Khả năng cảm ứng hình thành rễ chuyển gene từ cây Dừa cạn (Catharanthus roseus) bằng các chủng Agrobacterium rhizogenes được phân lập ở Việt Nam

Nội dung text: Khả năng cảm ứng hình thành rễ chuyển gene từ cây Dừa cạn (Catharanthus roseus) bằng các chủng Agrobacterium rhizogenes được phân lập ở Việt Nam

1. Science & Technology Development, Vol 19, No.T3-2016 Khả năng cảm ứng hình thành rễ chuyển gene từ cây Dừa cạn (Catharanthus roseus) bằng các chủng Agrobacterium rhizogenes được phân lập ở Việt Nam Nguyễn Như Nhứt Bùi Văn Lệ Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM (Bài nhận ngày 12 tháng 11 năm 2015, nhận đăng ngày 06 tháng 05 năm 2016) TÓM TẮT Cây Dừa cạn được xem như một loài cây cho thấy cả mười ba chủng A. rhizogenes đều có dược liệu nhờ nó có khả năng tổng hợp một số khả năng chuyển gene cảm ứng tạo rễ tơ trên mô hợp chất alkaloid có khả năng giúp điều trị một lá cây Dừa cạn. Trong đó, chủng A. rhizogenes số bệnh ung thư. Tuy nhiên, sản lượng của các C18 có khả năng cảm ứng tạo rễ chuyển gene hợp chất này trong cây rất thấp. Gần đây, rễ tơ cao nhất trên ba giống Dừa cạn VIN002, VIN005 từ cây Dừa cạn được cảm ứng bằng và VIN072 với tỷ lệ mẫu hình thành rễ đạt 59,4 Agrobacterium rhizogenes được kỳ vọng như một %, 50,3 % và 40,0 % tương ứng. Trong khi đó, công cụ có thể gúp nâng cao sản lượng những với giống Dừa cạn VIN077, chủng A. rhizogenes hợp chất có giá trị này. Bằng phương pháp gây C26 cho tỷ lệ mẫu hình thành rễ cao nhất là 26,7 nhiễm mô lá bị tổn thương của bốn giống Dừa %. Điều này đã phát hiện ra những công cụ cạn với huyền phù của mười ba chủng A. chuyển gene tiềm năng giúp thu nhận được nhiều rhizogenes, rễ tơ thu được sau ba tuần gây nhiễm dòng rễ chuyển gene khác nhau từ cây Dừa cạn được phân tích sự hiện diện của các gene rolB để phục vụ cho các nghiên cứu sau này. trong rễ thu được bằng PCR. Kết quả thu được Từ khóa: Agrobacterium rhizogenes, Dừa cạn, cảm ứng, rễ tơ MỞ ĐẦU giống Rhizobium. Trong khi đó, một số tác giả Agrobacterium gồm những loài vi khuẩn khác cho rằng chúng đủ khác biệt để tách thành Gram âm và hiếu khí hiện diện khắp nơi trong đất giống riêng và được gọi là Agrobacterium [17]. [10, 11, 15]. Chúng có thể xâm nhiễm vào hầu Các loài trong giống Agrobacterium được hết cây hai lá mầm, vài cây một lá mầm và một phân biệt nhau và phân biệt với Rhizobium chủ số cây hạt trần. Hơn 90 họ thực vật hai lá mầm có yếu dựa trên đặc điểm gây bệnh của chúng trên thể bị xâm nhiễm bởi Agrobacterium, trong đó thực vật [17]. Trong đó, A. rhizogenes là loài gây bao gồm nhiều loài có giá trị kinh tế cao như cây ra triệu chứng bệnh rễ tơ trên cây trồng tại vị trí lương thực, cây ăn quả và cây hoa cảnh [15]. Vị xâm nhiễm. Hiện nay, khả năng xâm nhiễm của trí phân loại của Agrobacterium hiện vẫn còn A. rhizogenes vào thực vật được các nhà nghiên được tranh cãi do chúng có nhiều đặc điểm giống cứu sinh học thực vật quan tâm nhiều do trong với Rhizobium. Một số tác giả phân chúng thuộc quá trình xâm nhiễm gây bệnh rễ tơ (hairy root), Trang 44
2. TAÏP CHÍ PHAÙT TRIEÅN KH&CN, TAÄP 19, SOÁ T3- 2016 chúng có khả năng chuyển gen vào tế bào thực nhằm sàng lọc được những chủng A. rhizogenes vật [11, 17]. Khả năng này được các nhà nghiên có khả năng chuyển gene cảm ứng tạo rễ tơ và cứu khai thác bằng cách sử dụng chúng như công làm tiền đề cho các nghiên cứu trên rễ chuyển cụ chuyển gen để thu nhận rễ tơ hay rễ chuyển gene từ cây Dừa cạn sau này. gene (transgenic root) cho nhiều mục đích nghiên VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP cứu khác nhau. Tuy nhiên, hiệu quả chuyển gen Vật liệu của A. rhizogenes vào tế bào thực vật phụ thuộc rất nhiều yếu tố [11]. Trong đó, các chủng A. Chủng vi khuẩn rhizogenes được phân lập từ các nguồn khác Mười ba chủng Agrobacterium rhizogenes nhau có khả năng xâm nhiễm khác nhau vào thực (C02, C04, C09, C10, C12, C15, C18, C20, C24, vật [16]. Ngoài ra, trong vài trường hợp, tế bào C26, C29, C32 và C34) được cung cấp bởi Bộ chuyển gene không phát sinh thành rễ mà chuyển môn Công nghệ sinh học thực vật và chuyển hóa thành sẹo hoặc không biểu hiện nào khác so với sinh học (Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, tế bào bình thường [3]. ĐHQG-HCM). Các chủng vi khuẩn này được Trong thời gian gần đây, cây Dừa cạn phân lập từ đất vùng rễ của nhiều loài thực vật Catharanthus roseus được xem như một trong khác nhau ở Việt Nam. Tất cả các chủng vi những cây mô hình cho các nghiên cứu khả năng khuẩn được nuôi cấy và bảo quản trên môi chuyển gene của A. rhizogenes cũng như nhằm trường thạch Yeast Mannitol Broth (YMB) [3]. tạo được rễ chuyển gene cho các nghiên cứu chức Các chủng vi khuẩn được nuôi cấy trên môi 0 năng của các gene liên quan đến các con đường trường YMB trong 48 giờ ở điều kiện 25 C và biến dưỡng ở thực vật. Trong nghiên cứu này, lắc 180 vòng/phút. Canh trường thu được sau khi chúng tôi đã sử dụng cây Dừa cạn để tiến hành nuôi cấy có OD600nm khoảng 1,7–1,8 được pha khảo sát khả năng chuyển gene của 13 chủng A. loãng thành huyền phù có OD600nm 1,0 để dùng rhizogenes khác nhau. Kết quả của nghiên cứu làm nguồn vi khuẩn để gây nhiễm. Hình 1. Cây Dừa cạn in vitro 8 tuần tuổi. Từ trái sang phải: giống VIN002, VIN005, VIN072 và VIN077. Mẫu thực vật in vitro trước khi xử lý với dung dịch Javel:nước (4:1) Bốn giống Dừa cạn khác nhau (VIN002, trong 15 phút. Hạt được rửa lại với nước vô trùng VIN005, VIN072 và VIN077) được cung cấp bởi 5 lần. Ủ hạt trên môi trường Murashige & Skoog 0 Công ty FVN. Cây Dừa cạn in vitro được chuẩn bán đậm đặc (MS/2) ở điều kiện 25 C trong tối. bị bằng cách khử trùng bề mặt theo Mohsen Hạt nẩy mầm sau 5 ngày ủ. Chuyển cây sang chế Zargar và cộng sự (2010) [14]. Hạt Dừa cạn được độ chiếu sáng 1500 lux (16 giờ/ngày). Sau 8 tuần rửa với xà phòng loãng trong 10 phút rồi được nuôi cấy, cây cao khoảng 5–7 cm và có được 4–5 rửa lại dưới vòi nước máy trong 5 phút. Sau đó, cặp lá thật đã phát triển (Hình 1) được dùng để hạt được xử lý với ethanol 80 % trong 1 phút làm nguyên liệu gây nhiễm. Trang 45
3. Science & Technology Development, Vol 19, No.T3-2016 Phương pháp khuếch đại là biến tính DNA ban đầu trong 5 Nhận diện chủng Agrobacterium rhizogenes có phút ở 95 0C; sau đó là 35 chu kỳ của biến tính khả năng chuyển gene tạo rễ tơ trên cây Dừa cạn trong 30 giây ở 94 0C, bắt cặp trong 30 giây ở 54 Các mô lá thật từ cây Dừa cạn in vitro được 0C và kéo dài trong 1 phút ở 72 0C; kết thúc quá tạo vết thương bằng dao mổ ngang qua gân chính trình bằng cách 5 phút ở 72 0C. Sản phẩm sau của lá. Sau đó, mẫu được cho vào huyền phù các khuếch đại có kích thước 430bp sẽ được nhận chủng A. rhizogenes khác nhau và ngâm trong 5 diện bằng cách điện di trên gel agarose 1 % với phút. Làm khô mẫu bằng giấy thấm rồi ủ cảm đệm TAE 0,5X. Phát hiện gen trên gel bằng cách ứng trên môi trường MS/2 trong tối trong 7 ngày ngâm trong dung dịch ethidium bromide rồi xem ở 25 0C. Tiến hành loại vi khuẩn bằng cách dưới đèn UV. Kết quả điện di được so sánh giữa chuyển mẫu sang môi trường MS/2 có bổ sung DNA rễ tơ, DNA của rễ không chuyển gene từ cefotaxime 500 mg/lít và ủ trong tối trong 7 ngày các cây in vitro, DNA plasmid Ri làm chứng ở 25 0C. Sau 7 ngày thì chuyển mẫu sang môi dương dựa trên thang DNA chuẩn [17, 19]. trường MS/2 và tiếp tục ủ trong tối trong 7 ngày Xử lý số liệu 0 ở 25 C. Rễ tơ được hình thành sau 2–3 tuần gây Số liệu thu được từ kết quả các thí nghiệm nhiễm. Ghi nhận số mẫu sống sót, số mẫu hình được xử lý thống kê bằng phần mềm Microsoft thành rễ. Mỗi nghiệm thức gồm 100 mẫu lá và Excel 2007, SAS 9.1 và được trình bày dưới dạng được lặp lại 3 lần. Tỷ lệ mẫu sống sót (%) là số số trung bình. mẫu sống sau 3 tuần thí nghiệm/số mẫu gây KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN nhiễm. Tỷ lệ mẫu hình thành rễ (%) là số mẫu hình thành rễ/số mẫu gây nhiễm. Tần số chuyển Cây Dừa cạn đã được xem như một loại cây gene (%) là số mẫu hình thành rễ/số mẫu sống sót sử dụng làm mô hình trong các nghiên cứu cơ [7, 11, 12]. chế sinh tổng hợp các hợp chất alkaloid. Rễ chuyển gene từ cây Dừa cạn bằng Agrobacterium Nhận diện rễ chuyển gene rhizogenes cũng đã được nghiên cứu từ những Cắt lấy rễ tơ để xác định sự hiện diện của gen năm 1980. Các dòng rễ chuyển gene bằng những rolB (có nguồn gốc từ trên plasmid Ri của vi chủng vi khuẩn khác nhau không giống nhau về khuẩn) bằng cách khuếch đại các trình tự với cặp mặt hình thái và khả năng sinh tổng hợp alkaloid. mồi gen rolB 430bp có trình tự 5’- Sự đa dạng trong đặc điểm sinh tổng hợp alkaloid GCTCTTGACGTGCTAGATTT-3’ và 5’- này của rễ chuyển gene từ cây Dừa cạn là một GAAGGTGCAAGCTACCTCTC-3’ [6]. Sử trong những đặc điểm thu hút các nhà nghiên dụng cặp mồi gene virC 730bp có trình tự 5’- cứu. Do đó, các nghiên cứu thu nhận những dòng ATC ATT TGT AGC GAC T-3’ và 5’-AGC rễ chuyển gene mới từ cây Dừa cạn không ngừng TCA AAC CTG CTT C-3’ [1] để dò sự hiện diện được báo cáo. của A. rhizogenes nhiễm trong rễ. Chương trình Trang 46
4. TAÏP CHÍ PHAÙT TRIEÅN KH&CN, TAÄP 19, SOÁ T3- 2016 Bảng 1. Tỷ lệ mẫu hình thành rễ (%) trên bốn giống Dừa cạn bằng các chủng Agrobacterium rhizogenes Giống Dừa cạn Chủng A. rhizogenes VIN002 VIN005 VIN072 VIN077 C02 39,6d 11,0m 18,0d 4,6ghij C04 26,7e 39,3fg 8,1ghi 17,5ef C09 16,3f 40,0fg 15,7def 21,1bcd C10 38,1d 28,9hij 13,6efg 17,5ef C12 47,7c 23,2kl 10,2fghi 14,2ef C15 17,8f 22,2kl 0j 3,3ghij C18 59,4a 50,3a 40,0a 20,2bcd C20 0g 31,4hij 23,5c 0k C24 40,7d 47,5bcd 14,4ef 7,2ghij C26 38,1d 43,2de 10,6fghi 26,7a C29 24,8e 46,4bcd 0,8j 3,8ghij C32 55,0b 45,6bcde 0j 0k C34 45,8c 29,3hij 31,5b 21,4bcd Ghi chú: Các trị trung bình trong cùng 1 cột có các chữ cái theo sau giống nhau thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở p=0,05. Bằng cách gây nhiễm trên mô lá in vitro, kết cho tỷ lệ hình thành rễ khác nhau trên cây xuyên quả đã cho thấy tất cả 13 chủng đều có khả năng tâm liên (Andrographis paniculata) [5]. Cây Dừa cảm ứng hình thành rễ trên cây Dừa cạn. Tuy cạn cũng đã được cảm ứng tạo rễ tơ bằng nhiều nhiên, mỗi chủng vi khuẩn có khả năng cảm ứng chủng vi khuẩn khác nhau và kết quả cho thấy tỷ hình thành rễ khác nhau trên từng giống Dừa cạn lệ hình thành rễ cũng không giống nhau giữa các khác nhau. Với giống Dừa cạn VIN005 thì cả 13 chủng. Chủng A. rhizogenes C58C1 có khả năng chủng A. rhizogenes đều có khả năng cảm ứng cảm ứng tạo rễ với tỷ lệ hình thành rễ đạt 70 % tạo rễ tơ (Bảng 1). Trong khi đó, chủng A. [4], trong khi tỷ lệ này là 85,26 % với chủng A. rhizogenes C20 không có khả năng cảm ứng tạo rhizogenes ATCC15834 (16). Sự khác nhau trong rễ tơ trên giống Dừa cạn VIN002 và VIN077; kết quả thu được có thể là do nhiều yếu tố gây ra, chủng C15 không thể cảm ứng tạo rễ tơ trên trong đó, hai yếu tố quan trọng quyết định là do giống Dừa cạn VIN072 và chủng C32 không tạo sự khác nhau về chủng vi khuẩn và khác nhau về được rễ tơ trên hai giống VIN072 và VIN077. giống thực vật chủ [18]. Nhìn chung, chủng A. Kết quả này cho thấy khả năng cảm ứng tạo rễ tơ rhizogenes C18 có khả năng cao ứng rễ cao trên 3 tùy thuộc vào từng giống Dừa cạn khác nhau. giống Dừa cạn VIN002, VIN005 và VIN072 (với Trước đây, khi nghiên cứu cảm ứng tạo rễ tơ trên tỷ lệ mẫu hình thành rễ đạt 59,4; 50,3 và 40,0 % củ cà rốt bằng bảy chủng A. rhizogenes khác tương ứng). Trong khi đó, trên giống Dừa cạn nhau, Y.R. Danesh và cộng sự (2006) cũng nhận VIN077, chủng A. rhizogenes C26 có khả năng thấy rằng mỗi chủng vi khuẩn đều có khả năng cảm ứng tạo rễ tơ cao nhất với tỷ lệ mẫu hình cảm ứng hình thành rễ nhưng tỷ lệ thu được cũng thành rễ tơ là 26,7 %. không giống nhau giữa các chủng [3]. Gần đây, Tỷ lệ mẫu hình thành rễ phụ thuộc nhiều vào E. Marwani và cộng sự (2015) cũng có kết luận khả năng sống sót của mẫu sau thời gian gây tương tự khi kết quả nghiên cứu cho thấy ba nhiễm. Trong khi đó, tỷ lệ mẫu sống sót thay đổi chủng A. rhizogenes R1000, A4 và ATCC15834 tùy theo giống Dừa cạn và chủng A. rhizogenes Trang 47
5. Science & Technology Development, Vol 19, No.T3-2016 nhất định (Bảng 2). Nhìn chung, giống Dừa cạn còn lại (11,0–50,3 %; 0,8–40 % và 3,8–26,7 % VIN002 có tỷ lệ mẫu sống sau khi gây nhiễm cao tương ứng). Tuy nhiên, tỷ lệ mẫu hình thành rễ và ổn định hơn (50,6–86,7 %) so với 3 giống Dừa không hoàn toàn tỷ lệ thuận với tỷ lệ mẫu sống cạn còn lại. Tỷ lệ mẫu sống sót của giống Dừa sót. Các trường hợp mẫu chết một phần hoặc cạn VIN005 và VIN077 thay đổi lớn khi được hoàn toàn đều có chung đặc điểm là mẫu hóa nâu gây nhiễm với các chủng A. rhizogenes khác ở trạng thái khô hoặc bị thối nhũng do sự phát nhau (27,6–97,3 % và 5,6–67,8 % tương ứng). triển quá mức của vi khuẩn. Hiện tượng này cũng Giống Dừa cạn VIN072 có tỷ lệ mẫu sống sót được phát hiện trước đây khi gây nhiễm lá cây thay đổi (36,7–89,5 %) ít hơn so với VIN005 và Dừa cạn với chủng A. rhizogenes ATCC15834 VIN077. Các kết quả thu cũng đã được cho thấy [2] và với lá cây Bạch hoa xà Plumbago trong đa số các trường hợp thì tỷ lệ mẫu sống sót zeylanica L. khi được gây nhiễm với chủng A. cao sẽ cho cơ hội cảm ứng được mẫu tạo rễ tơ rhizogenes MTCC532 [8]. Theo James A. cao kéo theo tỷ lệ mẫu hình thành rễ cao. Tỷ lệ Birchler (2011), sự hoại tử mô như trên có thể là mẫu từ giống Dừa cạn VIN002 hình thành rễ đạt do mô bị oxy hóa [9]. 16,3–59,4 %, cao hơn so với 3 giống Dừa cạn A B C D Hình 2. Rễ tơ sau 3 tuần gây nhiễm. A, B và C: rễ tơ được cảm ứng từ giống Dừa cạn VIN002, VIN005 và VIN072 bằng chủng A. rhizogenes C18; D: rễ tơ được cảm ứng từ giống Dừa cạn VIN077 bằng chủng A. rhizogenes C26. Trang 48
6. TAÏP CHÍ PHAÙT TRIEÅN KH&CN, TAÄP 19, SOÁ T3- 2016 Bảng 2. Tỷ lệ mẫu sống sót của bốn giống Dừa cạn sau khi gây nhiễm với Agrobacterium rhizogenes Giống Dừa cạn Chủng A. rhizogenes VIN002 VIN005 VIN072 VIN077 C02 74,8fgh 27,6m 62,7ef 54,2de C04 50,6ki 60,7f 43,1hijk 47,9fgh C09 52,0ki 54,2g 89,5a 67,4ab C10 83,7b 44,9j 66,9cde 56,1cde C12 78,0cde 39,5k 67,1cde 46,4fgh C15 74,4fgh 33,3l 22,3m 5,6m C18 86,7a 69,6e 45,6hij 36,6ij C20 6,7m 47,6hij 65,9cdef 19,3l C24 80,2cde 82,4cd 72,5b 67,8ab C26 68,3i 80,4cd 44,4hijk 44,4fgh C29 59,7j 93,7b 42,5ijk 40,9hij C32 77,0cdefgh 97,3a 36,7l 26,2k C34 78,2cde 49,4hi 55,1g 57,8cd Ghi chú: Các trị trung bình trong cùng 1 cột có các chữ cái theo sau giống nhau thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở p=0,05. Bảng 3. Tần số chuyển gene của các chủng Agrobacterium rhizogenes trên bốn giống Dừa cạn Giống Dừa cạn Chủng A. rhizogenes VIN002 VIN005 VIN072 VIN077 C02 53,0efgh 40,0m 28,7d 8,4ghi C04 52,7fgh 64,9cdef 18,7fghij 36,5cd C09 31,4k 73,8ab 17,6fghij 31,3ef C10 45,6i 64,4cdef 20,3fg 31,3ef C12 61,1cd 72,2ab 15,2hij 30,5ef C15 23,9l 66,7cdef 0kl 60,0a C18 68,6ab 58,8ghi 87,8a 55,2b C20 0m 65,9cdef 35,6c 0j C24 50,7fgh 57,6ghi 19,9fgh 10,7ghi C26 55,7def 53,7jk 23,8e 60,0a C29 41,6j 49,6jkl 2,0kl 9,3ghi C32 71,5ab 46,9kl 0kl 0j C34 58,5cde 59,2ghi 57,2b 37,0cd Ghi chú: Các trị trung bình trong cùng 1 cột có các chữ cái theo sau giống nhau thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở p=0,05. Trong trường hợp tỷ lệ mẫu sống sót là 100 với những yếu tố bất lợi khác [17, 18]. Nếu %, tần số chuyển gene cũng chính là tỷ lệ mẫu không đáp ứng phòng thủ được, hậu quả là A. hình thành rễ. Tỷ lệ mẫu sống sót càng cao thì tần rhizogenes sẽ gây chết tế bào. Vì vậy, tần số số chuyển gene có giá trị càng gần với tỷ lệ mẫu chuyển gene thông thường sẽ cao hơn tỷ lệ mẫu sống sót [7, 11, 12]. Nhưng, do bản chất A. hình thành rễ (Bảng 3). Với bốn giống Dừa cạn rhizogenes cũng chính là tác nhân gây bệnh cho VIN002, VIN005, VIN072 và VIN077, các thực vật, do đó tế bào thực vật cũng sẽ có những chủng A. rhizogenes có tần số chuyển gene cao đáp ứng phòng thủ tương tự như khi nó tương tác nhất tương ứng là C32, C09, C18 và C26. Tuy Trang 49
7. Science & Technology Development, Vol 19, No.T3-2016 nhiên, tỷ lệ hình thành rễ là một trong những yếu hoặc có thay đổi lớn sau khi gây nhiễm với A. tố quan trọng quyết định hiệu suất thu nhận rễ rhizogenes như mô lá cây Dừa cạn trong nghiên [11]. Tỷ lệ hình thành rễ càng cao thì số dòng rễ cứu này thì chỉ tiêu tỷ lệ hình thành rễ là rất quan thu được càng nhiều. Chỉ tiêu này rất quan trọng trọng giúp sàng lọc được những chủng A. nhằm giúp thu được nhiều dòng rễ tơ khác nhau rhizogenes thích hợp cho các nghiên cứu thu để phục vụ cho các nghiên cứu sau đó. Do đó, nhận rễ tơ sau này. trong những trường hợp tỷ lệ mẫu sống sót thấp A B C D Hình 3. Sự hiện diện của gene rolB được chuyển từ Agrobacterium rhizogenes và rễ tơ. A: các giếng từ trái sang phải tương ứng với rễ chuyển gene từ giống VIN002 bởi các chủng A. rhizogenes C02, C04, C09, C10, C12, C15, C18, C24, C26, C29, C32, C34 và rễ VIN002 không chuyển gene; B: các giếng từ trái sang phải tương ứng với rễ chuyển gene từ giống VIN005 bởi các chủng A. rhizogenes C02, C04, C09, C10, C12, C15, C18, C20, C24, C26, C29, C32, C34, rễ VIN005 không chuyển gene và nước; C: các giếng từ trái sang phải tương ứng với rễ chuyển gene từ giống VIN072 bởi các chủng A. rhizogenes C02, C04, C09, C10, C12, C18, C20, C24, C26, C29, C34, rễ VIN072 không chuyển gene và chứng dương; C: các giếng từ trái sang phải tương ứng với rễ chuyển gene từ giống VIN077 bởi các chủng A. rhizogenes C02, C04, C09, C10, C12, C15, C18, C24, C26, C29, C34, rễ VIN077 không chuyển gene và chứng dương. Ngoài ra, trong một số trường hợp, sự cảm cạn. Trong khi đó, kết quả phân tích PCR không ứng hình thành rễ có thể xảy ra bằng dịch lọc từ thấy xuất hiện băng tương ứng gene virC ở bất cứ canh trường nuôi cấy tăng sinh A. rhizogenes dòng rễ nào. Điều này chứng tỏ gene rolB trên [13]. Trong khi đó, chỉ có rễ mang gene được plasmid Ri đã được chèn vào bộ gene của tế bào chuyển từ A. rhizogenes vào trong bộ gene mới rễ cây Dừa cạn. Điều này cho thấy rằng có thể sử có thể mang những đặc điểm mong muốn. Do đó, dụng tất cả 13 các chủng A. rhizogenes này để tiêu chí chọn lọc quan trọng tiếp theo là sự hiện thu nhận rễ chuyển gene từ mô lá của các giống diện của các gene trên plasmid Ri của A. cây Dừa cạn. Tuy nhiên, để thu nhận được nhiều rhizogenes có trong DNA của tế bào mô rễ. Kết dòng rễ chuyển gene khác nhau từ các giống Dừa quả phân tích PCR của các dòng rễ được cảm cạn VIN002, VIN005 và VIN072 thì chủng A. ứng từ các chủng vi khuẩn khác nhau đều cho rhizogenes C18 là thích hợp để dùng cảm ứng thấy có xuất hiện các băng tương ứng với gene trong khi với giống Dừa cạn VIN077 thì chủng A. rolB với kích thước 430bp (Hình 3) nhưng không rhizogenes C26 là thích hợp hơn so với những với các dòng rễ không chuyển gene từ cây Dừa chủng còn lại. Trang 50
8. TAÏP CHÍ PHAÙT TRIEÅN KH&CN, TAÄP 19, SOÁ T3- 2016 KẾT LUẬN không giống nhau. Chủng A. rhizogenes C18 cho Qua các kết quả thu được đã giúp phát hiện hiệu suất thu nhận rễ chuyển gene cao nhất trên thêm công cụ chuyển gen mới là mười ba chủng ba giống Dừa cạn VIN002, VIN005 và VIN072, Agrobacterium rhizogenes được phân lập từ đất Trong khi đó, chủng A. rhizogenes C26 cho hiệu vùng rễ của một số loài thực vật ở Việt Nam. Khả suất thu nhận rễ chuyển gene cao nhất trên giống năng chuyển gene của các chủng A. rhizogenes Dừa cạn VIN077. này trên mô lá cây Dừa cạn Catharanthus roseus Hairy root induction in Catharanthus roseus by various strains of Agrobac- terium rhizogenes isolated in Vietnam Nguyen Nhu Nhut Bui Van Le University of Science, VNU-HCM ABSTRACT Catharanthus roseus is a well known this experiment, after 3 weeks of infection, the medicinal plant. It produces several presence of rolB gene in hairy roots were phytocompounds and many of which show analysed by polymerase chain reaction. All of 13 anticancerous properties. However the yields of A. rhizogenes strains could induce the formation these compounds are very low. Recently, of hairy root in C. roseus. The A. rhizogenes C18 induction of C. roseus hairy roots by strain had the highest induction percentage in C. Agrobacterium rhizogenes, is interested as a roseus VIN002, VIN005, and VIN072 with 59.4 promising tool for the enhanced production of %, 50.3 %, and 40.0 % respectively. And the these metabolites. In this research, wounded same result was ontained at 26.7% by A. leaves from four strains of C. roseus were Rhizogenes C26 for C. roseus VIN077 rhizogenes infected with various strains of A. rhizogenes strains. This result identified two A. rhizogenes isolated in Vietnam to provide more information strains C18 and C26 as potential transformation about the induction efficiency of hairy roots. In tools for hairy root production from C. roseus. Key words: Agrobacterium rhizogenes, Catharanthus roseus, hairy root induction TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. C.K. Chang, K.S. Chang, Y.C. Lin, S.Y. 31P and 13C muclear magnetic resonance Liu, C.Y. Chen, Hairy root cultures of spectroscopy, Thesis for the doctor degree Gynostemma pentaphyllum Thunb. of philosophy, Rice University, Houston, Makino: a promising approach for the Texas (1994). production of gypenosides as an alternative [3]. Y.R. Danesh, M.E. Goltapeh, A. Alizadeh, of ginseng saponins, Biotechnology S.M. Modarres, Optimizing Carrot hairy Letters, 27, 1165–1169 (2005). root production for monoxenic culture of [2]. C.H. Ho, Metabolic studies of arbuscular mycorrhizal fungi in Iran, Catharanthus roseus hairy root cultures by Trang 51
9. Science & Technology Development, Vol 19, No.T3-2016 Journy of Biologycal Sciences, 6, 10, 87– [12]. K. Yoshimatsu, H. Sudo, H. Kamada, F. 91 (2006). Kiuchi, Y. Kikuchi, J. Sawada, K. [4]. D.H. Liu, W.W. Ren, L.J. Cui, L.D. Zhang, Shimomura, Tropane alkaloid production X.F. Sun, K.X. Tang, Enhanced and shoot regeneration in hairy and accumulation of catharanthine and adventitious root cultures of Duboisia vindoline in Catharanthus roseus hairy myoporoides–D. leichhardtii hybrid, Biol. roots by overexpression of transcriptional Pharm. Bull., 27, 8, 1261-1265 (2004). factor ORCA2, African Journal of [13]. M.M. Altamura, Agrobacterium Biotechnology, 10, 17, 3260-3268 (2011). rhizogenes rolB and rolD genes: regulation [5]. E. Marwani, D. Pratiwi, K. Wardhani, R. and involvement in plant development, Esyanti, Development of hairy root culture Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 77, of Andrographis paniculata for in vitro 89-101 (2004). adrographollide production, Journal of [14]. M. Zargar, F. Farahani, T. Nabavi, Hairy Medical and Bioengineering, 4, 6, 446-450 roots production of transgenic (2015). Catharanthus roseus L. plants with [6]. E. SkaBa, A. Kicel, M.A. Olszewska, A.K. Agrobacterium rhizogenes under in vitro Kiss, H. Wysokińska, Establishment of conditions, Journal of Medicinal Plants hairy root cultures of Rhaponticum Research, 4, 21, 2199-2203 (2010). carthamoides (Willd.) Iljin for the [15]. S. Murugesan, C. Manoharan, R. production of biomass and caffeic acid Vijayakumar, A. Panneerselvam, Isolation derivatives, BioMed Research and characterization of Agrobacterium International, 2015, 1-11 (2015). rhizogenes from the root nudules of some [7]. G.S.H. AL-Yozbaki, J.H. Rasheed, S.M. leguminous plants, International Journal Salih, Transformation of Soybean (Glycine of Microbiological Research, 1, 3, 92-96 max L.) Via GUS–Labeled Agrobacterium (2010). Rhizogenes R1000, International Journal [16]. M. Sun, J.J. Zeng, A study on the hairy of Science and Technology, 4, 6, 267-272 root culture and antitumor alkaloids (2015). production of Catharanthus roseus, [8]. I. Sivanesan, B.R. Jeong, Induction and Zhongguo Zhong Yao Za Zhi, 30, 10, 741- establishment of adventitious and hairy 755 (2005). root cultures of Plumbago zeylanica L., [17]. T. Tzfira, V. Citovsky, Agrobacterium – African Journal of Biotechnology, 8, 20, From biology to biotechnology, Springer, 5294-5300 (2009). (2008). [9]. J.A. Birchler, Plant chromosome [18]. Y.Ö. Çiftçi, Transgenic Plants - Advances engineering: methods and protocols, and Limitations, InTech., (2012). Methods in Molecular Biology, 701 (2011). [19]. Z. Shakeran, M. Keyhanfar, G. Asghari, [10]. J.C. Jimenez-Lopez, Biochemical testing, M. Ghanadian, Improvement of atropine Intech., (2012). production by different biotic and abiotic [11]. K. Wang, Agrobacterium protocols, elicitors in hairy root cultures of Datura Humana Press, 1 (2006). metel, Turkish Journal of Biology, 39, 111- 118 (2015). Trang 52