Luận văn Nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa của các phụ phẩm rau quả Việt Nam và ứng dụng trong bảo quản tôm (Phần 1)

Nội dung text: Luận văn Nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa của các phụ phẩm rau quả Việt Nam và ứng dụng trong bảo quản tôm (Phần 1)

1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT TP.HCM KHOA CÔNG NGHỆ HÓA VÀ THỰC PHẨM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA CỦA CÁC PHỤ PHẨM RAU QUẢ VIỆT NAM VÀ ỨNG DỤNG TRONG BẢO QUẢN TÔM GVHD: ThS. PHAN THỊ ANH ĐÀO SVTH: NGUYỄN THÁI HOÀNG AN MSSV: 11116001 S K L 0 0 3 9 0 2 Tp. Hồ Chí Minh, tháng 8/2015
2. TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC VÀ THỰC PHẨM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP MÃ SỐ KHÓA LUẬN: 2015 - 11116001 NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA CỦA CÁC PHỤ PHẨM RAU QUẢ VIỆT NAM VÀ ỨNG DỤNG TRONG BẢO QUẢN TÔM GVHD: ThS. PHAN THỊ ANH ĐÀO SVTH: NGUYỄN THÁI HOÀNG AN MSSV: 11116001 THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 08/2015 i
3. TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC VÀ THỰC PHẨM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM NHIỆM VỤ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Họ và tên sinh viên: Nguyễn Thái Hoàng An Ngành: Công nghệ Thực phẩm 1. Tên khóa luận: Nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa của các phụ phẩm rau quả Việt Nam và ứng dụng trong bảo quản tôm. 2. Nhiệm vụ của khóa luận: - Tổng quan cơ sở lý thuyết về gốc tự do, chất kháng oxy hoá, quá trình oxy hóa- khử trong thực phẩm và các phương pháp thử hoạt tính kháng oxy hóa. - Điều chế cao ethanol từ các phụ phẩm rau quả từ ba vùng Tây Nguyên, Tây Nam Bộ, Ninh Thuận-Bình Thuận, Tây Nam Bộ bằng phương pháp trích nóng trong dung môi ethanol, ở nhiệt độ 600C - Sàng lọc hoạt tính kháng oxy hoá của 44 mẫu cao ethanol trích ly từ 44 mẫu phụ phẩm rau quả Việt Nam bằng hai phương pháp xác định tổng hàm lượng flavonoid. - Tìm hiểu những nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của mẫu phụ phẩm có hoạt tính mạnh. - Ứng dụng bảo quản tôm ở nhiệt độ 2oC. - Đánh giá cảm quan sự thay đổi điểm biến đen của tôm. - Đánh giá khả năng ức chế quá trình peroxide hóa lipid 3. Ngày giao nhiệm vụ khóa luận: . / . /2015 4. Ngày hoàn thành khóa luận: . / . /2015 5. Họ tên người hướng dẫn: ThS. Phan Thị Anh Đào Phần hướng dẫn: toàn bộ khóa luận Nội dung và yêu cầu khóa luận tốt nghiệp đã được thông qua bởi Trưởng Bộ môn Công nghệ Thực phẩm Tp.HCM, ngày tháng năm 2015 Trưởng Bộ môn Người hướng dẫn chính (Ký và ghi rõ họ tên) (Ký và ghi rõ họ tên) ii
4. LỜI CẢM ƠN Trong thời gian khóa luận, em đã nhận được nhiều sự giúp đỡ, đóng góp ý kiến và chỉ bảo nhiệt tình của thầy cô, gia đình và bạn bè. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Th.S Phan Thị Anh Đào, giảng viên Bộ môn Công nghệ Hóa học và Thực phẩm – trường ĐH Sư Phạm Kỹ Thuật TpHCM. Cô đã tận tâm hướng dẫn, chỉ bảo em rất nhiệt tình trong suốt quá trình làm khóa luận. Em cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong trường ĐH Sư Phạm Kỹ Thuật TpHCM nói chung, các thầy cô trong Bộ môn Công nghệ Hóa học và Thực phẩm nói riêng đã dạy dỗ cho em kiến thức về đại cương cũng như các môn chuyên ngành, giúp em có được cơ sở lý thuyết vững vàng và tạo mọi điều kiên thuận lợi về trang thiết bị, dụng cụ thí nghiệm để em hoàn thành được khóa luận tốt nghiệp này. Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè, đã luôn tạo mọi điều kiện, quan tâm, giúp đỡ, động viên em trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp. iii
5. LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan toàn bộ nội dung được trình bày trong khóa luận tốt nghiệp là của riêng tôi. Tôi xin cam đoan các nội dung được tham khảo trong khóa luận tốt nghiệp đã được trích dẫn chính xác và đầy đủ theo qui định. Ngày tháng năm 2015 Ký tên iv
6. MỤC LỤC NHIỆM VỤ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ii LỜI CẢM ƠN iii LỜI CAM ĐOAN iv MỤC LỤC v DANH MỤC HÌNH vii DANH MỤC BẢNG BIỂU viii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ix TÓM TẮT KHÓA LUẬN x LỜI MỞ ĐẦU xi CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1 1.1. Qúa trình oxy hóa thực phẩm 1 1.1.1. Gốc tự do 1 1.1.2. Sự oxy hóa chất béo trong thực phẩm 5 1.2. Sự hình thành biến đen ở tôm 6 1.3. Các phương pháp bảo quản tôm sau thu hoạch 8 1.3.1. Tình hình nghiên cứu trong nước 8 1.3.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nước 9 1.4. Định hướng nghiên cứu 9 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 12 2.1. Sàng lọc hoạt tính kháng oxy hóa của các phụ phẩm rau quả Việt Nam 12 2.1.1. Hóa chất và thiết bị 12 2.1.2. Nguyên liệu 12 2.1.3. Phương pháp điều chế cao ethanol 18 2.1.4. Phương pháp xác định tổng hàm lượng flavonoid 19 2.2. Nghiên cứu và ứng dụng phụ gia kháng oxy hóa trong bảo quản tôm 22 2.2.1. Quy trình điều chế phụ gia 22 2.2.2. Phương pháp cảm quan điểm biến đen ở tôm 23 v
7. 2.2.3. Phương pháp oxy hóa chất béo (TBARS) 25 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 3.1. Kết quả điều chế cao ethanol từ các phụ phẩm rau quả ba vùng Việt Nam 28 3.1.1. Kết quả điều chế cao ethanol từ các phụ phẩm rau quả 28 3.1.2. Kết quả thử hoạt tính kháng oxy hóa bằng phương pháp xác định tổng hàm lượng flavonoid 30 3.2. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng hoạt tính chống oxy hóa từ các loại phụ phẩm thử hoạt tính kháng oxy hóa bằng phương pháp xác định tổng hàm lượng flavonoid 36 3.2.1. Kết quả thử nghiệm bảo quản tôm 37 3.2.2. Kết quả khả năng ức chế quá trình peroxide hóa lipid 39 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42 4.1. Kết luận 42 4.2. Định hướng nghiên cứu tiếp theo 43 4.3. Ứng dụng trong công nghệ thực phẩm 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO 44 PHỤ LỤC xiii vi
8. DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cơ chế hình thành biến đen ở tôm 7 Hình 1.2. Hình ảnh tôm trước và sau khi bảo quản lạnh 2oC 7 Hình 1.3. Phụ phẩm vùng Tây Nguyên 10 Hình 1.4. Phụ phẩm vùng Tây Nam Bộ 10 Hình 1.5. Phụ phẩm vùng Ninh Thuận – Bình Thuận 11 Hình 2.1. Quy trình điều chế cao ethanol 18 Hình 2.2. Công thức hóa học của quercetin 20 hình 2.3. Quy trình xác định đường chuẩn theo phương pháp xác định tổng hàm lượng flavonoid 21 Hình 2.4. Quy trình xác định tổng hàm lượng flavonoid 21 Hình 2.5. Quy trình điều chế phụ gia 22 Hình 2.6. Một số hình ảnh mẫu phụ gia 23 Hình 2.7. Quy trình ngâm tôm trong dịch chết 24 Hình 2.8. Phản ứng tạo phức giữa malonyldialdehyde và acid thiobarbituric 25 Hình 2.9. Quy trình ngâm tôm trong TBA 26 Hình 2.10. Quy trình xác định độ hấp thụ quang 27 Hình 3.1. Hình ảnh các mẫu cao ethanol trích ly từ phụ phẩm rau quả 30 Hình 3.2. Đường chuẩn quercetin 31 Hình 3.3 Chín mẫu có hàm lượng flavonoid cao của ba vùng 34 Hình 3.4. Sự thay đổi điểm cảm quan tôm sau thời gian bảo quản lạnh 2oC 36 Hình 3.5. Mẫu tôm trong quá trình bảo quản 38 Hình 3.6. Đường cong chuẩn MAD 39 Hình 3.7. Sự thay đổi giá trị TBARS của thịt tôm trong quá trình bảo quản 2oC 40 vii
9. DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1. Các dạng hoạt động của nitrogen 1 Bảng 1.2. Các dạng hoạt động của oxygen 2 Bảng 2.1. Danh mục 44 mẫu phụ phẩm rau quả ba vùng 13 Bảng 2.2. Kết quả đo bước sóng hấp thu cực đại 20 Bảng 3.1. Kết quả thu suất ly trích cao ethanol 28 Bảng 3.2. Kết quả đo độ hấp thu quercetin qua các nồng độ 31 Bảng 3.3. Kết quả hàm lượng flavonoid của 44 mẫu phụ phẩm rau quả của ba vùng 32 Bảng 3.4. Năm mẫu cao có hoạt tính kháng oxy hóa mạnh 35 Bảng 3.5. Kết quả đo độ hấp thu của dung dịch MAD qua các nồng độ 39 viii
10. DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ANOVA : Analysis of variance (phân tích phương sai) BHA : Butylated hydroxyanisole BHT : Butylated hydroxytoluen CTCT : Công thức cấu tạo CTPT : Công thức phân tử NADPH : Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate PG : Propyl gallate RNS : Reactive nitrogen species (các dạng hoạt động của nitrogen) ROS : Reactive oxygen species (các dạng hoạt động của oxygen) TBA : Acid thiobarbituric TBARS : Thiobarbituric acid reactive substance TBHQ : Tert-butylhydroquinone TCA : Acid trichloracetic TN : Tây Nguyên TNB : Tây Nam Bộ NTBT : Ninh Thuận BìnhThuận UV : Ultraviolet (tử ngoại) QE : Quercetin MDA : Malonaldehyde ix
11. TÓM TẮT KHÓA LUẬN ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA CỦA CÁC PHỤ PHẨM RAU QUẢ VIỆT NAM VÀ ỨNG DỤNG TRONG BẢO QUẢN TÔM. Trong nhiều năm qua, tôm và các sản phẩm từ tôm luôn chiếm một tỷ trọng lớn nhất trong cơ cấu các mặt hàng thủy sản xuất khẩu của Việt Nam. Biến đen và quá trình oxy hóa chất béo ở tôm thường xuất hiện trong quá trình bảo quản lạnh, là một vấn đề nghiêm trọng làm giảm giá trị cảm quan, dinh dưỡng và giá trị kinh tế của tôm sau thu hoạch. Ngày nay xu hướng sử dụng phụ gia kháng oxy hóa đang được quan tâm nghiên cứu do tính thân thiện an toàn với con người và môi trường, vì thế chúng tôi đã sử dụng các phụ phẩm rau quả từ ba vùng Tây Nguyên, Tây Nam Bộ, Ninh Thuận-Bình Thuận để nghiên cứu và tìm giải pháp bảo quản tôm bằng các phụ phẩm kháng oxy hóa tự nhiên. Kết quả nghiên cứu: Trong 44 mẫu cao ethanol được trích ly từ phụ phẩm rau quả cuả ba vùng đã được nghiên cứu về hoạt tính kháng oxy hóa bằng phương pháp xác định hàm lượng flavonoid, nhận thấy có năm mẫu cao có hoạt tính kháng oxy hóa mạnh, trong đó hạt bơ có hàm lượng flavonoid cao nhất (f = 956,80 mgQE/g), thấp nhất là vỏ bơ (f =372,83 mgQE/g), các mẫu còn lại có hàm lượng flavonoid như sau: hạt thanh trà (f = 709,80 mgQE/g), hạt nho (f =655,95 mgQE/g), vỏ măng cụt (f = 422,97 mgQE/g). Do có hoạt tính kháng oxy hóa mạnh, năm mẫu cao này được ứng dụng trong việc bảo quản tôm, kết quả sau bảy ngày bảo quản ở 2oC thì nhận thấy hạt bơ có khả năng bảo quản tôm tốt nhất, khoảng 20-40% diện tích bề mặt tôm bị biến đen, ngược lại vỏ măng cụt lại có khả năng bảo quản tôm kém nhất, khoảng 40-60% diện tích bề mặt tôm bị biến đen. Ngoài ra, kết quả nghiên cứu về khả năng peroxide hóa lipid của các mẫu cao trong thịt tôm nhận thấy hạt nho có giá trị TBARS cao nhất trong năm ngày bảo quản, do đó nó có khả năng kháng oxy hóa chất béo thấp nhất, bên cạnh đó hạt thanh trà có giá trị TBARS thấp nhất nên nó có khả năng hạn chế oxy hóa chất béo tốt nhất. Điểm mới của khóa luận: - Sàng lọc hoạt tính kháng oxy hoá của 44 mẫu cao ethanol trích ly từ 44 mẫu phụ phẩm rau quả Việt Nam bằng phương pháp xác định tổng hàm lượng flavonoid. - Nghiên cứu phụ gia chống oxy hóa tự nhiên từ phụ phẩm rau quả. - Ứng dụng trong bảo quản tôm. x
12. LỜI MỞ ĐẦU Tôm và các sản phẩm từ tôm luôn chiếm một tỷ trọng lớn nhất trong cơ cấu các mặt hàng thủy sản xuất khẩu của Việt Nam trong nhiều năm qua. Trong năm 2010, xuất khẩu tôm của Việt Nam đem về hơn 2,1 tỉ USD, năm 2011 là 2,4 tỉ USD, năm 2012 là 2,25 tỉ USD, năm 2013 là 2,4 USD và tăng mạnh trong năm 2014 là 7,84. Dự báo trong những năm tiếp theo, tôm vẫn chiếm giữ vị trí dẫn đầu trong cơ cấu các mặt hàng xuất khẩu thủy sản của đất nước. Tôm là loài thủy sản dễ bị ươn hỏng, quá trình ươn hỏng trong tôm xảy ra rất nhanh do cơ thể bị các enzym tiêu hóa tấn công rất nhanh trong vài giờ sau khi chết. Hiện nay việc xử lý tôm sau thu hoạch chưa được quan tâm nhiều. Biến đen ở tôm và oxy hóa chất béo là hai trong những vấn đề nghiêm trọng làm giảm giá trị cảm quan, dinh dưỡng và giá trị kinh tế của nguyên liệu sau thu hoạch. Nhiều nỗ lực đã được các nhà chế biến, các nhà nghiên cứu thực hiện nhằm hạn chế các tác hại tiêu cực của hai vấn đề trên. Đối với vấn đề biến đen, các nỗ lực chủ yếu được thực hiện bằng việc sử dụng hóa chất metabisufite để hạn chế sự biến đen ở tôm. Tuy nhiên, hóa chất này ngày càng bị giới hạn sử dụng trong bảo quản thủy sản theo các luật định. Trong khi đó, các giải pháp nhằm hạn chế sự oxy hóa chất béo đối với thủy sản vẫn còn nhiều hạn chế. Biến đen ở tôm là một trong những nguyên nhân làm giảm thời hạn sử dụng cũng như giá trị thương mại của tôm. Tương tự như vậy, oxy hóa chất béo cũng gây ra những vấn đề nghiêm trọng làm giảm giá trị cảm quan và dinh dưỡng đối với sản phẩm thủy sản. Nhận thấy, một giải pháp an toàn cần được triển khai nghiên cứu nhằm hạn chế biến đen ở tôm và oxy hóa chất béo, nâng cao giá trị của tôm mà không ảnh hưởng tới sức khỏe người tiêu dùng. Việt Nam là một đất nước nông nghiệp, trong đó, các vùng Tây Nguyên, Ninh Thuận Bình Thuận và Tây Nam Bộ là một trong những vùng cung cấp nguồn nguyên liệu rau quả dồi dào trong và ngoài nước cho các nhà máy sản xuất thực phẩm, nước giải khát Các loại rau quả đa chủng loại, dễ trồng, rẻ tiền và phổ biến. Hằng năm, khối lượng phụ phẩm từ rau củ và trái cây tạo ra rất lớn, một phần được sử dụng làm phân bón, phần còn lại thải ra môi trường gây ô nhiễm. Với quan điểm, “phụ phẩm không phải là phế thải”, nhóm nghiên cứu đã hướng tới việc nghiên cứu phụ gia oxy hóa tự nhiên sử dụng trong thủy sản từ nguồn phụ phẩm này. Điều này không chỉ có ý nghĩa lớn về mặt y học, dinh dưỡng thực phẩm, kinh tế mà còn góp phần bảo vệ môi trường. Do đó các nghiên cứu hiện nay chủ yếu tập trung vào các loại cây thuốc được sử dụng chữa bệnh trong dân gian hoặc trên phần ăn được của rau củ, trái cây. Chúng tôi đã mở xi
13. rộng hướng nghiên cứu trên nguồn nguyên liệu rau quả mà cụ thể là những phụ phẩm rau quả - những chất thải bị bỏ đi trong sản xuất, chế biến. Do đó mục tiêu của khóa luận được đưa ra như sau:  Mục tiêu - Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của một số phụ phẩm trái cây vùng Ninh Thuận - Bình Thuận, vùng Tây Nguyên và vùng Tây Nam Bộ bằng phương pháp phương pháp xác định tổng hàm lượng flavonoid (Phương pháp AlCl3 ). - Lựa chọn 5 mẫu phụ phẩm có hoạt tính chống oxy hóa mạnh phục vụ cho quá trình nghiên cứu bảo quản tôm. - So sánh, đánh giá kết quả đạt được, từ đó đề xuất hướng sử dụng phụ gia trong bảo quản tôm sau thu hoạch.  Nội dung nghiên cứu - Tổng quan cơ sở lý thuyết về gốc tự do, chất kháng oxy hoá, quá trình oxy hóa- khử trong thực phẩm và các phương pháp thử hoạt tính kháng oxy hóa. - Điều chế cao ethanol từ các phụ phẩm trái cây từ ba vùng bằng phương pháp trích nóng trong dung môi ethanol, ở nhiệt độ 600C - Sàng lọc hoạt tính kháng oxy hoá của 44 mẫu cao ethanol trích ly từ 44 mẫu phụ phẩm rau củ quả Việt Nam bằng phương pháp xác định tổng hàm lượng flavonoid. - Tìm hiểu những nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của mẫu phụ phẩm có hoạt tính mạnh. - Bảo quản tôm ở nhiệt độ 2oC. - Đánh giá sự thay đổi điểm biến đen của tôm. xii
14. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Qúa trình oxy hóa trong thực phẩm 1.1.1. Gốc tự do a. Khái niệm Trong hóa học, gốc tự do là những nguyên tử, nhóm nguyên tử hoặc phân tử có những electron không ghép cặp ở lớp ngoài cùng. Các electron này có năng lượng cao, rất kém bền nên các gốc tự do dễ dàng tham gia vào nhiều phản ứng hóa học như phản ứng oxy hóa – khử, phản ứng polymer hóa để tạo ra một chuỗi những gốc tự do mới. Gốc tự do có hoạt tính cao nên thời gian tồn tại của chúng thường rất ngắn, phụ thuộc nhiều yếu tố: cấu hình không gian, đặc tính cộng hưởng, hiệu ứng liên hợp[9]. b. Phân loại Có hai nhóm gốc tự do chủ yếu bao gồm: các dạng hoạt động của nitrogen (reactivenitrogen species, RNS) và các dạng hoạt động của oxygen (reactive oxygen species, ROS) (bảng 1.1 và 1.2)[3]. Bảng 1.1. Các dạng hoạt động của nitrogen [3],[22],[27] Thời gian Các dạng hoạt động Ký hiệu Nguồn gốc tồn tại Vai trò rất quan trọng trong hệ Nitric oxide NO● 1s thống thần kinh trung ương và Radicals ngoại biên. Nitrogen ● Hình thành trong quá trình ô NO2 1s dioxide nhiễm không khí Acid Khá ổn Được hình thành khi ONOO─ ONOOH peroxynitrous định nhận thêm 1 proton. Nonradicals Hoạt tính cao, hình thành từ NO● ─ -3 Peroxynitrite ONOO 10 s ●─ và O2 1
15. Bảng 1.2. Các dạng hoạt động của oxygen [5],[22],[27] Thời Ký Các dạng hoạt động gian Hoạt động hiệu tồn tại ●─ -6 Tạo ra trong ty thể (mitochondria), hệ Superoxide O2 10 s thống tim mạch và các bộ phận khác Hoạt tính cao, được tạo ra trong tình Gốc hydroxyl HO● 10-9s trạng cơ thể dư chất sắt (phản ứng Radical Fenton) Alkoxyl RO● 1s Hoạt tính cao, được hình thành khi Gốc peroxyl ROO● 1s các đại phân tử bị gốc tự do tấn công Hydroperoxide Phản ứng với các ion kim loại chuyển ROOH Ổn định hữu cơ tiếp để tạo ra các dạng hoạt động. Là tác nhân oxy hóa mạnh, dễ dàng Hydrogen H2O2 Bền nhận 1 electron để chuyển hóa thành peroxide gốc tự do HO● Hoạt tính cao, hình thành trong quá 1 -6 Nonradical Singlet oxygen O2 10 s trình quang học (photosensitization) và phản ứng hóa học Là 1 chất gây ô nhiễm trong khí Ozon O3 1s quyển, có thể phản ứng với các phân tử khác nhau để tạo ra O2. Hai gốc tự do quan trọng chứa nitrogen là NO• và ONOO-, trong đó NO• là gốc tự do được quan tâm nhiều nhất do nó có vai trò rất quan trọng trong hệ thống thần kinh trung ương, ngoại biên và là tác nhân điều hòa huyết áp.Ngược lại, các dạng hoạt động của oxygen là tác nhân nguy hiểm gây hơn 60 bệnh lý.Các dạng oxygen hoạt động này có năng lượng cao, rất kém bền và dễ dàng phản ứng với những đại phân tử sinh học như protein, lipid, DNA gây rối loạn các quá trình sinh hóa trong cơ thể. Đồng thời khi một phân tử sống bị các gốc tự do tấn công, nó sẽ mất điện tử và trở thành một gốc tự do mới, tiếp tục phản ứng với những phân tử khác tạo thành một chuỗi phản ứng thường gọi là phản ứng dây chuyền trong cơ thể, gây ra các biến đổi có tác hại đối với cơ thể[22]. 2
16. c. Nguồn gốc phát sinh gốc tự do Gốc tự do được hình thành từ bên trong cơ thể (nguồn nội sinh) và từ môi trường xung quanh (nguồn ngoại sinh).  Nguồn nội sinh[27] Các gốc tự do được chính cơ thể tạo ra bởi những quá trình sinh lý (quá trình hô hấp ở tế bào), quá trình bệnh lý (quá trình viêm nhiễm), hoặc bởi hệ thống enzyme thân oxy hóa và sự có mặt của các ion kim loại chuyển tiếp trong cơ thể. + Quá trình hô hấp của tế bào[24] Một chuỗi những phản ứng oxy hóa–khử xảy ra trong quá trình hô hấp của tế bào, tạo ra sản phẩm trung gian là các gốc tự do. + Hội chứng viêm nhiễm Hội chứng viêm nhiễm là một phản ứng tự vệ của cơ thể sống nhằm chống lại sự tấn công của các vi khuẩn hoặc các vi sinh vật lạ từ bên ngoài xâm nhập vào cơ thể hoặc sinh ra ngay trong cơ thể. Khi các vi khuẩn hoặc các vi sinh vật xâm nhập vào cơ thể sẽ bị bạch cầu đa nhân trung tính bao kín để làm nhiệm vụ thực bào. Lúc này enzyme NADPH oxydase ở màng bạch cầu được hoạt hóa, xúc tác phản ứng giữa O2 và NADPH tạo nên - gốc tự do O2 , từ đó tạo nên nhiều gốc tự do khác nhau phân hủy các vi sinh vật lạ. Một phần các gốc tự do bị thoát ra ngoài bạch cầu và gây nên những phản ứng viêm. + Các enzyme thân oxy hóa[24] Một hệ thống các enzyme thân oxy hóa trong cơ thể có khả năng tạo gốc tự do như -  xanthine oxydase (XO), NADPH oxydase, nitric oxide synthase Gốc O2 và NO là 2 gốc tự do chính được sinh ra dưới sự xúc tác của các enzyme thân oxy hóa này. + Các ion kim loại chuyển tiếp Phản ứng giữa một ion kim loại chuyển tiếp và một hợp chất peroxide cũng góp phần sản sinh ra gốc tự do trong cơ thể.  Nguồn ngoại sinh Ngoài những yếu tố nội sinh, gốc tự do còn được hình thành trong cơ thể bởi các yếu tố ngoại sinh như sự ô nhiễm môi trường, bức xạ, khói thuốc, ozon + Sự bức xạ    Dưới tác dụng của bức xạ, các gốc tự do như O2 , HO , HOO được hình thành trong cơ thể. Vì thành phần chủ yếu của cơ thể là nước, do đó khi bức xạ có năng lượng cao (tia X, tia UV ) chiếu vào cơ thể sẽ phân hủy nước thành các gốc tự do. Điều này giải thích 3
17. cho sự lão hóa da người tăng lên ở những vùng bị phơi bày dưới ánh sáng. Đó là do tia cực tím đã làm sản sinh ra những gốc tự do có khả năng tham gia quá trình peroxide hóa lipid ở các tế bào da. + Khói thuốc lá Khói thuốc chứa một lượng lớn những hợp chất như aldehyde, expoxyde, peroxyde và những gốc oxy hóa như nitric oxide, gốc peroxyl, gốc với trung tâm carbon hiện diện trong pha khí. Theo ước tính, một làn hơi thuốc lá có khoảng 1015 gốc tự do. Chúng có khả năng tồn tại trong thời gian dài cho đến khi chúng tấn công túi phổi. Bên cạnh đó, khói thuốc còn chứa các gốc bền trong nhựa thuốc. Sự vi xuất huyết là nguyên nhân chủ yếu của sự kết tủa sắt được tìm thấy ở mô phổi của những người hút thuốc. Sắt trong thể này dễ dàng xúc tác cho phản ứng Fenton, sinh gốc HO● độc hại. + Ozon Ozon là một trong những tác nhân độc hại tạo ra gốc tự do và sự ảnh hưởng của nó trên cơ thể sống biểu hiện chủ yếu qua tổn thương ở phổi và máu. Ozon có thể phản ứng trực tiếp với các hợp chất bất bão hòa như các acid béo trong lipid hoặc có thể tự sinh gốc O2, từ đó gia tăng khả năng hình thành các gốc tự do trong cơ thể[23]. d. Vai trò của gốc tự do Theo ước tính, trung bình một ngày có khoảng 10 000-20 000 gốc tự do hoạt động trong cơ thể con người. Xét về phương diện có lợi, gốc tự do rất cần thiết đối với các hoạt động của cơ thể sống. Trong quá trình trao đổi chất, gốc tự do đóng vai trò trung gian di chuyển các điện tử từ phân tử này sang phân tử khác nhằm tạo ra năng lượng. Gốc tự do góp phần cùng với bạch cầu tiêu diệt các vi sinh vật có hại, tăng cường khả năng bảo vệ cho hệ thống miễn dịch của cơ thể. Gốc tự do giúp tiêu diệt các vi sinh vật lạ, gốc tự do còn góp phần quét dọn những tế bào già, chết trong cơ thể tạo điều kiện cho những tế bào mới sinh sôi, phát triển và tiêu diệt những tế bào bất thường như tế bào ung thư. Ngoài ra, gốc tự do còn tham gia vào nhiều quá trình có lợi khác cho cơ thể như đóng vai trò là chất dẫn truyền thần kinh (NO•) và tác nhân điều hòa huyết áp. Trong cơ thể sống luôn tồn tại sự cân bằng các dạng hoạt động và dạng kháng oxy hóa, đó là một trạng thái cân bằng nội môi (homeostasis). Tuy nhiên, do ảnh hưởng của nhiều yếu tố tác động ngoại sinh làm gia tăng nồng độ của các dạng hoạt động, vượt quá mức kiểm soát của các hệ thống kháng oxy hóa trong cơ thể. Hiện tượng stress oxy hóa 4
18. (oxydative stress) xảy ra, mang lại nhiều nguy hại cho con người khi các gốc tự do bùng phát và tấn công các phân tử sống như lipid, protein, DNA và có thể gây chết tế bào.[23] Gốc tự do tấn công ở mức độ nhẹ sẽ gây rối loạn chức năng tế bào, nặng hơn gây nên nhiều bệnh lý nguy hiểm và gây ung thư. Đặc biệt, khi gốc tự do tấn công lên não, sẽ gây mất ngủ, đau nửa đầu, suy giảm trí nhớ. 1.1.2 Sự oxy hóa chất béo trong thực phẩm[20] Trong sản xuất, bảo quản và chế biến thực phẩm, quá trình oxy hoá chất béo xảy ra làm giảm thời gian bảo quản sản phẩm. Sự oxy hoá chất béo không no được khởi tạo bằng việc tạo thành các gốc tự do dưới tác dụng của ánh sáng, nhiệt độ, ion kim loại và oxy. Thông thường, phản ứng xảy ra trên nhóm metyl cận kề với nối đôi C=C của mạch cacbon. Hai quá trình oxy hoá chất béo chủ yếu là quá trình oxy hoá sinh học và oxy hoá hoá học.  Quá trình oxy hoá hoá học Quá trình oxy hoá hoá học gồm 3 giai đoạn: giai đoạn khơi mào, giai đoạn tiếp diễn và giai đoạn kết thúc. + Trong giai đoạn khơi mào, các gốc tự do được hình thành dưới tác động của ánh sáng, sự có mặt của oxy hoà tan và kim loại chuyển tiếp trong môi trường. RH hv R• + H• (1.1) RH + O2 R• + HOO• (1.2) RH + M3+ M2+ + R• + H• (1.3) M2+ + ROOH M3+ + RO• + OH• (1.4) + Tiếp theo giai đoạn khơi mào là giai đoạn tiếp diễn, gốc tự do R• được hình thành trong giai đoạn khơi mào sẽ kết hợp với oxy không khí tạo nên gốc tự do peroxyte. R• + O2 ROO• (1.5) Gốc peroxyte được tạo thành sẽ kết hợp với những phân tử khác tạo ra hyroperoxyte ROOH và hình thành một gốc tự do R• mới. ROO• + RH ROOH + R• (1.6) Hydroperoxyte kém bền dễ dàng phân mạch để cho những gốc tự do khác nhau như gốc alcoxy RO•, peroxyte ROO•, hydroxyl •OH. ROOH RO• + •OH (1.7) 2ROOH ROO• + RO• + H2O (1.8) 5
19. Từ RO• có thể tạo nên những sản phẩm thứ cấp như rượu, ceton và aldehyte. Mặt khác từ hydroperoxyte và gốc ankyl cũng tạo ra ceton + Giai đoạn kết thúc: các gốc tự do kết hợp với nhau theo cơ chế lưỡng phân R• + R• R – R (1.9) ROO• + R• ROOR (1.10) ROO• + ROO• ROOR + O2 (1.11)  Quá trình oxy hoá sinh học Hai dạng oxy hoá sinh học chính là: oxy hoá do enzyme lipoxygenase và ôi hoá do ceton. Khi enzyme lipoxygenase ở dạng hoạt động, nó sẽ chứa một ion sắt tại trung tâm hoạt động. Sản phẩm trung gian của quá trình ức chế các gốc tự do sẽ được trình bày dưới đây: Enz(Fe2+) + LOO• Enz(Fe3+)LOO• (1.12) Enz(Fe3+)LOO• + H+ Enz(Fe3+) + LOOH (1.13) Enz(Fe3+) + LH Enz(Fe2+)L• + H+ (1.14) 2+ 2+ 3+ Enz(Fe )L• + O2 Enz(Fe )LOO• hay Enz(Fe )LOO• (1.15) Enz(Fe2+)LOO• Enz(Fe2+) + LOO• (1.16) LOO• + LH LOOH + L• (1.16). L• + O2 LOO• (1.17) Theo như cơ chế trên, gốc tự do peroxyte được tạo thành từ hydroperoxyte sẽ hoạt hoá enzyme lipoxygenase thành dạng hoạt động (phản ứng 1.13). Sau đó dạng hoạt động của enzyme sẽ phản ứng với oxy phân tử tạo thành phức Enz(Fe2+)LOO• (phản ứng 1.16). Phức Enz(Fe2+)LOO• có thể bị oxy hoá một lần nữa để tạo thành Enz(Fe3+)LOO•, hoàn tất quá trình oxy hoá. Hoặc là phức Enz(Fe2+)LOO• phân tách ra tạo thành Enz(Fe2+) và LOO•. Sau đó, LOO• hấp thu một hydrogen nguyên tử từ LH . 1.2. Sự hình thành biến đen ở tôm[21] Hiện tượng biến đen là quá trình sinh hóa học tự nhiên xảy ra trong tôm sau khi tôm bị chết, bắt đầu xuất hiện những tế bào riêng biệt bị phá hủy và bị phân chia thành những chất đơn giản bởi enzyme trên những bộ phận nhất định trên cơ thể tôm. Hiện tượng biến đen sẽ làm giảm giá trị của tôm do không đáp ứng được tiêu chuẩn để chế biến các sản phẩm xuất khẩu. Nguyên nhân gây ra hiện tượng biến đen ở tôm có thể là một trong những lý do sau: + Quá trình đánh bắt và vận chuyển tôm: tôm bị va chạm 6
20. + Hệ vi sinh vật sống ký sinh trên tôm: sau khi tôm chết gặp điều kiện nhiệt độ, độ ẩm thích hợp. hệ vi sinh vật sống ký sinh trên tôm sẽ phát triển nhanh từ một tế bào đến việc tạo thành các khuẩn lạc có sắc tố màu đen. + Có hai acid amin đóng vai trò cơ bản trong quá trình hình thành biến đen là tyrozin và phenylalanin. Enzyme polyphenoloxidase chứa trong lớp màng trong suốt dưới vỏ. Khi tôm chết lớp màng này bị vỡ, giải phóng enzyme ra ngoài xúc tác cho phản ứng oxy hóa tyrozin và phenylalanin trong môi trường có oxy không khí đã hình thành những vệt nâu (hình 1.1). Những vệt này tập hợp lại tạo nên chất màu tối melanin, từ đây phát triển thành các đốm đen. Quá trình này xảy ra rất nhanh đặc biệt trong điều kiện nhiệt độ cao, một số trường hợp đốm đen ở trên tôm còn sống, do tôm chịu sự va chạm trong môi trường sống. Cơ chế của hiện tượng này như sau: Hình 1.1: Cơ chế hình thành biến đen Điều kiện để hình thành phản ứng melanin: . Hệ enzyme polyphenoloxidase . Oxy không khí . Các hợp chất chứa gốc phenol (tyrosin, phenylalanin) Polyphenoloxydase + O2 Tôm tươi Tôm bị biến đen Hình 1.2: Tôm trước và sau khi bảo quản lạnh 2oC 7
21. 1.3. Các phương pháp bảo quản tôm sau thu hoạch 1.3.1 Tình hình nghiên cứu trong nước a. Phương pháp ướp nước đá gián tiếp Sử dụng đá xay hoặc đá vảy để bảo quản thủy sản trong các thùng cách nhiệt hoặc thùng nhựa. Thủy sản được ngăn không cho tiếp xúc với nước đá bằng các tấm nhựa hoặc thủy sản được đựng trong các túi PE. Phương pháp này có ưu điểm là hạn chế sự biến dạng, dập nát do góc cạnh của nước đá gây ra, cho phí vận chuyển thấp, dễ thực hiện. Tuy nhiên, bảo quản không cẩn thận sẽ gây ra hiện tượng nhiệt độ bảo quản không đều và sự hình thành biến đen vẫn xuất hiện sau khoảng 1-2 ngày bảo quản[14]. b. Phương pháp ướp đá ướt Thủy sản được làm lạnh trong hỗn hợp nước đá và nước. Phương pháp ướp đá và nước có ưu điễm là làm lạnh nhanh và đồng đều, nguyên liệu không bị dập nát, dễ thực hiện, giảm được tỷ lệ biến đen khi bảo quản tôm. Phương pháp này có nhược điểm là vận chuyển khó khăn, chi phí vận chuyển tăng, tôm dễ bị trương nước, long đầu, dãn đốt. c. Phương pháp “ ngủ đông” Tôm sú thương phẩm được rửa sạch rồi thả vào nước biển 20oC để tôm nghỉ khoảng 12 giờ, sau đó cho tôm ngủ đông trong nước biển ở nhiệt độ 15oC (từ 90-150 phút tôm sẽ ngủ hoàn toàn). Để vận chuyển đi xa hoặc bảo quản, vớt tôm ra khỏi nước, cho vào thùng cách nhiệt, phủ kín tôm bằng trấu hoặc rong biển đã làm ẩm và làm lạnh đến 15oC. Với cách làm này, thời gian bảo quản hoàn hảo (100%) để vận chuyển có thể kéo dài từ 6-7 tiếng đồng hồ, tỉ lệ tôm sống sẽ giảm xuống khoảng 30% trong vòng 6 tiếng đồng hồ tiếp theo. Muốn tôm thức dậy, chỉ lúc cần thả tôm vào nước có nhiệt độ ban đầu là 15oC, sau đó cứ 15 phút nâng nhiệt lên 1oC, cho tới khi đạt 20oC và duy trì ở nhiệt độ này khoảng từ 60-90 phút. Điều cần lưu ý là trong thời gian trước khi cho tôm ngủ đông và lúc đánh thức tôm phải tiến hành sục khí định kỳ 5 phút/lần, mỗi lần cách nhau 15 phút. Phương pháp này có kéo dài được thời gian bao quản nhưng cách làm phức tạp, tốn nhiều công sức[15]. d. Phương pháp bảo quản tôm bằng axit ascorbic và hợp chất đường khử Nobuyuki Higuchi đã nghiên cứu tạo chế phẩm bảo quản và phương pháp bảo quản không làm giảm chất lượng của tôm, được cấp bằng sáng chế số 1-0008570, ngày 25/08/2010 tại Việt Nam. 8
22. S K L 0 0 2 1 5 4