Luận văn Sử dụng kỹ thuật vi gel để vi bao vi khuẩn bacillus clausii (Phần 1)

Nội dung text: Luận văn Sử dụng kỹ thuật vi gel để vi bao vi khuẩn bacillus clausii (Phần 1)

1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT TP.HCM KHOA CÔNG NGHỆ HÓA VÀ THỰC PHẨM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM SỬ DỤNG KỸ THUẬT VI GEL ĐỂ VI BAO VI KHUẨN BACILLUS CLAUSII GVHD: ThS. LÊ HOÀNG DU SVTH: NGUYỄN THỊ THẢO HÀ MSSV: 11116022 S K L 0 0 3 8 9 8 Tp. Hồ Chí Minh, tháng 7/2015
2. TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM KỸ THUẬT THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC VÀ THỰC PHẨM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP MÃ SỐ: 2015-11116022 SỬ DỤNG KỸ THUẬT VI GEL ĐỂ VI BAO VI KHUẨN BACILLUS CLAUSII GVHD: ThS. LÊ HOÀNG DU SVTH: NGUYỄN THỊ THẢO HÀ MSSV: 11116022 THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 07/2015
3. TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC VÀ THỰC PHẨM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM NHIỆM VỤ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Họ và tên sinh viên: Nguyễn Thị Thảo Hà Ngành: Công nghệ Thực phẩm 1. Tên khóa luận: Sử dụng kỹ thuật vi gel để vi bao vi khuẩn Bacillus clausii 2. Nhiệm vụ của khóa luận: Khảo sát và đánh giá ảnh hưởng của nồng độ gelatin đến hiệu suất vi bao, mật độ tế bào được vi bao, đặc điểm hạt vi bao và khả năng bảo vệ tế bào vi khuẩn của hạt vi bao bằng gelatin và alginate khi ủ trong môi trường giả lập dạ dày; môi trường giả lập dịch ruột. Khảo sát và đánh giá ảnh hưởng của nồng độ soy protein đến hiệu suất vi bao, mật độ tế bào được vi bao, đặc điểm hạt vi bao và khả năng bảo vệ tế bào vi khuẩn của hạt vi bao bằng soy protein và alginate khi ủ trong môi trường giả lập dạ dày; môi trường giả lập dịch ruột. 3. Ngày giao nhiệm vụ khóa luận:16/01/2015 4. Ngày hoàn thành khóa luận: 16/07/2015 5. Họ tên ngƣời hƣớng dẫn 1: ThS. Lê Hoàng Du Phần hƣớng dẫn: toàn bộ khóa luận 6. Họ tên ngƣời hƣớng dẫn 2: Phần hƣớng dẫn: Nội dung và yêu cầu khóa luận tốt nghiệp đã đƣợc thông qua bởi Trƣởng Bộ môn Công nghệ Thực phẩm Tp.HCM, ngày tháng năm 20 Trƣởng Bộ môn Ngƣời hƣớng dẫn chính
4. KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SVTH: NGUYỄN THỊ THẢO HÀ LỜI CẢM ƠN Sau hơn 6 tháng nỗ lực thực hiện, đồ án tốt nghiệp “Sử dụng kỹ thuật vi gel để vi bao vi khuẩn Bacillus clausii” đã hoàn thành. Ngoài sự cố gắng học hỏi, nghiên cứu của bản thân em cũng đã nhận được sự giúp đỡ, động viên rất nhiều từ phía nhà trường, thầy cô, bạn bè và nhất là sự hướng dẫn tận tình của thầy Lê Hoàng Du. Đầu tiên, em xin cảm ơn quý thầy cô khoa Công nghệ Hóa học và Thực phẩm, trường Đại học Sư phạm kỹ thuật tp. Hồ Chí Minh đã tận tình dạy bảo, xây dựng những kiến thức cơ bản cần thiết cho em trong suốt 4 năm học tập tại trường. Các thầy cô cũng đã tạo mọi điều kiện giúp em thực hiện các thí nghiệm, khảo sát để thực hiện thành công đồ án tốt nghiệp này.Đặc biệt em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến thầy Lê Hoàng Du là giáo viên hướng dẫn chính. Thầy là người thầy tâm huyết, đầy trách nhiệm, đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt quá trình triển khai, nghiên cứu và hoàn thành đồ án. Thầy đã giúp đỡ em rất nhiều từ những kiến thức cơ bản cho đến tiến trình làm thí nghiệm; thầy luôn bên cạnh hỗ trợ, đóng góp ý kiến cho em trong suốt quá trình làm đồ án. Thầy chính là người dìu dắt, nếu không có thầy hướng dẫn chắc chắn đồ án này không thể hoàn thành được. Cảm ơn tất cả các bạn lớp 111160 đã cùng em chia sẻ những khoảnh khắc đẹp nhất của thời sinh viên, những người bạn luôn bên cạnh em vào những giây phút khó khăn. Và cuối cùng, con xin gởi lời cảm ơn đến gia đình, người thân đã nuôi nấng, quan tâm con, là nguồn động viên hỗ trợ con về mọi mặt từ khi con chào đời đến ngày hôm nay. Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn tất cả những người đã giúp đỡ em hoàn thành đồ án tốt nghiệp này. Mặc dù em đã có nhiều cố gắng để hoàn thành đồ án nhưng với thời gian và khả năng hạn chế không thể tránh khỏi những thiếu sót, rất mong nhận được sự đóng góp của quý thầy cô và các bạn. Tp Hồ Chí Minh, tháng 07 năm 2015 i
5. KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SVTH: NGUYỄN THỊ THẢO HÀ LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan toàn bộ nội dung được trình bày trong khóa luận tốt nghiệp là của riêng tôi. Tôi xin cam đoan các nội dung được tham khảo trong khóa luận tốt nghiệp đã được trích dẫn chính xác và đầy đủ theo qui định. Ngày 16tháng 07năm 2015 Ký tên ii
6. KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SVTH: NGUYỄN THỊ THẢO HÀ MỤC LỤC CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1. Giới thiệu 4 1.2. Tổng quan về probiotics 5 1.2.1. Khái niệm 5 1.2.2. Lợi ích của probiotics 5 1.2.3. Cơ chế tác dụng của probiotics 6 1.3. Vi khuẩn Bacillus clausii 7 1.3.1. Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa 7 1.3.2. Vai trò 8 1.3.3. Hoạt tính probiotics 8 1.4. Vi bao probiotics 9 1.4.1. Định nghĩa vi bao 9 1.4.2. Vi bao probiotics 9 1.4.3. Kỹ thuật vi bao probiotics 10 1.4.4. Vật liệu vi bao probiotics 14 1.5. Vi bao probiotics bằng gel alginate 16 1.5.1. Nghiên cứu trong nước 16 1.5.2. Nghiên cứu ngoài nước 17 1.6. Vi bao đa lớp probiotics 19 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1. Địa điểm thực hiện 21 2.2. Vật liệu 21 2.2.1. Nguồn vi sinh vật 21 2.2.2. Phụ gia và hóa chất 21 2.3. Phƣơng pháp 21 2.3.1. Phương pháp vi bao 21 iii
7. KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SVTH: NGUYỄN THỊ THẢO HÀ 2.3.2. Bố trí thí nghiệm 24 2.3.3. Xác định hiệu suất vi bao 25 2.3.4. Mật độ tế bào được vi bao 25 2.3.5. Phân tích phân bố kích thước hạt. 25 2.3.6. Phân tích đặc điểm bề mặt hạt vi bao. 25 2.3.7. Khảo sát khả năng tồn tại của vi khuẩn Bacillus clausii được vi bao trong môi trường giả lập dạ dày (SGJ) 26 2.3.8. Khảo sát khả năng tồn tại của vi khuẩn Bacillus clausii được vi bao trong môi trường giả lập dịch ruột (SIJ) 26 2.3.9. Phân tích xử lý số liệu 26 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 27 3.1. Ảnh hƣởng của nồng độ gelatin đến quá trình vi bao vi khuẩn Bacillus clausii bằng phƣơng pháp vi bao hai lớp gelatin và alginate 27 3.1.1. Hiệu suất vi bao 27 3.1.2. Mật độ tế bào được vi bao 28 3.1.3. Đặc điểm hạt vi bao 29 3.1.4. Khả năng bảo vệ tế bào vi khuẩn Bacillus clausii của hạt bao khi ủ trong môi trường giả lập dạ dày (SGJ) 32 3.1.5. Khả năng bảo vệ tế bào vi khuẩn Bacillus clausii của hạt bao khi ủ trong môi trường giả lập dịch ruột (SIJ) 36 3.2. Ảnh hƣởng của nồng độ soy protein đến quá trình vi bao vi khuẩn Bacillus clausii bằng phƣơng pháp vi bao hai lớp soy protein và alginate 39 3.2.1. Hiệu suất vi bao 40 3.2.2. Mật độ tế bào được vi bao 41 3.2.3. Đặc điểm hạt bao 42 3.2.4. Khả năng bảo vệ tế bào vi khuẩn Bacillus clausii của hạt bao khi ủ trong môi trường giả lập dạ dày (SGJ) 44 3.2.5. Khả năng bảo vệ tế bào vi khuẩn Bacillus clausii của hạt bao khi ủ trong môi trường giả lập dịch ruột (SIJ) 48 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN & KIẾN NGHỊ 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 iv
8. KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SVTH: NGUYỄN THỊ THẢO HÀ DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Tế bào Bacillus clausii quan sát dưới kính hiển vi 7 Hình 1.2. Bao gói tế bào probiotics bằng kỹ thuật nhũ tương 11 Hình 1.3. Sơ đồ quá trình bao gói vi khuẩn bằng phương pháp sấy phun 12 Hình 1.4. Sự hình thành gel tạo hạt bao khi các ion Ca2+ khuếch tán vào dung dịch sodium alginate 15 Hình 2.1. Quá trình vi bao 23 Hình 3.1. Ảnh hưởng của nồng độ gelatin đến hiệu suất vi bao (giá trị trung bình n = 3). Thanh sai số thể hiện giá trị độ lệch chuẩn. 28 Hình 3.2. Ảnh hưởng của nồng độ gelatin đến mật độ tế bào được vi bao (giá trị trung bình n = 3). Thanh sai số thể hiện giá trị độ lệch chuẩn. 29 Hình 3.3. Phân bố kích thước mẫu 1.0G 30 Hình 3.4. Bề mặt hạt vi bao mẫu 1.0G 32 Hình 3.5. Bề mặt hạt vi bao mẫu 0.0CB-SA 32 Hình 3.6. Ảnh hưởng của nồng độ gelatin đến khả năng bảo vệ tế bào vi khuẩn Bacillus clausii tự do ( ), được vi bao ( : 0.0%; : 0.5%; : 1.0%, : 1.5%) khi ủ trong môi trường SGJ 120 phút. Thanh sai số thể hiện giá trị độ lệch chuẩn. 34 Hình 3.7. Ảnh hưởng của nồng độ gelatin đến khả năng bảo vệ tế bào vi khuẩn Bacillus clausii tự do ( ), được vi bao ( : 0.0%; : 0.5%; : 1.0%, : 1.5%) khi ủ trong môi trường SIJ 120 phút. Thanh sai số thể hiện giá trị độ lệch chuẩn. 38 Hình 3.8. Ảnh hưởng của nồng độ soy protein đến hiệu suất vi bao (giá trị trung bình n = 3). Thanh sai số thể hiện giá trị độ lệch chuẩn. 40 Hình 3.9. Ảnh hưởng của nồng độ soy protein đến mật độ tế bào được vi bao (giá trị trung bình n = 3). Thanh sai số thể hiện giá trị độ lệch chuẩn. 41 Hình 3.10. Phân bố kích thước hạt mẫu 1.0G ( ) và mẫu 15.0SP ( ) 43 Hình 3.11. Bề mặt hạt vi bao mẫu 15.0SP 44 Hình 3.12. Ảnh hưởng của nồng độ soy protein đến khả năng bảo vệ tế bào vi khuẩn Bacillus clausii tự do ( ), được vi bao ( : 0.0%; : 5.0%; : 10.0%, : 15.0%) khi ủ trong môi trường SGJ 120 phút. Thanh sai số thể hiện giá trị độ lệch chuẩn 47 v
9. KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SVTH: NGUYỄN THỊ THẢO HÀ Hình 3.13. Ảnh hưởng của nồng độ soy protein đến khả năng bảo vệ tế bào vi khuẩn Bacillus clausii tự do ( ), được vi bao ( : 0.0%; : 5.0%; : 10.0%, : 15.0%) khi ủ trong môi trường SIJ 120 phút. Thanh sai số thể hiện giá trị độ lệch chuẩn. 51 vi
10. KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SVTH: NGUYỄN THỊ THẢO HÀ DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 2.1. Công thức phối trộn màng bao và tế bào Bacillus clausii 23 Bảng 3.1. Sự thay đổi về số lượng tế bào tự do và tế bào được vi bao sống sót (log CFU/g) khi ủ trong môi trường SGJ 120 phút 33 Bảng 3.2. Sự thay đổi về số lượng tế bào tự do và tế bào được vi bao sống sót (log CFU/g) khi ủ trong môi trường SIJ 120 phút 37 Bảng 3.3. Sự thay đổi về số lượng tế bào tự do và tế bào được vi bao sống sót (log CFU/g) khi ủ trong môi trường SGJ 120 phút 46 Bảng 3.4. Sự thay đổi về số lượng tế bào tự do và tế bào được vi bao sống sót (log CFU/g) khi ủ trong môi trường SIJ 120 phút 50 Bảng 3.5. Tỷ lệ sống sót (%) của tế bào khi được vi bao bằng màng gelatin và alginate, soy protein và alginate sau khi ủ trong môi trường SGJ, môi trường SIJ 120 phút 53 vii
11. KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SVTH: NGUYỄN THỊ THẢO HÀ DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT STT Từ viết tắtGiải thích nghĩa 1 0.0CB-SA Mẫu vi bao chỉ sử dụng sodium alginate 2 1.0GMẫu vi bao có nồng độ gelatin là 1.0%w/v 3 15.0SPMẫu vi bao có nồng độ soy protein là 15.0%w/v 4 %w/vWeight/Volume - Khối lượng/Thể tích 5 CFU Colony form unit - đơn vị hình thành khuẩn lạc 6 ĐCMẫu đối chứng 7 GGelatin 8 SGJ Simulated gastric juices - Môi trường giả lập dạ dày 9 SIJ Simulated intestinal juices - Môi trường giả lập dịch ruột 10 SP Soy protein - Protein từ đậu nành viii
12. KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SVTH: NGUYỄN THỊ THẢO HÀ TÓM TẮT KHÓA LUẬN Vi khuẩnBacillus clausii được vi bao hai lớp bằng protein (gelatin hoặc soy protein) và alginate bằng kỹ thuậtvi gel. Ảnh hưởng của nồng độ gelatin sử dụng (0.0, 0.5, 1.0, 1.5%); nồng độ soy protein sử dụng (0.0, 5.0, 10.0, 15.0%) đến hiệu suất vi bao, mật độ tế bào được vi bao, đặc điểm hạt vi bao và khả năng bảo vệ tế bào bên trong của hạt vi bao khi ủ trong môi trường giả lập dạ dày; môi trường giả lập dịch ruột được khảo sát. Kết quả cho thấy sau khi vi bao, mẫu sử dụng 1.0% gelatin và mẫu sử dụng 15.0% soy protein mang lại hiệu suất vi bao cao nhất là 88.38% và 85.89%. Mẫu 1.0% gelatin và mẫu 15.0% soy protein cũng là hai mẫu có mật độ tế bào được vi bao cao nhất tương ứng là 2.56x1011 CFU/g và 2.39x1011 CFU/g. Thêm vào đó, màng bao hai lớp gelatin và alginate; soy protein và alginateđã cải thiện đáng kể khả năng sống sót của vi khuẩn Bacillus clausii khi ủ trong môi trường giả lập dạ dày; môi trường giả lập dịch ruột. Màng bao sử dụng 1.0% gelatin và alginate, 15.0% soy protein và alginate cho thấy hiệu quả bảo vệ tế bào bên trong tốt nhất, số lượng tế bào sống sót sau 120 phút trong môi trường giả lập dạ dày của các mẫu ĐC, 0.0CB-SA, 1.0G và 15.0SP tương ứng là 4.36, 8.07, 9.29 và 9.86 log CFU/g. Số lượng tế bào sống sót sau 120 phút trong môi trường giả lập dịch ruột của các mẫu ĐC, 0.0CB-SA, 1.0G và 15.0SP tương ứng là 5.22, 8.77, 9.75 và 10.25 log CFU/g. Như vậy màng bao hai lớp 15.0% soy protein và alginate (15.0SP) cho thấy tiềm năng bảo vệ tốt tế bào bên trong khi ủ trong môi trường giả lập dạ dày và môi trường giả lập dịch ruột, cung cấp đủ số lượng probiotic (>106 CFU/g) mang lại lợi ích sức khỏe cho người sử dụng. ix
13. KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SVTH: NGUYỄN THỊ THẢO HÀ MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Probiotics là những vi sinh vật sống khi được đưa trực tiếp vào cơ thểvới một lượng đầy đủ sẽ có lợi về mặt sức khỏe cho người sử dụng[1]. Chúng đã được chứng minh mang lại nhiều lợi ích sức khỏe cho người sử dụng như giúp cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột, kháng khuẩn, cải thiện quá trình chuyển hóa lactose, giảm cholesterol trong huyết thanh, kích thích hệ thống miễn dịch, chống tiêu chảy, cải thiện bệnh viêm ruột, [2]–[4], [5]– [12].Tuy nhiên số lượng tế bào probioticstự do giảm đáng kể khi tiếp xúc với môi trường dạ dày - ruột của con người, với số lượng nhỏ hơn 106 CFU/g chúng không mang lại lợi ích sức khỏe cho người sử dụng[13]–[15]. Phương pháp bao gói từ lâu đã được sử dụng để bảo vệ các tế bào probiotics chống lại các điều kiện khắc nghiệt của môi trường bên ngoài. Có rất nhiều kỹ thuật bao gói được sử dụng như kỹ thuật sấy phun, ép đùn, nhũ tương,vi gel Trong đó nổi bật là kỹ thuật vi gelbằngthiết bị phun áp lực tạo ra hạt bao có kích thước nhỏ nên có thể bổ sung vào các sản phẩm thực phẩm mà không làm thay đổi kết cấu cũng như tính chất cảm quan của thực phẩm[16]. Các chất bao như alginate, gelatin, chitosan, whey protein, soy protein, carrageenan, thường được sử dụng để vi bao probiotics. Alginate là chất bao được sử dụng nhiều nhất vì chúng là vật liệu rẻ tiền, không độc hại, có thể bảo vệ tế bào bên trong chống lại môi trường khắc nghiệt dạ dày và nhất là có thể giải phóng tế bào bên trong vào ruột kết nhằm phát huy các tác dụng có lợi cho sức khỏe của người sử dụng[17]–[19]. Tuy nhiên nhược điểm của alginate là tạo thành màng bao xốp không bảo vệ tốt tế bào bên trong[20]. Vì những lý do trên, chúng tôi tiến hành vi bao chủng probioticsBacillus claussi bằng phương pháp vi bao hai lớp:lớp thứ nhất có bản chất protein (gelatin hoặc soy protein), lớp thứ hai là gel alginate sử dụng kỹ thuật vi gel bằng thiết bị phun áp lực nhằm tạo ra hạt vi bao có kích thước nhỏ hơn 1mm.Vi sinh vật được vi bao theo kỹ thuật này có khả năng chống chịu tốt hơn khi tiếp xúc với các điều kiện khắc nghiệt như môi trường giả lập dạ dày và môi trường giả lập dịch ruột. 1
14. KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SVTH: NGUYỄN THỊ THẢO HÀ 2. Mục tiêu của đề tài Mục tiêu của đề tài là cải thiện phương pháp bao gói vi khuẩnBacillus clausii bằng cách sử dụng kỹ thuật vi gel để vi bao hai lớp gelatin và alginate; soy protein và alginate; tìm ra nồng độ gelatin, soy protein thích hợp nhằm làm tăng hiệu suất vi bao, tăng mật độ tế bào được vi bao, cải thiện cấu trúc hạt vi bao và tăngkhả năng bảo vệ tế bào vi khuẩn bên trong khi ủ trong môi trường giả lập dạ dày và môi trường giả lập dịch ruột. 3. Đối tƣợng và giới hạn nghiên cứu của đề tài Đối tƣợng:Vi khuẩnBacillus clausii; phương pháp vi bao hai lớp gelatin và alginate, soy protein và alginate. Giới hạn nghiên cứu: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ gelatin, nồng độ soy protein đến hiệu suất vi bao, mật độ tế bào trong được vi bao, đặc điểm hạt bao và khả năng bảo vệ tế bào vi khuẩn của hạt bao khi ủ trong môi trường giả lập dạ dày và môi trường giả lập dịch ruột của quá trình vi bao vi khuẩn Bacillus clausii bằng phương pháp vi bao hai lớp gelatin và alginate, soy protein và alginate. 4. Nội dung của đề tài Vi bao vi khuẩnBacillus clausii bằng phương pháp vi bao hai lớp gelatin và alginate, soy protein và alginate bằng kỹ thuật vi gel. Sử dụng nồng độ gelatin khác nhau (0.0, 0.5, 1.0, 1.5%) và nồng độ soy protein khác nhau (0.0, 5.0, 10.0, 15.0%). Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ gelatin đến hiệu suất vi bao, mật độ tế bào được vi bao, đặc điểm hạt vi bao và khả năng bảo vệ tế bào vi khuẩn của hạt vi bao khi ủ trong môi trường giả lập dạ dày và môi trường giả lập dịch ruột. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ soy protein đến hiệu suất vi bao, mật độ tế bào được vi bao, đặc điểm hạt vi bao và khả năng bảo vệ tế bào vi khuẩn của hạt vi bao khi ủ trong môi trường giả lập dạ dày và môi trường giả lập dịch ruột. So sánh hiệu quả của hai loại màng bao bằng gelatin và alginate; soy protein và alginate trong việc bảo vệ tế bào bên trong khi ủ trong môi trường giả lập dạ dày và môi trường giả lập dịch ruột. 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài Ý nghĩa khoa học Sử dụng kỹ thuật vi bao mới trong việc bảo vệ tế bào probiotics. 2
15. KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SVTH: NGUYỄN THỊ THẢO HÀ Nghiên cứu, đánh giá và giải thích hiệu quả của màng bao hai lớp bằng gelatin và alginate, soy protein và alginate đến khả năng bảo vệ tế bào probioticsđược bao bên trong. Ý nghĩa thực tiễn Là phương pháp mới tạo ra hạt vi bao với kích thước nhỏ hơn 1mm nên có thể ứng dụng bổ sung vào thực phẩm không làm thay đổi kết cấu hay ảnh hưởng đến tính chất cảm quan của thực phẩm. Là phương pháp tiên tiến tạo ra hạt bao có khả năng bảo vệ tốt tế bào bên trong chống lại các điều kiện khắc nghiệt như môi trường giả lập dạ dày và giả lập dịch ruột. Từ đó làm tăng số lượng tế bào sống sót mang lại các lợi ích sức khỏe cho người sử dụng. Phương pháp vi bao dễ thực hiện. Các loại màng bao sử dụng rẻ tiền, không có độc tính, có sẵn trên thị trường. 6. Bố cục của đề tài Đề tài gồm có 4 chương chính: Chương 1: Tổng quan tài liệu Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu Chương 3: Kết quả và bàn luận Chương 4: Kết luận và kiến nghị 3
16. KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SVTH: NGUYỄN THỊ THẢO HÀ CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu Tại Việt Nam, các bệnh về đường tiêu hóa đứng đầu trong nhóm các bệnh nội khoa. Trong đó rối loạn tiêu hóa là vấn đề thường gặp nhất. Trong các bệnh về rối loạn tiêu hóa hay hấp thụ thì táo bón, tiêu chảy là những bệnh phổ biến và gây ra những hậu quả nghiêm trọng. Nguyên nhân là do thay đổi lối sống, chế độ ăn uống không khoa học, chế độ sinh hoạt nghỉ ngơi không phù hợp và đặc biệt là donhiễm khuẩn gây hại như Escherichia coli, Vibrio, Shigella, từ thực phẩm không vệ sinh, chúng làm mất cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột và tạo điều kiện cho những vi sinh vật gây hại phát triển tạo độc tố [119]. Sử dụng các sản phẩm có chứa probiotics là một trong những phương pháp góp phần cải thiện hệ vi sinh đường ruột, điều trị các bệnh về rối loạn tiêu hóa và cải thiện sức khỏe cho người sử dụng[2]–[4]. Theo tổ chức Y tế thế giới (World Health Organization - WHO), hàng năm trên thế giới có khoảng 1,3 tỷ lượt trẻ em dưới 5 tuổi bị tiêu chảy, trong đó 3,5-4 triệu trường hợp tử vong. Việc sử dụng probiotics để điều trị các bệnh về đường tiêu hóa như tiêu chảy nhiễm khuẩn và không nhiễm khuẩn, phòng ngừa và điều trị các rối loạn hệ vi khuẩn đường ruột gây ra do dùng kháng sinh, hội chứng ruột kích thích, đã mang lại những hiệu quả đáng kể [123]. Probiotics là những vi sinh vật thiết yếu sống trong đường ruột và có khả năng điều chỉnh hệ vi sinh vật đường ruột theo hướng có lợi cho cơ thể vật chủ[21], [22]. Để phát huy các tác dụng của mình, probiotics phải có khả năng vượt qua những trở ngại của acid dạ dày, phát triển nhanh và sống trong đường ruột thậm chí khi có mặt của acid, muối mật và các loại thuốc kháng sinh. Chúng phải bám chặt vào thành ruột và làm tăng khả năng miễn dịch cho cơ thể vật chủ, đặc biệt là kích thích bài tiết immunoglobulin A.Để phát huy các lợi ích cho sức khỏe người tiêu dùng, số lượng tối thiểu của các tế bào probiotics sống trong các sản phẩm tại thời điểm tiêu thụ nên cao hơn 106 CFU/g hoặc CFU/ml sản phẩm[13]–[15]. Phân tích các sản phẩm chứa probiotics ở nhiều quốc gia khác nhau đã cho thấy rằng lượng probiotic sống tồn tại rất ít trong các sản phẩm lên men truyền thống [23], [24]. 4
17. KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SVTH: NGUYỄN THỊ THẢO HÀ Mặc dù mang lại những lợi ích đáng kể cho sức khỏe cho người sử dụng nhưng số lượng probiotics trong các sản phẩm sau quá trình sản xuất, bảo quản bị giảm đi. Hơn nữa probiotics rất nhạy cảm với acid trong dạ dày và muối mật trong đường ruột vì thế cần tìm ra hướng giải quyết nhằm làm tăng tỷ lệ vi khuẩn sống sót và giải phóng vi khuẩn probiotics đúng chỗ, đúng thời điểm để mang lại lợi ích về sức khỏe cho người sử dụng. Sử dụng kỹ thuật bao gói probiotics để chống lại điều kiện bất lợi bên ngoài là một cách tiếp cận hiện đang nhận được nhiều sự quan tâm.Hơn nữa bao gói có xu hướng ổn định tế bào, có thể tăng cường khả năng phát triển và ổn định vi khuẩn trong sản xuất [25]. 1.2. Tổng quan về probiotics 1.2.1. Khái niệm Probiotics đã được định nghĩa theo nhiều cách và số lượng định nghĩa về probiotics rất nhiều tùy thuộc vào sự hiểu biết của chúng ta về cơ chế tác động của chúng đối với sức khỏe của con người. Gần đây nhất năm 2002, tổ chứcY tế thế giới (WHO) đưa ra định nghĩa về probioticsvà định nghĩa này đã được kiểm chứng bởi hiệp hội các nhà khoa học quốc tế về probiotics và prebiotic; định nghĩa này là định nghĩa chính xác nhất và được dùng phổ biến nhất: probiotics là những vi sinh vật sống được đưa trực tiếp vào cơ thể, với một lượng đầy đủ sẽ có lợi về mặt sức khỏe cho người sử dụng[1]. 1.2.2. Lợi ích của probiotics Có nhiều bằng chứng cho thấy probiotics có tiềm năng mang lại lợi ích sức khỏe cho con người [26]. Nhiều nghiên cứu đã mô tả những lợi ích sức khỏe của chúng khi làm giảm bệnh nhiễm trùng đường tiêu hóa, kháng khuẩn, cải thiện quá trình chuyển hóa lactose, giảm cholesterol trong huyết thanh, kích thích hệ thống miễn dịch, đặc tính chống ung thư, chống tiêu chảy, cải thiện bệnh viêm ruột và ức chếnhiễm khuẩnHelicobacter pylori bằng cách bổ sung các chủng probiotic đã được lựa chọn vào các sản phẩm thực phẩm[2]–[4], [5]–[12].Các tác dụng có lợi của probiotic xuất hiện khi chúng đến vùng dạ dày và ruột với số lượng đủ cao và sống sót được trong điều kiện khắc nghiệt này[27]. Hầu hết các chủng probiotics hiện nay đã được phân lập từ hệ vi sinh vật đường ruột của con người. Vi sinh vật này đóng một vai trò quan trọng trong sức khỏe con người, không chỉ do sự tham gia của chúng trong quá trình tiêu hóa, mà chúngcòn đóng góp tích cực trong sự phát triển của hệ vi sinh vật đường ruột và hệ thống miễn dịch [28]. Các cơ chế hoạt động của probiotics được cho là kết quả từ việc điều chỉnh thành phần của hệ vi 5
18. KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SVTH: NGUYỄN THỊ THẢO HÀ sinh vật đường ruột và các hoạt động trao đổi chất của chúngngăn ngừa sự tồn tại, phát triển quá mức của các mầm bệnh và kích thích hệ miễn dịch của cơ thể vật chủ[29]. 1.2.3. Cơ chế tác dụng của probiotics 1.2.3.1. Cạnh tranh vị trí bám dínhvà chất dinh dƣỡng với vi sinh vật gây bệnh Cách thức hoạt động của probiotics là cạnh tranh loại trừ, nghĩa là cạnh tranh bám vào màng nhầy thành ruột qua đó tạo nên một hàng rào vật lý bảo vệ khỏi sự tấn công của các khuẩn gây bệnh. Khả năng bám dính của probiotics vào niêm mạc ruột được xem là một trong những tiêu chí lựa chọn chủng probiotics. Các tế bào biểu mô đường ruột là các tế bào chủ cho hàng triệu vị trí gắn thụ thể của vi khuẩn khác nhau. Khi probiotics liên kết với vị trí gắn thụ thể trên tế bào biểu mô sẽ làm thay đổi niêm mạc của tế bào đó và tế bào lân cận. Do đó vi khuẩn có hại ít có khả năng bám dính lên niêm mạc ruột. Probiotics có thể tìm thấy điểm gắn trong rất nhiều vị trí nên có thể ngăn ngừa vi khuẩn có hại xâm nhập. Vi khuẩn bám dính trên niêm mạc ruột nhờ cơ chế đặc trưng (chất bám dính và các phân tử thụ thể của ruột) và cơ chế không đặc trưng (dựa vào những yếu tố hóa học). Một vài thành phần cấu tạo của vi khuẩn: protein, thành tế bào, carbohydrate, và acid lipoteichoic được xem là có liên quan đến tính bám dính của probiotics vào ruột. Ngoài ra, probiotics còn cạnh tranhnguồn dinh dưỡng như cacbon, nitơ và nhiều loại muối khoáng với vi sinh vật có hại [120]. 1.2.3.2. Sản xuất các hợp chất kháng khuẩn Trong quá trình trao đổi chất,probioticscó thể tạo ra các sản phẩm có tính kháng khuẩn như axit hữu cơ (acid lactic và acid acetic), hydroperoxide, ethanol, diacetyl, acetaldehyde, acetoine, CO2, reuterin, reutericyclin và bacteriocin Những hợp chất này có thể ảnh hưởng đến sự trao đổi chất và từ đó làm giảm vi sinh vật mang mầm bệnh. Điều này được thực hiện bằng cách giảm pH trong khoang ruột thông qua việc tạo ra các chuỗi acid béo ngắn dễ bay hơi, chủ yếu là acetic, propionic, butyric và nhất là acid lactic[30]. Ngoài ra, reuterin và dẫn xuất của reutericyclin cũng có thể ức chế các vi khuẩn Gram âm và Gram dương, nấm và động vật nguyên sinh như giun, sán Các chất diacetyl, acetaldehyde và acetoin cũng có tác dụng kìm hãm đối với các vi sinh vật có hại ngay cả khiở nồng độ thấp [120]. 1.2.3.3. Cân bằng hệ vi sinh vật đƣờng ruột 6
19. KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SVTH: NGUYỄN THỊ THẢO HÀ Probiotics có thể góp phần điều chỉnh thành phần hệ vi sinh vật đường ruột. Khi tập trung ở khoang ruột chúng tạo nên sự cân bằng tạm thời của hệ vi sinh vật đường ruột, sự thay đổi này được nhận thấy một vài ngày sau khi bắt đầu tiêu thụ thực phẩm có probiotics, phụ thuộc vào công dụng và liều lượng của chủng probiotics sử dụng.Probioticscó khả năng điều hòa hoạt động trao đổi chất của vi sinh vật đường ruột. Probiotics có thể làm giảm pH của bộ phận tiêu hóa và có thể theo cách đó sẽ gây cản trở hoạt động tiết ra enzyme của vi sinh vật có hại trong đường ruột. Đồng thời tăng sự dung nạp đường lactose giúp tránh khỏi tình trạng đầy hơi, khó tiêu khi hấp thu những loại thức ăn có chứa nhiều lactose và làm tăng lượng vi khuẩn có lợi, giảm lượng vi khuẩn gây hại[120], [121]. Trong số 5 chủng probiotics thương mại, chủngBacillus (Bacillus cereus, Bacillus clausii, Bacillus pumilus) mang các đặc tính tiềm năngnhư: khả năng sống thành nhóm lớn nhanh chóng phát triển trong đường ruột, có khả năng kích thích phản ứng miễn dịch và hoạt tính kháng khuẩn cao. Vì vậy chủngBacillus thường được bổ sung vào các sản phẩm thực phẩm mang lại lợi ích sức khỏe cho người sử dụng. 1.3. Vi khuẩn Bacillus clausii 1.3.1. Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa Bacillus clausii là vi khuẩn hiếu khí có dạng hình que đơn lẻ hoặc kết thành chuỗi (hình 1.1), là vi khuẩn Gram dương có khả năng di động. Vi khuẩn Bacillus clausii có kích thước chiều rộng 1-2 µm, dài 5 µm [22], [31]. Nhiệt độ tối thích để sinh trưởng và phát triển là 40oC, pH tối thích bằng 9 [32].Bacillus clausiiphân bố ở nhiều nơi nhưng chủ yếu là trong đất vườn hoặc đất sét. Ngoài ra có thể tìm thấychúngở trong nước và trong bùn. Vi khuẩn Bacillus clausii có khả năng thủy phân được casein, gelatin và tinh bột nhưng không thủy phân được pullulan[31], [122]. Hình 1.1.Tế bào Bacillus clausii quan sát dưới kính hiển vi 7
20. KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SVTH: NGUYỄN THỊ THẢO HÀ 1.3.2. Vai trò Bacilus clausii là loàiprobiotics rất quan trọng với con người cùng với các bào tử của trực khuẩn khác như: Bacillus subtilis, Bacillus pumilus, Bacillus coagulans, Bacillus cereus var vietnami [33].Nghiên cứu của Marseglia và cộng sự đã chỉ ra rằng Bacillus clausii không gây nên tác dụng phụ và độc tính đối với trẻ em trong quá trình điều trị[34]. Bacillus clausii phát triển ngay cả khi có mặt các kháng sinh, đồng thời sản sinh các men tiêu hóa như amylase và protease. Vì vậy Bacillus clausii thường được dùng làm thực phẩm chức năng để bổ sung hệ vi khuẩn có lợi cho đường ruột, nhờ đó giúp phòng ngừa và phối hợp điều trị rối loạn tiêu hóa cấp và mãn tính ở trẻ em, đặc biệt là sau khi dùng kháng sinh kéo dài [34]. Bacillus claussi giúp kích thích miễn dịch tự nhiên, ổn định hệ vi sinh vật đường ruột, tăng cường chức năng tiêu hóa, hấp thu thức ăn do sản sinh các loại men tiêu hóa và vitamin, đặc biệt là protease kiềm và vitamin nhóm B. Một số đặc tính của chúng có thể được sử dụng trong các ứng dụng quan trọng trong công nghiệp và công nghệ sinh học như: sản xuất protease kiềm và xylanase [34]. Theotổ chức Y tế thế giới - WHO (2008), phương pháp điều trị bệnh loét dạ dày - tá tràng do vi khuẩn Helicobacter pylorigây ra không thành công vì chính bệnh nhân vào khoảng 10%, nguyên nhân chủ yếu do đề kháng kháng sinh và tác dụng phụ của phương pháp điều trị này. Phương pháp điều trị bệnh loét dạ dày - tá tràng do Helicobacter pylori thường dùng 2 loại kháng sinh phối hợp với thuốc ức chế bơm proton tuy nhiên thường gây nhiều tác dụng phụ. Việc bổ sungBacillus clausii vào phương pháp điều trị ở trên làm giảm đáng kể các tác dụng phụ như buồn nôn, tiêu chảy, đau thượng vị và giúp bệnh nhân tuân thủ quá trình điều trị tốt hơn. Tổ chức tiêu hóa thế giới (World Gastroenterology Organisation -WGO) (2008) đã chính thức khuyến cáo sử dụngBacillus clausii trong điều trị hỗ trợ điều trị bệnh loét dạ dày – tá tràng do vi khuẩn Helicobacter pylori gây ra [123]. 1.3.3. Hoạt tính probiotics Việc cung cấp đủ một lượng nhất định tế bào Bacillus clausii sẽ giúp khôi phục hệ vi sinh vật có lợi cho hệ tiêu hóa, cung cấp thêm các enzyme có lợi cho tiêu hóa (amylase, protease ), các vitamin đặc biệt là vitamin nhóm B và các chất dinh dưỡng. Bacillus clausii là vi khuẩn tuyệt đối an toàn nên sẽ không sản sinh bất cứ độc tố hay chất nào ảnh gây hưởng xấu đến sức khỏe của người sử dụng[35]. 8
21. KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SVTH: NGUYỄN THỊ THẢO HÀ Đánh giá các hoạt động kháng khuẩn và điều hòa miễn dịch của loàiBacillus clausii cho thấy Bacillus clausiicó thể giải phóng các chất kháng khuẩn ra môi trường. Hơn nữa, việc giải phóng các chất kháng khuẩn này đã được quan sát thấy trong giai đoạn tăng trưởng. Những chất này có tác dụng chống lại các vi khuẩn Gram dương, đặc biệt là đối với Staphylococcus aureus, Enterococcus faecium và Clostridium difficile[31]. 1.4. Vi bao probiotics 1.4.1. Định nghĩa vi bao Bao gói là một quá trình hóa lý hoặc cơ học bao bọc một chất hoặc một loại vi sinh vật trong vật liệu bao gói để tạo ra các phân tử với đường kính từ vài nanomet đến vài milimet [17], [36], [37]. Các chất được bao gói có thể được gọi là vật liệu cốt lõi, chất bên trong hoặc pha nội bộ. Các chất bao gói có thể được gọi là các lớp phủ, màng, vỏ, pha bên ngoài hoặc ma trận màng bao. Vi bao được định nghĩa như một công nghệ bao gói các chất rắn, chất lỏng hoặc chất khí dưới dạng thu nhỏ và các hạt bao kín có thể giải phóng chất được bao bên trong ở mức kiểm soát nhất định dưới những điều kiện đặc biệt [38],[39].Vi hạt thường có dạng hình cầu, có lớp màng bán thấmmỏng và là màng baovững chắc bao quanh một lõi lỏng/rắn, với đường kính khác nhau từ một vài micromet đến vài milimet[40]. Hạt vi bao thường có đường kính từ 3-800μm tùy theo kỹ thuật vi bao được sử dụng [41]. Vibao thường được nhắc đến như là cách để bảo vệ vi khuẩn chống lại các yếu tố khắc nghiệt của môi trường bên ngoài[41], [42]. Mục tiêu của vi bao là tạo ra môi trường vi mô trong đó các vi khuẩn sẽ tồn tại trong suốt quá trình xử lý, lưu trữ và giải phóng chúng tại các địa điểm thích hợp trong đường tiêu hóa.Trong trường hợp vi baoprobiotics, mục tiêu không chỉ để bảo vệ các tế bào chống lại những điều kiện bất lợi của môi trường dạ dày – ruột, mà còn có thể giải phóng các tế bào probiotics đúng nơi, đúng thời điểm trong tình trạng còn sống, có thểhoạt động và trao đổi chất trong đường ruột mang lại các lợi ích sức khỏe cho người sử dụng [41]. 1.4.2. Vi bao probiotics Sự sống sót của probiotics trong các sản phẩm bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố bao gồm pH, quá trình acid hóa (trong quá trình bảo quản) trong các sản phẩm lên men, quá trình oxy hóa, oxy độc tính (thẩm thấu oxy thông qua bao bì), nhiệt độ lưu trữ, độ ổn định 9
22. S K L 0 0 2 1 5 4