Hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời

Nội dung text: Hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời

1. Hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời 
2. Hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời 1. Giới thiệu Ngày nay, việc nghiên cứu cải thiện các quy trình nhân giống thực vật nhất là cây hoa cảnh trong ống nghiệm rất được quan tâm bởi nhiều nhà khoa học trên khắp thế giới. Ðể ứng dụng của hệ thống vi nhân giống thông
3. thường trên môi trường thạch vào quy mô công nghiệp nhằm giảm tỷ lệ nhiễm bệnh, giảm chi phí giá thành, tăng hệ số nhân giống. Nhiều nghiên cứu đã sử dụng phương pháp nuôi cấy trong môi trường lỏng có hay không có lắc. Kỹ thuật này cho phép đạt được hệ số nhân chồi, tạo phôi soma, PLB (protocorm-like body: thể giống protocorm), nhiều hơn so với trên môi trường thạch. Tuy nhiên khi nuôi cấy trong môi trường lỏng mẫu cấy bị trương nước và bị hiện tượng thủy tinh thể do ngập quá lâu trong môi trường, ngoài ra mẫu còn bị những tổn thương do quá trình
4. lắc. Vì vậy để kết hợp những ưu điểm của hệ thống nuôi cấy trên thạch với nuôi cấy lỏng, vào năm 1983, Harris và Mason đã thiết kế hai hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời là hệ thống nuôi cấy nghiêng và hệ thống Rocker. Ít lâu sau, vào năm 1985 Tisserat và Vandercook đã thiết kế một hệ thống nuôi cấy tự động APCS đây là hệ thống có thể thay thế được môi trường và có thể sử dụng nuôi cấy trong một thời gian dài mà không cần cấy chuyền. Ngoài ra còn có một số hệ thống ngập chìm tạm thời một phần hay toàn phần được điều khiển tự động bằng máy tính hay
5. bán tự động. Hiện nay đáng chú ý là hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời RITA®của hãng Cirad, Pháp; BIT® Twin Flask của Cuba đã được khảo sát và nghiên cứu trên nhiều đối tượng khác nhau. 2. Nguyên tắc vận hành và cấu trúc cơ bản hệ thống Tất cả các hệ thống này đều tuân theo những điều kiện được đề ra bởi Teisson và cộng sự năm 1999: (1) tránh sự ngập liên tục là yếu tố ảnh hưởng tiêu cực lên sự sinh trưởng và phát sinh hình thái của mẫu cấy; (2) cung cấp sự trao đổi oxy một cách đầy đủ; (3) cung
6. cấp sự hòa trộn đầy đủ; (4) có thể thay đổi môi trường và điều khiển tự động; (5) hạn chế sự nhiễm; (6) giá thành hạ. Tất cả các hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời đều phải tuân theo một nguyên tắc là phải có khả năng tạo ra sự ngập chìm không liên tục theo chu kỳ xác định. Các hệ thống đều có ngăn chứa môi trường riêng, có thể chung một bình chứa nhưng có hai ngăn khác nhau hay gồm một hệ thống bình chứa nối với hệ thống chứa mẫu cấy bằng hệ thống ống dẫn và bơm điều khiển. Các mẫu cấy thường được đặt trên những đĩa
7. bằng nhựa polypropylene thành một cụm, điều này giúp tiết kiệm được thời gian phải đặt mẫu lên trên giá thể thạch trong nuôi cấy thông thường. Tóm lại, hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời thông thường có những bộ phận chủ yếu sau: - Bơm hay máy nén khí tạo áp lực để hút môi trường từ ngăn chứa lên ngăn chứa mẫu cấy và ngược lại - Hệ thống cài đặt thời gian dùng để điều khiển chu kỳ ngập - Hệ thống ống dẫn và van điều khiển - Các màng lọc
8. - Bình nuôi cấy thường bằng nhựa polycarbonate hay thủy tinh Dựa theo nguyên tắc và nguyên lý để tạo ra hệ thống ngập chìm tạm thời, nhiều nhà khoa học đã thiết kế và tạo ra các hệ thống ngập khác nhau, tùy vào mục đích nuôi cấy khác nhau. Sau đây là ba biến thể khác nhau đã được phát triển và bán rộng rãi trên thị trường, đó là hệ thống RITA®, thứ hai là hệ thống bình đôi BIT®, và hệ thống Plantima. a. Hệ thống RITA®
9. Hình 1. Hệ thống RITA®, Pha 1: mô không ngập trong môi trường, Pha 2: hiện tượng ngập được hoạt hóa, các van mở ra cho khí đi qua các màng lọc đẩy môi trường lỏng lên ngập mô cấy, Pha 3: sự trao đổi khí trong hệ thống
10. RITA®, Pha 4: chu kỳ kết thúc, các van đóng lại và môi trường lỏng rút xuống ngăn bên dưới. Hệ thống RITA® (Hình 1) là công trình của Teisson và Alvard vào năm 1995. Một bình chứa 1 L gồm có hai phần, phần trên chứa mẫu cấy và phần dưới chứa môi trường. Một áp suất vượt mức tác động vào môi trường lỏng chứa trong phần dưới và đẩy chúng dâng lên ngăn chứa mẫu cấy. Mẫu cấy được ngập chìm trong môi trường lỏng lâu hay mau tùy theo thời gian áp suất vượt mức được duy trì. Trong suốt thời gian ngập, không khí được sục vào trong môi
11. trường lỏng, môi trường được chuyển động làm cho mẫu cấy xoay trở được các mặt tiếp xúc với bề mặt môi trường, áp suất vượt mức sau đó được thoát ra bên ngoài nhờ một ngõ ra phía trên đầu hệ thống. b. Hệ thống bình sinh đôi BIT® Hệ thống bình sinh đôi BIT® (Hình 2) được thiết kế bởi Escalona và cộng sự (1998) được dự định nhân giống số lượng lớn qua con đường phát sinh phôi soma. Ðối với nhân giống theo con đường phát sinh cơ quan kích thước mẫu cấy đòi hỏi một hệ
12. thống có thể tích lớn hơn và rẻ hơn. Con đường dễ dàng nhất để đạt được trạng thái ngập chìm tạm thời theo chu kỳ nhất định là nối hai bình thủy tinh hay plastic có kích thước từ 250 ml - 10 L bằng một hệ thống ống dẫn, và điều khiển tạo ra áp suất vượt mức để đưa môi trường vào bình chứa mẫu và ngược lại. Hệ thống BIT® được thiết kế đáp ứng với những yêu cầu trên.
13. Hình 2. Hệ thống bình sinh đôi BIT® c. Hệ thống Plantima®
14. Hệ thống này được thiết kế tổng thể tương tự như hệ thống RITA® tuy nhiên có thay đổi và cải tiến một số chi tiết như hệ thống bơm và vị trí các màng lọc. Hệ thống này được sản xuất và cung cấp bởi Công ty A-tech Bioscientific tại đảo Ðài Loan. Cấu tạo và phương pháp vận hành cơ bản (Hình 3, Hình 4):
15. Hình 3. Các thành phần của hệ thống Plantima
16. Hình 4. Hệ thống Plantima với hệ thống điều khiển chu kỳ ngập 3. Ưu và khuyết điểm của hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời
17. a. Ưu điểm Hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời (Temporary Immersion System, TIS) có tác động tích cực lên tất cả các giai đoạn từ nhân nhanh chồi cho tới phát sinh phôi soma trên nhiều đối tượng cây trồng khác nhau. Sự sinh trưởng và hệ số nhân nhanh chồi của cây được nuôi cấy trong hệ thống ngập chìm tạm thời luôn cao hơn so với những cây nuôi cấy trong hệ thống thông thường trên môi trường rắn hay trong những hệ thống bioreactor thông thường. Cây tái sinh và phôi soma thu được trong hệ thống này luôn có
18. chất lượng tốt hơn. Từ đó cây có nguồn gốc từ hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời có tỷ lệ sống sót cao, sinh trưởng khỏe mạnh trong quá trình thuần hoá ngoài vườn ươm. Có thể nói hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời đã kết hợp thành công những ưu điểm của hệ thống nuôi cấy rắn thoáng khí và hệ thống nuôi cấy lỏng giúp cây tránh được những hiện tượng bất lợi do sự thiếu thông thoáng của môi trường lỏng ngập liên tục hay trong hệ thống kín trên môi trường rắn, giúp gia tăng sự hấp thu chất dinh dưỡng. Chu kỳ và tần số ngập chìm là
19. những chỉ số chủ yếu ảnh hưởng đến sự phát triển của mẫu cấy cũng như toàn bộ quy trình nhân giống. Khi những chỉ số này được tối ưu hóa, sản lượng sẽ được gia tăng, quá trình kiểm soát sự phát sinh hình thái tốt hơn và còn có khả năng hạn chế tối đa hiện tượng thủy tinh thể. Ðây là ưu điểm lớn nhất của hệ thống TIS so với hệ thống bioreactor thông thường. Hệ thống TIS tiết kiệm được công lao động và không gian phòng nuôi cấy và giảm được chi phí sản xuất. Những quá trình nhân nhanh phôi soma, tái sinh nhiều chồi, tạo
20. củ bi có khả năng được tối ưu hoá trên nhiều đối tượng cây trồng từ đó giảm được chi phí sản xuất một cách đáng kể. b. Khuyết điểm Mật độ nuôi cấy là một yếu tố không kém phần quan trọng nhưng hiện nay vẫn chưa được khảo sát một cách sâu rộng. Thời gian ngập tối ưu phải được khảo sát và xác định chính xác cho từng giai đoạn nuôi cấy của từng loại cây cũng như thời gian giữa các lần cấy chuyền đối với những hệ thống không thể bổ sung môi trường mới, cuối cùng là phải
21. khảo sát tối ưu hóa thành phần môi trường cho từng giai đoạn nuôi cấy. Hiện nay, nhiều nghiên cứu sâu hơn về ảnh hưởng của hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời về mặt vật lý là rất cần thiết để có thể tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy trong những hệ thống này. Một ưu điểm khác của hệ thống này trong việc giảm được hoạt tính của các chất độc ngoại bào hay các chất ức chế sinh trưởng được tiết ra ngoài môi trường trong thời gian nuôi cấy của mẫu cấy vẫn chưa được đánh giá chính
22. xác. Trong điều kiện Việt Nam hiện nay, giá thành của những hệ thống nuôi cấy TIS tương đối cao do phải nhập hệ thống này từ nước ngoài như Pháp, Cuba, Đài Loan do đó nếu muốn ứng dụng rộng rãi thì những hệ thống này nhất thiết phải được nghiên cứu thiết kế ngay trong nước để giảm giá thành. Ngoài ra, những thông số kỹ thuật của hệ thống này cần được khảo sát kỹ lưỡng và tối ưu hóa đối với từng giai đoạn nuôi cấy của từng loại cây, có được những điều kiện như vậy thì chúng ta mới có khả năng áp dụng
23. hệ thống TIS rộng rãi trong sản xuất cây giống. N.Q. Thiện Tổng hợp từ các nguồn: - Teisson C & Alvard D, (1995). A new concept of plant in vitro cultivation liquid medium: temporary immersion. In: Terzi M et al. (eds). Current Issues in Plant Molecular and Cellular Biology (pp. 105-110). Kluwer Academic Publishers, Dordrecht. - Escalona M, Lorenzo JC, Gonzalez B, Daquinta M, Fundora Z, Borrto CG, Espinosa D, Arias E & Aspiolea ME,
24. (1998). New system for in vitro propagation of pineapple (Ananas comosus (L.) Merr).Pineapple News. 5. pp: 5-7. - Etienne H. & Berthouly M., (2002). Temporary immersion systems in plant micropropagation. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 69: 215–231. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht.