Khóa luận Sử dụng kỹ thuật vi gel để vi bao nấm men Saccharomyces boulardii (Phần 1)

Nội dung text: Khóa luận Sử dụng kỹ thuật vi gel để vi bao nấm men Saccharomyces boulardii (Phần 1)

1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT TP.HCM KHOA CÔNG NGHỆ HÓA VÀ THỰC PHẨM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM SỬ DỤNG KỸ THUẬT VI GEL ĐỂ VI BAO NẤM MEN SACCHAROMYCES BOULARDII GVHD: ThS. LÊ HOÀNG DU SVTH: LÊ THỊ HỒNG LỤA MSSV: 11116035 S K L 0 0 3 9 3 8 Tp. Hồ Chí Minh, tháng 7/2015
2. TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM KỸ THUẬT THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC VÀ THỰC PHẨM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP MÃ SỐ: 2015-11116035 SỬ DỤNG KỸ THUẬT VI GEL ĐỂ VI BAO NẤM MEN SACCHAROMYCES BOULARDII GVHD: TH.S LÊ HOÀNG DU SVTH: LÊ THỊ HỒNG LỤA MSSV: 11116035 THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 07/2015
3. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Th.S Lê Hoàng Du TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC VÀ THỰC PHẨM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM NHIỆM VỤ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Họ và tên sinh viên: Lê Thị Hồng Lụa MSSV: 11116035 Ngành: Công nghệ Thực phẩm 1. Tên đồ án: Sử dụng kỹ thuật vi gel để vi bao nấm men Saccharomyces boulardii. 2. Mã số đồ án: 2015-11116035 3. Nhiệm vụ của đồ án: Khảo sát khả năng vi bao của màng bao alginate kết hợp với gelatin, soy protein. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ gelatin/ soy protein đến khả năng sống sót của tế bào nấm men Saccharomyces loulardii được vi bao trong môi trường giả lập dạ dày, giả lập dịch ruột. 4. Ngày giao nhiệm vụ đồ án: 20/01/2015 5. Ngày hoàn thành đồ án: 15/07/2015 6. Họ tên ngƣời hƣớng dẫn: ThS. Lê Hoàng Du Nội dung và yêu cầu đồ án tốt nghiệp đã đƣợc thông qua bởi Trƣởng Bộ môn Công nghệ Thực phẩm Tp.HCM, ngày 15 tháng 07 năm 2015 Trƣởng Bộ môn Ngƣời hƣớng dẫn SVTH: Lê Thị Hồng Lụa Trang ii
4. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Th.S Lê Hoàng Du LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình nghiên cứu đồ án tốt nghiệp tại bộ môn Công nghệ thực phẩm, Khoa Công nghệ hóa học và thực phẩm, Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật TP Hồ Chí Minh. Em đã nhận được nhiều sự quan tâm giúp đỡ từ gia đình, thầy cô, bạn bè và nhà trường. Qua đây em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến: Gia đình đã luôn động viên ủng hộ, làm chỗ dựa tinh thần cho em Ban giám hiệu Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật TP Hồ Chí Minh Quý thầy cô Khoa công nghệ Hóa học và Thực phẩm - Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật TP Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện học tập và nghiên cứu hoàn thành đồ án tốt nghiệp. Đặc biệt em chân thành gửi lời cảm ơn sâu sắc đến thầy Lê Hoàng Du đã trược tiếp hướng dẫn, tận tình giúp đỡ, truyền đạt những kiến thức cũng như kinh nghiệm quý báu, tạo điều kiện tốt nhất để em có thể hoàn thành đề tài. Tập thể lớp 111160 đã giúp đỡ và đồng hành cùng tôi trong suốt quãng đời sinh viên. Cuối cùng em xin chúc quý Thầy, Cô sức khỏe và thành công. Một lần nữa em xin chân thành cảm ơn. TP Hồ Chí Minh, ngày 15 tháng 07 năm 2015 Sinh viên thực hiện SVTH: Lê Thị Hồng Lụa Trang iii
5. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Th.S Lê Hoàng Du LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan toàn bộ nội dung được trình bày trong khóa luận tốt nghiệp là của riêng tôi. Tôi xin cam đoan các nội dung được tham khảo trong khóa luận tốt nghiệp đã được trích dẫn chính xác và đầy đủ theo qui định. Ngày 15 tháng 07 năm 2015 Ký tên SVTH: Lê Thị Hồng Lụa Trang iv
6. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Th.S Lê Hoàng Du TÓM TẮT KHÓA LUẬN Gelatin hoặc soy protein kết hợp với sodium alginate, được sử dụng như một hệ chất bao để vi bao tế bào nấm men Saccharomyces boulardii với mục tiêu tăng khả năng sống sót của tế bào nấm men khi tiếp xúc với các điều kiện bất lợi ở dạ dày cũng như ở đường ruột. Phân bố kích thước hạt được đo bằng cách sử dụng kỹ thuật nhiễu xạ laser, kích thước của hạt vi bao có gelatin trung bình 270.4 µm và kích thước hạt vi bao có soy protein 360.2 µm. Mẫu hạt vi bao sử dụng màng bao có 0.75% gelatin và mẫu 15% soy protein cho hiệu suất vi bao cao nhất, tương ứng lần lượt là 85.72% và 82.46%. Mật độ tế bào của hạt vi bao đạt 8.47 – 8.83 log cfu/g gel đối với mẫu gelatin, 8.72 – 8.95 log cfu/g gel ứng với mẫu soy protein. Khi vi bao bằng gelatin (0.5, 0.75 và 1%) hoặc soy protein (5, 10 và 15%) với alginate đã cải thiện đáng kể khả năng sống sót của tế bào nấm men trong môi trường giả lập dạ dày (pH = 1.55), kết quả số tế bào sống ở nồng độ gelatin 0.75 % và soy protein 15% cao nhất, cao hơn đáng kể (p < 0.05) so với tế bào tự do và tế bào được bao một lớp bằng alginate. Sau khi ủ trong môi trường giả lập dạ dày 120 phút, số lượng tế bào sống sót là 6.78 log cfu/g gel cho màng bao có gelatin 0.75% và 7.12 log cfu/g gel cho màng bao có soy protein 15%, trong khi tế bào tự do là 4.06 log cfu/g. Khi ủ hạt vi bao trong môi trường giả lập dịch ruột, màng bao có chứa 0.75% gelatin hoặc 15% soy protein cho kết quả vi bao tốt nhất tương ứng 7.65 log cfu/g gel và 7.89 log CFU/ g gel so với đối với tế bào tự do 5.74 log cfu/g. Như vậy, khi vi bao bằng gelatin hoặc soy protein với alginate, số lượng tế bào sống sót phù hợp với yêu cầu tối thiểu khi sử dụng probiotics (6 – 7 log cfu/g hoặc ml). Từ khóa:S. boulardii, gelatin, soy protein, alginate, vi bao, khả năng sống sót SVTH: Lê Thị Hồng Lụa Trang v
7. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Th.S Lê Hoàng Du MỤC LỤC NHIỆM VỤ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ii LỜI CẢM ƠN iii LỜI CAM ĐOAN iv TÓM TẮT KHÓA LUẬN v MỤC LỤC vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT x CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 1 1.1. Giới thiệu 1 1.2. Probiotics 2 1.2.1. Định nghĩa về probiotics. 2 1.2.2. Các chủng vi khuẩn thường dùng làm probiotics. 2 1.2.3. Cơ chế hoạt động của probiotics. 3 1.2.4. Tính chất chức năng & lợi ích đối với cơ thể 5 1.3. Nấm men S. boulardii 7 1.3.1. Giới thiệu 7 1.3.2. Đặc điểm S. boulardii 7 1.3.3. Cơ chế hoạt động của S. boulardii 8 1.4. Kỹ thuật vi bao. 10 1.4.1. Định nghĩa, phân loại. 10 1.4.2. Một số kỹ thuật vi bao thường sử dụng 10 CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1. Vật liệu 20 2.2. Phương pháp. 20 2.2.1. Chuẩn bị giống vi sinh vật S. boulardii. 20 2.2.2. Chuẩn bị dung dịch màng bao. 20 SVTH: Lê Thị Hồng Lụa Trang vi
8. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Th.S Lê Hoàng Du 2.2.3. Phương pháp vi bao. 21 2.2.4. Bố trí thí nghiệm. 22 2.2.5. Phân tích mật độ tế bào vi bao. 24 2.2.6. Xác định hiệu suất bao. 24 2.2.7. Xác định phân bố thước hạt bao. 25 2.2.9. Khảo sát khả năng sống sót của tế bào được vi bao trong môi trường giả lập dịch dạ dày. 25 2.2.11. Phân tích xử lý số liệu. 26 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 3.1. Mật độ tế bào vi sinh vật được bao gói. 27 3.3. Kích thước hạt vi bao S. Boulardii với chất bao gelatin-alginate và soy protein- alginate. 32 3.4. Bề mặt hạt vi bao chụp dưới kính hiển vi điện tử quét. 33 3.5. Khả năng sống sót của tế bào nấm men được vi bao trong môi trường giả lập dạ dày. 34 3.6. Khả năng sống sót của tế bào nấm men S. boulardii được vi bao trong môi trường giả lập dịch ruột. 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO 45 SVTH: Lê Thị Hồng Lụa Trang vii
9. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Th.S Lê Hoàng Du DANH SÁCH BẢNG BIỂU Bảng 1.1: Những vi sinh vật được sử dụng làm probiotics 3 Bảng 1.2: Một số loại màng bao và kích thước hạt bao tương ứng 17 Bảng 2.1. Công thức phối trộn màng bao và tế bào S. boulardii 21 Bảng 3.1: Mật độ tế bào nấm men S. boulardii được vi bao trong màng bao gelatin – alginate (log cfu/g). 27 Bảng 3.2: Mật độ tế bào nấm men S. boulardii được vi bao trong màng bao gelatin – soy protein (log cfu/g). 27 Bảng 3.3: Hiệu suất vi bao nấm men S. boulardii trong màng bao gelatin – alginate. 29 Bảng 3.4: Hiệu suất vi bao nấm men S. boulardii trong màng bao gelatin – alginate. 30 Bảng 3.5. Khả năng sống của tế bào nấm men theo thời gian (log cfu/g) trong môi trường giả lập dạ dày. 35 Bảng 3.6: Khả năng sống của tế bào nấm men S boulardii theo thời gian (log cfu/g) trong môi trường giả lập dịch ruột 40 SVTH: Lê Thị Hồng Lụa Trang viii
10. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Th.S Lê Hoàng Du DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Tế bào S. boulardiiquan sát dưới kính hiển vi. 7 Hình 1.2: Cấu trúc alginate và quá trình hình thành gel khi có mặt ion Ca2+ 16 Hình 1.3. Quy trình vi bao nấm men. 22 Hình 3.1: A. Mật độ tế bào nấm men S. boulardii được vi bao 28 Hình 3.2: Hiệu suất vi bao S. boulardii. 30 Hình 3.3: Biểu đồ phân bố kích thước hạt vi bao. 33 Hình 3.4: Cấu trúc bề mặt hạt vi bao. A. hạt vi bao bằng alginate, B. hạt vi bao bằng soy protein – alginate, C. hạt vi bao bằng gelatin-alginate 34 Hình 3.5: Khả năng sống của tế bào nấm men S. boulardii trong môi trường giả lập dạ dày (pH = 1.55). 36 Hình 3.6: Khả năng sống của tế bào nấm men S. boulardii trong môi trường giả lập dịch ruột Error! Bookmark not defined. SVTH: Lê Thị Hồng Lụa Trang ix
11. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Th.S Lê Hoàng Du DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT S: Saccharomyces L: Lactobacillus WHO/FAO: tổ chức Y tế thế giới và tổ chức nông lương thế giới SVTH: Lê Thị Hồng Lụa Trang x
12. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Th.S Lê Hoàng Du CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu Trong đường ruột của chúng ta, có khoảng hơn 100 ngàn tỉ khuẩn, chúng bao gồm cả vi sinh vật có lợi và vi sinh vật có hại. Sự cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột là rất quan trọng để duy trì lượng vi sinh vật có lợi, hỗ trợ các chức năng về tiêu hóa và miễn dịch. Tuy nhiên, trong cuộc sống hằng ngày hệ tiêu hóa của chúng ta rất dễ bị tác động bởi các yếu tố bên ngoài, gây rối loạn hệ vi sinh vật đường ruột. Chẳng hạn như sự lão hóa, dùng kháng sinh, chế độ ăn uống không hợp lý, Các nhân tố này làm giảm hệ vi sinh vật có lợi, tạo điều kiện cho vi sinh vật gây hại gia tăng, ảnh hưởng đến sức khỏe. Qua đó cho thấy tầm quan trọng của hệ vi sinh đường ruột trong duy trì sức khỏe và phòng bệnh. Việc bổ sung probiotics được xem như là một biện pháp hữu hiệu để tăng cường hệ tiêu hóa giúp nâng cao lượng vi sinh vật có lợi. Trong đó Saccharomyces boulardii (S. boulardii) một loại nấm men không gây bệnh hiện đang được sử dụng rộng rãi như là một loại thuốc để tăng cường hệ vi sinh vật có lợi cho đường ruột (Duong thi ngoc Diep, 2013.). Tuy nhiên, một số probiotics cũng như nấm men S. boulardii khi vào trong cơ thể bị bất hoạt, phá hủy do pH thấp của dạ dày và tác động của môi trường dịch ruột (Klein và cộng sự, 1993), một số khác có thể sống sót qua khỏi dạ dày như vi khuẩn trong sữa chua, Lactobacillus delbruecklii, Streptococcus thermophilus chúng có khả năng chịu được acid thấp (Marteau và cộng sự, 2003). Do lượng lớn probiotics không thể tồn tại cho đến ruột già nên cần phải thực hiện một biện pháp nào đó để đảm bảo lượng probiotics còn tồn tại khi đến ruột già. Hiện nay, một trong những phương pháp hữu hiệu nhất là bao gói và vi bao chúng, nghĩa là tạo ra một lớp màng bao quanh chúng tránh các tác động của pH dạ dày, muối mật nhưng vẫn đảm bảo vi sinh vật có khả năng phóng thích đúng lúc (Duong thi ngoc Diep, 2013). Vì vậy để giải quyết vấn đề này, chúng tôi thực hiện đề tài ―Sử dụng kỹ thuật vi gel để vi bao S. boulardii ‖ với mục tiêu bảo vệ S. boulardii trong chất bao gelatin, soy protein, kết hợp với gel alginate tránh các tác động tiêu cực của hệ tiêu hóa lên khả năng sống sót của tế bào. Nội dung nghiên cứu chính của đề tài bao gồm: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ gelatin, soy protein lên hiệu suất vi bao S. boulardii SVTH: Lê Thị Hồng Lụa Trang 1
13. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Th.S Lê Hoàng Du Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ gelatin, soy protein lên khả năng sống sót của S. boulardii sau vi bao trong môi trường giả lập dạ dày và môi trường giả lập dịch ruột. 1.2. Probiotics 1.2.1. Định nghĩa về probiotics Định nghĩa về probitics lần đầu tiên được Lilly và Stillwell sử dụng vào năm 1965 để chỉ những ―chất bí mật được tạo ra bởi một loài vi sinh vật có tác động kích thích sự phát triển của một loài vi sinh vật khác‖ (Lilly và cộng sự, 1965). Probiotics được định nghĩa là các vi sinh vật được dùng với một số lượng đủ để tồn tại trong hệ đường ruột và có tác động tích cực đến hệ vi sinh đường ruột, chúng được tạo thành từ một hoặc nhiều chủng của một loài đơn lẻ hoặc hỗn hợp của một số loài, trong đó có các thành phần chung của hệ thực vật đường ruột bình thường và đã được phân lập từ phân của người khỏe mạnh (Gismondo và cộng sự, 1999) và còn nhiều định nghĩa khác đã được đưa ra bởi các nhà khoa học nổi tiếng như Charteris và cộng sự, 1997; Fioramonti và cộng sự, 2003; Marteau và cộng sự, 2011. Mặc dù có nhiều định nghĩa, thuật ngữ đã được đề cập, song phổ biến nhất và có giá trị khoa học là định nghĩa của tổ chức Y tế thế giới và tổ chức nông lương thế giới (WHO/FAO,2001), được kiểm chứng bởi Hiệp hội các nhà khoa học quốc tế về probiotic và prebiotic đây là định nghĩa chính xác nhất: ―probiotic là những vi sinh vật sống được đưa trực tiếp vào cơ thể, với một lượng đầy đủ sẽ có lợi về mặt sức khỏe cho người sử dụng (Araya và cộng sự, 2002). Như vậy, theo định nghĩa này thì những vi sinh vật sống không chỉ bao gồm vi khuẩn mà còn có nấm men như nấm men S. boulardii. Hầu hết các chủng probiotics thường được sử dụng để sản xuất thực phẩm thuộc nhóm vi khuẩn acid lactic như là Lactobacillus và Bifidobacteria (Lê Văn Việt Mẫn và cộng sự, 2008). 1.2.2. Các chủng vi khuẩn thường dùng làm probiotics Vi sinh vật probiotics có thể tìm thấy ở nhiều nơi như ở các cơ chất chứa carbohydrat, các môi trường khác nhau như niêm mạc người và gia súc (khoang bụng, ruột và âm đạo), ở thực vật hoặc các vật liệu có nguồn gốc thực vật, trong phân và thực phẩm lên men. Hiện nay, các chủng vi khuẩn được sử dụng với vai trò là các probiotics chủ yếu thuộc Lactobacillus và Bifidobacterium, ngoài ra còn có Enterococcus và Streptococis. Những vi khuẩn này thường cư trú ở ruột. Một số chủng tiêu biểu gồm Lactobacillus SVTH: Lê Thị Hồng Lụa Trang 2
14. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Th.S Lê Hoàng Du acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus rhamnous, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum, bên cạnh đó còn có nấm men Saccharomyces Boulardi (Berni Canani và cộng sự, 2011; Hong và cộng sự, 2005). Bảng 1.1: Những vi sinh vật được sử dụng làm probiotics Chủng Chủng Các chủng vi khuẩn lactic Các loại vi sinh vật khác Lactobacillus Bifidobacterium khác L. acidophilus B. adolescentis Enterococcus faecalis Bacillus cereus L. amylovocus B. alimalis Enterococcus faecium Eschiarichia coli L. casei B. bifidum Lactococcus lactis Propionibacterium L. crispatus B. breve Leuconostoc mesenteroides freudenreichii L. gallinarium B. infantis Pediococus acidilactici Saccharomyces cerevisiae L. gasseri B. lactis Sporolactobacillus inulinus Saccharomyces boulardii L. iohnsonii B. longum Streptococus thermophilus L. paracasei L. plantarum L. reuteri L. rhamnosus L. salivarius (Taylor & Francis, 2004) 1.2.3. Cơ chế hoạt động của probiotics Cơ chế tác động của probiotics chủ yếu thể hiện trên ba phương thức: cạnh tranh loại trừ, tổng hợp các chất đối kháng vi sinh vật gây bệnh, điều chỉnh miễn dịch (Steiner và cộng sự, 2006). 1.2.3.1. Cạnh tranh loại trừ Đặc điểm cạnh tranh điển hình là cạnh tranh chỗ bám dính. Các vi sinh vật probitics cư ngụ và nhân lên trên bề mặt của biểu mô ruột, khóa chặt các vị trí thụ cảm và ngăn cản sự bám dính của các vi sinh vật khác như E. coli, Salmonella, Nấm men là probiotics (S. boulardii) không những tranh vị trí bám dính với các vi khuẩn khác mà còn gắn kết với các vi khuẩn có roi (đa số là vi khuẩn có hại) thông qua các cơ quan thụ cảm mannose và đẩy SVTH: Lê Thị Hồng Lụa Trang 3
15. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Th.S Lê Hoàng Du chúng ra khỏi vị trí bám dính ở niêm mạc ruột (Czeruckap và cộng sự, 2002.). Bên cạnh việc cạnh tranh loại trừ probiotics còn cạnh tranh về nguồn dinh dưỡng với vi sinh vật gây bệnh, vì sự sinh trưởng và phát triển số lượng lớn vi sinh vật gây bệnh ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát tiển của các vi khuẩn có lợi. 1.2.3.2. Tổng hợp các chất đối kháng vi sinh vật gây hại Bên cạnh cạnh tranh lọai trừ, các vi sinh vật probiotics còn sản sinh các chất kìm hãm sự phát triển của các vi khuẩn khác như lactoferrun, lysozym, hydrogen peroxide cũng như một số acid hữu cơ khác. Các chất này gây tác động bất lợi đối với các vi khuẩn khác đặc biệt là các vi khuẩn gây hại (Conway và cộng sự, 1996). Hoạt động này có được là do: Làm giảm pH của môi trường trong khoang ruột thông qua tổng hợp các acid hữu cơ như acid lactic, acid acetic, acid propionic. Làm giảm khả năng oxi hóa khử của môi trường ruột. Sản xuất H2O2 trong điều kiện kị khí. Đặc biệt tạo những hợp chất ức chế vi sinh vật có hại như Bacteriocin. a. Ảnh hƣởng của acid lactic và acid acetic Sư tích tụ acid lactic và acid acetic làm giảm pH của môi trường và hạn chế sự phát triển của vi khuẩn Gram (+) và Gram (-) với phổ rộng. Ở pH ruột có chứa 8.4% acid acetic và 1.1% acid lactic ở dạng không phân ly. Đây là yếu tố quan trọng vì ở dạng không phân ly chúng được xem như chất đối kháng chống lại sự tăng trưởng của nhiều vi khuẩn gây bệnh cũng như vi khuẩn gây thối (Đỗ Thị Liễu, 2011). Những acid acetic và acid lactic ở dạng không phân ly có thể thấm vào màng tế bào vi khuẩn, khi ở môi trường nội bào với pH cao chúng phân ly tạo ra ion hydrogene, ảnh hưởng đến các chức năng trao đổi chất của tế bào (Đỗ Thị Liễu, 2011). b. Khả năng kháng khuẩn của dehydrogene peroxide (H2O2) H2O2 được hình thành bởi vi khuẩn acid lactic (LAB) và ảnh hưởng đến nhiều vi sinh vật khác nhau đã được nhiều tác giả nghiên cứu. Các chủng LAB tạo ra H2O2 trong môi trường chứa glucose với điều kiện kỵ khí. SVTH: Lê Thị Hồng Lụa Trang 4
16. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Th.S Lê Hoàng Du Sự tích lũy H2O2 trong quá trình trao đổi chất làm tăng hoạt động của enzyme NADH oxidase, pyruvate oxidase, NADH peroxidase. Đồng thời hình thành dạng gốc hydroxyl phóng xạ. Quá trình này dẫn đến sự oxi hóa màng lipid và làm tăng tính thẩm thấu của màng. Các ảnh hưởng này góp phần oxi hóa tế bào vi khuẩn cũng như phá hủy acid nucleic và protein tế bào. c. Tổng hợp Bacteriocin Vi khuẩn lactic tạo ra nhiều tạo ra nhiều chất đối kháng tương tự sản phẩm trao đổi chất, chất giống chất kháng sinh và protein kháng khuẩn gọi chung là Bacteriocin (là nhóm peptide hoặc protein được tổng hợp nhờ ribosome và có hoạt tính kháng vi sinh vật). Chất đối kháng này làm thay đổi quá trình trao đổi chất, đặc điểm sinh học và hình dạng tế bào. 1.2.3.3. Điều chỉnh hệ miễn dịch Thông qua tương tác với hệ thống miễn dịch dịch ruột, các pobiotics có thể điều chỉnh cả miễn dịch thụ động và chủ động hoặc cả hai. Tác động điều chỉnh đặc hiệu của probiotics phụ thuộc vào chủng giống hoặc các loài vi khuẩn probiotics (Dugan và cộng sự, 1999). Tuy nhiên, cơ chế tác động của các probiotics đối với việc nâng cao chức năng miễn dịch vẫn còn chưa được nghiên cứu sâu sắc. Probiotics có các điều chỉnh hệ miễn dịch như sau: Probiotics như là một phương tiện phân phát các kháng nguyên cho đường ruột Đẩy mạnh sự báo hiệu cho tế bào chủ. Các kháng nguyên của probiotics kích thích tế bào niêm mạc ruột sản sinh kháng thể. Như vậy, cơ chế hoạt động của một chủng probiotics nhất định, phụ thuộc vào hoạt động chuyển hóa, sự có mặt của các chất mà chúng tạo ra trong quá trình sống. Những thành phần bên trong tế bào probioitcs như DNA hoặc peptidoglycan cũng đóng vai trò quan trọng trong cơ chế hoạt động của probiotics. Sự kết hợp chặt chẽ của từng thuộc tính riêng lẻ trong một chủng probiotics nhất định, sẽ quy định cơ chế hoạt động chủ yếu và ý nghĩa ứng dụng của chủng probiotics đó trong việc ngăn chặn và điều trị bệnh (Oelschlaeger và cộng sự, 2010.). 1.2.4. Tính chất chức năng & lợi ích đối với cơ thể SVTH: Lê Thị Hồng Lụa Trang 5
17. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Th.S Lê Hoàng Du Probiotics là nhóm vi khuẩn có khả năng chuyển hóa carbohydrate thành acid lactic (Lactobacillus); acid lactic và acid acetic (Bifidobacterium) làm tăng độ acid trong đường ruột, do đó các chủng vi khuẩn này còn được gọi là vi khuẩn lactic. Chúng thường được gọi là nhóm vi khuẩn có lợi hay lợi khuẩn. Các chủng vi khuẩn probiotics ức chế chọn lọc nhóm vi khuẩn đường ruột xấu (ví dụ nhóm vi khuẩn Clostridia thủy phân protein thành các hợp chất độc cho cơ thể), do nhóm vi khuẩn có lợi có ưu thế hơn nhóm vi khuẩn xấu trong môi trường acid, do đó tạo một môi trường lành mạnh cho hệ đường ruột của cơ thể. Ngoài lợi ích trực tiếp này, probiotic còn có các vai trò sau: • Ngăn chặn sự xâm nhập vào cơ thể của các vi sinh vật gây hại. • Ngăn chặn, ức chế, phân hủy các tiền chất độc có khả năng gây ung thư cho cơ thể. • Làm giảm hoạt lực của các enzyme xúc tác các quá trình trao đổi chất gây hại. Sản sinh một số tác nhân sinh học hỗ trợ cho hệ miễn dịch. • Giúp phân giải các chất hữu cơ phức tạp có trong thức ăn thành những hợp chất đơn giản và dễ tiêu hóa. Giúp chuyển hóa lactose trong sữa cho người sử dụng sữa nhưng không thể dung nạp được lactose (được gọi là ―Hội chứng không dung nạp đường lactose‖). • Giảm nguy cơ ung thư ruột kết, ung thư đương ruột. • Giảm cholesterol xấu LDL (low density lipoprotein). • Tăng cường hệ thống miễn dịch và ngăn ngừa viêm, nhiễm trùng. • Kìm hãm sự phát triển của các vi khuẩn, virus, nấm có hại, có khả năng chịu đựng được acid dạ dày, muối mật, có khả năng xâm chiếm đường ruột, bám vào màng nhầy ruột do đó hạn chế sự có mặt của vi sinh vật. Cân bằng hệ vi sinh đường ruột cho bệnh nhân đang điều trị kháng sinh. • Phòng và chữa một số bệnh đường tiêu hóa: hỗ trợ điều trị tiêu chảy, táo bón, ung loét dạ dày, SVTH: Lê Thị Hồng Lụa Trang 6
18. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Th.S Lê Hoàng Du • Tăng cường hấp thu một số khoáng chất vi lượng. • Tăng cường hấp thu & tổng hợp một số vitamin nhóm B. 1.3. Nấm men S. boulardii 1.3.1. Giới thiệu S. boulardii là một chủng nấm men ở vùng nhiệt đới được phân lập từ vải thiều và quả măng cụt vào năm 1923 bởi nhà khoa học người Pháp Henri Boulard. Khi bệnh tiêu chảy do Vibrio Cholera bùng nổ, nhưng những người uống một loại trà đặt biệt được nấu từ vỏ của các loại quả nhiệt đới (vải và măng cụt) thì không bị mắc bệnh. S. boulardii cũng có đặc điểm tương tự S. cerevisiae như có dạng hình cầu, dài hay elip, nảy chồi ở nhiều phía, không có khuẩn ty, khuẩn lạc có dạng bột nhão hơi bóng (Vương Thị Hồng Vi, 2007). Tuy nhiên, S. boulardii khác với S. cerevisiae trong một số đặc điểm về phân loại, trao đổi chất, và các đặc tính di truyền (Malgoire và cộng sự, 2005). Sau khi phân lập thành công, tên của ông đã được đặt tên cho loại nấm men này “S. boulardii” (McFarland và cộng sự, 2010). Hình 1.1: Tế bào S. boulardii quan sát dưới kính hiển vi. Nguồn: S. boulardii thường được bán trên thị trường như là một probiotic ở dạng đông khô và do đó thường được gọi là S. boulardii Lyo. 1.3.2. Đặc điểm S. boulardii SVTH: Lê Thị Hồng Lụa Trang 7
19. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Th.S Lê Hoàng Du S. boulardii, một chế phẩm men đã được cấp bằng sáng chế, là nấm men duy nhất có hoạt tính probiotics (Sazawal và cộng sự, 2006.). Loại nấm men này được sử dụng ở nhiều quốc gia trên thế giới như là một lá chắn bên ngoài của hệ miễn dịch và có khả năng điều trị cho bệnh tiêu chảy và rối loạn tiêu hóa do các vi sinh vật có hại gây nên. S. boulardii có nhiều tính năng thể hiện chúng là một probiotic, tức là nó tồn tại ở đường tiêu hóa, chịu được acid dạ dày và muối mật. Nhiệt độ tối ưu của chúng là 370C, cả in vitro và in vivo, nó ức chế sự tăng trưởng của một số tác nhân gây bệnh của vi sinh vật. Tuy nhiên, S. boulardii thuộc về nhóm các tế bào nhân chuẩn đơn giản (như nấm và tảo), do đó nó khác với chế phẩm sinh học của vi khuẩn là sinh vật nhân sơ (Czerucka và cộng sự, 2007). 1.3.3. Cơ chế hoạt động của S. boulardii Cơ chế hoạt động của S. Boulardii đối với hệ thống tiêu hóa ở người đã được khảo sát trong nhiều nghiên cứu trước đây. Chúng ta có thể phân thành 3 tác động chính: hoạt động chống vi khuẩn, hoạt động dinh dưỡng, và điều hòa miễn dịch (Berni Canani và cộng sự, 2011.).  Hoạt động kháng khuẩn: trong ruột hoạt động kháng khuẩn có thể được chia làm hai nhóm chính: Hoạt động chống độc tố trực tiếp: hoạt động này chủ yếu là do các chuỗi peptide ngắn được tạo ra bởi nấm men. S. boulardii tiết enzyme protease 54kDa, in vivo. Protease này đã được chứng minh là làm giảm cả độc tố A và B*(souche virulente và toxinogenique) được tiết ra từ vi khuẩn Clostridium difficile, và ức chế hoạt động của vi khuẩn này . Điều này dẫn đến việc giảm nhiễm độc do tế bào Clostridium difficile (Castagliuolo và cộng sự, 1999). *Độc tố A: có tác dụng gây sự tiết dịch từ niêm mạc ruột. Độc tố B mạnh hơn độc tố A nhiều lần, tác dụng thẳng vào các tế bào niêm mạc ruột và hủy hoại chúng gây ra bệnh lý viêm ruột nặng và tiêu chảy gọi là pseudo – membraneuse Kìm hãm sự phát triển và chống nhiễm vi khuẩn: Escherichia coli và Salmonella typhimurium, hai vi khuẩn gây bệnh thường liên quan đến tiêu chảy nhiễm trùng cấp tính. Nấm men tác dụng trực tiếp kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh (Dahan và cộng sự, 2003). Nấm men có vai trò làm tăng bề dày của các tế bào hấp thụ trên thành ruột. Nhờ đó, nó được loại bỏ khỏi cơ thể sau lần đi cầu tiếp theo (Gedek và cộng sự, 1999). Các hypersecretion* nước và chất điện giải (bao gồm chloride ion), do độc tố dịch tả trong SVTH: Lê Thị Hồng Lụa Trang 8
20. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Th.S Lê Hoàng Du nhiễm trùng Vibrio cholerae, có thể được đáng kể với sự xuất hiện của S. boulardii . Các protease 120kDa được tiết ra bởi S. boulardii không có khả năng phân giải protein nhưng có hoạt tính cạnh tranh đặc biệt với độc tố tiết ra của Vibrio cholerae, dẫn đến việc giảm enterocytic adenosine monophosphate vòng (cAMP) và clorua (Czerucka và cộng sự, 1999). * Hypersecretion là khi sản xuất quá nhiều, so với nhu cầu.  Hoạt động dinh dưỡng: Khi S. boulardii được đưa vào cơ thể bệnh nhân hoặc động vật, chúng sẽ chống lại kháng sinh để điều trị tiêu chảy, hệ vi khuẩn đường ruột thông thường sẽ được tái thiết lập một cách nhanh chóng (Barc và cộng sự, 2008). S. boulardii kích thích sản sinh những glycoprotein ở lớp nhung mao vách thành ruột như enzyme hydrolase, chất vận chuyển, nội tiết tố IgA và chất đáp ứng miễn dịch globulins (Ozkan và cộng sự, 2007). S. boulardii kích hoạt hoạt động của thụ thể peroxisome proliferator-activated receptor-γ (PPAR-γ) giúp bảo vệ đường ruột và chống các bệnh viêm đường ruột (Therapeutic và cộng sự, 2009).  Điều hòa miễn dịch Interleukin 8 (IL-8) là một tiền cytokine được tiết ra trong quá trình nhiễm trùng E. coli trong ruột. S. boulardii đã được chứng minh là làm giảm sự tiết IL-8 khi nhiễm E. coli; S. boulardii có tác dụng bảo vệ trong bệnh viêm ruột (Dahan và cộng sự, 2003). S. boulardii thể biểu hiện khả năng chống viêm của nó một phần thông qua dạng tế bào có kiểu hình đuôi gai, chức năng và di chuyển. Hoạt động ức chế các phản ứng miễn dịch của nó với các kháng nguyên của vi sinh vật thay thế vi khuẩn như lipopolysaccharide ( LPS). S. boulardii ức chế sự tăng sinh của các tế bào T* trong phản ứng lympho (Thomas và cộng sự, 2009). Những nghiên cứu gần đây cũng cho thấy rằng sự tắc ruột ở động vật gặm nhấm thông qua điều trị với S. boulardii (sống hoặc chết vì nhiệt) có tác dụng bảo vệ chống viêm đường ruột, ngăn chặn sự di chuyển của vi khuẩn đến vị trí bị tổn thương của đường ruột (Generoso và cộng sự, 2010). Cuối cùng, S. boulardii điều chỉnh con đường nitơ – oxi thông qua kìm hãm iNOS (Inducible nitric oxide synthase), góp phần điều trị, làm giảm viêm thành ruột, kích thích tiết ra chất chống viêm trên vùng vận chuyển ion biểu mô (Girard và cộng sự, 2003). SVTH: Lê Thị Hồng Lụa Trang 9
21. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Th.S Lê Hoàng Du * Tế bào T là tên gọi tắt của tế bào lympho T. Gọi là tế bào T vì trong quá trình biệt hoá để trưởng thành nó hoàn toàn phụ thuộc tuyến ức (Thymus). Bất đầu từ tế bào gốc, quá trình biệt hoá đã phân ra dòng lympho và từ đó tách ra 2 dòng nhỏ là Lympho T và lympho B. Đối với lympho T khi qua tuyến ức bị giữ lại phần lớn ở vùng vỏ tuyến ức (90-95%). Tại đây nhờ các hormon của tuyến ức chúng được biệt hoá trưởng thành rồi đi vào vùng tuỷ ức để tiếp tục chín. 1.4. Kỹ thuật vi bao 1.4.1. Định nghĩa, phân loại a. Định nghĩa Bao gói (encapsulation) được hiểu là quá trình nhốt một chất vào trong một màng bao, tạo thành hạt ở kích thước nano mét (nanoencapsulation – nano gói), micro mét (microencapsulation – vi bao– vi gói) hoặc mili mét (Burgain và cộng sự, 2011). Vi bao (microencapsulation): một kỹ thuật mà chất rắn, chất lỏng hay chất khí được đóng gói trong một vật liệu thứ hai với mục đích tránh khỏi các tác động của các hoạt chất từ môi trường xung quanh. Điều này được hiểu là quá trình tạo thành một lớp màng mỏng, một lớp vỏ bọc vi bao (shell) hoàn toàn phần vật chất có hoạt tính bên trong (core material). Vì vậy, các thành phần hoạt chất được xác định là vật liệu cốt lõi, trong khi các vật liệu xung quanh tạo thành lớp vỏ. Kỹ thuật này đã được sử dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau từ thực phẩm, hóa chất dược phẩm mỹ phẩm và in ấn (Rama Dubey và cộng sự, 2009). b. Phân loại Sản phẩm thu được từ những kỹ thuật vi bao khác nhau có thể được phân loại dựa theo kích thước sản phẩm cuối cùng, chúng được gọi là bao/gói (capsules) hay bao lớn (macrocapsules) khi kích thước lớn hơn 5.000 μm, vi bao (microcapsules) khi kích thước trong phạm vi từ 0.1 – 5.000 μm và bao nano (nanocapsules) khi kích thước nhỏ hơn 0.1 μm (Murugesan và cộng sự, 2012). Ngoài ra, chúng cũng được phân loại dựa theo hình dạng gồm hạt một nhân (monocore), nhiều nhân (polycore) và kiểu mạng lưới (matrix). Tuy nhiên, hình thái của các cấu trúc bên trong của một microparticle phụ thuộc phần lớn vào các vật liệu bao được lựa chọn và phương pháp microencapsulation được sử dụng (Rama Dubey và cộng sự, 2009). 1.4.2. Một số kỹ thuật vi bao thường sử dụng SVTH: Lê Thị Hồng Lụa Trang 10
22. S K L 0 0 2 1 5 4