOBACTER Nguyên lý phương pháp • Phân lập và xác định Campylobacter nuôi cấy trên môi trường chọn lọc trong khí trường vi hiếu khí ở 420C bằng các thử nghiệm sinh hoá học đặc trưng. Phạm vi áp dụng • Thực phẩm và các sản phẩm thực phẩm. Tài liệu viện dẫn 52 TCN – TQTP 0014 : 2005 50
  52. Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4 THIẾT BỊ-DỤNG CỤ - Máy đồng nhất mẫu, 10.000 – 20.000 vòng/phút - Tủ sấy 180 – 200oC - Nồi hấp áp lực - Tủ ấm 42 ±1oC - Đĩa petri đường kính 90 – 100ml - Bình nuôi cấy kị khí và túi tạo khí trường vi hiếu khí - Bình thuỷ tinh vô trùng, dung tích 250 – 500ml - Ống nghiệm vô trùng 16 – 18 mm pH met hoặc giấy đo pH - Túi đồng nhất mẫu có rãnh lọc - Que cấy, đầu niken/crom hoặc platin. Que cấy thuỷ tinh HÓA CHẤT-MÔI TRƯỜNG - Canh thang Preston - Thạch Charcoal cefoperazone desoxycholate - Thạch 5%máu thỏ (hoặc bò) - Thành phần bổ sung vào môi trường cơ sở - Thạch dinh dưỡng - Dung dịch Oxy già (H2O2 3%) - Dung dịch Natri hippurat 1% - Dung dịch Ninhydrin 3,5% - Dung dịch thử Oxydase - Bộ thuốc nhuộm Gram CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH * Tăng sinh trong canh thang Preston • Cân 25 g thực phẩm, cắt nhỏ, xay nhuyễn hoặc dập bằng máy dập mẫu ở điều kiện vô trùng trong canh thang tăng sinh Preston cho tới khi đươc thể đồng nhất. Sau đó cho vào bình kỵ khí và tạo khí trường vi hiếu khí bằng túi tạo khí (chuẩn bị theo hướng dẫn trên túi tạo khí), đậy chặt nắp bình và ủ ấm ở 42oC từ 24 – 48 * Cấy chuyển lên môi trường thạch chọn lọc CCD • Cấy lên hai đĩa thạch chọn lọc CCD, mỗi đĩa 1 ăng canh thang tăng sinh chọn lọc, ủ trong điều kiện vi hiếu khí như bước trên, ủ ấm 42oC từ 24 – 48 giờ để nhận dạng khuẩn lạc nghi ngờ. 51
  53. Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4 • Khuẩn lạc nghi ngờ là Campylobacter dẹt, bóng, thường mọc lan, có màu từ xám kem nhạt đến xám xanh. * Cấy chuyển lên môi trường thạch máu • Từ khuẩn lạc nghi ngờ trên môi trường thạch CCD, dùng que cấy ria sang môi trường thạch 5% máu bò hoặc thỏ. Ủ ấm trong điều kiện vi hiếu khí ở 42oC/24 giờ để thử khẳng định bằng các phản ứng sinh hoá. * T hử khẳng định: Bằng khuẩn lạc vi khuẩn nghi ngờ cấy trên môi trường thạch máu • Hình thể vi khuẩn - Nhuộm Gram và soi trên kính hiển vi xác định hình thể vi khuẩn. Campylobacter là vi khuẩn Gram âm (bắt màu đỏ), có hình lượn sóng hoặc hình cánh chim. Trường hợp vi khuẩn nuôi cấy để quá 48 h và có sự tiếp xúc với oxy không khí, Campylobacter chuyển sang dạng hình cầu. • Phản ứng Catalase - Nhỏ một giọt H2O2 3% lên lam kính, dùng que cấy lấy một khuẩn lạc đặt vào giữa giọt H2O2. Nếu thấy sủi bọt là phản ứng dương tính. • Phản ứng Oxydase - Đặt một tờ giấy lọc nhỏ lên lam kính. Dùng que thuỷ tinh hoặc que gỗ vô trùng lấy một ít khuẩn lạc phết lên tờ giấy lọc. Nhỏ vài giọt thuốc thử Oxydase lên, đọc kết quả trong 10 giây đầu. - Phản ứng thuỷ phân Natri hippurat (phân biệt Campylobacter jejuni với các loài Campylobacter khác) - Dùng que cấy lấy một ít khuẩn lạc trên môi trường thạch máu cho vào ống nhựa 2 ml đã có sẵn dung dịch Natri hippurat 1% và nghiền đều cho đến khi dung dịch có màu sữa, đem ủ ấm ở 37oC/2 giờ. Sau đó lấy ra cho từ từ 200µl dung dịch Ninhydrin 3,5% bằng cách chạm nhẹ pipet vào thành ống để lớp dung dịch này nổi ở bên trên. Ủ ấm lần nữa ở 37oC trong 10 phút và lấy ra đọc kết quả. - Phản ứng dương tính: xuất hiện màu tím sẫm hoặc xanh. - Phản ứng âm tính: không màu hoặc màu xám. TIÊU CHUẨN XÁC ĐỊNH • Gram âm, hình lượn sóng hoặc hình cánh chim • Catalase dương • Oxydase dương 52
  54. Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4 BÁO CÁO KẾT QUẢ • Nêu rõ phương pháp đã dùng và có hay không có Campylobacter trong 25 gam sản phẩm kiểm nghiệm, các thông tin về mẫu thử cũng như các điều kiện khác với tiêu chuẩn này. 53
  55. Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4 TỔNG KẾT VI SINH THỰC PHẨM II CÁC TÍNHCHẤT PHƯƠNG PHÁP NGUYÊN LÝ TIẾN HÀNH ĐIỂN HÌNH TRÊN NHẬN ĐỊNH KẾT TÍNH KẾT QỦA MTCL QUẢ -KT đổ đĩa Pha loãng bằng các 48 h đếm sơ bộ Có hay không các đĩa Chọn đĩa 150 – 300 KL của hai 0 -Ủ hiếu khí 37±1 C dung dịch pha loãng 72h đếm chính thức thỏa mãn yêu cầu đậm độ liên tiếp để tính KQ - 48-72h thông thường theo Kết quả tính theo số công thức: KL C  N = ( n 0 ,1 xn ) d 1 2 TỔNG SỐ 10g(10ml) + 90 ml Tất cả các khuẩn lạc Chọn đĩa 15 – 300 KL Giá trị cao/giá trị thấp >2 lấy VKHK dung dịch pha loãng mọc hiếu khí(kể cả đậm độ thấp hơn để tính kết Mỗi đậm độ cấy 2 đĩa men, mốc) quả theo trung bình cộng Mỗi đĩa 1 ml Nuôi cấy ít nhất 3 đậm Không có dạng khuẩn Chọn hai đậm độ liên Tổng KL ở đậm độ nguyên độ lạc điển hình nhất định tiếp để tính kết quả hoặc 10-1 <15: lấy KQ trung bình cộng các đĩa ở hai đậm độ được chọn Tất cả các đĩa không có KL Lật ngược đĩa mọc: < 1VSVHK/ml SP lỏng <1x1/d VSVHK/g SP dạng khác 54
  56. Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4 CÁC TÍNHCHẤT PHƯƠNG PHÁP NGUYÊN LÝ TIẾN HÀNH ĐIỂN HÌNH TRÊN NHẬN ĐỊNH KẾT TÍNH KẾT QỦA MTCL QUẢ -KT đổ đĩa -Nấm men; pha loãng Phát triển hiếu khí Có hay không các đĩa Giá trị cao/giá trị thấp ≤ 2 tính 0 -Ủ hiếu khí 28±1 C bằng các dung dịch pha 3 ngày đọc kết quả sơ thỏa mãn yêu cầu theo công thức: 5 – 7 ngày loãng thông thường bộ (72h) Kết quả tính theo số -TSBT NM-NM hoặc 5 ngày đọc chính thức  C khóm nấm tổng số nấm mốc: sử (120h) N = ( n 0 ,1 xn ) d dụng nước pha loãng 1 2 có thạch TỔNG SỐ BT MEN MỐC 10g(10ml) + 90 ml Khóm nấm mốc có Chọn đĩa có từ 15-150 Giá trị cao/giá trị thấp >2 lấy dung dịch pha loãng bông khí sinh, màu sắc KL nấm men đậm độ thấp hơn để tính kết Mỗi đậm độ cấy 2 đĩa và đường kính khác Chọn đĩa có 5 – 50 KL quả theo trung bình cộng nhau, viền mép không nấm mốc Mỗi đĩa 1 ml đều, tâm thường có Nuôi cấy ít nhất 3 đậm màu đậm độ Không lât ngược đĩa Khuẩn lạc nấm men Chọn hai đậm độ liên Tổng KL ở đậm độ nguyên thường bóng, lối, viền tiếp để tính kết quả hoặc 10-1 <15: lấy KQ trung mép đều. Dạng bơ bình cộng các đĩa ở hai đậm độ Màu săc đồng đều, được chọn không phân biệt tâm, có thể kem, hồng hoặc đỏ Tất cả các đĩa không có KL mọc: < 1 BTNM NM/ml SP lỏng <1x1/d BTNM NM/g SP dạng khác 55
  57. Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4 CÁC TÍNHCHẤT PHƯƠNG PHÁP NGUYÊN LÝ TIẾN HÀNH ĐIỂN HÌNH TRÊN NHẬN ĐỊNH KẾT TÍNH KẾT QỦA MTCL QUẢ Định lượng VSV lên Độ pha loãng cuối Từ tổ hợp được chọn, tra bảng men Lactose sinh khí Pha loãng: LST: các ống đục có cùng phải cho kết quả để ra chỉ số MPN trong MT tăng sinh Đệm pep ton, pepton sinh khí âm tính Đậm độ kép: chia chỉ số MPN 0 chọn lọc ở 30 C và muối Chọn tổ hợp 3 ống cho 10 phú hợp trong phép theo các trường hợp để Đậm độ đơn: nhân chỉ số MPN thử khẳng định tính kêt quả với số đảo của độ pha loãng ĐỊNH LƯỢNG COLIFORM 10g(10ml) + 90 ml BGBL: các ống đục có Trường hợp 1: có ít Chọn độ pha loãng cao nhất Kỹ thuật tính số có dung dịch pha loãng sinh khí nhất một đậm độ cho cho kết quả 3 ống (+) và hai xác suất lớn nhất(MPN) KQ 3 ống dương tính đậm độ cao hơn liền kề 3 3 2 1 0 Chọn 3 đậm độ cao nhất trong LST kép: 3 ống : 10 ml Trường hợp 2: không dãy pha loãng trong đó ít nhất MT; 10 ml mẫu đậm độ nào cho KQ 3 có 1 kết quả (+) ống dương tính 2 2 1 1 0 LST đơn: 3 đậm độ Trường hợp đặc biệt : Chọn độ pha loãng thấp nhất 3 ống 1 đậmđộ Trong dãy được chọn cho KQ (+) và hai độ pha 1ml/ống theo (1) có hai đậm độ loãng cao hơn kế tiếp không cho kết quả (+) 3 3 0 0 0 Ủ 300C/24 - 48± 2h Trường hợp đặc biệt : Chọn độ pha loãng thấp nhất Trong dãy được chọn cho KQ (+) và hai độ pha theo (2) có hai đậm độ loãng cao hơn kế tiếp không cho kết quả (+) 2 2 0 1 0 Từ các ống (+) cấy Trường hợp đặc biệt : Chọn ba độ pha loãng đầu tiên sang BGBL, 1 ăng/ống các ống (+) chỉ thấy ở để tính kết quả Ủ 300C/24 - 48± 2h đậm độ pha loãng đầu 1 0 0 0 2 0 0 0 3 0 0 0 56
  58. Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4 CÁC TÍNHCHẤT PHƯƠNG PHÁP NGUYÊN LÝ TIẾN HÀNH ĐIỂN HÌNH TRÊN NHẬN ĐỊNH KẾT TÍNH KẾT QỦA MTCL QUẢ Định lượng VSV có khả năng phân giải Lecithin Pha loãng bằng các Phát triển hiếu khí Tính kết quả theo các Tính số S.aureus đông huyết lòng đỏ trứng gà trên dung dịch pha loãng Sau 24h xem sơ bộ KL điển hình/không tương đã nhận dạng trên mỗi MT chọn lọc và có phản thông thường 48h đọc kết quả điển hình có phản ứng đĩa ứng đông huyết tương đông HT(+) Bc Bnc (+) ở 35-370C a= Cc + Cnc Ac Anc ĐỊNH LƯỢNG S.AUREUS 25g(25ml) + 225 ml KL điển hình: đen, -Có thể có 3 trường Hoặc: Phương pháp hộp trải dung dịch pha loãng bóng, lồi, đường kính 1 hợp: tất cả KL được Tính số giá trị % số Kl ĐH hoặc Mỗi đậm độ cấy 2 đĩa – 1,5 mm, có vòng đục chọn là KĐH, có cả ĐH KĐH có đông HT(+) trên tổng Mỗi đĩa 0,1 ml sát KL và vòng trong và KĐH, chỉ có KĐH số KL được chọn, sau đó nhân phía ngoài trên cùng một đĩa với số đếm được trên đĩa Nếu số KL cho KQ đông HT(+) Nuôi cấy ít nhất 3 đậm KL không điển hình: Chỉ tính những đĩa có từ ≥ 80% tổng số KL đã đếm thì độ. Để yên 15 phút, sau không có vòng trong 15 – 150 khuẩn lạc toàn bộ số KL trên đĩa được coi đó lật ngược đĩa hoặc khó phân biệt là S.aureus vòng đục Ủ 35 – 370C/24-48h Đông HT(+) Tính sô S.aureus Coaguase(+) trong mẫu thử Σa N = V(n1+ 0,1 n2)d Chọn 5 KL điển hình/không điển V: thể tích cấy/đĩa(ml) hình/đĩa. Mỗi KL cấy d: độ pha loãng của dung dịch sang một ống BHI được chọn thứ nhất Ủ 35 – 370C/20-24h Làm tròn kết quả đến hai chữ số 0,1ml BHI + 0,3ml HT có nghĩa, biểu diễn dưới dạng thỏ. Ủ 35 – 370C/4-6h thập phân Nếu không đông để qua đêm 57
  59. Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4 CÁC TÍNHCHẤT PHƯƠNG PHÁP NGUYÊN LÝ TIẾN HÀNH ĐIỂN HÌNH TRÊN NHẬN ĐỊNH KẾT TÍNH KẾT QỦA MTCL QUẢ Định lượng VSV có khả năng phân giải Pha loãng bằng các Phát triển hiếu khí Tính kết quả theo các Tính kết quả tương tự như tính Lecithin lòng đỏ trứng dung dịch pha loãng KL điển hình có các kết quả S.aureus gà trên MT thạch MYP thông thường Sau 24h đọc kết quả tính chất SVHH điển 0 chọn lọc khi ủ ở 30 C hình trong phép thử /24h và có phản ứng khẳng định VSHH phù hợp trong ĐỊNH LƯỢNG phép thử khẳng định B.CEREUS KL điển hình: dẹt, xù Phương pháp hộp trải 25g(25ml) + 225 ml xì (dạng R) đường kính dung dịch pha loãng 2-3mm, bờ hình răng Mỗi đậm độ cấy 2 đĩa cưa, màu đỏ hồng, Mỗi đĩa 0,1 ml xung quanh có vùng đục. Gr(+), có bào tử Nuôi cấy ít nhất 3 đậm Lên men Glucose kỵ khí Chỉ tính những đĩa có độ. Để yên 15 phút, Lên men manit từ 15 – 150 khuẩn lạc sau đó lật ngược đĩa VP(+) Ủ 300C/24h Di động (+) Tan máu ß (+) Nitrit (+) Chọn 5 KL điển hình/không điển hình/đĩa. Mỗi KL cấy sang một ống thạch dinh dưỡng Ủ 300C/24h Thử các tính chất SVHH ở 350C 58
  60. Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4 CÁC TÍNHCHẤT PHƯƠNG PHÁP NGUYÊN LÝ TIẾN HÀNH ĐIỂN HÌNH TRÊN NHẬN ĐỊNH KẾT TÍNH KẾT QỦA MTCL QUẢ Định lượng VSV tạo Pha loãng bằng các Phát triển kỵ khí Chọn các đĩa có ≤ 150 khuẩn lạc đen khi nuôi dung dịch pha loãng KL và tính số KLĐH cấy kỵ khí trên môi thông thường Khuẩn lạc điển hình: theo các trường hợp trường TSC ở tròn đều, màu đen trên bên dưới 370C/20h và có tính TSC, đường kính ≥ 3 CHÚ Ý: số đếm này chất SVHH phù hợp mm ghi lại trước khi thử trong phép thử khẳng khẳng định ĐỊNH LƯỢNG định Cl.PERFRINGENS Phương pháp hộp đổ 25g (25ml) + 225 ml Tính trung bình cộng Sau khi thử khẳng định, tính dung dịch pha loãng khi: kết quả như với S.aureus để ra Mỗi đậm độ cấy 2 đĩa - 2 đĩa cùng một đậm số Cl.perfringens trong mẫu Mỗi đĩa 1 ml-KT đổ độ ≤150 KLĐH thử đĩa -4 đĩa của hai đậm độ liên tiếp có từ 15- CHÚ Ý: KQ chỉ để hai chữ số Sau khi thạch đông đổ 150KLĐH có nghĩa: tiếp 4 ml thạch màng -Nếu giá trị cao/thấp -Nếu số đó 2, lấy giá trị trung -Nếu số đó >100 và tận cùng Ủ kỵ khí ở 35 – 370C bình thấp hơn bằng 5: làm tròn bằng bội số /20h ±2h - Nếu không đếm của 20 gần nhất được, chuyển đậm độ - Nếu số đó <100 nhưng không cao hơn kế tiếp tận cùng bằng 5: làm tròn bằng bội số của 10 gần nhất Thử khẳng định SH: 5 Gr(+), sinh bào tử KL/đĩa Nitrit(+) Khử nitrat-nitrit Lactose(+) Lên men đường lactose Gelatin(+) Hóa lỏng Gelatin Di động(-) Di động 59
  61. Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4 CÁC TÍNHCHẤT PHƯƠNG PHÁP NGUYÊN LÝ TIẾN HÀNH ĐIỂN HÌNH TRÊN NHẬN ĐỊNH KẾT TÍNH KẾT QỦA MTCL QUẢ Xác định các khuẩn lạc Sử dụng canh thang điển hình trên môi Shigella hoặc Trypton Phát triển hiếu khí Có hay không có Trả lời KQ trường chọn lọc và có soya có bổ sung 0,5 Shigella các phản ứng sinh hoá µg/ml novobiocin Có mặt hay không có mặt và huyết thanh đặc Shigella /25g (25ml) mẫu thử trưng trong phép thử khẳng định 25g(25ml) + 225 ml PHÂN LẬP CT Shigella hoặc VÀ XÁC ĐỊNH Trypton soya có bổ SHIGELLA sung 0,5 µg/ml Phương pháp định tính novobiocin Ủ ở 41,50C/ 16-24h Cấy chuyển lên thạch KLĐH: chọn lọc: Macconkey, -Macconkey: KL nâu XLD hoặc Hektoen đỏ, trong mờ, không enteric lên men lactose Ủ ở 370C ± 10C/20 - -XLD: KL trong mờ, 24h tâm đỏ, không lên men Lactose -HE: KL ướt, xanh lá cây, có thể lồi (Sh.sonnei) -Lên men dường: Chọn 5 KLĐH/đĩa cấy Glucose(+); H2S (-) chuyển lên thạch dinh -LDC(-) dưỡng, ủ 370C ± -ADH(-) 10C/18 - 24h để thử -Ure (-) SVHH và ngưng kết -Indol (-) KHTĐH O và K -Di động (-) -Oxydase (-) 60
  62. Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4 CÁC TÍNHCHẤT ĐIỂN PHƯƠNG PHÁP NGUYÊN LÝ TIẾN HÀNH HÌNH TRÊN MTCL NHẬN ĐỊNH TÍNH KẾT QỦA KẾT QUẢ Xác định các khuẩn lạc Dùng nước đệm pepton để tiền điển hình trên môi tăng sinh Phát triển hiếu khí Trả lời KQ trường chọn lọc, có các Dùng RV và selenit cystin cho Có hay không có phản ứng sinh hoá và bước tăng sinh chọn lọc Salmonella Có mặt hay không có huyết thanh đặc trưng mặt Salmonella /25g trong phép thử khẳng (25ml) mẫu thử định Tiền tăng sinh: 25g (25ml) + 225 ml đệm pepton PHÂN LẬP Ủ 35-370C/16-20h VÀ XÁC ĐỊNH Tăng sinh chọn lọc: SALMONELLA -0,1ml + 10ml RV. Ủ 420C/24h Phương pháp định tính -10ml +100ml selenit cystin. Ủ 35-370C/24 và 48h KLĐH trên thạch Hektoen Từ RV cấy lên thạch đĩa enteric: dạng S, trong, màu Hektoen enteric. xanh, có tâm đen hoặc không Ủ ở 35-370C/18 – 24h Từ selenit cystin, cấy lên thạch KLĐH trên thạch đỏ phenol đỏ phenol lục sáng, Chọn 5 lục sáng: dạng S, đục, thay KLĐH/đĩa. Cấy lên thạh dinh đổi màu MT từ hồng sang đỏ dưỡng. Ủ 35-370C/18 – 24h Lên men đường glucose(+) Chọn 5 KLĐH/đĩa. Cấy lên thạh ,lactose (-) 0 dinh dưỡng. Ủ 35-37 C/18 – - H2S (+) 24h để thử SVHH -Phân giải Ure (-) Làm phản ứng ngưng kết với -Phản ứng VP (-) kháng huyết thanh đặc hiệu O - Indol (-) và H -ONPG(-), LDC(+) Ngưng kết KHT O(+), KHT H(+) 61
  63. Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4 CÁC TÍNHCHẤT PHƯƠNG PHÁP NGUYÊN LÝ TIẾN HÀNH ĐIỂN HÌNH TRÊN NHẬN ĐỊNH TÍNH KẾT QỦA MTCL KẾT QUẢ Phát hiện những VSV tạo thành khuẩn lạc điển Sử dụng canh thang Fraser Phát triển cả trong điều kiện Trả lời KQ hình trên môi trường cho bước tăng sinh hiếu khí và vi hiếu khí Có hay không có thạch chọn lọc, có L.monocytogenes Có mặt hay không có mặt những đặc tính về hình -Tăng sinh lần 1: L.monocytogenes /25g (25ml) thái, TC sinh hoá phù 25g(25ml) + 225ml CT mẫu thử PHÂN LẬP hợp trong phép thử Fraser, ủ 300C/ 24h VÀ XÁC ĐỊNH khẳng định L.MONOCYTOGENES -Tăng sinh lần 2: Phương pháp định tính Cấy 1ml CT tăng sinh lần 1 vào 10 ml CT FraserỦ 35-370C/48 ±2h Trên thạch Oxford: sau 24h Cấy chuyển lên hai MT KLĐH nhỏ, ĐK 1mm, màu thạch chọn lọc: xám, có quầng đen bao -Oxford: 1 đĩa ria cấy, quanh. Sau 48h, KL sẫm một đĩa cấy trải, ủ ấm ở 30 màu, hoặc lục sáng, ĐK 0C, 35 0C hoặc 37 0C từ 18 2mm, có quầng đen, tâm – 24 h trong điều kiện lõm hiếu khí Trên thạch PALCAM: sau -PALCAM: một đĩa ria 24h KLĐH nhỏ, ĐK 1,5-2 cấy, m ột đĩa cấy trải, ủ ấm mm, màu lục hoặc vàng lục, ở 300 C, 35 0C hoặc 37 0C có quầng đen bao quanh, đôi từ 18 – 24 h trong điều khi tâm đen. Sau 48h, KL kiện vi hiếu khí. xanh lá cây, ĐK 1,5 - 2mm, có quầng đen, tâm lõm Từ mỗi đĩa chọn 5 KLĐH -TK Gram(+) cấy lên MT thạch TSYE, ủ -Catalase (+) 30 0C, 35 0C hoặc 37 0C từ -Di động hình ô ở 250C/48h 18 – 24 h để thử tính chất -Tan máu cừu dạng ß SVHH Rhamnose(+),Xylose(+) - CAMP test(+) 62
  64. Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4 CÁC TÍNHCHẤT PHƯƠNG PHÁP NGUYÊN LÝ TIẾN HÀNH ĐIỂN HÌNH TRÊN NHẬN ĐỊNH KẾT TÍNH KẾT QỦA MTCL QUẢ Sử dụng canh thang Phát triển trong điều Trả lời KQ Preston để tăng sinh kiện vi hiếu khí Có hay không có Campylobacter Có mặt hay không có mặt Campylobacter /25g (25ml) mẫu thử PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CAMPYLOBACTER Phương pháp định tính 25g +225ml Preston KLĐH dẹt, bóng, xám Ủ vi hiếu khí/420C/24 kem nhạt đến xám – 48h xanh, thường lan Cấy chuyển lên thạch chọn lọc CCD Ủ vi hiếu khí/420C/24 – 48h Cấy chuyến KLĐH lên -VK Gram(-) thạch máu và thạch -Hình lượn sóng, cánh dinh dưỡng. Ủ vi hiếu chim khí/420C/24 – 48h để -Catalase (+) thử các tính chất -Oxydase(+) SVHH - Thủy phân Hippurate (+): C.jejuni 63
  65. Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4 BẢNG CHỈ SỐ MPN CHO DÃY 3 ỐNG Số ống dương tính MPN cho 1g hoặc 1ml Giới hạn tin cậy (95%) 1 : 10 1 : 100 1 : 1000 Thấp nhất Cao nhất 0 0 0 2400 64
  66. Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4 MỘT SỐ PHẢN ỨNG SINH HÓA ĐỊNH DANH VI SINH VẬT 1 TỔNG SỐ BÀO TỬ NẤM MEN - NẤM MỐC 6 TỔNG SỐ VI SINH VẬT HIẾU KHÍ 10 ĐỊNH LƯỢNG COLIFORMS KỸ THUẬT ĐẾM SỐ CÓ XÁC SUẤT LỚN NHẤT (MPN) 14 STAPHYLOCOCCUS AUREUS 18 ĐỊNH LƯỢNG B.CEREUS 26 CLOSTRIDIUM PERFRINGENS (C.WELCHII) 29 SHIGELLA SPP 34 SALMONELLA 40 LISTERIOSIS MONOCYTOGENES 43 CAMPYLOBACTER 49 TỔNG KẾT VI SINH THỰC PHẨM II 54 BẢNG CHỈ SỐ MPN CHO DÃY 3 ỐNG 64 65