Luận văn Nghiên cứu hoạt tính kháng oxy hóa của thân cây gáo vàng, Nauclea orientalis (L.)L. (Rubiaceae) (Phần 1)

Nội dung text: Luận văn Nghiên cứu hoạt tính kháng oxy hóa của thân cây gáo vàng, Nauclea orientalis (L.)L. (Rubiaceae) (Phần 1)

1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA CỦA THÂN CÂY GÁO VÀNG, NAUCLEA ORIENTALIS (L.) L.S K C 0 (RUBIACEAE)0 3 9 5 9 MÃ SỐ: T2015-66TĐ S KC 0 0 4 7 9 5 Tp. Hồ Chí Minh, 2015
2. TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC & THỰC PHẨM BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KH&CN CẤP TRƯỜNG TRỌNG ĐIỂM NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA CỦA THÂN CÂY GÁO VÀNG, NAUCLEA ORIENTALIS (L.) L. (RUBIACEAE) Mã số: T2015-66TĐ Chủ nhiệm đề tài: TS. Phan Thị Anh Đào Thành viên đề tài: TS. Võ Thị Ngà TP. HCM, 2015
3. DANH SÁCH NHỮNG NGƯỜI THAM GIA ĐỀ TÀI Nội dung ST Đơn vị công tác và Họ và tên nghiên cứu T lĩnh vực chuyên môn được giao 1 Phan Thị Anh Đào Bộ môn CN Hóa học- Khoa CN Hóa Chủ trì học& Thực phẩm, ĐH Sư phạm Kỹ thuật TP. HCM 2 Võ Thị Ngà Bộ môn Hóa Phân Tich, Khoa Hóa, Tham gia ĐH Khoa học Tự Nhiên TP. HCM ĐƠN VỊ PHỐI HỢP CHÍNH Tên đơn vị Nội dung phối hợp Họ và tên trong và ngoài nước nghiên cứu người đại diện đơn vị Phòng thí nghiệm Hóa Dược– ĐH Thử hoạt tính kháng oxy Nguyễn Xuân Khoa học Tự nhiên Tp. HCM hóa Hải Phòng phân tích trung tâm-– ĐH Khoa học Tự nhiên Tp. HCM Phân tích phổ nghiệm Nguyễn Huỳnh Hoa iii
4. MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT viii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ vi DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU vii DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ vii MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 4 1.1 GỐC TỰ DO VÀ CHẤT KHÁNG OXY HÓA 4 1.1.1 Khái niệm về gốc tự do 4 1.1.2 Các nguồn phát sinh gốc tự do trong cơ thể 5 1.1.3 Vai trò của gốc tự do trong cơ thể 8 1.1.4 Khái niệm về chất kháng oxy hóa 12 1.1.5 Phân loại 12 1.1.6 Các phương pháp xác định hoạt tính kháng oxy hóa 16 1.2 TÌM HIỂU VỀ CÂY THUỐC NAUCLEA ORIENTALIS (L.), L. 20 1.2.1 Mô tả thực vật và phân bố sinh thái của cây Nauclea orientalis (L.) L. 20 1.2.2 Nghiên cứu dược học của cây N. orientalis 21 1.2.3 Nghiên cứu thành phần hóa học của cây N. orientalis 22 1.2.4 Nghiên cứu thành phần hóa học của chi Nauclea 25 1.3 ĐỊNH HƯỚNG NGHIÊN CỨU .30 1.3.1 Những vấn đề còn tồn tại 30 1.3.2 Định hướng nghiên cứu 31 CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 32 2.1 TRÍCH LY VÀ PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT TINH KHIẾT 32 2.1.1 Hóa chất 32 2.1.2 Thiết bị 32 2.1.3 Trích ly và phân lập các hợp chất từ thân cây N.orientalis 33 2.2 THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA 35 2.2.1 Thử nghiệm hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH 35 2.2.2 Khảo sát hoạt tính ức chế quá trình peroxide hóa lipid 37 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 39 iv
5. 3.1 KẾT QUẢ THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA CỦA THÂN CÂY NUCLEA ORIENTALIS (L.) L. 39 3.2 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA THÂN CÂY NUCLEA ORIENTALIS (L.) L. 40 3.2.1 Khảo sát cấu trúc hóa học các hợp chất benzopyranoid 40 3.2.2 Khảo sát cấu trúc hóa học các hợp chất monoterpenoid 47 3.3 XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA 59 3.3.1 Kết quả thử nghiệm hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH 59 3.3.2 Kết quả thử nghiệm hoạt tính ức chế quá trình peroxide hóa lipid 60 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO 64 CÔNG TRÌNH KHOA HỌC PHỤ LUC THUYẾT MINH ĐỀ TÀI v
6. DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 1.1 Một số chất kháng oxy hóa tổng hợp 13 Hình 1.2 Công thức cấu tạo của acid L-ascorbic và acid dehydro ascorbic 15 Hình 1.3 Công thức cấu tạo của vitamin E 15 Hình 1.4 Công thức cấu tạo của β-carotene 15 Hình 1.5 Công thức cấu tạo của taurine và hypotaurine [84] 16 Hình 1.6 Công thức cấu tạo của acid α-lipoic 16 Hình 1.7 Phản ứng trung hòa gốc DPPH 18 Hình 1.8 Phản ứng tạo phức giữa malonyldialdehyde và acid thiobarbituric 19 Hình 1.9 Ảnh minh họa cây, hoa và lá của N. orientalis 21 Hình 1.10 Cấu trúc một số hợp chất alkaloid phân lập từ cây N. orientalis 24 Hình 1.11 Cấu trúc một số hợp chất steroid và chất béo phân lập từ cây N. orientalis 24 Hình 1.12 Cấu trúc một số hợp chất terpenoid phân lập từ cây N. orientalis 25 Hình 1.13 Cấu trúc một số hợp chất phenol phân lập từ cây N. orientalis 25 Hình 1.14 Cấu trúc một số hợp chất alkaloid phân lập từ chi Nauclea 28 Hình 1.15 Cấu trúc một số hợp chất steroid, terpenoid phân lập từ chi Nauclea 29 Hình 1.16 Cấu trúc một số hợp chất polyphenol phân lập từ chi Nauclea 29 Hình 3.1 Tương quan HMBC (mũi tên) trong hợp chất GV-8 41 Hình 3.2 Tương quan HMBC (mũi tên) trong hợp chất GV-9 42 Hình 3.3 Tương quan HMBC (mũi tên) và COSY (kẻ đậm) trong hợp chất GV-10 44 Hình 3.4 Tương quan HMBC (mũi tên) trong hợp chất GV-12 47 Hình 3.5 Tương quan HMBC (mũi tên) và COSY (kẻ đậm) trong hợp chất GV-17 48 Hình 3.6 Tương quan HMBC (mũi tên) và COSY (kẻ đậm) trong hợp chất GV-18 50 Hình 3.7 Tương quan HMBC (mũi tên) và COSY (kẻ đậm) trong hợp chất GV-19 52 Hình 3.8 Tương quan HMBC (mũi tên) và COSY (kẻ đậm) trong hợp chất GV-20 54 Hình 3.9a Cấu trúc và tương quan HMBC (mũi tên) và COSY (kẻ đậm) trong phần aglycone của hợp chất GV-21 57 Hình 3.9b Cấu trúc và tương quan HMBC (mũi tên) và COSY (kẻ đậm) trong phần đường của hợp chất GV-21 58 Hình 3.9c Tương quan HMBC (mũi tên) và COSY (kẻ đậm) trong hợp chất GV-21 58 Hình 3.38c Tương quan HMBC (mũi tên) và COSY (kẻ đậm) trong hợp chất GV-21 58 Hình 3.9d Tương quan NOESY (mũi tên) trong hợp chất GV-21 59 Hình 4.1 Cấu trúc của 10 hợp chất phân lập từ thân cây N. orientalis 62 vi
7. DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng 1.1 Các dạng hoạt động của nitroge .4 Bảng 1.2 Các dạng hoạt động của oxygen 4 Bảng 1.3 Các hợp chất được phân lập từ các cây N. orientalis 23 Bảng 1.4 Các hợp chất phân lập từ chi Nauclea 25 Bảng 2.1 Khối lượng và thu suất các loại cao từ thân cây N.orientalis 33 Bảng 2.2 Kết quả sắc ký cột cao ethyl acetate của thân cây N. orientalis 35 Bảng 3.1 Kết quả thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH của các cao phân đoạn từ thân cây N. orientalis 39 Bảng 3.2 Kết quả thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH của các phân đoạn từ cao ethyl acetate của thân cây N. orientalis 39 Bảng 3.3 Số liệu phổ NMR của hợp chất GV-8 so sánh với umbelliferone 41 Bảng 3.4 Số liệu phổ NMR của hợp chất GV-9 so sánh với skimmin 43 Bảng 3.5 Số liệu phổ NMR của hợp chất GV-10 so sánh với adicardin 45 Bảng 3.6 Số liệu phổ NMR của hợp chất GV-11 so sánh với esculetin 46 Bảng 3.7 Số liệu phổ NMR của hợp chất GV-12 so sánh với scopoletin 47 Bảng 3.8 Số liệu phổ NMR của hợp chất GV-17 so sánh với loganetin 49 Bảng 3.9 Số liệu phổ hợp chất GV-18 so sánh với loganin 50 Bảng 3.10 Số liệu phổ hợp chất GV-19 so sánh với sweroside 52 Bảng 3.11 Số liệu phổ hợp chất GV-20 so sánh với grandifloroside 54 Bảng 3.12 Số liệu phổ hợp chất GV-21 57 Bảng 3.13 Hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH của 10 hợp chất phân lập trên thân cây N. orientalis 59 Bảng 3.14 Hoạt tính ức chế quá trình peroxide hóa lipid của hai hoạt chất lựa chọn 60 DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ Sơ đồ 1.1 Các bộ phận cơ thể và các bệnh lý liên quan tới gốc tự do 9 Sơ đồ 1.2 Phân loại các chất kháng oxy hóa tự nhiên 13 Sơ đồ 2.1 Sơ đồ điều chế các loại cao từ thân cây N.orientalis 34 Sơ đồ 2.2 Quy trình thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH 36 Sơ đồ 2.3 Quy trình khảo sát hoạt tính ức chế quá trình peroxide hóa lipid 38 vii
8. DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT AO (AH) : Antioxidant (chất kháng oxy hóa) Asc : Ascorbic acid (vitamin C) BHA : Butylated hydroxyanisole br : Broad (rộng) BHT : Butylated hydroxytoluene CHCl3 : Chloroform CTPT : Công thức phân tử d : Doublet (mũi đôi) DEPT : Distortionless enhancement by polarization transfer DMSO : Dimethyl sulfoxide DNA : Acid deoxyribonucleic DPPH : 2,2-diphenylpicrylhydrazyl EDTA : Ethylenediaminetetraacetic acid ET : Electron transfer methods GSH : Glutathione HAT : Hydrogen atom transfer methods HMBC : Heteronuclear multiple bond correlation HR-ESI-MS : High resolution electro spray ionization mass spectroscopy HSQC : Heteronuclear single quantum coherence IC50 : Nồng độ của mẫu mà tại đó nó có thể ức chế 50 % gốc tự do J : Hằng số ghép m : Multiplet (mũi đa) MDA : Malonyldialdehyde NADPH : Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate NMR : Nuclear magnetic resonance (cộng hưởng từ hạt nhân) NOS : Nitrogen oxygen species NP : Nomal phase (pha thường) PBS : Phosphate buffered saline PG : Propyl gallate Pr : Protein PTLC : Preparative thin layer chromatography (sắc ký bản mỏng điều chế) quin : quintet (mũi năm) viii
9. RNS : Reactive nitrogen species ROS : Reactive oxygen species s : Singlet (mũi đơn) SEM : Standard error of the mean (sai số chuẩn của giá trị trung bình) SKC : Sắc ký cột TBA : Acid thiobarbituric TBHQ : tert-Butylhydroquinone TCA : Acid Trichloroacetic TLC : Thin layer chromatography (sắc ký bản mỏng) Trolox : Acid 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic UV : Ultraviolet (tử ngoại) XO : Xanthine oxidase YHCT : Y học cổ truyền ix
10. TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH Độc lập - Tự do - Hạnh phúc ĐƠN VỊ: KHOA CNHH VÀ TP Tp. HCM, Ngày 28 tháng 10 năm 2015 THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 1. Thông tin chung: - Tên đề tài: Nghiên cứu hoạt tính kháng oxy hóa của thân cây Gáo Vàng, Nauclea orientalis (L.)L. (Rubiaceae) - Mã số: T2015-66TĐ - Chủ nhiệm: Phan Thị Anh Đào - Cơ quan chủ trì: ĐH Sư phạm Kỹ thuật Tp. HCM - Thời gian thực hiện: 6/2014-12/2015 2. Mục tiêu:  Cô lập các hợp chất từ thân cây Gáo vàng, Nauclea orientalis (L.)L. (Rubiaceae).  Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất cô lập được.  Thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hóa bằng phương pháp ức chế gốc tự do DPPH, ức chế quá trình peroxyde hóa lipid. 3. Tính mới và sáng tạo:  Đây là nghiên cứu có tính định hướng về hoạt tính kháng oxy hóa và phân lập hoạt chất kháng oxy hóa- Một xu hướng nghiên cứu mới trong Hóa dược.  Đây là nghiên cứu đầu tiên về thành phần và hoạt tính kháng oxy hóa của Nauclea orientalis (L.)L. (Rubiaceae) tại Việt nam.  Đề tài công bố 10 hợp chất lần đầu tiên cô lập được từ thân cây này và chi Nauclea. 4. Kết quả nghiên cứu: Từ thân cây Nauclea orientalis (L.)L. (Gáo vàng), chúng tôi đã phân lập được 10 hợp chất bao gồm: Umbelliferone (GV-8), skimmin (GV-9), adicardin (GV-10), esculetin (GV-11), scopoletin (GV-12), Loganetin (GV-17), Loganin (GV-18), Sweroside (GV-19), Grandifloroside (GV-20), Naucleaorinoside A (GV-21). Đây cũng là 10 hợp chất lần đầu tiên cô lập được từ thân cây này và chi Nauclea. x
11.  10 hợp chất được phân lập từ cây nghiên cứu đều được thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH. 02 hợp chất thể hiện hoạt tính ức chế gốc tự do mạnh là GV-11 và GV- 20 với IC50 < 15 µM.  02 hoạt chất này được lựa chọn để đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa trên mô hình ức chế quá trình peroxide hóa lipid. Theo kết quả IC50 nhận thấy, 02 hợp chất này đều có hoạt tính mạnh hơn chất đối chứng dương Trolox (IC50, 2265,5 µM). 5. Sản phẩm:  01 bài báo đăng trên Natural Product Communications. 6. Hiệu quả, phương thức chuyển giao kết quả nghiên cứu và khả năng áp dụng: Đề tài góp phần cung cấp thông tin khoa học về thành phần và hoạt tính kháng oxy hóa của thân cây Gáo Vàng, Nauclea orientalis (L.)L. (Rubiaceae). Do vậy, đây là tài liệu tham khảo hữu ích cho sinh viên ngành Hóa, Sinh và Dược học. Bên cạnh đấy, kết quả nghiên cứu của đề tài giúp đẩy mạnh ứng dụng của cây thuốc Gáo vàng trong y học cổ truyền Việt Nam. Ngày 28 tháng 10 năm 2015 Trưởng Đơn vị Chủ nhiệm đề tài (ký, họ và tên, đóng dấu) (ký, họ và tên) xi
12. INFORMATION ON RESEARCH RESULTS 1. General information: - Project title: Study on antioxidant activity of the stem of Nauclea orientalis (L.) L. (Rubiaceae). - Code number: T2015- 66TĐ - Coordinator: Phan Thi Anh Dao - Implementing institution: HCM City University of Technology and Education - Duration: from 6/2014 to 12/2015 2. Objective(s): - Isolating compounds from the stem of Nauclea orientalis (L.) L. (Rubiaceae). - Indentification the isolated compounds. - Study on DPPH free radical scavenging and lipid peroxidation inhibitory activities of isolated compounds. 3. Creativeness and innovativeness:  Study on antioxidant activity is a new trending research in chemical pharmacy.  Until now, this is the first scientific report on chemical constituents and biological activities of this plant in Vietnam.  Project was reported ten compounds which is the first time from this plant and Tetrastigma genius. 4. Research results:  Ten compounds were isolated from the stem of N.orentalis including : Umbelliferone (GV-8), skimmin (GV-9), adicardin (GV-10), esculetin (GV-11), scopoletin (GV-12), Loganetin (GV-17), Loganin (GV-18), Sweroside (GV-19), Grandifloroside (GV-20), Naucleaorinoside A (GV-21). These compounds were isolated for the first time from this plant and Nauclea genius.  All isolated compounds from the stem of T.erubescens were assayed and compared were assayed and compared for their DPPH inhibitory activity to the positive control, trolox. The results indicated that 02 compounds GV-11 and GV-20 showed significant free radical scavenging capacities with IC50 values below 15 µM.  Based on the results obtained from the DPPH assay, three compounds which exhibited strong DPPH inhibitory were tested for lipid peroxidation inhibition by xii
13. the thiobarbituric acid assay (TBA assay). All the studied compounds showed antioxidant activity much more active than trolox (IC50, 2265,5 µM). 5. Products: one paper public on Natural Product Communications. 6. Effects, transfer alternatives of reserach results and applicability: This project which has supplied results about chemical constituents and biological activities of stem of Nauclea orientalis (L.) L. (Rubiaceae) helpful for student in chemistry, biology and pharmacy. In addition, this investigation of antioxidant phenolic compounds suggested that the potency of these compounds could provide a chemical basis for some of the health benefits claimed for N.orientalis in foods and folk medicine. xiii
14. MỞ ĐẦU * Tính cấp thiết: Trong những năm gần đây, các nhà khoa học đặc biệt quan tâm đến các vấn đề gốc tự do, chất kháng oxy hóa và hoạt tính kháng oxy hóa. Trong cơ thể con người, khi lượng gốc tự do quá lớn, vượt qua mức kiểm soát của hệ thống miễn dịch, gốc tự do sẽ tấn công vào các đại phân tử như DNA, protein, lipid và gây rối loạn các quá trình sinh hóa trong cơ thể. Gốc tự do được biết là thủ phạm có liên quan tới nhiều căn bệnh mà trong đó phải kể tới các bệnh nguy hiểm hiện nay như ung thư, viêm khớp, huyết áp, tim mạch, Alzheimer, Parkinson Chất kháng oxy hóa được đưa vào cơ thể con người thông qua thực phẩm, dược phẩm có khả năng ngăn ngừa, ức chế và loại bỏ tác dụng độc hại của các gốc tự do một cách trực tiếp hoặc gián tiếp. Nhu cầu và thị yếu của con người ngày càng cao, đòi hỏi sự tìm tòi, nghiên cứu của các nhà khoa học càng sâu rộng, hiệu quả và kịp thời. Ngày này, xu hướng nghiên cứu mới là tìm kiếm các hoạt chất có nguồn gốc tự nhiên nhằm thay thế cho các chất kháng oxy hóa tổng hợp hiện vẫn còn sử dụng nhiều trong thực phẩm, y học và cuộc sống hằng ngày. Vùng Bảy Núi, huyện Tịnh Biên, An Giang có hệ thực vật phong phú và đa dạng, được sử dụng nhiều trong y hoc cổ truyền (YHCT). Có nhiều cây thuốc được sử dụng trong dân gian để điều trị nhiều bệnh lý liên quan tới gốc tự do như ung thư, tim mạch, viêm gan, tiểu đường, huyết áp Tuy nhiên, cho đến nay, chưa có bất kỳ một nghiên cứu qui mô và hệ thống nào về các cây thuốc Việt Nam có hoạt tính kháng oxy hóa. Từ kết quả sàng lọc hoạt tính kháng oxy hóa của 90 cây thuốc An Giang (3/2012), nhóm chúng tôi đã tìm ra cao MeOH trích ly từ thân cây Gáo vàng có hoạt tính kháng oxy hóa mạnh với giá trị IC50= 6,0 µg/ml (phương pháp thử ức chế gốc tự do DPPH) và IC50= 95,1 µg/ml (phương pháp ức chế quá trình peroxide hóa lipid). Ở Việt Nam và trên thế giới, chưa có công trình khoa học nào nghiên cứu về thành phần và hoạt tính của cây Gáo vàng nói chúng và thân cây Gáo vàng nói riêng. Do vậy, nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính kháng oxy hóa của thân cây Gáo vàng là hết sức cần thiết và hứa hẹn những kết quả khả quan. * Tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước Tình hình ngoài nước: hoạt tính kháng oxy hóa là một hoạt tính sinh học được các nhà khoa học tập trung nghiên cứu nhiều vào khoảng 20 năm trở lại đây. Trên thế giới 1
15. có một số ít các công trình nghiên cứu mang tính qui mô trên đối tượng lớn các cây thuốc. Xu hướng nghiên cứu phân lập các hoạt chất từ các mẫu dược liệu hiện đang phát triển mạnh. Cây N.orientalis (Gáo vàng) đã được nghiên cứu về thành phần và hoạt tính kháng oxy hóa theo định hướng phân lập alkaloid từ cao ethyl acetate-amoniac và cao chloroform trích ly từ các bộ phận của cây. Bằng các phương pháp sắc ký, phổ nghiệm, các nhà khoa học trên thế giới đã phân lập, xác định cấu trúc và định danh được 40 hợp chất có giá trị từ cao amoniac và cao chloroform của các bộ phận khác nhau (rễ, thân, vỏ, lá) từ cây N. orientalis. Các hợp chất ấy chủ yếu là alkaloid, ngoài ra còn có thêm một số chất béo, nhóm hợp chất terpenoid và polyphenol. Tuy nhiên, định hướng nghiên cứu về các hoạt chất kháng oxy hóa thì chưa tiến hành. Tình hình trong nước: nước ta là một trong những nước nhiệt đới có thảm thực vật phong phú nhất thế giới với khoảng 12.000 loài, chưa kể tới các rong, rêu, nấm. Bên cạnh đó, YHCT Việt Nam cũng đang phát triển với bề dày kinh nghiệm được lưu truyền qua các thế hệ. Có nhiều cây thuốc được sử dụng trong dân gian để điều trị nhiều bệnh lý trong đó phải kể tới các bệnh liên quan tới gốc tự do như ưng thư, tim mạch, viêm gan, tiểu đường, huyết áp. Tuy nhiên, những bằng chứng khoa học về những cây thuốc này chưa có hoặc còn rất hạn chế. Ở Việt Nam, chưa có nhiều công trình nghiên cứu mang tính qui mô, sâu rộng theo định hướng hoạt tính kháng oxy hóa. - Cây N.orientalis đã được ứng dụng trong dân gian để chữa trị các bệnh xơ gan cổ trướng. Tuy nhiên, nghiên cứu hóa học và hoạt tính của loài cây này thì chưa được triển khai ở Việt Nam. * Mục tiêu:  Cô lập các hợp chất từ thân cây Gáo vàng, Nauclea orientalis (L.), L., Họ Cà phê (Rubiaceae).  Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất cô lập được.  Thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hóa bằng phương pháp ức chế gốc tự do DPPH, ức chế quá trình peroxyde hóa lipid. * Cách tiếp cận  Tham khảo tài liệu.  Thực nghiệm. 2
16. * Phương pháp nghiên cứu: Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm: Điều chế các mẫu cao bằng phương pháp trích nóng trong dung môi MeOH và cô lập các hợp chất bằng các phương pháp sắc ký cột, sắc ký bản mỏng điều chế.  Phương pháp nghiên cứu phân tích tổng hợp: Phân tích và tổng hợp các dữ liệu phổ nghiệm như phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H, 13C, DEPT, COSY, HMBC, HMQC và khối phổ để xác định cấu trúc hóa học các hợp chất polyphenol cô lập được. * Đối tượng và phạm vi nghiên cứu  Đối tượng nghiên cứu: thân cây Gáo vàng  Phạm vi nghiên cứu : - Cô lập 10 hợp chất tinh khiết * Nội dung nghiên cứu  Cô lập các hợp chất tinh khiết từ thân cây Gáo vàng bằng các phương pháp trích ly, sắc ký cột, sắc ký bản mỏng, sắc ký bản mỏng điều chế.  Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất cô lập được bằng các phương pháp phổ nghiệm hiện đại như cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều, khối phổ,  Thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hóa bằng phương pháp ức chế gốc tự do DPPH và hoạt tính ức chế quá trình peroxide hóa lipid. 3
17. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1 GỐC TỰ DO VÀ CHẤT KHÁNG OXY HÓA 1.1.1 Khái niệm về gốc tự do Gốc tự do (free radical) được định nghĩa là những phân tử, nguyên tử, nhóm nguyên tử có chứa một hay nhiều electron tự do (electron độc thân) ở lớp ngoài cùng.[1-3] Gốc tự do gồm hai dạng hoạt động chính là: dạng hoạt động của nitrogen (RNS- reactive nitrogen species) (bảng 1.1) và dạng hoạt động của oxygen (ROS-reactive oxygen species) (bảng 1.2). Bảng 1.1 Các dạng hoạt động của nitrogen [1] Các dạng hoạt Thời gian Ký hiệu Hoạt động động tồn tại Vai trò rất quan trọng trong hệ thống thần kinh trung Nitric oxide NO● 1s ương và ngoại biên. ● Nitrogen dioxide NO2 1s Hình thành trong quá trình ô nhiễm không khí Acid ONOOH Khá ổn định Được hình thành khi ONOO─ nhận thêm một proton. peroxynitrous ─ -3 ● ●─ Peroxynitrite ONOO 10 s Hoạt tính cao, hình thành từ NO và O2 Bảng 1.2 Các dạng hoạt động của oxygen [1] Các dạng hoạt Ký Thời gian Hoạt động động hiệu tồn tại Tạo ra trong ty thể (mitochondria), hệ thống tim mạch Superoxide O ●─ 10-6s 2 và các bộ phận khác Gốc hydroxyl Hoạt tính cao, được tạo ra trong tình trạng cơ thể dư HO● 10-9s chất sắt (phản ứng Fenton) Alkoxyl RO● 1s Hoạt tính cao, được hình thành khi các đại phân tử bị Gốc peroxyl ROO● 1s gốc tự do tấn công Hydroperoxide Phản ứng với các ion kim loại chuyển tiếp để tạo ra các ROOH Ổn định hữu cơ dạng hoạt động. Hydrogen Là tác nhân oxy hóa mạnh, dễ dàng nhận một electron H O Bền peroxide 2 2 để chuyển hóa thành gốc tự do HO● Hoạt tính cao, hình thành trong quá trình quang học Oxygen đơn bội 1O 10-6s 2 (photosensitization) và phản ứng hóa học Là một chất gây ô nhiễm trong khí quyển, có thể phản Ozon O3 1s 1 ứng với các phân tử khác nhau để tạo ra O2. Các gốc tự do thường kém bền và có năng lượng cao, dễ dàng tham gia vào nhiều phản ứng hóa học như phản ứng oxy hóa-khử, phản ứng polymer hóa . Gốc tự do có hoạt tính cao nên thời gian tồn tại của chúng thường rất ngắn, phụ thuộc nhiều yếu tố: cấu hình không gian, đặc tính cộng hưởng, hiệu ứng liên hợp.[4] 4
18. Hai gốc tự do quan trọng chứa nitrogen là NO• và ONOO-, trong đó NO• là gốc tự do được quan tâm nhiều nhất do nó có vai trò rất quan trọng trong hệ thống thần kinh trung ương, ngoại biên và là tác nhân điều hòa huyết áp. Nếu như các dạng hoạt động của nitrogen có ý nghĩa trên lâm sàng thì các dạng hoạt động của oxygen lại là tác nhân nguy hiểm gây ra nhiều bệnh lý.[1,5] Các dạng oxygen hoạt động này có năng lượng cao, rất kém bền và dễ dàng phản ứng với những đại phân tử sinh học như protein, lipid, DNA gây rối loạn các quá trình sinh hóa trong cơ thể. Đồng thời khi một phân tử sống bị các gốc tự do tấn công, nó sẽ mất điện tử và trở thành một gốc tự do mới, tiếp tục phản ứng với những phân tử khác tạo thành một chuỗi phản ứng thường gọi là phản ứng dây chuyền trong cơ thể, gây ra các biến đổi có tác hại đối với cơ thể.[1,5] 1.1.2 Các nguồn phát sinh gốc tự do trong cơ thể 1.1.2.1. Nguồn nội sinh Gốc tự do được chính cơ thể tạo ra bởi những quá trình sinh lý (quá trình hô hấp ở tế bào), quá trình bệnh lý (quá trình viêm nhiễm), hoặc bởi hệ thống enzyme thân oxy hóa (prooxidant enzyme) và sự có mặt của các ion kim loại chuyển tiếp trong cơ thể. a) Quá trình hô hấp của tế bào [6-8] Quá trình hô hấp ở tế bào là một chuỗi những phản ứng oxy hóa-khử và gốc tự do là các sản phẩm trung gian được sinh ra trong quá trình này. Ví dụ: quá trình khử oxygen tạo nước trong quá trình hô hấp tạo các gốc tự do ●- ● như O2 , HO thông qua những phản ứng như sau: + O2 + 4 H + 4e 2H2O (1.1) ●- O2 + e O2 (1.2) ●- + H2O2 O2 + 2H + e (1.3) + ● H2O2 + H + e HO + H2O (1.4) ● + HO + H + e H2O (1.5) Bên cạnh đó, phản ứng phụ giữa các gốc tự do trong quá trình hô hấp cũng sẽ hình thành những gốc tự do mới, độc hại hơn. Một phản ứng phụ đáng chú ý là phản ứng ●- ● Haber-Weiss (phản ứng 1.6), xảy ra giữa gốc O2 và H2O2 tạo nên gốc HO và oxygen đơn bội: ●- 1 ● - O2 + H2O2 O2 + HO + HO (1.6) Phản ứng 1.6 sẽ xảy ra nhanh hơn khi được xúc tác bởi các ion kim loại chuyển tiếp như sắt, đồng, coban, Oxygen đơn bội và gốc hydroxyl hình thành là những gốc 5
19. tự do có khả năng phản ứng mạnh và rất độc hại. Chúng là nguyên nhân chính gây ra các quá trình peroxide hóa màng lipid. b) Hội chứng viêm nhiễm [6,9] Hội chứng viêm nhiễm là một phản ứng tự vệ của cơ thể sống nhằm chống lại sự tấn công của các vi khuẩn hoặc các sinh vật lạ từ bên ngoài xâm nhập vào cơ thể hoặc sinh ra ngay trong cơ thể. Khi các vi khuẩn hoặc các sinh vật lạ xâm nhập vào cơ thể sẽ bị bạch cầu đa nhân trung tính (neutrophil) bao kín để làm nhiệm vụ thực bào. Lúc này, enzyme NADPH oxidase ở màng bạch cầu được hoạt hóa, xúc tác phản ứng giữa O2 và NADPH tạo nên ●- gốc tự do O2 (phản ứng 1.7), từ đó tạo nhiều gốc tự do khác nhằm phân hủy các sinh vật lạ. Một phần các gốc tự do bị thoát ra ngoài bạch cầu, gây nên những phản ứng viêm. NADPH oxidase ●- + 2O2 + NADPH 2O2 + NADP + H (1.7) c) Các enzyme thân oxy hóa [5,6,10] Một hệ thống các enzyme thân oxy hóa trong cơ thể có khả năng tạo gốc tự do ●- như xanthine oxidase (XO), nitric oxide synthase, myeloperoxidase Gốc O2 và NO● là hai gốc tự do chính được sinh ra dưới sự xúc tác của các enzyme thân oxy hóa này. - Xanthine oxidase là một enzyme quan trọng trong quá trình thoái hóa của các hợp chất purine. XO dùng O2 như một chất chuyển electron trong quá trình phản ứng ●- và kết quả dẫn đến là hình thành gốc O2 . Điều này được minh họa bằng phản ứng 1.8 như sau: O H O N H HN XO N + + H2O + 2O2 HN 2O2 + 2H (1.8) O + N N O N H O N H H ●- Sự tạo thành gốc O2 bởi XO đóng vai trò quan trọng trong việc gây ra các tổn thương trong hiện tượng thiếu máu cục bộ (ischaemia injury). - Nitric oxide synthase là một enzyme xúc tác sự oxy hóa L-arginine thành citrulline và tạo gốc NO●. Enzyme này dùng NADPH làm chất chuyển electron trong ●- ●- quá trình phản ứng. Nếu trong phản ứng có tồn tại gốc O2 thì gốc O2 dễ dàng phản ứng với gốc NO● tạo ONOO- (một hợp chất có hại đối với DNA). 6
20. - Enzyme myeloperoxidase được tạo ra do sự hoạt hóa bởi bạch cầu đa nhân trung - tính, sử dụng H2O2 để oxy hóa ion Cl tạo ra HOCl, một hợp chất không phải là gốc tự do nhưng có khả năng oxy hóa mạnh, gây nguy hại cho các mô cơ trong quá trình viêm nhiễm. d) Các ion kim loại chuyển tiếp [6,9] Phản ứng giữa một ion kim loại chuyển tiếp và một hợp chất peroxide cũng góp ● phần sản sinh gốc tự do trong cơ thể. Phản ứng phân hủy H2O2 thành gốc HO dưới xúc tác ion sắt là một ví dụ điển hình (phản ứng 1.9 và 1.10) 2+ - ● 3+ Fe + H2O2 HO + HO + Fe (1.9) 3+ + ● 2+ Fe + H2O2 H + HOO + Fe (1.10) Hai phản ứng trên được gọi là phản ứng Fenton. Ngoài sắt, các ion kim loại chuyển tiếp khác như đồng, cobalt cũng có thể tham gia quá trình này. 1.1.2.2 Nguồn ngoại sinh Ngoài những yếu tố nội sinh, gốc tự do còn được hình thành trong cơ thể bởi các yếu tố ngoại sinh như sự ô nhiễm môi trường, bức xạ, khói thuốc, ozon a) Sự bức xạ [6] Thành phần chủ yếu của cơ thể là nước, do đó các bức xạ có năng lượng cao (tia X, tia UV ) khi chiếu vào cơ thể sẽ phân hủy các phân tử nước thành các gốc tự do, có khả năng phản ứng rất mạnh (phản ứng 1.11 và 1.12): ● + -aq H2O HO + H + e (1.11) ● ● H2O HO + H (1.12) Nếu trong nước có oxygen thì sẽ xảy ra phản ứng sau (phản ứng 1.13 và 1.14): -aq ●- O2 + e O2 (1.13) ● ● H + O2 HOO (gốc hydroperoxide) (1.14) ● ●- ● Như vậy, dưới tác dụng của bức xạ, các gốc tự do như HO , O2 , HOO được hình thành trong cơ thể. Điều này có thể giải thích vì sao sự lão hóa của da người sẽ tăng lên tại những vùng bị phơi bày dưới ánh sáng. Đó là do các bức xạ mặt trời, tia cực tím đã làm sản sinh những gốc tự do có khả năng tham gia quá trình peroxide hóa lipid ở các tế bào da. Bức xạ cũng có thể khơi mào những phản ứng gốc trong tế bào, chẳng hạn như sự tự oxy hóa các lipid. Đồng thời, các phân tử DNA cũng là mục tiêu bị nguy hại bởi các bức xạ vì các gốc tự do sản sinh từ sự phân giải nước sẽ tấn công các base của DNA. 7
21. b) Khói thuốc lá [11] Khói thuốc chứa một lượng lớn những hợp chất như aldehyde, epoxide, peroxide và những gốc tự do như nitric oxide, gốc peroxyl, gốc với trung tâm carbon hiện diện trong pha khí. Theo ước tính, trong một làn hơi thuốc lá có khoảng 1015 gốc tự do. Chúng có khả năng tồn tại trong thời gian dài cho đến khi chúng tấn công túi phổi. Bên cạnh đó, khói thuốc còn chứa các gốc tự do bền trong nhựa thuốc. Sự vi xuất huyết là nguyên nhân chủ yếu của sự kết tủa sắt được tìm thấy ở mô phổi của những người hút thuốc. Sắt trong thể này dễ dàng xúc tác cho phản ứng Fenton, sinh ra gốc HO● độc hại. c) Ozon [12] Ozon là một trong những tác nhân độc hại tạo ra gốc tự do và sự ảnh hưởng của nó trên cơ thể sống biểu hiện chủ yếu qua các tổn thương ở phổi và máu. Ozon có thể phản ứng trực tiếp với các hợp chất bất bão hòa như các acid béo trong lipid hoặc có thể tự phân hủy sinh ra O2, từ đó gia tăng khả năng hình thành các gốc tự do trong cơ thể . 1.1.3 Vai trò của gốc tự do trong cơ thể Theo ước tính, trung bình một ngày có khoảng 10 000-20 000 gốc tự do hoạt động trong cơ thể con người.[3] Xét về phương diện có lợi, gốc tự do rất cần thiết đối với các hoạt động của cơ thể sống. Trong quá trình trao đổi chất, gốc tự do đóng vai trò trung gian di chuyển các điện tử từ phân tử này sang phân tử khác nhằm tạo ra năng lượng. Gốc tự do góp phần cùng với bạch cầu tiêu diệt các vi sinh vật có hại, tăng cường khả năng bảo vệ cho hệ thống miễn dịch của cơ thể. Gốc tự do giúp tiêu diệt các vi sinh vật lạ, gốc tự do còn góp phần quét dọn những tế bào già, chết trong cơ thể tạo điều kiện cho những tế bào mới sinh sôi, phát triển và tiêu diệt những tế bào bất thường như tế bào ung thư. Ngoài ra, gốc tự do còn tham gia vào nhiều quá trình có lợi khác cho cơ thể như đóng vai trò là chất dẫn truyền thần kinh (NO•) và tác nhân điều hòa huyết áp. 8
22. S K L 0 0 2 1 5 4