Khóa luận Khảo sát khả năng sống sót của Saccharomyces boulardii được bao gói bằng gel alginate có bổ sung maltodextrin trong môi trường dạ dày và dịch ruột (Phần 1)

Nội dung text: Khóa luận Khảo sát khả năng sống sót của Saccharomyces boulardii được bao gói bằng gel alginate có bổ sung maltodextrin trong môi trường dạ dày và dịch ruột (Phần 1)

1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT TP.HCM KHOA CÔNG NGHỆ HÓA VÀ THỰC PHẨM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SỐNG SÓT CỦA SACCHAROMYCES BOULARDII ĐƯỢC BAO GÓI BẰNG GEL ALGINATE CÓ BỔ SUNG MALTODEXTRIN TRONG MÔI TRƯỜNG DẠ DÀY VÀ DỊCH RUỘT GVHD: TS. TRỊNH KHÁNH SƠN SVTH: VÕ THỊ DIỄM THƯƠNG MSSV: 11116067 S K L 0 0 3 9 5 3 Tp. Hồ Chí Minh, tháng 7/2015
2. TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC VÀ THỰC PHẨM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM NHIỆM VỤ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Họ và tên sinh viên: Võ Thị Diễm Thương MSSV: 11116067 Ngành: Công nghệ thực phẩm 1. Tên đồ án: Khảo sát khả năng sống sót của Saccharomyces boulardii được bao gói bằng gel alginate có bổ sung maltodextrin trong môi trường dạ dày và dịch ruột. 2. Mã số đồ án: 2015 - 11116067 3. Nhiệm vụ của đồ án: Khảo sát và đánh giá khả năng sống sót của Saccharomyces boulardii được bao gói bằng gel alginate có bổ sung maltodextrin trong môi trường dạ dày và dịch ruột. 4. Ngày giao nhiệm vụ đồ án: 20/01/2015 5. Ngày hoàn thành đồ án: 16/07/2015 6. Họ tên người hướng dẫn: TS. Trịnh Khánh Sơn Nội dung và yêu cầu đồ án tốt nghiệp đã được thông qua bởi Trưởng Bộ môn Công nghệ Thực phẩm Tp.HCM, ngày tháng năm 20 Trưởng Bộ môn Người hướng dẫn i
3. LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin chân thành cám ơn các thầy cô trường Đại học Sư Phạm Kỹ Thuật TP.HCM đặc biệt là các thầy cô Khoa Công nghệ hóa học & thực phẩm đã truyền đạt kiến thức cho chúng em trong suốt những năm học Đại học và tạo điều kiện cho chúng em hoàn thành đồ án tốt nghiệp. Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy TS. Trịnh Khánh Sơn - giảng viên hướng dẫn em hoàn thành đồ án này. Cám ơn thầy đã tận tâm chỉ dạy và hướng dẫn em trong suốt thời gian qua. Trong quá trình làm việc cùng thầy, em không chỉ được mở mang thêm kiến thức mà còn học hỏi cách làm việc có khoa học, nêu cao tinh thần trách nhiệm trong công việc nhờ đó dù thời gian ngắn và gặp không ít khó khăn nhưng em đã kết thúc đồ án đúng thời hạn. Cám ơn tất cả các bạn sinh viên lớp 11116, những người bạn luôn bên tôi động viên, chia sẻ khi tôi gặp khó khăn. Con xin gửi lời cám ơn đến cha mẹ, anh chị em trong gia đình đã luôn ủng hộ và là động lực lớn nhất cho con về mọi mặt. Mặc dù đã cố gắng nhưng do thiếu kinh nghiệm thực tế cùng những hạn chế về kiến thức bài báo cáo chắc chắn không thể tránh khỏi những thiếu sót, em rất mong nhận được ý kiến đóng góp từ Thầy, Cô để bài báo cáo được hoàn thiện hơn. Em xin chân thành cám ơn! ii
4. LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan toàn bộ nội dung được trình bày trong khóa luận tốt nghiệp là của riêng tôi. Tôi xin cam đoan các nội dung được tham khảo trong khóa luận tốt nghiệp đã được trích dẫn chính xác và đầy đủ theo qui định. Ngày tháng năm 201 Ký tên iii
5. MỤC LỤC NHIỆM VỤ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP i LỜI CẢM ƠN ii LỜI CAM ĐOAN iii MỤC LỤC iv DANH MỤC HÌNH vi DANH MỤC BẢNG BIỂU vii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT viii TÓM TẮT LUẬN VĂN ix CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1 1.1. Probiotic 1 1.1.1. Định nghĩa 1 1.1.2. Vai trò của probiotic 2 1.2. Nấm men Sacchromyces boulardii 3 1.3. Kĩ thuật bao gói 5 1.3.1. Một số khái niệm 5 1.3.2. Vật liệu bao gói 7 1.3.3. Phương pháp bao gói 11 1.4. Các nghiên cứu về khả năng bảo vệ hệ vi sinh vật bằng phương pháp vi bao 15 1.4.1. Nghiên cứu trong nước 15 1.4.2. Nghiên cứu ngoài nước 17 1.5. Định hướng nghiên cứu 20 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 21 2.1. Địa điểm thực hiện 21 2.2. Vật liệu 21 2.3. Phương pháp thực hiện 21 iv
6. 2.3.1. Bao gói S. boulardii với natri alginate có bổ sung maltodextrin 21 2.3.2. Khảo sát đường cong sinh trưởng của S. boulardii 22 2.3.3. Khảo sát cấu trúc tinh thể của hạt bao alginate sau khi sấy 22 2.3.4. Đánh giá khả năng tồn tại của S. boulardii trong môi trường giả lập dịch dạ dày và dịch ruột. 23 2.3.5. Khảo sát mật độ tế bào theo thời gian lưu trữ của hạt bao gói 23 2.3.6. Khảo sát khả năng tồn tại của S. boularddi trong môi trường giả lập dạ dày và dịch mật sau khi 12 ngày lưu trữ. 23 2.3.7. Phương pháp phân tích thu nhận kết quả 24 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 25 3.1. Đường cong sinh trưởng của S. boulardii 25 3.2. Đặc điểm hạt vi bao S. boulardii 27 3.2.1. Hình dạng hạt vi bao sau khi vi bao 27 3.2.2. Hình dạng hạt sau khi sấy 27 3.3. Đánh giá mật độ kết tinh của hạt bao gói sau khi sấy 29 3.4. Đánh giá khả năng sống sót của S. boulardii trong môi trường giả lập dịch dạ dày và dịch ruột. 31 3.5. Khảo sát mật độ tế bào theo thời gian lưu trữ của hạt bao gói 37 3.6. Khảo sát khả năng sống sót của S. boularddi trong môi trường giả lập dạ dày và dịch ruột sau 12 ngày lưu trữ của hạt bao gói 40 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO x PHỤ LỤC xviii v
7. DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Tế bào S. boulardii quan sát dưới kính hiển vi 3 Hình 1.2. Phân loại hạt vi bao theo hình thái 6 Hình 1.3. Cấu tạo alginate 8 Hình 1.4. Quá trình hình thành gel khi có mặt ion Ca2+ 8 Hình 1.5. Quá trình vi bao bằng phương pháp sấy phun 12 Hình 1.6. Sơ đồ quá trình vi bao bằng kỹ thuật nhũ tương 13 Hình 1.7. Quá trình tạo hạt vi bao bằng kỹ thuật ép đùn dùng kim tiêm 14 Hình 1.8. Đặc điểm mặc ngoài của hạt vi bao khi quan sát dưới kính hiển vi quét điện tử. 16 Hình 1.9. A,B - Cấu trúc mặt ngoài của vi gói Azospirillum trong nghiên cứu của Yoav Bashan; C,D - Cấu trúc mặt ngoài hạt vi gói trong nghiên cứu Nitin W. Fadnavis 19 Hình 3.1. Đường cong sinh trưởng S. boulardii 26 Hình 3.2. Hạt vi bao trước và sau khi sấy 28 Hình 3.3. Nhiễu xạ tia X của các mẫu hạt bao sau khi sấy 30 Hình 3.4. Sự thay đổi mật độ tế bào S. boulardii trong môi trường giả lập dạ dày 33 Hình 3.5. Sự thay đổi mật độ tế bào S. boulardii trong môi trường dịch ruột . 36 Hình 3.6. Sự thay đổi mật độ tế bào S.boulardii theo thời gian lưu trữ 39 Hình 3.7. Sự thay đổi mật độ tế bào S. boulardii trong môi trường giả lập dạ dày sau 12 ngày lưu trữ 41 Hình 3.8. Sự thay đổi mật độ tế bào S. boulardii trong môi trường giả lập dịch ruột sau 12 ngày lưu trữ 43 vi
8. DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1. Một số đặc điểm khác biệt chính giữa vi khuẩn và nấm men và ứng dụng probiotic 4 Bảng 1.2. Tóm tắt các phương pháp bao gói 15 vii
9. DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT STT Từ viết tắt Giải thích nghĩa 1 B. Bifidobacteria 2 C. Candida 3 CFU Colony form unit – đơn vị hình thành khuẩn lạc 4 E. Escherichia 5 FAO Food and Argiculture Organization – Tổ chức Nông Lương Liên Hiệp Quốc 6 L. Lactobacillus 7 Rpm round per minute – vòng/phút 8 S. Saccharomyces 9 V. Vibrio 10 w/v Weight/Volume – Khối lượng/Thể tích 11 WHO World Health Organization – Tổ chức Y tế thế giới viii
10. TÓM TẮT LUẬN VĂN Việc bao gói S. boulardii trong gel alginate có bổ sung maltodextrin được thực hiện bằng phương pháp nhỏ giọt đã góp phần đáng kể trong việc bảo vệ S. boulardii trong môi trường dịch dạ dày và dịch ruột. Bên cạnh đó nấm men được bao gói đã được cải thiện đáng kể khả năng sống sót trong quá trình bảo quản 12 ngày. Nhiệt độ bảo quản 50C cho hiệu quả sống sót của S. boulardii cao hơn ở 300C. Kết quả cho thấy mẫu nấm men bao gói được sấy khô có mức độ giảm mật độ tế bào là thấp nhất trong môi trường dạ dày (0.20 log CFU/g ) và dịch ruột (0.28 log CFU/g ) cũng như trong quá trình bảo quản hạt 12 ngày (giảm 0.95 log CFU/g hạt khi lưu trữ ở điều kiện 50C và giảm 1.18 log CFU/g hạt khi khi lưu trữ ở điều kiện 300C). Bên cạnh đó lượng tế bào S. boulardii không làm ảnh hưởng đến cấu trúc tinh thể của hạt bao alginate có bổ sung maltodextrin sau khi sấy. Nghiên cứu thành công việc bao gói S. boulardii trong gel alginate sấy khô (có bổ sung maltodextrin) sẽ là tiền đề cho nhiều nghiên cứu mới khác trong việc tăng khả năng bảo vệ probiotic khi đưa vào hệ tiêu hóa ở người. ix
11. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Probiotic 1.1.1. Định nghĩa Người tiêu dùng hiện đại mong đợi thực phẩm sẽ mang lại cho họ được sự khỏe mạnh và ngăn ngừa bệnh tật vì họ đang ngày càng quan tâm đến sức khỏe của bản thân (Kailasapathy, 2009). Điều này giải thích lý do các sản phẩm probiotic được sử dụng ngày càng rộng rãi. Probiotic bắt nguồn từ ngôn ngữ Hy Lạp có nghĩa là vì sự sống và được định nghĩa là '' các vi sinh vật sống mà có lợi ảnh hưởng đến sức khỏe của vật chủ bằng cách cải thiện sự cân bằng vi khuẩn '' (Fuller, 1989). Gần đây hơn, probiotics đã được định nghĩa là '' các vi sinh vật sống mà, khi được dùng với số lượng phù hợp, mang lại lợi ích sức khỏe trên vật chủ '' (FAO / WHO, 2002) [8]. Thực phẩm chứa probiotic phải chứa ít nhất 106 tế bào/g hay 106 tế bào/ml, tại thời điểm tiêu thụ để tạo ra lợi ích trị liệu (Shah, 2002). Một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tồn tại của probiotic bao gồm nhiệt độ, pH, nồng độ acid lactic và acetic và các điều kiện chế biến [52]. Với những định nghĩa mang tính chất lý thuyết này, câu hỏi được đặt ra là liệu một vi sinh vật có được xem xét là probiotic hay không [69]. Vài giới hạn đã được đưa ra, Havenarr và cộng sự (1992) cho rằng để xác định một loài vi sinh vật có phải là probiotic hay không cần dựa vào các yếu tố sau: độ an toàn cho vật chủ, khả năng chống lại acid dạ dày, dịch tuyến tụy, khả năng bám dính vào tế bào thành ruột, hoạt tính kháng khuẩn, khả năng ức chế sự bám dính của vi khuẩn gây bệnh, khả năng chống lại chất kháng sinh, chịu được phụ gia thực phẩm và ổn định trong chất nền của thực phẩm [32]. Nhiều chủng probiotic đã được nghiên cứu về hiệu quả lâm sàng, bao gồm: Lactobacillus, Bifidobacteria, Streptococci, clostridia và chủng nấm: Saccharomyces boulardii (S. boulardii), S. cerevisiae, và Monascus purpureus [19], [26], [49]. Probotics được sử dụng trong thực phẩm là chủng có khả năng sống sót trong đường tiêu hóa, chúng phải kháng được axit dạ dày và dịch mật để đến được ruột non hổ trợ chức năng miễn dịch và phải an toàn khi sử dụng. Trong ngành công nghiệp thực phẩm, một số lượng lớn các sản phẩm probiotic được sản xuất ở dạng sữa, sữa chua uống và đông lạnh, các loại pho mát probiotic, kem, phết bơ sữa và các sản phẩm lên men đậu nành [28]. 1
12. 1.1.2. Vai trò của probiotic Probiotic có tác dụng cải thiện sức khỏe đường ruột, tăng cường hệ thống miễn dịch, tổng hợp và tăng cường hoạt tính sinh học của dinh dưỡng, giảm đi triệu chứng không dung nạp lactose và các triệu chứng dị ứng ở một số cơ thể nhạy cảm, đồng thời giảm nguy cơ mắc bệnh ung thư. Đường tiêu hóa không chỉ hấp thụ các chất dinh dưỡng mà còn đóng vai trò quan trọng như là cơ quan miễn dịch lớn nhất trong cơ thể người. Do đó, nó là hệ thống bảo vệ và là hàng rào quan trọng chống lại các tác nhân gây bệnh xâm nhiễm. Thêm vào các cơ chế bảo vệ nói chung, hệ thống miễn dịch, với các phản ứng đặc hiệu và không đặc hiệu, giúp chống lại các vi sinh vật gây bệnh [36]. Cơ chế hoạt động của probiotics: Cơ chế hoạt động của probiotic vẫn chưa tìm hiểu rõ nhưng được giải thích một cách tổng quát là nhờ vào khả năng cạnh tranh nơi cư trú [27]. Khả năng cạnh tranh nơi cư trú được mô tả là một hiện tượng nhờ vào vi khuẩn kị khí giới hạn số lượng bám dính lên đường ruột của các vi khuẩn có tiềm năng gây bệnh (thường là vi khuẩn hiếu khí) [68]. Oelschlaeger, (2010) báo cáo rằng cơ chế hoạt động của probiotic có thể phân thành ba cơ chế sau: 1. Probiotic có thể tham gia vào hàng rào miễn dịch của tế bào vật chủ tự nhiên cũng như đáp ứng miễn dịch. Cơ chế này gần như đóng vai trò quan trọng nhất trong ngăn chặn và điều trị các bệnh do nhiễm trùng đường ruột cũng như các bệnh viêm đường ruột mãn tính. Điều này cũng có ý nghĩa quan trọng đối với các tế bào ung thư được điều trị bằng xạ trị. 2. Probiotic cũng có thể tác động trực tiếp lên các vi khuẩn khác bao gồm vi khuẩn hội sinh (một bên có lợi bên còn lại không có lợi cũng không có hại) và vi khuẩn gây bệnh. Cơ chế này đóng vai trò quan trọng trong nhiều trường hợp ngăn chặn và điều trị các bệnh nhiễm trùng, giúp ổn định cân bằng hệ sinh vật đường ruột. 3. Cuối cùng, hoạt động sống của probiotic cũng có thể tác động lên các chất độc và sản phẩm trao đổi chất của tế bào vật chủ như muối mật, thành phần thực phẩm, kết quả là chất độc bị bất hoạt, các thành phần thực phẩm trong đường ruột vật chủ được phân giải [55]. 2
13. 1.2. Nấm men Sacchromyces boulardii S. boulardii được phát hiện bởi một nhà vi sinh học người Pháp, Henri boulard vào năm 1920 khi ông còn ở Đông Dương tìm kiếm giống mới của nấm men có thể được sử dụng trong quá trình lên men. Vào thời điểm đó dịch tả bùng phát, ông nhận thấy một sô người uống một loại trà đặc biệt không bị bệnh. Loại trà này làm từ vỏ vải thiều và măng cụt, và ông đã cô lập các chất trên và đặt tên nó là Sacchromyces boulardii [50]. Tế bào có dạng hình tròn, bầu dục, sinh sản bằng hình thức này chồi và tạo bào tử túi, hô hấp hiếu khí. Hình 1.1. Tế bào S. boulardii quan sát dưới kính hiển vi (Nguồn: probooticsdb.com) S. boulardii là nấm men tồn tại trong đường tiêu hóa, nhiệt độ tối ưu của nó là 370C, cả in vitro và in vivo, kháng axít dạ dày và sự phân giải protein, nó ức chế sự tăng trưởng của một số tác nhân gây bệnh của vi sinh vật. S.boulardii thuộc nhóm tế bào nhân thực do đó nó khác với probiotics của vi khuẩn nhân sơ [18]. 3
14. Bảng 1.1. Một số đặc điểm khác biệt chính giữa vi khuẩn và nấm men và ứng dụng probiotic Đặc điểm Vi khuẩn Nấm men Ý nghĩa probiotic Số lượng hiện diện 99% <1% trong ruột người Kích thước tế bào 1μm 10μm Kháng stearic Đáp ứng miễn dịch qua Peptidoglycan TLRs, chất nhận lectin Chitin, Mannose Thành tế bào LPS (Gram âm) (PPM, PLM), glucan LTA (Gram dương) Điều kiện phát triển tối thích pH 6.5 – 7.5 4.5 – 6.5 Có trung tâm hoạt động khác nhau trong đường Nhiệt độ (0C) 10 – 80 20 - 30 ruột Khả năng chống kháng Không Có An toàn khi kết hợp với sinh các giải pháp trị liệu kháng sinh Truyền vật liệu gen Có Không LPS: lipolysaccharide LTA: lipoteichoic acid PPM: phosphopeptidimannan LPM: phospholipomannan TLR: Toll – like receptor – thụ thể giống Toll chống lại nhiễm trùng. Cơ chế hoạt động của S. boulardii có thể phân thành 3 cơ chế chủ yếu: hoạt động kháng khuẩn, hoạt động dinh dưỡng và điều hòa miễn dịch [5]. Trong đường ruột, S. boulardii thể hiện hoạt động kháng khuẩn của mình bao gồm ba hoạt động chính: tác động trực tiếp kháng độc tố, kìm hãm sự phát triển và lây nhiễm của các mầm bệnh [5]. Hoạt động kháng độc tố của S. boulardii chủ yếu dựa vào chuỗi peptides ngắn do chúng tạo ra. Một enzyme serine protease 54kDa có khả năng kìm hãm nội độc tố và hoạt động ngăn cản sự phân bào của Clostridium difficile bằng việc phân giải độc tố A và B và vùng nhận độc tố A trên bề mặt 4
15. tế bào đường ruột [14, 15]. Bên cạnh đó nó cũng sản sinh ra protein 120kDa, protein này không có khả năng phân giải protein nhưng có hoạt tính cạnh tranh đặc biệt với độc tố tiết ra của V. cholera làm giảm cAMP (adenosin monophosphate vòng) trong tế bào hấp thụ đường ruột [6, 20]. Cuối cùng S. boulardii tạo ra enzyme phosphatase có khả năng phân giải nội độc tố (như lipopolysaccharide của E. coli 055B5) và bất hoạt những tác động có hại của nó [10]. Trong thí nghiệm in vitro, S. boulardii kiềm hãm sự bám dính của C. albicans lên tế bào biểu mô, tác động được quan sát với dịch chiết của S. boulardii [47]. Nghiên cứu cho thấy rằng acid capric, sản phẩm trao đổi chất của S. boulardii có chức năng kiềm hãm sự tạo sợi và bám dính, tạo màng sinh học của C. albicans [48]. Ngược lại với kết quả của một nghiên cứu gần đây đối với động vật gặm nhấm thấy rằng S. boulardii truyền qua đường miệng không ngăn chặn sự bám dính của C. albicans [64]. S.boulardii giúp động vật hay bệnh nhân bị tiêu chảy chống sốc, lấy lại cân bằng cho cơ thể rất nhanh. Thường thì hệ vi sinh vật đường ruột thiết lập lại hệ thống rất nhanh và S.boulardii không gây ảnh hưởng gì đến cấu tạo cơ thể những vi sinh vật trong cơ thể con người [4]. Điều này thúc đẩy quá trình tạo ra các chuỗi acid béo ngắn mạch như butyrate [65]. Những chuỗi acid béo này có vai trò quan trọng trong việc thúc đẩy sự phát triển của enterocytes, sự hấp thu chất lỏng, tăng cường khả năng miễn dịch, chống lại khả năng bị viêm, sự phát triển của neuron ruột [9]. Trong nghiên cứu ở những người thiếu sucrase – isomaltase, S.boulardii thúc đẩy hoạt động của enzyme sucrase lên cao đủ cho cơ thể cần [11]. Chất độc của Clostridium difficile và vi khuẩn gây bệnh (như độc tố của E.coli) thúc đẩy sự sưng viêm. S.boulardii ngăn chặn MAP kinase và hoạt động chuyển hóa theo con đường NF-kB giúp làm giảm các triệu chứng bệnh tiêu chảy. Những nghiên cứu gần đây cho rằng, S.boulardii có khả năng tiết ra môi trường chất hạn chế sự bám dính của lymphocytes lên màng trong tế bào. Điều này đã đánh dấu sự thúc đẩy quá trình sản xuất IgA và đặc biệt IgG chống chất độc A và B của C.difficile [21]. 1.3. Kĩ thuật bao gói 1.3.1. Một số khái niệm Bao gói (Encapsulation) được định nghĩa là một quá trình nhốt một chất này trong một chất khác, tạo thành hạt có kích thước nanometer (nanoencapsulation), micrometer (microencapsulation) hoặc milimet [45]. Cố định (immobilization) và bao gói (Encapsulation) là các định nghĩa được dùng thay thế cho nhau trong các nghiên cứu được công bố. Bao gói là quá trình hình thành một lớp phủ liên tục xung quanh một ma trận bên trong nó, còn cố định thì đề cập đến việc nhốt 5
16. tế bào trong một ma trận, một phần nhỏ vật liệu cố định chỉ tiếp xúc với bề mặt thì trường hợp này không được coi là bao gói [40]. Trong mọi trường hợp, vi khuẩn probiotic phải duy trì sự sống, từ khi được tiêu thụ cho đến khi tiêu hóa hết trong ruột. Đây là khó khăn vì các vi khuẩn phải chịu độ pH axit rất thấp ở đường tiêu hóa. Bao gói vi khuẩn probiotic là một sự lựa chọn tốt để bảo vệ cho tế bào sống tiếp xúc với một môi trường bất lợi [45]. Bao gói có xu hướng ổn định tế bào, có khả năng tăng cường khả năng tồn tại và ổn định của chúng trong quá trình sản xuất, lưu trữ và xử lý [38]. Theo Parra-Huertas (2010), bao gói cũng giúp nguyên liệu thực phẩm để chống lại điều kiện chế biến và đóng gói, cải thiện hương vị, mùi thơm, tính ổn định, giá trị dinh dưỡng [45]. Hệ vi sinh vật bao gói được phóng thích ra môi trường bên ngoài nhờ vào các tác nhân: do thay đổi pH, áp suất cơ học, tác dụng nhiệt xử lý (nhiệt độ nóng hoặc nhiệt lạnh), hoạt động enzyme, áp suất thẩm thấu, một số hợp chất hóa học và thời gian lưu trữ [53]. Phân loại viên nang bao gói (Microcapsules): a) Viên nang có kích thước Micro/Nano: Viên nang siêu nhỏ có kích thước từ một micron (một phần nghìn của một mm) đến vài mm. Một số nang siêu nhỏ có đường kính trong khoảng nanomet được gọi là nanocapsules [60]. b) Hình thái viên nang (Microcapsules): hình thái của các cấu trúc bên trong của một hạt vi gói phụ thuộc phần lớn vào vật liệu màng và phương pháp vi gói. Hình thái viên nang gồm hạt một nhân (monocore), nhiều nhân (polycore) và kiểu mạng lưới (matrix) được thể hiện như hình [60]. Hình 1.2. Phân loại hạt vi bao theo hình thái 6
17. 1.3.2. Vật liệu bao gói Các vấn đề liên quan đến việc lựa chọn nguyên liệu cho bao gói probiotics là: (a) tính chất hóa lý (thành phần hóa học, hình thái, độ bền cơ học, độ ổn định trong dịch dạ dày và ruột; (b) khảo nghiệm chất độc;(c) các quy trình sản xuất và khử trùng [38]. Việc lựa chọn các vật liệu để tạo lớp phủ bao gói cần phù hợp là rất quan trọng để vệ hiệu quả của probiotics [70]. Các vật liệu sinh học được sử dụng để đóng gói chế phẩm sinh học bao gồm các polyme tự nhiên và polyme tổng hợp [30, 38]. Vật liệu sinh học là các đại phân tử vô cơ hay hữu cơ, bao gồm các chuỗi lặp đi lặp lại của các đơn phân được liên kết bằng liên kết hóa trị. Cấu trúc hoá học và cấu tạo của chuỗi monomer cho chúng chức năng cụ thể như khả năng tạo gel [61, 38]. Một số vật liệu dùng cho quá trình bao gói: Polysaccharide: Tinh bột, sodium alginate, carrageenan, agar, gum arabic, chitosan, dextrans, và cellulose (ethyl cellulose, acetyl-cellulose, methyl-cellulose, carboxymethyl cellulose, nitrocellulose) là vật liệu chính dùng cho bao gói. Trong các polysaccharide thì sodium alginate là vật liệu phổ biến nhất được sử dụng, tương thích với hầu như tất cả các phương pháp đóng gói, và thường được sử dụng kết hợp với các thành phần khác [45]. Sodium alginate là một polymer tuyến tính của cấu trúc không đồng nhất bao gồm hai đơn vị monosaccharide: axit α-L-guluronic (G) và axit β-D- mannuronic (M) được liên kết bởi β (1-4) glycosizit [45], có lợi ích là không độc hại cho các tế bào được cố định và là một chất phụ gia thực phẩm được chấp nhận. Tuy nhiên, hạt alginate không kháng axit và độ bền cơ học giảm trong quá trình lên men lactic [13]. Nhiệt độ hòa tan alginate trong nước là trong khoảng 600C đến 800C [38] Sodium alginate được sử dụng rộng rãi như một chất tạo gel, do khả năng tạo thành hydrogel với các cation hóa trị hai, như Ca2+, Ba2+ hoặc Sr2+ trong điều kiện ôn hòa. Các hydrogel được hình thành bởi liên kết axit guluronic với các cation, kết quả hình thành một mạng lưới ba chiều [45]. Hòa tan alginate vào nước thì chúng sẽ ngậm nước, tạo ra dung dịch nhớt. Ion canxi liên kết với alginate tạo cầu nối giữa các phân tử dẫn đến tăng trọng lượng phân tử. Độ nhớt của alginate phụ thuộc nhiều yếu tố như: khối lượng phân tử, pH dung dịch, tỉ lệ ion muối, nguồn tảo, nhiệt độ, quá trình lưu trữ. Dung dịch alginate tạo thành gel khi cho dung dịch alginate vào dung dịch có chứa ion Ca2+ nhờ tương tác tĩnh điện qua cầu calcium. Khi hạt vi 7
18. bao đạt trong môi trường muối có chứa ion Na+, ion này sẽ trao đổi với io Ca2+ làm cho lực đẩy tĩnh điện giữa các điện tích âm –COO- tăng nên dẫn đến sự dãn mạch và trương nở. Hình 1.3. Cấu tạo alginate (Nguồn: www1.lsbu.ac.uk) Hình 1.4. Quá trình hình thành gel khi có mặt ion Ca2+ (Nguồn: journal.frontiersin.org) 8
19. Chitosan là một polysaccharide tích điện dương. Mức độ hòa tan nó phụ thuộc vào pH. Nó không tan trong nước có pH cao hơn 5.4. Điều này sẽ hạn chế việc đưa đầy đủ các vật liệu sinh học vào ruột khi mà pH lớn hơn 5.4 [38]. Tuy nhiên, các nghiên cứu đã cho thấy hiệu quả của chitosan là một tác nhân phủ của hạt gel alginate [2, 38, 43]. Sử dụng chitosan ở nồng độ 1% w / v để bao gói dạng ép đùn chủng Lactobacillus acidophilus 547, Bifidobacterium bifidum ATCC 1994, và L. casei 01, dẫn đến khả năng tồn tại lớn hơn cho L. acidophilus và bảo vệ tốt nhất các tế bào L. casei [38]. Cellulose acetate phthalate (CAP) thì không hòa tan ở pH dưới 5 nhưng hòa tan ở pH lớn hơn 6 [3, 42]. Điều cần thiết cho bao gói probiotics vì các vật liệu sinh học không phải hòa tan vào dạ dày. CAP được sử dụng rộng rãi như là một tác nhân phủ [38]. Tinh bột là một polysaccharide gồm các đơn vị α-D-glucose liên kết bởi glycosizit [45]. Nó bao gồm amylose và amylopectin. Các amylose là chuỗi tuyến tính và xoắn của polymer glucose, trong khi amylopectin là chuỗi phân nhánh cao.Một hỗn hợp của alginate và tinh bột biến tính được sử dụng để đóng gói các probiotics L. acidophilus và B. lactics bằng nhũ tương để kết hợp chúng thành sữa chua. Chế phẩm sinh học cho thấy khả năng tồn tại của vi khuẩn được bao gói lớn hơn vi khuẩn không được bao gói khi lưu trữ. Một phân tích cảm thấy rằng việc sử dụng các tế bào đóng gói trong sữa chua không làm thay đổi màu sắc, độ chua hoặc tính hương vị [45]. Carrageenan là polymer cấu trúc tuyến tính gồm các đơn vị D-galactose liên kết bởi α (1-3) và β (1-4). Gel carrageenan được tạo ra bởi sự thay đổi nhiệt độ. Nhiệt độ tăng (60- 80°C) là cần thiết để hòa tan nó và đặc lại xảy ra bằng cách làm lạnh đến nhiệt độ phòng [46, 51]. Carrageenan thường được sử dụng làm phụ gia thực phẩm; an toàn của nó đã được chấp thuận bởi một số cơ quan chính phủ bao gồm FDA, Codex và FAO / WHO doanh phụ gia thực phẩm [63]. Việc sử dụng carrageenan trong vi bao probiotics là do năng lực của nó để tạo thành gel bao bọc các tế bào [38]. Oligosaccharides Syrup ngô, sucrose và maltodextrin được sử dụng phổ biến. 9
20. Maltodextrins là một nhóm các hợp chất có nguồn gốc từ quá trình thủy phân axit hoặc enzyme tinh bột (Chronakis, 1998; Wang và Wang, 2000; Dokic, 2004; Zheng, 2007) có chứa các đơn vị hình thành là glucose liên kết α-1,4-glucoside với đương lượng dextrose (DE) nhỏ hơn 20 (Zheng, 2007) [16]. Đương lượng Dextrose Equivalent (DE) là đại lượng chỉ khả năng khử đối với chuẩn là 100% ở đường glucose (dextrose), hay số gam tương đương D – glucose trong 100g hạt của sản phẩm. Maltodextrin cải thiện chất lượng của các sản phẩm bị mất nước, giảm độ dính và tăng tính ổn định của sản phẩm (Roos và Karel, 1991). Chức năng này đã được quy cho khả năng của maltodextrin để hấp thụ nước tạo thành một rào cản chống ẩm bảo vệ trên bề mặt của các hạt hút ẩm, (Chronakis, 1998; Avaltroni, 2004; Phanindrakumar, 2005; Gabas, 2007; Tong, 2008; TELIS và Martínez-Navarrete, 2009) [16]. Một nghiên cứu về hiệu quả và chất lượng của vi bao L. casei bằng kĩ thuật sấy phun sử dụng maltodextrin và dịch trích rau quả, kết quả cho thấy việc bổ sung maltodextrin cho chất lượng bột tốt hơn, độ giảm của tế bào sau khi sấy thấp hơn đáng kể so với trường hợp không bổ sung maltodextrin.[33] Khi trộn một lượng maltodextrin thích hợp và trehalose để vi bao L. paracasei bằng kĩ thuật sấy phun lạnh, kết quả cho thấy số lượng sống sót cao hơn so với tế bào tự do bởi vì áp suất thẩm thấu tăng [74]. Proteins Gluten, casein, whey protein, albumin, là những protein thường được sử dụng làm vật liệu đóng gói. Picot và Lacroix (2004) đã sử dụng whey protein sữa như một loại vật liệu để đóng gói Bifidobacterium breve và Bifidobacterium longum R070 R023 [45]. Whey protein có thể làm tăng khả năng chịu đựng của các vi khuẩn ở pH có tính axit, do đó whey protein có một tiềm năng lớn để được sử dụng trong các chế phẩm sinh học và các sản phẩm mà vi khuẩn cần phải tồn tại khi đến đường tiêu hóa (Picot và Lacroix, 2004). Các whey protein đã được sử dụng để đóng gói L. rhamnosus bằng việc phun ra trong một môi trường mô phỏng tiêu hóa, các viên nang protein hình thành một ma trận để bảo vệ L. rhamnosus trong pH có tính axit và có tác dụng điều chỉnh sự phóng thích tế bào tại thời điểm mong muốn [45]. Ngoài ra nó có thể dễ dàng trộn với polysaccharides tích điện âm như alginate, carrageenan hoặc pectin [24, 25]. Gelatin thường được sử dụng trong các ngành công nghiệp thực phẩm và dược phẩm Gelatin là một protein có nguồn gốc từ collagen bị biến tính có chứa hàm lượng cao của 10
21. hydroxyproline, proline và glycin. Gelatin được chọn làm vật liệu bao gói vì có khả năng tạo màng tốt và không gây độc hại [76]. Gelatin có một cấu trúc rất đặc biệt và tính năng linh hoạt và tạo thành một dung dịch có độ nhớt cao trong nước[62], không tạo thành hạt nhưng vẫn có thể được coi như vật chất cho microencapsulation [38]. Lipids Các loại sáp, parafin, diglycerides, monoglycerides, chất béo, axit stearic, triestearins và các loại dầu được sử dụng chủ yếu. Các kết quả nghiên cứu cũng cho thấy khả năng tồn tại của vi khuẩn bao gói được khả sát trong điều kiên mô phỏng đường ruột tốt hơn là vi khuẩn tự do không được bao gói (Hou và các cộng sự, 2003) [45]. 1.3.3. Phương pháp bao gói Việc bao gói các chế phẩm sinh học được thực hiện bằng nhiều phương pháp khác nhau. Mục đích chính của những kỹ thuật này là để bảo vệ cho tế bào vi khuẩn dưới tác động của các điều kiện môi trường bất lợi và mục tiêu là đưa tế bào sống đến đường tiêu hóa. Có ba giai đoạn chính để thự hiện quá trình bao gói: (i) kết hợp các thành phần vào một dung dịch bằng cách pha trộn hoặc khuếch tán, tạo nên nhân của hạt bao gói; (ii) thực hiện các hoạt động cơ học như phun hoặc nhũ tương hóa, hình thành các giọt nước nhỏ; (iii) ổn định sản phẩm thông qua lớp phủ, theo sau là một số các quá trình vật lý hoặc hóa học [70]. Các kỹ thuật thường được sử dụng nhất trong bao gói probiotics là nhũ tương, ép và sấy phun. Kích thước của các viên nang sau khi bao gói thu được là rất quan trọng vì nó ảnh hưởng đến các tính chất cảm quan của thực phẩm. Nhiều thiết bị hiện có sẵn cho bao gói dựa trên phương pháp nhũ tương và ép đùn nhưng phương pháp này không thể tạo ra một lượng lớn đồng thời các hạt có kích thước micro hoặc nano. Sự ra đời của phương pháp sấy phun đã dẫn đến việc tạo ra các hạt và viên nang với số lượng lớn cho các ứng dụng công nghiệp [70]. Phương pháp sấy Trong thực tế, hầu hết các kỹ thuật bao gói sử dụng các quá trình sấy để biến sản phẩm thành dạng khô ổn định hơn. Ví dụ, quá trình sấy phun được thực hiện với các loại dầu thực vật và dầu cá giàu omega được nhũ hoá với maltodextrin và cô đặc whey protein (Jafari, 2008; Turchiuli, 2005). Sấy là một kỹ thuật đóng gói được sử dụng khi các thành phần hoạt chất được hòa tan trong chất tạo màng bao, tạo thành nhũ tương hoặc huyền phù. Gelatin, 11
22. S K L 0 0 2 1 5 4