Khóa luận Khảo sát khả năng sống sót của saccharomyces boulardii được bao gói bằng gel alginate có bổ sung gelatin trong môi trường giả lập dạ dày và dịch ruột (Phần 1)

Nội dung text: Khóa luận Khảo sát khả năng sống sót của saccharomyces boulardii được bao gói bằng gel alginate có bổ sung gelatin trong môi trường giả lập dạ dày và dịch ruột (Phần 1)

1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT TP.HCM KHOA CÔNG NGHỆ HÓA VÀ THỰC PHẨM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SỐNG SÓT CỦA SACCHAROMYCES BOULARDII ĐƯỢC BAO GÓI BẰNG GEL ALGINATE CÓ BỔ SUNG GELATIN TRONG MÔI TRƯỜNG GIẢ LẬP DẠ DÀY VÀ DỊCH RUỘT GVHD: TS. TRỊNH KHÁNH SƠN SVTH: ĐOÀN THỊ BÍCH THẢO MSSV: 11116060 S K L 0 0 3 9 5 7 Tp. Hồ Chí Minh, tháng 7/2015
2. TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC VÀ THỰC PHẨM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP MÃ SỐ: 2015-11116060 KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SỐNG SÓT CỦA SACCHAROMYCES BOULARDII ĐƯỢC BAO GÓI BẰNG GEL ALGINATE CÓ BỔ SUNG GELATIN TRONG MÔI TRƯỜNG GIẢ LẬP DẠ DÀY VÀ DỊCH RUỘT GVHD: TS. TRỊNH KHÁNH SƠN SVTH: ĐOÀN THỊ BÍCH THẢO MSSV: 11116060 THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 07/2015
3. TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM KỸ THUẬT THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC VÀ THỰC PHẨM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM NHIỆM VỤ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Họ và tên sinh viên: Đoàn Thị Bích Thảo Ngành: Công nghệ Thực phẩm 1. Tên khóa luận: Khảo sát khả năng của Saccharomyces boulardii đƣợc bao gói bằng gel alginate có bổ sung gelatin trong môi trƣờng giả lập dạ dày và dịch ruột 2. Nhiệm vụ của khóa luận: Khảo sát khả năng của Saccharomyces boulardii đƣợc bao gói bằng gel alginate có bổ sung gelatin trong môi trƣờng giả lập dạ dày và dịch ruột. 3. Ngày giao nhiệm vụ khóa luận: 15/01/2015 4. Ngày hoàn thành khóa luận: 16/07/2015 5. Họ tên ngƣời hƣớng dẫn 1: TS. Trịnh Khánh Sơn Phần hƣớng dẫn: toàn bộ khóa luận Nội dung và yêu cầu khóa luận tốt nghiệp đã đƣợc thông qua bởi Trƣởng Bộ môn Công nghệ Thực phẩm Tp.HCM, ngày 16 tháng 07 năm 2015 Trƣởng Bộ môn Ngƣời hƣớng dẫn chính (Ký và ghi rõ họ tên) (Ký và ghi rõ họ tên) i
4. LỜI CÁM ƠN Lời đầu tiên, em xin chân thành cám ơn các thầy các cô trƣờng Đại học Sƣ Phạm Kỹ Thuật TP.HCM đặc biệt là các thầy cô Khoa Công nghệ hóa học & thực phẩm đã truyền đạt kiến thức cho chúng em trong suốt những năm học Đại học và tạo điều kiện cho chúng em hoàn thành đồ án tốt nghiệp. Đặc biệt em xin bày tỏ lời biết ơn sâu sắc đến thầy TS. Trịnh Khánh Sơn đã hƣớng dẫn em hoàn luận văn này. Em xin gởi lời cám ơn đến thầy, thầy đã quan tâm chỉ dẫn em hoàn thành luận văn, khi làm việc với thầy em không chỉ mở mang thêm đƣợc nhiều kiến thức mà còn học đƣợc nhiều thứ về tinh thần trách nhiệm trong công việc và những bài học về cuộc sống mà thầy chia sẻ với cả nhóm. Nhờ vậy đã giúp em trong thời gian ngắn và đầy khó khăn có thể hoàn thành luận văn đúng thời hạn. Xin gởi đến lời cảm ơn đến tập thể lớp 11116, đã luôn quan tâm và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua. Và cuối cùng xin chân thành cám ơn gia đình đã luôn ủng hộ, động viên tôi trong suốt quãng thời gian qua. Dù cố gắng nhƣng do thời gian có hạn và thiếu nhiều kinh nghiệm thực tế trong qúa trình thực hiện luận văn không tránh khỏi những sai sót, rất mong nhận đƣợc ý kiến đóng góp của các thầy các cô để giúp cho bài luận văn thêm hoàn thiện. ii
5. LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan toàn bộ nội dung đƣợc trình bày trong khóa luận tốt nghiệp là của riêng tôi. Tôi xin cam đoan các nội dung đƣợc tham khảo trong khóa luận tốt nghiệp đã đƣợc trích dẫn chính xác và đầy đủ theo qui định. Ngày 16 tháng 7 năm 2015 Kí tên Đoàn Thị Bích Thảo iii
6. MỤC LỤC NHIỆM VỤ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP i LỜI CÁM ƠN ii LỜI CAM ĐOAN iii MỤC LỤC iv DANH MỤC HÌNH vi DANH MỤC BẢNG BIỂU vii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT viii TÓM TẮT LUẬN VĂN ix CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1 1.1. Hệ vi sinh vật trong dạ dày – ruột ở ngƣời 1 1.2. Probiotic và nấm men Saccharomyces boulardii 2 1.2.1. Định nghĩa Probiotic 2 1.2.4. Sự tồn tại và sống sót của Probiotic trong dạ dày - ruột 4 1.2.5. Nấm men Saccharomyces boulardii và vai trò đối với hệ tiêu hóa 4 1.3. Kĩ thuật vi bao 7 1.3.1. Định nghĩa bao gói (encapsulation) 7 1.3.2. Cấu trúc hạt trong quá trình vi bao 7 1.3.3. Nguyên liệu để vi bao 7 1.3.4. Vai trò của vi bao 11 1.3.5. Các phƣơng pháp vi bao 11 1.4. Các nghiên cứu trong và ngoài nƣớc 16 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 20 2.1. Địa điểm thực hiện đồ án 20 2.2. Vật liệu sử dụng cho nghiên cứu 20 2.2.1. Vật liệu 20 2.2.2. Chủng vi sinh vật sử dụng và môi trƣờng 20 2.3. Phƣơng pháp phân tích thu nhận kết quả 20 2.3.1. Phân tích vi sinh 20 2.3.2. Phân tích hóa sinh 20 2.3.3. Phƣơng pháp thống kê và xử lí số liệu 21 2.4.1. Quá trình chuẩn bị 21 iv
7. 2.4.2. Khảo sát đặc tính sinh học 22 2.4.3. Khảo sát đƣờng cong sinh trƣởng của S.Boulardii 22 2.4.4. Vi bao S.Boulardii với Natri Alginate có bổ sung gelatin 22 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 25 3.1. Kiểm tra đặc tính sinh học của S.boulardii 25 3.1.1. Quan sát hình thái S.boulardii 25 3.1.2. Khảo sát đƣờng cong sinh trƣởng của S.boulardii 26 3.2. Vi bao S.boulardii bằng Natri alginate có bổ sung gelatin (G) 27 3.2.1. Cấu trúc hạt vi bao 27 3.2.2. Mật độ tinh thể của hạt bao gói 29 3.3. Đánh giá khả năng tồn tại của S. boulardii trong môi trƣờng giả lập dịch dạ dày và môi trƣờng giả lập dịch ruột. 31 3.3.1. Đánh giá khả năng tồn tại của S. boulardii trong môi trƣờng giả lập dịch dạ dày 31 3.3.2. Đáng giá khả năng tồn tại của S. boulardii trong môi trƣờng dịch ruột 34 3.4. Khảo sát mật độ tế bào theo thời gian lƣu trữ của hạt bao gói 36 3.5. Khảo sát khả năng sống sót của S. boularddi trong môi trƣờng giả lập dạ dày và dịch ruột sau 12 ngày lƣu trữ của hạt bao gói 40 3.5.1. Khảo sát khả năng sống sót của S. boularddi trong môi trƣờng giả lập dạ dày sau 12 ngày lƣu trữ của hạt bao gói 40 3.5.2. Khảo sát khả năng sống sót của S. boularddi trong môi trƣờng giả lập dịch ruột sau 12 ngày lƣu trữ của hạt bao gói 42 CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO 45 PHỤ LỤC 50 v
8. DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. sơ đồ tóm tắt thay đổi các thành phần của hệ vi sinh vật đƣờng ruột qua các giai đoạn khác nhau 1 Hình 1.2. Hệ vi sinh vật trong đƣờng ruột 2 Hình 1.4. Cấu trúc alginate và quá trình hình thành gel khi có mặt ion Ca2+ 8 Hình 1.5. Quá trình vi bao bằng phƣơng pháp sấy phun 13 Hình 1.6. Sơ đồ quá trình vi bao bằng kỹ thuật nhũ tƣơng 14 Hình 1.7. Quá trình tạo hạt vi bao bằng kỹ thuật ép đùn dùng kim tiêm 15 Hình 1.8. Bề mặt vi bao của mẫu khô (A) và hạt vi bao khô nghiền (B) 18 Hình 3.1: A-Tế bào S.boulardii, B-Khuẩn lạc S.boulardii 25 Hình 3.2. Hình dạng của hạt bao gói trƣớc sấy (A) và sấy khô (B) 28 Hình 3.3. Cấu trúc tinh thể của mẫu bao gói alginate (A), mẫu bao gói alginate có gelatin (B) và mẫu bao gói alginate có bổ sung vi sinh vật và geletine (C) 29 vi
9. DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1: Một số đặc điểm khác biệt chính giữa vi khuẩn và nấm men và ứng dụng probiotic 6 Bảng 1.2. Tóm tắt các phƣơng pháp bao gói 16 Biểu đồ 3.1. đƣờng cong sinh trƣởng của S.Bouladii trên môi trƣờng Hasnsen 30 Biểu đồ 3.2. Mật độ tế bào S. boulardii sau khi thử dịch giả lập dạ dày theo thời gian 0, 30, 60, 90 và 120 phút . 33 Biểu đồ 3.3. Mật độ tế bào S. boulardii sau khi thử dịch giả lập dạ dày theo thời gian 0, 30, 60, 90 và 120 phút 35 Biểu đồ 3.4: Mật độ tế bào S. boulardii theo thời gian lƣu trữ (0, 3, 6, 9 và 12 ngày) ở 50C (A) và 300C (B) của các mẫu không vi bao, hạt vi bao tƣơi, hạt vi bao sấy và hạt vi bao sấy nghiền 38 Biểu đồ 3.5: mật độ tế bào S. boulardii thử giả lập dạ dày trong 120 phút sau 12 ngày lƣu trữ của mẫu không vi bao, hạt vi bao tƣơi, hạt vi bao khô và hạt vi bao sấy nghiền 41 Biểu đồ 3.6: mật độ tế bào S. boulardii thử giả lập dịch ruột trong 120 phút sau 12 ngày lƣu trữ của mẫu không vi bao, hạt vi bao tƣơi, hạt vi bao sấy và hạt vi bao sấy nghiền .43 vii
10. DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT STT Từ viết tắt Giải thích nghĩa 1 B. Bifidobacteria 2 C. Candida 3 CFU Colony form unit – đơn vị hình thành khuẩn lạc 5 ĐC Mẫu đối chứng 6 T Mẫu hạt tƣơi bổ sung 0.75%w/v 7 S Mẫu hạt sấy khô 8 SN Mẫu hạt sấy khô nghiền 9 E. Escherichia 10 FAO Food and Argiculture Organization – Tổ chức Nông Lƣơng Liên Hiệp Quốc 11 G Gelatin 12 L. Lactobacillus 13 S. Saccharomyces 14 V. Vibrio 15 %w/v Weight/Volume – Khối lƣợng/Thể tích 16 WHO World Health Organization – Tổ chức Y tế thế giới viii
11. TÓM TẮT LUẬN VĂN Vi bao Saccharomyces boulardii bằng alginate kết hợp gelatin thông qua phƣơng pháp nhỏ giọt đem lại khả năng sống sót của nấm men cao hơn so với không vi bao khi thử trên môi trƣờng giả lập dạ dày và dịch ruột trong 0, 30, 60, 90 và 120 phút. Kết quả cho thấy mẫu không vi bao giảm đáng kể sau 120 phút thử môi trƣờng giả lập dạ dày (giảm 3.9 log), môi trƣờng giả lập dịch ruột (giảm 4.1log), mẫu hạt tƣơi, hạt khô và sấy nghiền khi thử thì giảm rất ít ở cả 2 môi trƣờng giả lập. Điển hình là hạt tƣơi giảm 0.5 log và 0.59 log, hạt khô giảm từ 0.3 log và 0.38 log, mẫu sấy nghiền giảm 1.14 log và 1.3 log. Lƣu trữ 4 mẫu sau 12 ngày ở 5 và 30 thì cả 4 mẫu lƣu trữ ở 5 giảm ít hơn so với mẫu lƣu trữu ở 30 . Trong đó mẫu vi bao có bổ sung gelatin giảm ít hơn so với mẫu không vi bao. sau 12 ngày lƣu trữ khả năng sống sót của Saccharomyces boulardii trong môi trƣờng giả lập dạ dày và dịch ruột trong 120 phút kết quả cho thấy những mẫu vi bao giảm ít hơn so với mẫu vi bao. Từ khóa: S. boulardii, gelatin, alginate, vi bao, mật độ tế bào, muối mật, giả lập dạ dày. ix
12. CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Hệ vi sinh vật trong dạ dày – ruột ở ngƣời Hệ tiêu hóa ở ngƣời gồm: dạ dày, ruột non và ruột già. Dạ dày ngƣời có pH trung bình là 2.0-2.5, đây chính là hàng rào hóa học rất tốt chống lại quá trình nhiễm vi sinh vật. Ngƣời ta thấy rằng, lƣợng vi khuẩn ở dạ dày chỉ nằm trong khoảng 104 tế bào/ml dịch ruột. Ruột non gồm: tá tràng (duodenum), hồng tràng (jejunum) và hồi tràng (ilenum). Bên trong tá tràng do pH thấp nên rất ít vi sinh vật tồn tại ở đây. Tuy nhiên khi xuống đến hồi tràng lƣợng vi sinh vật có thể tăng đến 105 – 107 tế bào/ml dịch ruột. Ruột già ngƣời bắt đầu từ manh tràng (cecum), nơi nối với hồi tràng, gắn với kết tràng lên (ascending colon), kết tràng ngang (transverse colon), kết tràng xuống (descending colon), kết tràng xích ma (sigmoid colon) và trực tràng (rectum). Trong kết tràng, vi khuẩn cƣ trú gồm khoảng 50 giống và vài trăm loài khác nhau chúng sử dụng dinh dƣỡng từ quá trình tiêu hóa thức ăn để lên men. Các vi khuẩn hiếu khí tùy ý ở đây sử dụng oxy tạo ra môi trƣờng kị khí trong ruột già. Điều này tạo điều kiện cho vi khuẩn kị khí Clostridium và Bacteroides phát triển và sản sinh các chất kháng khuẩn nhƣ bacteriocin. [25] Nhiều nghiên cứu khoa học trên thế giới đã chỉ ra lƣợng vi sinh vật tồn tại trong ruột ngƣời khoảng 400 loài nhƣng chỉ có 30 – 40 loài tạo thành hệ vi sinh vật đƣờng ruột nuôi cấy đƣợc. Hình 1.1. sơ đồ tóm tắt thay đổi các thành phần của hệ vi sinh vật đƣờng ruột qua các giai đoạn khác nhau 1
13. Hình 1.2. Hệ vi sinh vật trong đƣờng ruột 1.2. Probiotic và nấm men Saccharomyces boulardii 1.2.1. Định nghĩa Probiotic Probiotic là những tế bào vi sinh vật sống mà khi dùng với số lƣợng thích hợp mang lại lợi ích sức khỏe con ngƣời. [15] Theo FAO và WHO (2001), tiêu chuẩn quan trọng nhất để chọn chủng khuẩn probiotic sử dụng dƣới dạng thực phẩm là chủng khuẩn đó phải có khả năng sống sót qua hệ tiêu hóa và phải có khả năng phát triển trong ruột[44]. Điều này có nghĩa là chúng phải kháng đƣợc axít dịch vị dạ dày và dịch mật để tiến đến ruột non hỗ trợ các chức năng về 2
14. tiêu hóa và miễn dịch. Ngoài ra, chúng phải đƣợc chứng minh là an toàn khi sử dụng. Sự an toàn rất quan trọng cho thực phẩm probiotic bởi vì chúng là những vi sinh vật sống và có thể phát triển trong ruột. Không giống nhƣ dƣợc phẩm có thể có độc tính, gây nên những phản ứng phụ và bệnh nhân phải có chỉ định của bác sĩ mới có thể sử dụng, đối với probiotic, ngƣời tiêu thụ không cần lo ngại đến phản ứng phụ sau khi dùng và cũng không cần sự kê toa của bác sĩ. Elie Metchnikoff (1845-1916), nhà khoa học ngƣời Ucraina đầu tiên đƣa ra liệu pháp chữa trị bằng các vi khuẩn lactic. Cùng thời đó, bác sĩ nhi khoa Henry Tissier đã theo dõi những đứa trẻ bị tiêu chảy. Và ông phát hiện ra có những vi khuẩn trong đƣờng ruột có thể hỗ trợ điều trị bệnh tiêu chảy [14]. Elie Metchnikoff và Henry Tissier đã tạo nên tiền đề cho những nghiên cứu Probiotic sau này. Ngày nay, ngoài các sản phẩm probiotic có chứa Bifidobacteria hoặc Lactobacillus thì nấm men Saccharomyces boulardii cũng đƣợc tiêu thụ rộng rãi và phổ biến trên khắp thế giới. 1.2.2. Vai trò của probiotic Probiotic có tác dụng cải thiện sức khỏe đƣờng ruột, tăng cƣờng hệ thống miễn dịch, tổng hợp và tăng cƣờng hoạt tính sinh học của dinh dƣỡng, giảm đi triệu chứng không dung nạp lactose và các triệu chứng dị ứng ở một số cơ thể nhạy cảm, đồng thời giảm nguy cơ mắc bệnh ung thƣ. Đƣờng tiêu hóa không chỉ hấp thụ các chất dinh dƣỡng mà còn đóng vai trò quan trọng nhƣ là cơ quan miễn dịch lớn nhất trong cơ thể ngƣời. Do đó, nó là hệ thống bảo vệ và là hàng rào quan trọng chống lại các tác nhân gây bệnh xâm nhiễm. Thêm vào các cơ chế bảo vệ nói chung, hệ thống miễn dịch, với các phản ứng đặc hiệu và không đặc hiệu, giúp chống lại các vi sinh vật gây bệnh. [16] Số lƣợng tế bào vi sinh vật cƣ trú trong đƣờng tiêu hóa của vật nuôi có thể cao gấp mƣời lần số lƣợng tế bào cấu tạo nên cơ thể chúng (Fonty, 1995). Số lƣợng loài có thể lên tới từ 400-500 (Tannock, 1999). Tuy nhiên, mật độ vi sinh vật ở các đoạn khác nhau của đƣờng tiêu hóa (dạ dày; tá tràng; ruột non và ruột già) ở loài động vật dạ dày đơn rất khác nhau (Jans, 2005). 1.2.3. Cơ chế tác động của Probiotic Oelschlaeger (2010) báo cáo rằng cơ chế hoạt động của probiotic gồm khả năng tham gia vào hàng rào miễn dịch, khả năng tác động trực tiếp lên các vi khuẩn khác và có thể tác động lên các chất độc hay sản phẩm trao đổi chất của tế bào vật chủ. Probiotic có 3
15. thể tham gia vào hàng rào miễn dịch của tế bào vật chủ tự nhiên cũng nhƣ đáp ứng miễn dịch. Cơ chế này gần nhƣ đóng vai trò quan trọng nhất trong ngăn chặn và điều trị các bệnh do nhiễm trùng đƣờng ruột cũng nhƣ các bệnh viêm đƣờng ruột mãn tính. Điều này cũng có ý nghĩa quan trọng đối với các tế bào ung thƣ đƣợc điều trị bằng xạ trị. Ngoài ra, probiotic cũng có thể tác động trực tiếp lên các vi khuẩn khác bao gồm vi khuẩn hội sinh (một bên có lợi bên còn lại không có lợi cũng không có hại) và vi khuẩn gây bệnh. Cơ chế này đóng vai trò quan trọng trong nhiều trƣờng hợp ngăn chặn và điều trị các bệnh nhiễm trùng, giúp ổn định cân bằng hệ sinh vật đƣờng ruột. Bên cạnh đó, hoạt động sống của probiotic cũng có thể tác động lên các chất độc và sản phẩm trao đổi chất của tế bào vật chủ nhƣ muối mật, thành phần thực phẩm, kết quả là chất độc bị bất hoạt, các thành phần thực phẩm trong đƣờng ruột vật chủ đƣợc phân giải [31]. 1.2.4. Sự tồn tại và sống sót của Probiotic trong dạ dày - ruột Trong dạ dày-ruột, sự tồn tại và sống sót của probiotic chủ yếu phụ thuộc vào khả năng chịu axit và nồng độ muối mật, khả năng kết dính trên bề mặt biểu mô ruột và tồn tại trong đƣờng tiêu hóa. Khoang miệng và dạ dày của vật chủ là nơi có môi trƣờng axit pH từ 2-3 và có mặt các enzym tiêu hoá (amylase, protease, lysozyme ). Vì vậy, Probiotic phải chịu đƣợc điều kiện pH thấp thì mới phát huy đƣợc tác dụng của mình trong dạ dày. Trong dạ dày có hai loại muối mật là glycochalate natri và taurocholate natri. Muối mật có chức năng quan trọng trong việc tiêu hóa và hấp thu lipid ở ruột non cũng nhƣ các vitamin tan trong chất béo: A, D, E, K. Khi xuống đến hồi tràng 95% muối mật đƣợc tái hấp thu theo tĩnh mạch chủ trở về gan và đƣợc bài tiết. 5% còn lại đƣợc đào thải theo phân có tác dụng giữ nƣớc trong phân và duy trì nhu động ruột già. Khả năng chịu enzyme tiêu hóa: enzyme tiêu hóa trong đƣờng ruột là một loại enzyme sinh học do cơ thể con ngƣời sinh ra có tác dụng hỗ trợ chuyển hóa các chất dinh dƣỡng trong thức ăn, biến đổi thức ăn thành dạng nhũ tƣơng để mao ruột hấp thu vào máu nuôi dƣỡng cơ thể [26]. 1.2.5. Nấm men Saccharomyces boulardii và vai trò đối với hệ tiêu hóa S. boulardii là một chủng nấm men, đƣợc tìm ra vào năm 1920 bởi nhà vi sinh vật học ngƣời Pháp, Henri Boulard khi ông đang ở Đông Nam Á, Boulard đến đây là để tìm một chủng nấm men mới có thể sử dụng cho quá trình lên men. Cũng trong thời gian này bệnh tiêu chảy do V. Cholera bùng nổ, Boulard nhận thấy những ngƣời uống loại trà đặc biệt, làm từ vỏ ngoài của các loại quả nhiệt đới (vải và măng cụt) thì không mắc bệnh. Cuối cùng, ông đã phân lập thành công tác nhân chịu trách nhiệm cho ngăn ngừa căn bệnh 4
16. này, một chủng nấm men đặc biệt, tên của ông sau đó đƣợc đặt tên cho tên của loài nấm men này “S. boulardii” [27]. Hiện nay S. boulardii là nấm men duy nhất đƣợc sử dụng phổ biến trong lĩnh vực y học. S.boulardii có khả năng lên men đƣờng glucose, saccharose, rafinose, xylose không lên men lactose, manitol, maltose và không hình thành hợp chất phân giải tinh bột. S.boulardii đƣợc xếp vào nhóm đặc biệt nhất trong chủng S.cerevisiae. Bằng những thiết bị hiện đại, ngƣời ta phân biệt S.boulardii bởi đặc tính vật lý, sự trao đổi chất và khả năng chống lại ảnh hƣởng từ vi sinh vật. Trên thị trƣờng hiện đã có rất nhiều sản phẩm thƣơng mại S.boulardii dạng đông khô, hạt vi bao sấy hay chứa trong môi trƣờng lỏng. Chất lƣợng các sản phẩm này cũng khác nhau mặc dù chúng đều công bố chứa ít nhất 109 cfu/mg. [33] Hình 1.3. ảnh chụp Saccharomyces boulardii 5
17. Bảng 1.1: Một số đặc điểm khác biệt chính giữa vi khuẩn và nấm men và ứng dụng probiotic [8] Đặc điểm Vi khuẩn Nấm men Ý nghĩa probiotic Số lƣợng hiện diện 99% <1% trong ruột ngƣời Kích thƣớc tế bào 1μm 10μm Kháng stearic Đáp ứng miễn dịch Peptidoglycan qua TLRs, chất nhận LPS (Gram âm) Chitin, Mannose lectin Thành tế bào LTA (PPM, PLM), glucan (Gram dƣơng) Điều kiện phát triển tối thích pH 6.5 – 7.5 4.5 – 6.5 Có trung tâm hoạt động khác nhau Nhiệt độ (0C) 10 – 80 20 - 30 trong đƣờng ruột Khả năng chống Không Có An toàn khi kết hợp kháng sinh với các giải pháp trị liệu kháng sinh Truyền vật liệu gen Có LPS: lipolysaccharide LTA: lipoteichoic acid PPM: phosphopeptidimannan LPM: phospholipomannan TLR: Toll – like receptor – thụ thể giống Toll chống lại nhiễm trùng. 6
18. 1.3. Kĩ thuật vi bao 1.3.1. Định nghĩa bao gói (encapsulation) Bao gói (encapsulation) đƣợc hiểu là quá trình nhốt một chất vào trong một chất khác, tạo thành hạt ở kích thƣớc nano mét (nanoencapsulation – nano gói), micro mét (microencapsulation – vi bao – vi gói) hoặc milimét [4]. Phân biệt vi bao và cố định (Immobilization): Nhốt tế bào trong mạng lƣới gel alginate là phƣơng pháp phổ biến nhất của việc cố định [25]. Định nghĩa cố định và vi bao có thể đƣợc dùng thay thế cho nhau trong hầu hết các nghiên cứu đƣợc báo cáo. Trong đó vi bao là quá trình hình thành một lớp màng liên tục vi bao nhƣ một mạng lƣới bao bọc phần nhân bên trong, cố định liên quan đến nhốt vật liệu trong nó hoặc thông qua hình thành một mạng lƣới. Mộ tỷ lệ nhỏ vật liệu cố định chỉ ở bề mặt, trƣờng hợp này thì không đƣợc gọi là vi bao [20] Vi bao (Microencapsulation): đƣợc hiểu là quá trình tạo thành một lớp màng mỏng, một lớp vỏ bọc vi bao (shell) hoàn toàn phần vật chất có hoạt tính bên trong (core material) nhằm cố định, bảo vệ, điều khiển sự giải phóng, cấu trúc và chức năng của nó [20]. Hạt vi bao gồm một lớp màng bán thấm, hình cầu dày hoặc mỏng bao xung quanh phần lõi (hạt rắn hoặc lỏng) với đƣờng kính khác nhau từ vài micromet đến vài milimet đƣợc giải phóng tại thời điểm phù hợp với mục đích ứng dụng [35]. 1.3.2. Cấu trúc hạt trong quá trình vi bao Mỗi hạt vi nang gồm lớp gel ƣa nƣớc bao bọc gọi là lớp vỏ. Viên vi nang tạo thành có kích thƣớc từ vài micromet đến vài milimet và có dạng hình cầu hoặc hình dạng không đối xứng. Bề mặt hạt có thể phẳng hoặc gồ ghề. Nếu vi bao vi sinh vật thì mỗi hạt có thể chứa một hoặc nhiều tế bào. Nói chung, hình dạng và kích thƣớc hạt vi bao phụ thuộc vào vật liệu và phƣơng pháp vi bao. 1.3.3. Nguyên liệu để vi bao Các polysaccharides thƣờng dùng để vi bao gồm agar, natri aginat, carrageenan, gum Arabic, chitosan, dextrane, tinh bột và cellulose (ethyl- cellulose, acetyl- cellulose, metyl- cellulose, carboxymethyl- cellulose, nitrocellulose). Khi sử dụng chitosan với nồng độ 1% %w/v để vi bao Lactobacillus acidophilus 547, Bifidobacterium bifidum ATCC 1994 và L.casei 01 thì L.acidophilus có khả năng tồn tại tốt hơn, tế bào L.casei đƣợc bảo vệ tốt. Tuy nhiên, không có nguyên liệu nào có thể giữ B.bifidum tồn tại vì nó kháng cự rất 7
19. yếu với pH. Trong các polysaccharides trên, natri aginat thƣờng hay đƣợc sử dụng nhất. [8] Nó có thể phối hợp với nhiều nguyên liệu khác trong nhiều phƣơng pháp vi bao (Burgain và cộng sự 2011). Natri aginate có tác dụng nhƣ một nhân tố tạo gel, hình thành cấu trúc hydrogel với cation hóa trị hai Ca2+, Ba2+, Sr2+ ở điều kiện bình thƣờng. Kết quả cho thấy rằng vi khuẩn đƣợc vi bao thì khả năng tồn tại trong dịch dạ dày lớn hơn những vi khuẩn tự do (Gbassi và cộng sự 2010). Natri alginate là dạng thƣơng phẩm của alginate. Alginate là polysaccharide dị hợp mạch thẳng đƣợc chiết tách từ các loại tảo khác nhau, với 2 đơn vị cấu trúc là β-D-manuronic và α-L-guluronic acid. Alginate hình thành từ sự liên kết giữa các monomer này ở vị trí C-1 và C-4 bằng liên kết glucozide, tỷ lệ 2 hợp phần này (mannuronic:guluronic acid) thƣờng là 1:5. [9] Trọng lƣợng của phân tử alginate thƣờng dao động từ 32-200 kdal, hấp thụ nƣớc dạng muối của kim loại kiềm, magnesium, ammonia hoặc muối amin. Alginate là tác nhân làm dày, ổn định và tạo gel trong công nghiệp thực phẩm. Hình 1.4. Cấu trúc alginate và quá trình hình thành gel khi có mặt ion Ca2+ Nguồn từ website: Theo Belits và cộng sự (1999), độ nhớt của alginate phụ thuộc vào nhiều yếu tố nhƣ trọng lƣợng phân tử, tỷ lệ ion muối, quá trình làm đông và rã đông, nhiệt độ, nguồn tảo, quá trình lƣu trữ và pH của dung dịch. Trọng lƣơng phân tử càng cao thì độ nhớt càng 8
20. cao. Độ nhớt tỷ lệ thuận với ion đa hóa trị vì thế khi dung dịch alginate có tác nhân chelate (tác nhân xúc tác tạo thành hợp chất hữu cơ có nhiều hơn một liên kết các ion kim loại trong dung dịch), độ nhớt sẽ giảm. Quá trình làm đông và rã đông của alginate khi có mặt ion Ca2+ sẽ làm tăng độ nhớt của dung dịch. Khi nhiệt độ tăng 10C thì độ nhớt sẽ tăng 25% tuy nhiên độ nhớt alginate thấp hơn ban đầu nếu làm nguội. Tảo có nguồn gốc ôn đới sẽ có độ nhớt khá cao. Nhiệt độ lƣu trữ cao làm alginate bị phân hủy và sau một thời gian độ nhớt sẽ giảm dần. Giá trị pH có nhiều ảnh hƣởng đến độ nhớt của alginate. Nếu pH thấp, alginate mất điện tích âm, làm giảm lực đẩy tĩnh điện giữa các chuỗi và tạo liên kết hydro làm tăng độ nhớt, gel đƣợc hình thành. Nếu pH cao, alginate bị cắt chuỗi polymer, dung dịch giảm độ nhớt do liên kết glucoside dễ bị thủy phân trong môi trƣờng kiềm [37] Chitosan là một polysaccharide tích điện dƣơng. Mức độ hòa tan nó phụ thuộc vào pH. Nó không tan trong nƣớc có pH cao hơn 5.4. Điều này sẽ hạn chế việc đƣa đầy đủ các vật liệu sinh học vào ruột khi mà pH lớn hơn 5.4 [20]. Tuy nhiên, các nghiên cứu đã cho thấy hiệu quả của chitosan là một tác nhân phủ của hạt gel alginate [19]. Sử dụng chitosan ở nồng độ 1% w/v để bao gói dạng ép đùn chủng Lactobacillus acidophilus 547, Bifidobacterium bifidum ATCC 1994, và L. casei 01, dẫn đến khả năng tồn tại lớn hơn cho L. acidophilus và bảo vệ tốt nhất các tế bào L. casei [20]. Cellulose acetate phthalate (CAP) thì không hòa tan ở pH dƣới 5 nhƣng hòa tan ở pH lớn hơn 6 [48]. Điều cần thiết cho bao gói probiotics vì các vật liệu sinh học không phải hòa tan vào dạ dày. CAP đƣợc sử dụng rộng rãi nhƣ là một tác nhân phủ [20] Tinh bột là một polysaccharide gồm các đơn vị α-D-glucose liên kết bởi glycosizit [41]. Nó bao gồm amylose và amylopectin. Các amylose là chuỗi tuyến tính và xoắn của polymer glucose, trong khi amylopectin là chuỗi phân nhánh cao.Một hỗn hợp của alginate và tinh bột biến tính đƣợc sử dụng để đóng gói các probiotics L. acidophilus và B. lactics bằng nhũ tƣơng để kết hợp chúng thành sữa chua. Chế phẩm sinh học cho thấy khả năng tồn tại của vi khuẩn đƣợc bao gói lớn hơn vi khuẩn không đƣợc bao gói khi lƣu trữ. Một phân tích cảm thấy rằng việc sử dụng các tế bào đóng gói trong sữa chua không làm thay đổi màu sắc, độ chua hoặc tính hƣơng vị (Kailasapathy, 2006) [23] Oligosaccharides Syrup ngô, sucrose và maltodextrin đƣợc sử dụng phổ biến. Maltodextrins là một nhóm các hợp chất có nguồn gốc từ quá trình thủy phân axit hoặc enzyme tinh bột (Chronakis, 1998; Wang và Wang, 2000; Dokic et al, 2004; Zheng 9
21. et al, 2007) có chứa các đơn vị hình thành là glucose liên kết α-1,4-glucoside với đƣơng lƣợng dextroza (DE) nhỏ hơn 20 (Zheng et al., 2007) [6]. Đƣơng lƣợng Dextroza Equivalent (DE) là đại lƣợng chỉ khả năng khử đối với chuẩn là 100% ở đƣờng glucose (dextrose), hay số gam tƣơng đƣơng D – glucose trong 100g chất khô của sản phẩm. Maltodextrin cải thiện chất lƣợng của các sản phẩm bị mất nƣớc, giảm độ dính và tăng tính ổn định của sản phẩm (Roos và Karel, 1991). Chức năng này đã đƣợc quy cho khả năng của maltodextrin để hấp thụ nƣớc tạo thành một rào cản chống ẩm bảo vệ trên bề mặt của các hạt hút ẩm, (Chronakis, 1998; Avaltroni et al, 2004.; Phanindrakumar et al, 2005; Gabas et al, 2007;. Tong et al, 2008; TELIS và Martínez-Navarrete, 2009) [38]. Một nghiên cứu về hiệu quả và chất lƣợng của vi bao L. casei bằng kĩ thuật sấy phun sử dụng maltodextrin và dịch trích rau quả, kết quả cho thấy việc bổ sung maltodextrin cho chất lƣợng bột tốt hơn, độ giảm của tế bào sau khi sấy thấp hơn đáng kể so với trƣờng hợp không bổ sung maltodextrin [20]. Khi trộn một lƣợng maltodextrin thích hợp và trehalose để vi bao L. paracasei bằng kĩ thuật sấy phun lạnh, kết quả cho thấy số lƣợng sống sót cao hơn so với tế bào tự do bởi vì áp suất thẩm thấu tang [45]. Proteins Gluten, casein, whey protein, albumin, là những protein thƣờng đƣợc sử dụng làm vật liệu đóng gói. Picot và Lacroix (2004) đã sử dụng whey protein sữa nhƣ một loại vật liệu để đóng gói Bifidobacterium breve và Bifidobacterium longum R070 R023 [23]. Whey protein có thể làm tăng khả năng chịu đựng của các vi khuẩn ở pH có tính axit, do đó whey protein có một tiềm năng lớn để đƣợc sử dụng trong các chế phẩm sinh học và các sản phẩm mà vi khuẩn cần phải tồn tại khi đến đƣờng tiêu hóa (Picot và Lacroix, 2004). Các whey protein đã đƣợc sử dụng để đóng gói L. rhamnosus bằng việc phun ra trong một môi trƣờng mô phỏng tiêu hóa, các viên nang protein hình thành một ma trận để bảo vệ L. rhamnosus trong pH có tính axit và có tác dụng điều chỉnh sự phóng thích tế bào tại thời điểm mong muốn(Doherty et al., 2011) [23]. Ngoài ra nó có thể dễ dàng trộn với polysaccharides tích điện âm nhƣ alginate, carrageenan hoặc pectin [11] [12]. Gelatin thƣờng đƣợc sử dụng trong các ngành công nghiệp thực phẩm và dƣợc phẩm Gelatin là một protein có nguồn gốc từ collagen bị biến tính có chứa hàm lƣợng cao của hydroxyproline, proline và glycin. Nó đƣợc chọn làm vật liệu bao gói vì có khả năng tạo màng tốt và không gây độc hại [47]. Gelatin có một cấu trúc rất đặc biệt và tính năng 10
22. S K L 0 0 2 1 5 4