Luận văn Nghiên cứu hoạt tính kháng oxy hóa của một số cây thuốc An Giang, Nghệ An và thành phần các hoạt chất (Phần 1)

Nội dung text: Luận văn Nghiên cứu hoạt tính kháng oxy hóa của một số cây thuốc An Giang, Nghệ An và thành phần các hoạt chất (Phần 1)

1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ÐỀ TÀI KH&CN CẤP TRƯỜNG TRỌNG ÐIỂM NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA CỦA MỘT SỐ CÂY THUỐC AN GIANG, NGHỆ AN VÀ THÀNH PHẦN CÁC HOẠT CHẤT Mã số: T2013-39TÐ Chủ nhiệm đề tài: Ths . Phan Thị Anh Ðào S KC 0 0 4 2 8 5 Tp. Hồ Chí Minh, tháng 11/2013
2. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM KỸ THUẬT THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KH&CN CẤP TRƢỜNG TRỌNG ĐIỂM NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA CỦA MỘT SỐ CÂY THUỐC AN GIANG, NGHỆ AN VÀ THÀNH PHẦN CÁC HOẠT CHẤT Mã số: T2013-39TĐ Chủ nhiệm đề tài: Ths. Phan Thị Anh Đào TP. HCM, 11/2013
3. TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC & THỰC PHẨM BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KH&CN CẤP TRƢỜNG TRỌNG ĐIỂM NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA CỦA MỘT SỐ CÂY THUỐC AN GIANG, NGHỆ AN VÀ THÀNH PHẦN CÁC HOẠT CHẤT Mã số: T2013-39TĐ Chủ nhiệm đề tài: Ths. Phan Thị Anh Đào Thành viên đề tài: TS. Võ Thị Ngà TP. HCM, 11/2012
4. DANH SÁCH NHỮNG NGƢỜI THAM GIA ĐỀ TÀI Nội dung ST Đơn vị công tác và Họ và tên nghiên cứu T lĩnh vực chuyên môn đƣợc giao 1 Phan Thị Anh Đào Bộ môn CN Hóa học- Khoa CN Hóa Chủ trì học& Thực phẩm, ĐH Sư phạm Kỹ thuật TP. HCM 2 Võ Thị Ngà Bộ môn Hóa Phân Tich, Khoa Hóa, Tham gia ĐH Khoa học Tự Nhiên TP. HCM ĐƠN VỊ PHỐI HỢP CHÍNH Tê n đơn vị Nội dung phối hợp Họ và tên trong và ngoài nƣớc nghiên cứu ngƣời đại diện đơn vị Phòng thí nghiệm Hóa Dược– ĐH Thử hoạt tính kháng oxy Nguyễn Xuân Khoa học Tự nhiên Tp. HCM hóa Hải Phòng phân tích trung tâm-– ĐH Khoa học Tự nhiên Tp. HCM Phân tích phổ nghiệm Nguyễn Huỳnh Hoa
5. LỜI CẢM ƠN Xin chân thành gửi tới TS. Nguyễn Thị Thanh Mai (Khoa Hóa, ĐH Khoa học Tự nhiên TP HCM), đã dìu dắt, định hướng cho tôi trong nghiên cứu này. Đề tài hoàn thành còn có sự đóng góp, hỗ trợ của các thầy cô trong khoa CN Hóa Học & Thực Phẩm- ĐH Sư phạm kỹ thuật HCM và khoa Hóa, ĐH Khoa học Tự nhiên tp HCM. Xin chân thành cảm ơn! Chủ nhiệm đề tài: Phan Thị Anh Đào
6. MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ DANH MỤC BẢNG BIỂU VÀ SƠ ĐỒ DANH MỤC PHỤ LỤC THÔNG TIN KẾT QỦA NGHIÊN CỨU INFORMATION RESURCH RESULTS MỞ ĐẦU 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 1 1.1. TỔNG QUAN VỀ GỐC TỰ DO VÀ CHẤT KHÁNG OXY HÓA 1 1.1.1. Gốc tự do 1 1.1.2. Chất kháng oxy hóa 5 1.1.3. Các phương pháp xác định hoạt tính kháng oxy hóa 7 1.2. TÌM HIỂU VỀ CÂY THUỐC NAUCLEA ORIENTALIS (L.) 9 1.2.1. Mô tả thực vật [8, 9] 9 1.2.2. Phân bố và sinh thái [8, 9] 9 1.2.3. Những nghiên cứu về dược học 11 1.2.4. Nghiên cứu về thành phần hóa học 12 1.3. ĐỊNH HƯỚNG NGHIÊN CỨU 21 1.3.1. Những vấn đề còn tồn tại 21 1.3.2. Định hướng nghiên cứu 22 CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM 23 2.1. TRÍCH LY VÀ CÔ LẬP HỢP CHẤT 23 2.1.1. Hóa chất và thiết bị 23 2.1.2. Nguyên liệu 23 2.1.3. Điều chế các loại cao 24 2.1.4. Cô lập các hợp chất hữu cơ từ thân cây N.orientalis 28 2.3. THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA 29
7. 2.3.1. Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa bằng thử nghiệm ức chế gốc tự do DPPH 29 2.3.2. Khảo sát hoạt tính ức chế quá trình peroxide hóa lipid 31 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 3.1. KẾT QUẢ THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA 33 3.1.1. Kết quả sàng lọc hoạt tính kháng oxy hóa của các mẫu cao meOH 33 3.1.2. Kết quả thử hoạt tính trên các mẫu cao của cây N. orientalis 35 3.2. KHẢO SÁT CẤU TRÚC CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP TỪ CÂ Y NAUCLEA ORIENTALIS L 36 3.2.1. Khảo sát cấu trúc hóa học các hợp chất polyphenol đơn vòng 36 3.3. XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA 43 3.3.1. Kết quả thử nghiệm hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH 43 3.3.2. Kết quả thử nghiệm hoạt tính ức chế quá trình peroxide hóa lipid 44 CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 PHỤ LỤC 51 CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CÔNG BỐ 65 THUYẾT MINH ĐỀ TÀI HỢP ĐỒNG NCKH
8. DANH MỤC CHỮ CÁI VIẾT TẮT CHCl3 Cloroform d Doublet (NMR), mũi đôi dd Doublet of doublet (NMR), mũi đôi đôi DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl EtOAc Etyl acetat 1H-NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance HMBC Heteronuclear Multiple Bond Coherence HSQC Heteronuclear Single Quantum Correlation IC50 50% Inhibitory Capacity Value J Coupling constant, hằng số ghép MeOH Methanol NMR Nuclear Magnetic Resonance, cộng hưởng từ hạt nhân Rf Retention factor s Singlet (NMR), mũi đơn SKC Sắc kí cột TLC Thin Layer Chromatography, sắc kí bản mỏng. δ Chemical shift, độ dịch chuyển (ppm) YHCT Y học cổ truyền
9. DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 1.1. Quá trình peroxide hóa lipid 4 Hình 1.2. Một số chất kháng oxy hóa tổng hợp Error! Bookmark not defined. Hình 1.3. Công thức cấu tạo của L-ascorbic acid và dehydro ascorbic acidError! Bookmark not defined. Hình 1.4. Công thức cấu tạo của vitamin E Error! Bookmark not defined. Hình 1.5: Công thức cấu tạo của β-carotene Error! Bookmark not defined. Hình 1.6. Công thức cấu tạo của taurine và hypotaurineError! Bookmark not defined. Hình 1.7: Công thức cấu tạo của acid α-lipoic Error! Bookmark not defined. Hình 1.8. Phản ứng trung hòa gốc DPPH 7 Hình 1.9. Phản ứng tạo phức giữa malonyldialdehyde và thiobarbituric acid 8 Hình 1.10. Ảnh minh họa cây, hoa và lá của 10 N. orientalis 10 Hình 1.11. Cấu trúc một số hợp chất steroid và chất béo được phân lập từ cây N. orietalis 13 Hình 1.12. Cấu trúc một số hợp chất terpenoid được phân lập từ cây N. orietalis 13 Hình 1.13. Cấu trúc một số hợp chất chứa nitrogen được phân lập từ cây N. orietalis14 Hình 1.14. Cấu trúc một số hợp chất polyphenol được phân lập từ cây N. orietalis 15 Hình 1. 15. Cấu trúc một số hợp chất steroid, terpenoid có trong chi Nauclea 16 Hình 1. 16. Cấu trúc một số hợp chất alkaloid được cô lập từ chi Nauclea 19 Hình 1.17. Cấu trúc một số hợp chất polyphenol đã được cô lập từ chi Nauclea 20 Hình 3.1. Cấu trúc của DR-1 37 Hình 3.3. Cấu trúc hợp chất GV-2 38 Hình 3.3. Cấu trúc hợp chất GV-3 39 Hình 3.4. Cấu trúc của hợp chất GV-4 40 Hình 3.5. Cấu trúc của hợp chất GV-5 41 Hình 3.6. Cấu trúc của hợp chất GV-6 43
10. DANH MỤC BẢNG BIỂU VÀ SƠ ĐỒ Bảng 1.1. Các dạng hoạt động của oxygen và nitrogen trong sinh học [1] 1 Sơ đồ 1.2. Phân loại các chất kháng oxy hóa tự nhiên trong hệ thống sinh học [5]Error! Bookmark not defined. Bảng 1.3. Các chất được phân lập từ các cây N. orientalis 12 Bảng 1.4. Các hợp chất phân lập từ chi Nauclea [14-20] 15 Sơ đồ 2.1. Quá trình ly trích 24 Bảng 2.1. Danh mục 36 cây thuốc của An Giang và Nghệ An [1-2] 25 Bảng 2.2. Kết quả sắc ký cột cao ethyl acetate của thân cây N. orientalis 28 Sơ đồ 2.2. Qui trình thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH 30 Sơ đô 2.3. Qui trình khảo sát hoạt tính ức chế quá trình peroxide hóa lipid 32 Bảng 3.1. Phần trăm ức chế và giá trị IC50 của các 90 mẫu cao sàng lọc 33 Bảng 3.2. Hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH của các cây thuốc An Giang và Nghệ An có hoạt tính mạnh 34 Bảng 3.3. Kết quả thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH của cao thô từ thân cây N. orientalis 35 Bảng 3.4. Kết quả thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH của cao phân đoạn từ thân cây N. orientalis 35 Bảng 3.5. Số liệu phổ NMR của hợp chất GV-1 so sánh với 4 – hydroxybenzoic acid36 Bảng 3.6. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất GV-2 so với acid protocatechuic 38 Bảng 3.7. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất GV-3 so với acid gallic 39 Bảng 3.8 . Dữ liệu phổ NMR của hợp chất GV-4 với umbelliferone 40 Bảng 3.9. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất GV-8 so với esculetin 41 Bảng 3.10. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất GV-9 so với scpoletin 42 Bảng 3.11. Hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH của tất cả hợp chất được phân lập trên hai cây 43
11. DANH MỤC PHỤ LỤC Phụ lục 1a. Phổ 1H-NMR của chất GV-1 51 Phụ lục 1b. Phổ 13C-NMR của chất GV-1 51 Phụ lục 2a: Phổ 1H-NMR của hợp chất GV-2 52 Phụ lục 2b: Phổ 13C-NMR của hợp chất GV-2 52 Phụ lục 3a: Phổ 1H-NMR của hợp GV-3 53 Phụ lục 3b: Phổ 13C-NMR của hợp chất GV-3 53 Phụ lục 4a: Phổ 1H-NMR và phổ giãn rộng của hợp chất GV-4 54 Phụ lục 4b: Phổ 13C-NMR của hợp chất GV-4 54 Phụ lục 4c: Phổ COSY-NMR của hợp chất GV-4 55 Phụ lục 4d: Phổ HSQC-NMR của hợp chất GV-4 55 Phụ lục 4e: Phổ HMBC-NMR của hợp chất GV-4 66 Phụ lục 5a: Phổ 1H-NMR và phổ giãn rộng của hợp chất GV-5 56 Phụ lục 5b: Phổ 13C-NMR của hợp chất GV-5 57 Phụ lục 5c: Phổ HSQC-NMR của hợp chất GV-5 57 Phụ lục 5d: Phổ HMBC-NMR của hợp chất GV-5 58 Phụ lục 6a: Phổ 1H-NMR và phổ giãn rộng của hợp chất GV-6 58 Phụ lục 6b: Phổ 13C-NMR của hợp chất GV-6 59 Phụ lục 6c: Phổ HSQC-NMR của hợp chất GV-6 59 Phụ lục 6d: Phổ HMBC-NMR của hợp chất GV-6 60 Phụ lục 7. Kết quả thử hoạt tính ức chế quá trình peroxide hóa lipid (thử nghiệm MDA) 64
12. ĐH SPKT TP HCM Đơn vị: KHOA CNH & TP THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 1. Thông tin chung: - Tên đề tài: Nghiên cứu hoạt tính kháng oxy hóa của một số cây thuốc An Giang, Nghệ An và thành phần các hoạt chất - Mã số: T2013-39TĐ - Chủ nhiệm: Phan Thị Anh Đào - Cơ quan chủ trì: ĐH Sư phạm Kỹ thuật Tp. HCM - Thời gian thực hiện: 3/2013-11/2013 2. Mục tiêu:  Sàng lọc hoạt tính kháng oxy hóa của các cây thuốc An Giang bằng phương pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH.  Lựa chọn cây thuốc có hoạt tính mạnh để cô lập và định danh thành phần các hoạt chất.  Thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hóa của các chất cô lập được bằng phương pháp ức chế gốc tự do DPPH và ức chế quá trình pero xide hóa lipid. 3. Tính mới và sáng tạo:  Đây là nghiên cứu có tính định hướng về hoạt tính kháng oxy hóa và phân lập hoạt chất kháng oxy hóa- Một xu hướng nghiên cứu mới trong Hóa dược.  Đề tài công bố 06 hợp chất lần đầu tiên cô lập được từ thân cây này và chi Nauclea.  Đây là kết quả đầu tiên công bố hoạt tính ức chế quá trình peroxide hóa lipid của hợp chất esculetin (GV-5). 4. Kết quả nghiên cứu:  Từ 36 mẫu cao MeOH được trích ly từ 36 mẫu cây thuốc An Giang, Nghệ An, đã phát hiện ra 05 mẫu có hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH rất mạnh. Đây sẽ là tiềm năng cho các nghiên cứu thành phần và hoạt tính sinh học tiếp theo.
13.  Từ thân cây Nauclea orientalis L., chúng tôi đã phân lập được 06 hợp chất bao gồm: 4-hydroxylbenzoic acid (GV-1), protocatechuic acid (GV-2), gallic acid (GV- 3), umbelliferone (GV-4), esculetin (GV-5), scopoletin (GV-6). Đây cũng là 06 hợp chất lần đầu tiên cô lập được từ thân cây này và chi Nauclea (chi Gáo).  Sáu hợp chất được phân lập từ hai cây nghiên cứu đều được thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH. Ba hợp chất có hoạt tính ức chế gốc tự do mạnh là 4-, protocatechuic acid (GV-2), gallic acid (GV-3), esculetin (GV-5).  03 hoạt chất này được lựa chọn để đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa trên mô hình ức chế quá trình peroxide hóa lipid. Theo kết quả IC50 nhận thấy, 03 hợp chất này đều có hoạt tính mạnh hơn chất đối chứng dương Trolo x (IC50, 2265.5 µM). Hai hợp chất gallic acid (GV-3), esculetin (GV-5) có hoạt tính ức chế quá trình peroxide hóa lipid mạnh. 5. Sản phẩm:  01 bài báo đang trên Giáo dục Kỹ thuật- ĐH Sư phạm kỹ thuật TP. HCM  01 Bài báo đăng trên tạp chí Khoa học Công nghệ 6. Hiệu quả, phƣơng thức chuyển giao kết quả nghiên cứu và khả năng áp dụng: Đề tài ghóp phần cung cấp thông tin khoa học về hoạt tính kháng oxy hóa của một số cây thuốc An Giang và Nghệ An và thành phần hóa học và hoạt tính của thân cây Gáo vàng, do vậy, đây là tài liệu tham khảo hữu ích cho sinh viên ngành Hóa, Sinh và Dược học. Bên cạnh đấy, kết quả nghiên cứu của đề tài giúp đẩy mạnh ứng dụng của cây thuốc Gáo vàng trong y học cổ truyền Việt nam. Ngày tháng năm Trƣởng Đơn vị Chủ nhiệm đề tài (ký, họ và tên, đóng dấu) (ký, họ và tên)
14. INFORMATION ON RESEARCH RESULTS 1. General information: - Project title: Study of antioxidant activity of An giang and Nghe an medicinal plants, and their compositions - Code number: 2012- 29TĐ - Coordinator: Phan Thi Anh Dao - Implementing institution: HCM City University of Technical Education - Duration: from 3/2013 to 12/2013 2. Objecti ve(s):  Screening of antioxidant activity of 36 An Giang and Nghe An medicinal plants using DPPH free radical scavenging test.  Evaluation of the results to choose plants which for further investigation on these medicinal plant species to isolate active constituents.  Isolating and indentification the isolated compounds from the selected plant.  Study on DPPH free radical scavenging and lipid pero xidation inhibitory activities of isolated compounds. 3. Creativeness and innovati veness: Until now, this is the first scientific report on chemical constituents and biological activities of this plant. 4. Research results:  36 extracts prepared from 36 medicinal plants from An Giang province and Nghe An province were studied on antioxidant activity by the DPPH radical scavenging test. The results indicate a five extracts that may be useful for the treatment of diseases relating free radical damages, and provide the basis for further investigation on these medicinal plants.  Six compounds were isolated from the stem of Nauclea orientalis L. including 4- hydroxybenzoic acid (GV-1), protocatechuic acid (GV-2), gallic acid (GV-3), 7- hydroxycoumarin (GV-4, esculetin (GV-5), and scopoletin (GV-6). These compounds were isolated for the first time from this plant.  All isolated compounds from the stem of N. orientalis were assayed and compared for their DPPH inhibitory activity to the positive control, trolox. The results indicated that compounds (GV-2), (GV-3), and (GV-5) showed significant free
15. radical scavenging capacities with IC50 values of 10.3, 5.1 and 3.6 µM, respectively. Among of them, compounds (3) and (5) were much more active than trolox (IC50, 7.0 µM).  Based on the results obtained from the DPPH assay, three compounds which exhibited strong DPPH inhibitory were tested for lipid peroxidation inhibition by the thiobarbituric acid assay (TBA assay). All the studied compounds showed antioxidant activity much more active than trolox (IC50, 2265.5 µM). 5. Products:  one paper public on Journal of Technical Education Science  one paper public on Journal of Science and Technology 6. Effects, transfer alternatives of reserach results and applicability: This project which has supplied results about antioxidant activity of An Giang and Nghe An, and medicinal plants chemical constituents and biological activities of stem of N. orientalis helpful for student in chemistry, biology and pharmacy. In addition, this investigation of antioxidant phenolic compounds suggested that the potency of these compounds could provide a chemical basis for some of the health benefits claimed for N. orientalis in foods and folk medicine.
16. Mở đầu T2013-39TĐ MỞ ĐẦU  Tính cấp thiết: Trong những năm gần đây, các nhà khoa học đặc biệt quan tâm đến các vấn đề gốc tự do-chất kháng oxy hóa và hoạt tính kháng oxy hóa. Trong cơ thể con người, khi lượng gốc tự do quá lớn, vượt qua mức kiểm soát của hệ thống miễn dịch, gốc tự do sẽ tấn công vào các đại phân tử như DNA, protein, lipid và gây rối loạn các quá trình sinh hóa trong cơ thể. Gốc tự do là thủ phạm có liên quan tới hơn 60 căn bệnh mà trong đó phải kể tới các bệnh nguy hiểm hiện nay như ưng thư, viêm khớp, huyết áp, tim mạch Ngày này, xu hướng nghiên cứu mới là tìm kiếm các hoạt chất có nguồn gốc tự nhiên nhằm thay thế cho các chất kháng oxy hóa tổng hợp hiện vẫn còn sử dụng nhiều trong thực phẩm, y học và cuộc sống hằng ngày. Vùng Bảy Núi (Tịnh Biên, An Giang) và vùng Phủ Quỳ (Nghĩa Đàn, Nghệ An) là hai địa danh có hệ thực vật phong phú và đa dạng ở Việt Nam. Với mong muốn tìm kiếm những cây thuốc có hoạt tính kháng oxy hóa mạnh, chúng tôi đã lựa chọn ra 36 cây thuốc cho nghiên cứu hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH. Từ kết quả sàng lọc, chúng tôi đã tìm ra một số cây thuốc quí có hoạt tính kháng oxy hóa mạnh và lựa chọn thân cây Nauclea Orientalis L. cho nghiên cứu phân lập hoạt chất tiếp theo. Đây là cây thuốc quí được sử dụng chữa trị các căn bệnh liên quan tới gan, đặc biệt là xơ gan cổ trưởng và hiện chưa được nghiên cứu ở Việt Nam. Trên thế giới, các nghiên cứu tập trung theo hướng phân lập nhóm hợp chất alkaloid từ cao ammoniac và cao chloroform được trích ly từ các bộ phận của cây. Do đó, hướng nghiên cứu phân lập hoạt chất kháng oxy hóa từ thân của cây N. orientalis sẽ góp phần tìm ra các hoạt chất đa dạng khác có trong cây nói riêng và chi Nauclea nói chung.  Mục tiêu:  Sàng lọc hoạt tính kháng oxy hóa của các cây thuốc An Giang và Nghệ An bằng phương pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH.  Lựa chọn cây thuốc có hoạt tính mạnh để cô lập và định danh thành phần các hoạt chất. 1
17. Mở đầu T2013-39TĐ  Thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hóa của các chất cô lập được bằng phương pháp ức chế gốc tự do DPPH và ức chế quá trình peroxide hóa lipid.  Phƣơng pháp nghiên cứu:  Các mẫu cây sử dụng trong nghiên cứu sàng lọc được điều chế bằng kỹ thuật trích nóng trong dung môi methanol, 600 C.  Cô lập các hợp chất tinh khiết từ thân cây Gáo vànng, N. orientalis bằng các phương pháp trích ly, sắc ký cột, sắc ký bản mỏng, sắc ký bản mỏng điều chế.  Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất cô lập được bằng các phương pháp phổ nghiệm hiện đại như cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều, khối phổ,  Thử nghiệm hoạt tính chống oxi hóa bằng phương pháp ức chế gốc tự do DPPH và hoạt tính ức chế quá trình peroxide hóa lipid. 2
18. Chương 1. Tổng quan T2013-39TĐ CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. TỔNG QUAN VỀ GỐC TỰ DO VÀ CHẤT KHÁNG OXY HÓA 1.1.1. Gốc tự do Trong hóa học, gốc tự do là những nguyên tử, nhóm nguyên tử hoặc phân tử có những electron không ghép cặp ở lớp ngoài cùng. Các electron này có năng lượng cao, rất kém bền nên dễ dàng tham gia vào nhiều phản ứng hóa học như phản ứng oxy hóa – khử, phản ứng polymer hóa . Gốc tự do có hoạt tính cao nên thời gian tồn tại của chúng thường rất ngắn, phụ thuộc nhiều yếu tố: cấu hình không gian, đặc tính cộng hưởng, hiệu ứng liên hợp. [1] Bảng 1.1. Các dạng hoạt động của oxygen và nitrogen trong sinh học [1] Các dạng hoạt Thời gian Ký hiệu Hoạt động động tồn tại Các dạng hoạt động của oxygen Tạo ra trong ty thể (mitochondria), hệ thống tim Superoxide O ●─ 10-6s 2 mạch và các bộ phận khác Gốc hydroxyl Hoạt tính cao, được tạo ra trong tình trạng cơ thể dư HO● 10-9s chất sắt (Phản ứng Fenton) Là tác nhân oxy hóa mạnh, dễ dàng nhận 1 electron Hydrogen peroxide H O Bền 2 2 để chuyển hóa thành gốc tự do HO● Hoạt tính cao, được hình thành khi các đại phân tử Gốc peroxyl ROO● bị gốc tự do tần công Hydroperoxide hữu Phản ứng với các ion kim loại chuyển tiếp để tạo ra ROOH Ổn định cơ các dạng hoạt động. Hoạt tính cao, hình thành trong quá trình quang học Singlet oxygen 1O 10-6s 2 (photosensitization) và phản ứng hóa học Là 1 chất gây ô nhiễm trong khí quyển, có thể phản Ozon O3 1 ứng với các phân tử khác nhau để tạo ra O2. Các dạng hoạt động của nitrogen Vai trò rất quan trọng trong hệ thống thần kinh trung Nitric oxide NO● ương và ngoại biên. ─ -3 ● ●─ Peroxynitrite ONOO 10 s Hoạt tính cao, hình thành từ NO và O2 Khá ổn Acid peroxynitrous ONOOH Được hình thành khi ONOO─nhận thêm 1 proton. định Nitrogen dioxide NO2 Hình thành trong quá trình ô nhiễm không khí 1
19. Chương 1. Tổng quan T2013-39TĐ Các gốc tự do đóng vai trò quan trọng trong các quá trình sinh lý của con người và cũng là nguyên nhân liên quan tới nhiều bệnh lý nguy hiểm. Có hai nhóm gốc tự do bao gồm: các dạng hoạt động của nitrogen (nitrogen oxygen species, NOS) và các dạng hoạt động của oxygen (reactive oxygen species, ROS) (bảng 1.1). Hệ thống gốc tự do trong sinh học chủ yếu là các gốc có trung tâm là oxygen. Hai gốc tự do quan trọng chứa nitrogen là NO• và ONOO─, trong đó NO• là gốc tự do được quan tâm nhiều nhất do nó có vai trò rất quan trọng trong hệ thống thần kinh trung ương, ngoại biên và là tác nhân điều hòa huyết áp. Nếu như các dạng hoạt động của nitrogen có ý nghĩa trên lâm sàng thì các dạng hoạt động của oxygen lại là tác nhân nguy hiểm gây hơn 60 bệnh lý. Các dạng oxygen hoạt động này có năng lượng cao, rất kém bền và dễ dàng phản ứng với những đại phân tử sinh học như protein, lipid, DNA gây rối loạn các quá trình sinh hóa trong cơ thể. Đồng thời khi một phân tử sống bị các gốc tự do tấn công, nó sẽ mất điện tử và trở thành một gốc tự do mới, tiếp tục phản ứng với những phân tử khác tạo thành một chuỗi phản ứng thường gọi là phản ứng dây chuyền trong cơ thể, gây ra các biến đổi có tác hại đối với cơ thể.[2] 1.1.2. Vai trò của gốc tự do trong cơ thể Ở nồng độ trung bình, gốc tự do rất có lợi và cần thiết cho các hoạt động của cơ thể sống. Trong quá trình trao đổi chất, gốc tự do đóng vai trò trung gian di chuyển các điện tử từ phân tử này sang phân tử khác nhằm tạo ra năng lượng cung cấp cho hoạt động sống của con người. Gốc tự do, phần lớn là các gốc tự do góp phần cùng với bạch cầu tiêu diệt các vi sinh vật có hại, tăng cường khả năng bảo vệ cho hệ thống miễn dịch của cơ thể. Bên cạnh tác dụng giúp tiêu diệt các vi sinh vật lạ, gốc tự do còn góp phần quét dọn những tế bào già, chết trong cơ thể tạo điều kiện cho những tế bào mới sinh sôi và phát triển. Đồng thời, gốc tự do còn góp phần tiêu diệt những tế bào bất thường như tế bào ung thư. Ngoài hai vai trò trên, gốc tự do còn tham gia vào nhiều quá trình có lợi khác cho cơ thể như đóng vai trò là chất dẫn truyền thần kinh (NO•) và tác nhân điều hòa huyết áp. Trong cơ thể sống luôn tồn tại sự cân bằng các dạng hoạt động và dạng kháng oxy hóa, đó là một trạng thái cân bằng nội môi (homeostasis). Tuy nhiên, do ảnh hưởng 2
20. Chương 1. Tổng quan T2013-39TĐ của nhiều yếu tố tác động ngoại sinh làm gia tăng nồng độ của các dạng hoạt động, vượt quá mức kiểm soát của các hệ thống kháng oxy hóa trong cơ thể. Hiện tượng stress oxy hóa (oxydative stress) xảy ra, mang lại nhiều nguy hại cho con người khi các gốc tự do bùng phát và tấn công các phân tử sống như lipid, protein, DNA và có thể gây chết tế bào. Theo các nhà khoa học, gốc tự do có thể là thủ phạm gây ra tới trên 60 bệnh, đáng kể nhất gồm có: bệnh xơ vữa động mạch, ung thư, Alzheimer, Parkinson, đục thuỷ tinh thể, bệnh đái tháo đường, cao huyết áp vô căn, xơ gan. Các bệnh lý này thường xảy ra do quá trình tổn thương trong cơ thể: a) Sự tổn thƣơng do quá trình peroxide hóa lipid [4] Trong cơ thể, ngoài nước ra thì các tổ chức màng chiếm phần lớn và giữ vai trò quan trọng. Thành phần của màng chủ yếu là các acid béo chưa no, phospholipid, Vì vậy, xác suất các gốc tự do tấn công vào thành phần lipid gây ra quá trình pero xide hóa lipid là rất cao. Quá trình peroxide hóa là sự tương tác của các dạng oxygen hoạt động với các acid béo chưa no, tạo ra nhiều sản phẩm độc hại và các phản ứng gốc tự do lan truyền trong cơ thể. Quá trình peroxide hóa lipid là chuỗi phản ứng gốc tự do điển hình với ba giai đoạn: khơi mào, phát triển và dập tắt mạch (hình 1.1). Trong giai đoạn khơi mào, gốc HO• sẽ lấy một nguyên tử hydrogen trong nhóm methylen của lipid (LH) hình thành gốc tự do lipid (L•). Gốc tự do lipid sẽ tiếp tục phản ứng với oxygen trong cơ thể tạo gốc tự do lipid peroxyl (LOO•). Gốc LOO• sẽ hình thành hợp chất lipid hydroperoxid (LOOH) bằng cách lấy đi một nguyên tử hydrogen từ một acid béo không no kế cận nó trong giai đoạn thứ hai gọi là giai đoạn phát triển. Giai đoạn kết thúc xảy ra khi 2 gốc tự do kết hợp với nhau tạo thành phân tử trung hòa hoặc khi sản phẩm của phản ứng không còn ở trạng thái gốc. 3
21. Chương 1. Tổng quan T2013-39TĐ R R H2O H + H2O Khơi mào Lipid chưa bão hòa Gốc tự do lipid O2 Phát triển mạch R R R OOH H + OO Lipid peroxide Gốc lipid peroxyl Hình 1.1. Quá trình peroxide hóa lipid Các gốc tự do lipid có thể phản ứng với nhau, gây xáo trộn cấu trúc màng tế bào. Quá trình peroxide hóa lipid làm thay đổi độ nhớt, tính thấm của màng tế bào và chức năng của các kênh ion trên màng, gây nguy hiểm cho các thành phần bên trong tế bào. Khi màng tế bào mất chức năng sinh học, tế bào sẽ bị chết kéo theo sự thoái hóa mô. Quá trình peroxide hóa cũng có thể được xúc tiến bởi oxygen đơn bội. Lipid hydroperoxide bị phân hủy thành rất nhiều sản phẩm aldehyde. Trong đó, hợp chất malonyldialdehyde (MDA) là sản phẩm aldehyde phổ biến nhất và nó được xem là dấu hiệu của quá trình peroxide hóa lipid. b) Sự tổn thƣơng các phân tử protein [2, 4] Những nghiên cứu gần đây cho thấy protein là phần chính của tế bào bị gốc tự do hydroxyl tấn công, tạo thành sản phẩm hydroperoxid trên protein (xem các phản ứng): PrH + X• (HO•) → Pr• + XH (H2O) (1.14) Pr• + O2 → PrOO• (1.15) PrOO• + H+ → PrOOH (1.16) PrOO•+ PrH → PrOOH + Pr• (1.17) PrOO• + gốc tự do → PrOOH (1.18) Các protein bị hư hại bởi gốc tự do dẫn đến sự rối loạn chức năng của nhiều cơ quan trong cơ thể. Ví dụ, sự hư hại các protein collagen ở da, gây tổn hại da; hay các 4
22. S K L 0 0 2 1 5 4