Giáo trình Thực tập vi sinh gây bệnh

80 trang phuongnguyen 5090

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Giáo trình Thực tập vi sinh gây bệnh", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

giao_trinh_thuc_tap_vi_sinh_gay_benh.pdf

Nội dung text: Giáo trình Thực tập vi sinh gây bệnh

Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh gây bệnh - Trường Đại học Mở Tp. HCM Dương Nhật Linh BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC Giáo trình THỰC TẬP VI SINH GÂY BỆNH Biên soạn: Dương Nhật Linh Nguyễn Văn Minh Tp.HCM, năm 2008 (Lưu hành nội bộ) 1
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh gây bệnh - Trường Đại học Mở Tp. HCM Dương Nhật Linh MỤC LỤC PHẦN 1: MỘT SỐ KỸ THUẬT CƠ BẢN Bài 1: Khảo sát trực tiếp BÀI 2: Kỹ thuật kháng sinh đồ PHẦN 2: MỘT SỐ KỸ THUẬT ĐỊNH DANH VI KHUẨN BÀI 1: Kỹ thuật định nhĩm cầu khuẩn BÀI 2: Kỹ thuật định danh phẩy khuẩn tả BÀI 3: Kỹ thuật định danh trực khuẩn mủ xanh BÀI 4: Kỹ thuật định danh vi khuẩn thương hàn Salmonella typhi PHẦN 3: KỸ THUẬT PHÂN TÍCH BỆNH PHẨM BÀI 1: Phương pháp lấy và gửi bệnh phẩm BÀI 2: Phân tích bệnh phẩm: các mẩu mủ và chất dịch. PHẦN 4: PHẢN ỨNG HUYẾT THANH HỌC BÀI 1: Phản ứng ngưng kết kháng nguyên - kháng thể BÀI 2: Phản ứng ngưng kết hồng cầu HA (Hemagglutination test) và Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu HI (Hemagglutination Inhibition test) 2
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh gây bệnh - Trường Đại học Mở Tp. HCM Dương Nhật Linh PHẦN 1: MỘT SỐ KỸ THUẬT CƠ BẢN 3
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh gây bệnh - Trường Đại học Mở Tp. HCM Dương Nhật Linh Bài 1: KHẢO SÁT TRỰC TIẾP I/ CÁC PHƯƠNG PHÁP KHẢO SÁT TRỰC TIẾP. 1. Soi tươi - Qua kính hiển vi thường. + Soi tươi khơng cần nền, là phương pháp soi tươi qua kính hiển vi đĩng bớt tụ quang, với bệnh phẩm được đặt trong một giọt nước muối sinh lý trên một lame kính, treo hay ép dưới một lamelle. Phương pháp nầy dùng để xem sự di động của vi khuẩn. + Soi tươi cần nền, là phương pháp soi tươi qua kính hiển vi đĩng bớt tụ quang với bệnh phẩm được đặt trong một giọt dung dịch màu làm nền như dung dịch mực tàu; nigrosin; methylene blue, trên một lame kính, ép dưới một lamelle. Phương pháp nầy dùng xem nang vi khuẩn, hay tìm nấm men cĩ trong bệnh phẩm như Cryptococcus neoformans trong dịch não tuỷ. - Qua kính hiển vi nền đen hay đảo phase + Qua kính hiển vi nền đen, mục đích thơng thường nhất là xem hình dạng và sự di động của vi khuẩn cĩ trong một bệnh phẩm đặt trong một giọt nước muối sinh lý trên một lame kính ép dưới một lamelle. Phương pháp này được dùng để tìm xoắn khuẩn giang mai, vi khuẩn leptospira, hay khảo sát sự di động vi khuẩn. + Qua kính hiển vi đảo phase, mục đích thơng thường nhất là xem nang vi khuẩn như là S. pneumoniae, hay tìm nấm men cĩ trong bệnh phẩm như Cryptococcus neoformans trong dịch não 4
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh gây bệnh - Trường Đại học Mở Tp. HCM Dương Nhật Linh tuỷ. 2. Nhuộm. - Nhuộm Gram, là phương pháp nhuộm thơng thường nhất trong các phịng thí nghiệm vi sinh. Phương pháp nhuộm Gram cho phép xác định được hình dạng, cách sắp xếp, và phân biệt vi khuẩn là thuộc loại Gram [+] hay Gram [-]. - Nhuộm đơn Methylene blue kiềm, là phương pháp hay được dùng để nhuộm khảo sát cĩ sự hiện diện của vi khuẩn Corynebacteria hay khơng vì phương pháp nầy cho phép nhuộm vi khuẩn và các hạt biến sắc cĩ trong vi khuẩn. - Nhuộm kháng acid, là phương pháp hay được dùng để nhuộm và phát hiện các vi khuẩn kháng acid như các Mycobacteria. - Phương pháp nhuộm huỳnh quang, là phương pháp nhuộm vi khuẩn bằng phẩm màu huỳnh uang, và chỉ áp dụng cho một số trường hợp như nhuộm huỳnh quang rhodamin phếtđàm tìm vi khuẩn lao. - Phương pháp nhuộm kháng thể đặc hiệu đánh dấu men hay đánh dấu huỳnh quang, là các phương pháp phát hiện trực tiếp vi sinh vật muốn tìm cĩ trong bệnh phẩm nhờ kháng thể đặc hiệu kháng nguyên vi sinh vật được đánh dấu bằng men (phát hiện qua quan sát bằng kính hiển vi thường) hay bằng huỳnh quang (phát hiện qua quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang) - Các phương pháp nhuộm khác, như nhuộm nang, flagella, spore chỉ được dùng trong các trường hợp đặc biệt. 5
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh gây bệnh - Trường Đại học Mở Tp. HCM Dương Nhật Linh II. VAI TRỊ VÀ Ý NGHĨA CỦA KHẢO SÁT TRỰC TIẾP. 1. Cho kết quả rất sớm, gần như chung cuộc. Cĩ những kết quả khảo sát trực tiếp giúp bác sĩ lâm sàng và phịng thí nghiệm nghĩ ngay đến tác nhân gây bệnh với sự chính xác gần như 99%, ví dụ: - Kết quả khảo sát trực tiếp dịch não tuỷ thấy cĩ song cầu Gram [- ]; nghĩ ngay đến tác nhân N. meningitidis, thấy song cầu Gram [+] hình mũi giáo; nghĩ ngay đến S. pneumoniae, hay thấy trực khuẩn Gram [-] nhỏ; nghĩ ngay đến H. influenzae - Kết quả soi tươi mủ niệu đạo từ đàn ơng thấy cĩ song cầu Gram [-]; nghĩ ngay đến tác nhân N. gonorrhoeae - Kết quả soi tươi dịch não tuỷ thấy cĩ nấm men cĩ nang; nghĩ ngay đến tác nhân nấm men C. neoformans - Kết quả khảo sát trực tiếp phết quệt cổ tử cung phát hiện C. trachomatis bằng phương pháp nhuộm kháng thể huỳnh quang đặc hiệu C. trachomatis dương tính là đủ để kết kuận bệnh nhân bị nhiễm vi khuẩn này. Các kết quả như trên rất cĩ giá trị giúp cho bác sĩ điều trị chọn được kháng sinh điều trị ban đầu, và giúp phịng thí nghiệm biết được hướng phân lập; định danh; và kháng sinh đồ trong xét nghiệm cấy và phân lập tiếp theo. 2. Cho kết quả sớm và gợi ý. Rất nhiều kết quả khảo sát trực tiếp, nếu biết tận dụng, bác sĩ lâm sàng sẽ cĩ hướng điều trị ban đầu cũng như phịng thí nghiệm cĩ hướng phân lập và định danh. Ví dụ: - Khảo sát trực tiếp nước tiểu, thấy cĩ 1 vi khuẩn/quang trường 6
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh gây bệnh - Trường Đại học Mở Tp. HCM Dương Nhật Linh x100, cĩ thể nghĩ ngay là bệnh nhân bị nhiễm trùng tiểu và cĩ thể chọn lựa kháng sinh điều trị bước đầu tùy theo hình ảnh Gram của vi khuẩn hiện diện trong mẫu. - Khảo sát phết nhuộm Gram mẫu mủ, hay abcess, hình ảnh vi khuẩn thấy trong bệnh phẩm qua phết nhuộm Gram gợi ý được tác nhân vi khuẩn gây bệnh, nhờ đĩ bác sĩ lâm sàng sẽ cĩ hướng điều trị ban đầu cũng như phịng thí nghiệm cĩ hướng phân lập và định danh . 3. Cho kết quả đánh giá mẫu cĩ tin cậy để nuơi cấy và phân lập hay khơng, và cho kết quả gợi ý. - Làm một phết Gram mẫu đàm, quan sát ở quang trường x100, cĩ thể đánh giá mẫu tin cậy hay khơng để cĩ thể tiếp tục thực hiện quá trình nuơi cấy phân lập - Cũng qua phết nhuộm Gram mẫu đàm, Mnếu mẫu tin cậy, cĩ thể tiếp tục qua quang trường x1.000 để quan sát hình ảnh Gram các vi khuẩn hiện diện, và kết quả nầy sẽ rất cĩ giá trị gợi ý cho phịng thí nghiệm hướng phân lập vi khuẩn gây bệnh, và bác sĩ sẽ cĩ thể cĩ hướng dùng kháng sinh nào trong điều trị ban đầu. 4. Cĩ những trường hợp mẫu khơng cần phải làm khảo sát trực tiếp. - Mẫu quyệt họng, nếu khơng cĩ yêu cầu tìm vi khuẩn bạch hầu thì khơng cần thiết phải làm khảo sát trực tiếp vì khơng cĩ sự khác biệt giữa mẫu khơng bênh với mẫu bệnh. - Mẫu phân, nếu khơng cĩ yêu cầu tìm Campylobacter, V. cholerae thì khơng cần thiết phải làm khảo sát trực tiếp. 7
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh gây bệnh - Trường Đại học Mở Tp. HCM Dương Nhật Linh III/ CÁC PHƯƠNG PHÁP NHUỘM. A/ NGUYÊN TẮC CHUNG KHI LÀM TIÊU BẢN NHUỘM. 1/ Phết kính tiêu bản. Lau nhẹ tiêu bản sạch bằng giấy mềm, hơ qua đèn cồn. Dùng bút chì mỡ hoặc bút lơng ghi tên mẫu, và vẽ vịng trịn f » 15mm, ở mặt dưới lame kính để đánh dấu vết khuẩn phía trên lame. Đốt nĩng đỏ que cấy ( trước và sau khi thao tác ), mở nút bơng, hơ nhanh miệng ống nghiệm. Trường hợp 1: mẫu nuơi cấy trong canh dinh dưỡng, đưa đầu que cấy vào miệng ống nghiệm ( vẫn giữ gần ngọn lửa ), nhúng vào dung dịch canh cấy, lấy 1 vịng que cấy. Lấy que cấy ra, hơ nhanh miệng ống nghiệm và nút bơng, đậy nút bơng lại. Phết canh khuẩn trên vịng que cấy vào mặt trên lam, giữa vịng trịn,dàn đều ra xung quanh. Trường hợp 2: mẫu nuơi cấy trong thạch dinh dưỡng, nhỏ giọt dung dịch NaCl 9‰ lên giữa vịng trịn (mặt trên lam . Thao tác giống trường hợp 1, nhưng dùng cạnh vịng trịn của đầu que cấy đặt nhẹ lên khuẩn lạc vi khuẩn, rồi đặt vào giọt NaCl 9‰ trên lam, dàn mỏng và đều. 2/ Cố định mẫu: Mục đích giết chết vi khuẩn và làm cho vi khuẩn bám chặt vào lame. Cố định mẫu bằng cách để khơ tự nhiên. Chú ý: Nếu cố định khơng tốt vi khuẩn sẽ trơi đi trong quá trình nhuộm. 8
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh gây bệnh - Trường Đại học Mở Tp. HCM Dương Nhật Linh Khi cố định mẫu, chỉ hơ nhanh chứ khơng đốt trên ngọn lửa. Khơng được chạm vào thành khi đưa đầu que cấy vào và ra khỏi ống nghiệm vi khuẩn. Hình 1: Sơ đồ thứ tự phết kính. B/ CÁC PHƯƠNG PHÁP NHUỘM. 1/ Phương pháp nhuộm gram ( Christian Gram ): Dùng phân biệt vi khuẩn gram dương và gram âm. Ø Nguyên tắc: 9
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh gây bệnh - Trường Đại học Mở Tp. HCM Dương Nhật Linh Nhuộm Gram, là phương pháp nhuộm thơng thường nhất trong các phịng thí nghiệm vi sinh. Phương pháp nhuộm Gram cho phép xác định được hình dạng, cách sắp xếp và phân biệt vi khuẩn là thuộc loại Gram[+] hay Gram[-]. Do sự khác biệt về cấu trúc vách tế bào nên trong quá trình nhuộm Gram, vi khuẩn Gram [+] sẽ giữ được phức hợp tím Gentian-iode khơng bị tẩy màu bởi alcool, trong khi vi khuẩn Gram [-] khơng giữ được phức hợp màu này, do vậy kết quả sau khi nhuộm là vi khuẩn Gram [+] vẫn giữ được màu tím của gentian, cịn vi khuẩn Gram [-] ăn màu hồng của phẩm màu safranin hay fuchsin. Ø Thao tác: - Đặt tiêu bản đã phết kính và cố định mẫu lên thanh thủy tinh chữ U, trên thau nhựa. - Đặt miếng giấy lọc lên vịng phết kính. - Nhỏ dd Crystal violet thấm ướt hết giấy lọc. Để từ 1 – 2 phút ( nếu vi khuẩn lấy từ canh lỏng để 2 phút, lấy từ thạch dinh dưỡng để 1 phút ). Rửa nước, thấm khơ. - Tẩy cồn 96o từ 15 – 30 giây ( từ canh lỏng tẩy 15 giây, từ thạch dinh dưỡng tẩy 30 giây ). Rửa nước, thấm khơ. Tẩy cồn bằng cách để nghiêng tiêu bản, cho cồn chảy từ từ ở mép trên phiến kính. Quan sát ở mép dưới cho đến khi giọt cồn vừa mất màu tím. - Đặt miếng giấy lọc lên vết khuẩn, nhỏ dung dịch Fuschin kiềm lỗng (hoặc Safranin O), để 1 phút. Rửa nước, thấm khơ. - Quan sát bằng vật kính dầu, độ phĩng đại 1.000 lần. Vi khuẩn Gr+ bắt màu tím Crystal violet, vi khuẩn Gr– bắt màu hồng Fuschin ( Safranin O). 10
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh gây bệnh - Trường Đại học Mở Tp. HCM Dương Nhật Linh Chú ý: - Trước mỗi lần nhỏ thuốc nhuộm lên tiêu bản, phải đặt miếng giấy lọc phủ lên vết bơi. - Sau mỗi lần nhuộm đều phải rửa nước và thấm khơ tiêu bản. Hình 2: Sơ đồ thứ tự nhuộm Gram. Ø Đọc kết quả: - Quan sát phết nhuộm Gram qua kính hiển vi, dưới vật kính dầu, chúng ta sẽ thấy vi khuẩn Gram[+] ăn màu tím, cịn vi khuẩn Gram[-] ăn màu hồng. - Khi trả lời một kết quả nhuộm Gram, phải trả lời các chi tiết sau: + Hình dáng vi khuẩn. + Cách sắp xếp các vi khuẩn. + Cách ăn màu của vi khuẩn, tức là vi khuẩn Gram [+] hay Gram [-]. 11
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh gây bệnh - Trường Đại học Mở Tp. HCM Dương Nhật Linh 2/ Phương pháp nhuộm Ziehl – Neelsen (kháng acid): Dùng phân biệt vi khuẩn Lao với các vi khuẩn khác: Ø Nguyên tắc: Do tế bào vi khuẩn kháng acid cĩ lớp vỏ sáp bao bọc nên khi đã nhuộm được phức hợp màu carbolfuchsin, phức hợp này sẽ khơng bị tẩy màu bởi dung dịch tẩy màu mạnh (acid, alcool acid). Tuy nhiên để phức hợp màu này cĩ thể thấm xuyên qua lớp vỏ sáp của vi khuẩn, cĩ hai cách: (1) Đun nĩng phết nhuộm với dung dịch màu carbolfuchin, nhờ đĩ mà carbolfuchsin thấm qua lớp vỏ sáp của vi khuẩn để nhuộm màu vi khuẩn; đây là phương pháp nhuộm nĩng Ziehl Neelsen. (2) Phương pháp thứ hai là phương pháp nhuộm lạnh cịn gọi là phương pháp Kinyoun, trong phương pháp này người ta dùng dung dịch carbolfuchsin đậm đặc, nhờ vậy khi phủ dung dịch màu đậm đặc này lên phết nhuộm với thời gian lâu, carbolfuchsin vẫn cĩ thể thấm qua lớp vỏ sáp để nhuộm màu vi khuẩn. Ø Thao tác: - Đặt tiêu bản đã phết kính và cố định mẫu lên thanh thủy tinh chữ U, đặt trên thau nhựa. - Đặt miếng giấy lọc lên vịng phết kính. - Nhỏ dung dịch Fuschin đậm đặc thấm ướt hết giấy lọc, hơ nĩng liên tục từ 5 – 7 phút. - Trong khi hơ phải nhỏ bổ sung thuốc nhuộm liên tục để giấy lọc luơn thấm ướt. - Rửa nước, thấm khơ. - Tẩy cồn – acid đến khi khơng cịn màu hồng của Fuschin đậm đặc ( khoảng 30 giây ). 12
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh gây bệnh - Trường Đại học Mở Tp. HCM Dương Nhật Linh - Rửa nước, thấm khơ. - Quan sát bằng vật kính dầu, độ phĩng đại 1.000 lần. - Vi khuẩn lao bắt màu hồng Fuschin, vi khuẩn khác bắt màu xanh methylen. Chú ý: Trước mỗi lần nhỏ thuốc nhuộm lên tiêu bản, phải đặt miếng giấy lọc phủ lên vết bơi. Sau mỗi lần nhuộm đều phải rửa nước và thấm khơ. Trong khi hơ nĩng: dung dịch nhuộm khơng được sơi, thuốc nhuộm phải luơn thấm ướt giấy, khơng được khơ. Khơng được nhầm lãn giữa cồn – acid ( nhuộm Ziehl Neelsen ) và cồn 96o ( dùng nhuộm Gram ). Ø Đọc kết quả: - Quan sát phết nhuộm kháng acid qua kính hiển vi, dưới vật kính dầu, trực khuẩn kháng acid ăn màu đỏ cánh sen, cịn vi - khuẩn thường cũng như các nền khác như tế bào biểu mơ hay bạch cầu ăn màu xanh methylene blue. - Khi trả lời một kết quả nhuộm kháng acid, khơng được kết luận là dương tính M. tuberculosis mà chỉ trả lời cĩ hiện diện trực khuẩn kháng acid. - Riêng đối với mẫu đàm, cần quan sát 3 dịng, mỗi dịng quan sát khoảng 100 quang trường (QT) dầu, ghi nhận kết quả theo bảng dưới đây để trả lời trên phiếu trả lời kết quả: Cách ghi kết quả quan sát phết nhuộm kháng acid một mẫu đàm: Số trực khuẩn kháng acid /số quang trường Cách ghi 13
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh gây bệnh - Trường Đại học Mở Tp. HCM Dương Nhật Linh kết quả 1-2/300 QT (3 dịng) +/- 1-9/100 QT (1 dịng) 1+, số trung bình/100 QT 1-9/10 QT 2+, số trung bình/10 QT 1-9/1 QT 3+, số trung bình/1QT >9/1 QT 4+, >9/QT 3/ Nhuộm methylene blue kiềm Ø Nguyên tắc. Methylene blue khi được làm kiềm hố thì sẽ nhuộm được các hạt biến sắc của các trực khuẩn Corynebacteria, đặc biệt là trực khuẩn bạch hầu. Do vậy nhuộm methylene blue kiềm ngồi mục đích dùng để nhuộm đơn, nhuộm nền sau khi nhuộm kháng acid, cịn cĩ mục đích chính là nhuộm các phết bệnh phẩm quệt hầu họng để phát hiện Corynebacterium diphtheriae. Ø Bộ thuốc nhuộm methylene blue kiềm Để nhuộm methylene blue kiềm, cần cĩ chai thuốc nhuộm methylene blue kiềm chứa trong chai sẫm màu, nắp vặn chặt, giữ trong tối ở nhiệt độ phịng. Ø Phương pháp thực hiện. - Trước hết làm một phết mỏng bệnh Phẩm hay vi khuẩn trên lame kính, để khơ tự nhiên, rồi sau đĩ gắn trên lame bằng cách hơ nhanh qua ngọn lửa đèn cồn hay đèn bunsen 3 lần. Lưu ý là chỉ hơ nhẹ trên ngọn lửa để lame chỉ ấm lên vừa phải chứ khơng làm lame bị quá nĩng vì như vậy sẽ làm biến thể hình 14
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh gây bệnh - Trường Đại học Mở Tp. HCM Dương Nhật Linh dạng vi khuẩn. - Đặt lame trên giá nhuộm, cho vài giọt thuốc nhuộm methylene blue kiềm phủ trùm lên phết vi khuẩn, để yên trong 1 phút. Sau đĩ cầm lame lên và rửa sạch màu thừa dính trên lame dưới một vịi nước máy chảy rất nhẹ. - Thấm khơ lame bằng cách ép lame giữa 2 tờ giấy thấm. Để khơ lame hồn tồn trong khơng khí. Sau đĩ nhỏ một giọt dầu soi kính lên phết nhuộm và quan sát qua kính hiển vi, trước hết ở vật kính x10 để tìm vùng phết bệnh phẩm, sau đĩ xoay sang vật kính ×100 (vật kính dầu) để quan sát hình thái và cách ăn màu của vi khuẩn. Ø Đọc kết quả. Tế bào vi khuẩn bắt màu xanh biển nhạt, các hạt biến sắc bắt màu tím đen. 15
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh gây bệnh - Trường Đại học Mở Tp. HCM Dương Nhật Linh BÀI 2: KỸ THUẬT KHÁNG SINH ĐỒ - Kháng sinh đồ là phương pháp tìm độ nhạy cảm của vi khuẩn với các loại kháng sinh. - Thử nghiệm kháng sinh đồ được chỉ định thực hiện trên bất cứ vi khuẩn nào gây ra tiến trình nhiễm trùng nhằm đảm bảo được kháng sinh trị liệu một khi khơng thể đốn trước được một cách chính xác độ nhạy cảm của vi khuẩn đối với kháng sinh nếu chỉ dựa vào định danh vi khuẩn. - Thử nghiệm kháng sinh đồ thường được thực hiện khi tác nhân vi khuẩn được coi là thuộc các lồi cĩ khả năng đề kháng được các kháng sinh thơng dụng. - Cĩ một số vi khuẩn người ta cĩ thể đốn trước được độ nhạy cảm với kháng sinh và cĩ thể dùng được kháng sinh điều trị theo kinh nghiệm. Khơng cần thiết làm kháng sinh đồ khi nhiễm trùng đĩ gây ra do vi khuẩn đã được biết là luơn luơn nhạy cảm với kháng sinh điều trị. - Kháng sinh đồ rất quan trọng trong việc nghiên cứu dịch tễ học kháng thuốc và trong nghiên cứu các kháng sinh mới. - Cĩ nhiều phương pháp thử kháng sinh đồ, phạm vi bài này ta khảo sát 2 phương pháp: · Phương pháp khuếch tán kháng sinh đồ trên thạch Kirby Bauer. · Phương pháp pha lỗng kháng sinh liên tiếp (Phương pháp MIC tìm nồng độ ức chế tối thiểu). 16
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh gây bệnh - Trường Đại học Mở Tp. HCM Dương Nhật Linh I. PHƯƠNG PHÁP KIRBY BAUER. 1. Nguyên tắc. Kháng sinh được tẩm vào đĩa giấy theo nồng độ cho từng loại. Kháng sinh sẽ khuếch tán chung quanh mặt thạch mơi trường nuơi cấy. Đường kínhvịng vơ khuẩn 2. Chuẩn bị vật liệu. 2.1 Đĩa kháng sinh. - Chọn lựa các kháng sinh thích hợp nhất để thử nghiệm và phúc trình kết quả là quyết định của phịng thí nghiệm vi sinh lâm sang để cĩ thể tham vấn với các bác sĩ, khoa dược, các bộ phận dược chính và ủy ban kiểm sốt nhiễm trùng của bệnh viện. - Cĩ rất nhiều loại kháng sinh. Tuy nhiên khơng thể thử nghiệm kháng sinh đồ hết cho tất cả các loại mà cần phải cĩ sự lựa chọn. - Các tiêu chuẩn lựa chọn kháng sinh thử nghiệm được hướng dẫn chi tiết bởi Ủy ban Quốc gia về tiêu chuẩn của các phịng thí nghiệm tại Mỹ. Các tiêu chuẩn chính: + Chọn kháng sinh đại diện cho nhĩm cĩ cùng phổ hoạt động. + Tùy thuộc vào loại vi khuẩn thử nghiệm. + Tùy thuộc vào vị trí nhiễm khuẩn. + Tùy theo chiến lược và chính sách sử dụng kháng sinh ở từng vùng, từng địa phương. - Đĩa kháng sinh là những đĩa giấy cĩ đường kính 6mm, được tẩm dung dịch kháng sinh với nồng độ tiêu chuẩn. - Các đĩa kháng sinh được đĩng gĩi đảm bảo điều kiện khơng hút ẩm. Các đĩa kháng sinh nên được lưu trữ như sau: 17
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh gây bệnh - Trường Đại học Mở Tp. HCM Dương Nhật Linh + Các lọ chứa đĩa kháng sinh được giữ ở 80C hay thấp hơn hay giữ đơng ở -140C hay thấp hơn cho đến khi dùng. + Nên lấy các lọ chứa đĩa kháng sinh cịn đĩng kín ra khỏi tủ lạnh trong khoảng 1- 2h để nhiệt độ trong lọ bằng với nhiệt độ phịng thí nghiệm trước khi mở nắp. Thao tác này nhằm tránh các giọt nước đọng lại trên đĩa do khí ấm tiếp xúc với nhiệt độ lạnh của đĩa. + Khi khơng sử dụng, dụng cụ phân phối địa cĩ chứa đĩa kháng sinh phải luơn luơn được giữ trong tủ lạnh. + Chỉ sử dụng các đĩa cịn hạn dùng, loại bỏ các đĩa kháng sinh quá hạn. 2.2 Mơi trường cơ bản thực hiện kháng sinh đồ Thạch Mueller Hinton là mơi trường tốt nhất để thử nghiệm kháng sinh đồ thường qui (đối với vi khuẩn dễ mọc)vì các lý do sau: + Cho kết quả cĩ tính lặp lại cao khi thử nghiệm kháng sinh đồ với các loạt mơi trường. + Ít chất ức chế đối với sulfonamide, trimethprim và tetracycline. + Thích hợp tăng trưởng cho hầu hết các vi khuẩn dễ mọc. + Một số lượng lớn các dữ liệu và kinh nghiệm là cĩ từ kháng sinh đồ thực hiện trên mơi trường này. Đối với các vi khuẩn khĩ mọc thì tiêu chuẩn mơi trường phải được biến đổi cho phù hợp, bổ sung các chất đối với mỗi loại vi khuẩn. VD: 18
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh gây bệnh - Trường Đại học Mở Tp. HCM Dương Nhật Linh - Đối với các lồi Haemophilus phải chọn mơi trường thử nghiệm là HTM (Haemophilus Test Medium). - Đối với việc phát hiện chủng Staphylococci kháng Methycilline thì mơi trường cần thêm 2% NaCl, chỉnh pH mơi trường từ 7.2 -7.4. - Đối với việc phát hiện chủng Pseudomonas aeruginosa đối với các kháng sinh trong nhĩm Aminoglycosides cần them Ca++ và Mg++. Pha thạch MHA và những điều cần lưu ý: + Được pha từ mơi trường khơ cĩ sẵn trên thương mại, theo chỉ dẫn của nhà sản xuất. + Được để nguội từ 45 – 500C trong máy cách thủy (bể điều nhiệt) ngay sau khi hấp ướt. + Đổ mơi trường vừa pha và để nguội vào các hộp Petri phải thật phẳng đáy và Petri này được đặt trên mặt thật phẳng để thạch cĩ bề dày đồng nhất khoảng 4mm + Nên để nguội mơi trường ở nhiệt độ phịng thí nghiệm, nếu chưa sử dụng trong ngày nên giữ trong tủ lạnh từ 2 – 80C và được bọc trong bao plastic để hạn chế sự mất nước. Các hộp thạch chỉ nên được dùng trong vịng 1 tuần kể từ ngày pha. + Một mẫu đại diện cho các hộp thạch đã pha nên được kiểm tra ngoại nhiễm bằng cách mang ủ 35- 350C/ 24h. + Nếu trước khi dùng, trên mặt thạch quá ẩm thì nên để hộp thạch ở tủ ấm 350C hay trong buồng khí lưu cho đến khi khơ mặt (khoảng 10- 30 phút) 19
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh gây bệnh - Trường Đại học Mở Tp. HCM Dương Nhật Linh + Khi trải vi khuẩn, mặt thạch nên ẩm nhưng khơng cĩ nước đọng trên mặt và trên nắp đậy. 2.3 Dung dịch chuẩn độ đục 0.5 McFarland - Để chuẩn mực hĩa độ đục của vi khuẩn thử nghiệm phải đạt 8 10 tế bào/ml, nên dùng huyền dịch BaSO4 tương đương độ đục 0.5McFarland hay một huyền dịch tương đương thấy bằng mắt thường (huyền dịch latex). - Pha độ đục chuẩn dựa trên nguyên tắc phản ứng giữa : H2SO4 + BaCl BaSO4¯ + HCl - Cĩ 2 cách pha: CÁCH 1: Chọn 10 ống nghiệm cùng chất liệu pha dung dịch chuẩn như sau: Thứ tự BaCl 1% Số lượng vi H2SO41% khuẩn x 106 1 9,9 0,1 300 2 9,8 0,2 600 3 9,7 0,3 900 4 9,6 0,4 1200 5 9,5 0,5 1500 6 9,4 0,6 1800 7 9,3 0,7 2100 8 9,2 0,8 2400 9 9,1 0,9 2700 10 9,0 1 3000 20
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh gây bệnh - Trường Đại học Mở Tp. HCM Dương Nhật Linh Để ống đục chuẩn 0.5 McFarland cĩ độ đục tương đương với số lượng vi khuẩn là 108 tế bào/ml thì ta lấy ống số 1 đã pha tương ứng với 3. 108 tế bào/ml pha lỗng thêm 3 lần. Cách pha: dùng ống nghiệm số 1, lắc đều, hút lấy 4ml pha vào 8ml nước cất vơ khuẩn, trộn đề, bỏ 2 ml, đậy kín à dùng ống này làm ống đục chuẩn 0.5McFarland. CÁCH 2: Pha dung dịch dự trữ: a. Dung dịch dự trữ A : (0,048 M) BaCl2 . 2H2O :11.75g Nước cất vừa đủ :1000ml b. Dung dịch dự trữ B : (0,36N) H2SO4 :1% c. Dung dịch chuẩn độ đục Dung dịch A : 0,5ml Dung dịch B : 99,5ml Đậm độ chính xác của độ đục chuẩn nên được xác định bằng quang phổ kế đo độ hấp thụ. Độ đục chuẩn 0.5McFarland phải đo độ hấp thụ ở bước sĩng 625nm đạt 0.08 đến 0.1. - Nên phân phối 4 -6ml huyền dịch BaSO4 vào các tube nắp vặn cĩ cùng cỡ với tube pha dịch khuẩn thử nghiệm - Các tube này nên vặn kín nắp và giữ trong tối ở nhiệt độ phịng thí nghiệm - Trước khi dùng, phải lắc mạnh tube chứa độ đục chuẩn để đạt được độ đục đồng nhất. Nếu cĩ lợn cợn phải thay ống này bằng ống khác. - Nếu sử dụng ống đục chuẩn này thì hàng tháng phải thay tube độ đục chuẩn mới hay phải định lại đậm độ của nĩ. 21
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh gây bệnh - Trường Đại học Mở Tp. HCM Dương Nhật Linh 3. Quy trình thực hiện thử nghiệm khuếch tán. 3.1 Chuẩn bị dịch khuẩn thử nghiệm. Cĩ 2 phương pháp. Ø Phương pháp tăng sinh để pha huyền dịch vi khuẩn - Trên mặt thạch phân lập thuần khiết, chọn ít nhất từ 3 – 5 khĩm vi khuẩn giống nhau và tách rời cấy truyền vào 4- 5ml mơi trường lỏng thích hợp như: NB, TSB. - Ủ canh cấy lỏng ở 350C cho đến khi đạt được hay hơn độ đục chuẩn 0.5McFarland (thường từ 2- 6h). Huyền dịch vi khuẩn như vậy chứa khoảng 1- 2 x 108 tế bào/ml. - Dùng mơi trường lỏnghay nước muối sinh lý vơ khuẩn để điều chỉnh độ đục của canh cấy vi khuẩn đang tăng trưởng này đến độ đục chuẩn 0.5McFarland. Để thực hiện được chính xác bước này thì cĩ thể dùng quang kế hay nhìn bằng mắt thường bằng cách dùng đủ ánh sang để so sánh tube chứa vi khuẩn với tube độ đục chuẩn 0.5McFarland trên một tấm bìa cứng cĩ kẽ những vạch đen Ø Pha huyền dịch vi khuẩn trực tiếp từ khĩm vi khuẩn. - Cũng thuận tiện như phương pháp tăng sinh, cĩ thể pha huyền dịch vi khuẩn trong mơi trường lỏng hay trong n ước muối sinh lý trực tiếp từ các khĩm vi khuẩn mọc trên mặt thạch nuơi cấy đã ủ 18- 24h (nên dùng mơi trường thạch khơng chọn lọc như BA). Điều chỉnh huyền dịch vi khuẩn đạt độ đục chuẩn 0.5McFarland như đã trình bày ở phần trên. 22
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh gây bệnh - Trường Đại học Mở Tp. HCM Dương Nhật Linh - Đây là cách được chọn để thử nghiệm kháng sinh đồ các vi khuẩn khĩ mọc như: Haemophilus spp., N.gonorrhoeae , S. pneumoniae và thử nghiệm vi khuẩn Staphylococci kháng Methycilline hay Oxacilline. 3.2 Trải dịch khuẩn trên mặt thạch. - Trong vịng 15 phút sau khi pha huyền dịch vi khuẩn, dùng 1 que gịn vơ khuẩn nhúng vào huyền dịch rồi lấy lên ép và xoay nhẹ que gịn trên thành ống nghiệm. Thao tác này sẽ loại bỏ được lượng huyền dịch vi khuẩn thừa khỏi que gịn. - Trải đầy vi khuẩn từ que gịn lên mặt thạch MHA đã hong khơ trước đĩ. Trải bằng cách cấy vạch que gịn lên mặt thạch, xong lại xoay mặt thạch 600 rồi cấy vạch 1 lần nữa, tiếp tục như vậy để đảm bảo trải đầy được vi khuẩn lên mặt thạch - Để cho khơ mặt trước khi đặt đĩa kháng sinh lên mặt thạch. - LƯU Ý: Tránh trải mầm cấy quá dày. Tuyệt đối khơng bao giờ trải vi khuẩn từ canh cấy vi khuẩn qua đêm khơng pha lỗng hay khơng đúng độ đục chuẩn. 3.3 Đặt đĩa kháng sinh lên mặt thạch đã trải vi khuẩn. - Xác định bộ đĩa kháng sinh nào nên đặt lên mặt thạch. Khi đặt phải ép nhẹ mỗi đĩa kháng sinh để đảm bảo chúng tiếp xúc hồn tồn với mặt thạch. Đặt đĩa kháng sinh bằng tay hay bằng dụng cụ phân phối đĩa đều phải đảm bảo các tâm đĩa kháng sinh khơng gần nhau dưới 24mm và cách mép hộp Petri 2.5 -3cm. Thường với hộp thạch Ø 150mm khơng đặt quá 12 đĩa, Ø90mm khơng đặt quá 7 đĩa. 23
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh gây bệnh - Trường Đại học Mở Tp. HCM Dương Nhật Linh - Kháng sinh khuếch tán ngay sau khi đĩa kháng sinh chạm mặt thạch, vì vậy khơng nên dời chỗ các đĩa kháng sinh sau khi đã đặt lên mặt thạch. - Trong vịng 15 sau khi đã đặt các đĩa kháng sinh, phải ủ sấp hộp thạch (đáy trên, nắp dưới) ở 350C. Ngoại trừ vi khuẩn Haemophilus spp. và S. pneumoniae thì khơng ủ hộp thạch trong khí trường nhiều CO2 vì các tiêu chuẩn biện luận kết quả đều được hình thành từ điều kiện ủ bình thường và ngồi ra CO2 cịn cĩ thể làm thay đổi đáng kể đường kính các vịng vơ khuẩn. 3.4 Đọc và biện luận kết quả - Sau khi ủ 16 – 18h, đọc kết quả các hộp thạch. Nếu mặt thạch được trải vi khuẩn đúng cách , đúng độ đục chuẩn, vi khuẩn sẽ mọc thành những khĩm mịn tiếp hợp nhau và vịng vơ khuẩn sẽ là một vịng trịn đồng nhất. Nếu vi khuẩn mọc thành những khĩm riêng lẽ thì mầm cấy quá lỗng à phải làm lại thử nghiệm - Đo đường kính vịng vơ khuẩn là một vịng, kể cả đường kính của đĩa kháng sinh, hồn tồn khơng thấy vi khuẩn mọc và thấy được bằng mắt thường - Đo đường kính vịng vơ khuẩn thành mm trịn , bằng compa trượt hay thước kẽ trượt hay thước thiết kế dành riêng cho mục đích này bằng cách áp thước lên mặt sau của đáy hộp thạch và rọi bằng ánh sáng phản chiếu - Chu vi vịng vơ khuẩn là vùng mà thấy bằng mắt thường , khơng thể thấy vi khuẩn mọc. Khơng cần để ý đến các khĩm vi khuẩn li ti hay sự tăng trưởng nhẹ của vi khuẩn bên trong 24
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh gây bệnh - Trường Đại học Mở Tp. HCM Dương Nhật Linh vịng vơ khuẩn mà chỉ cĩ thể thấy bằng kính lúp. Tuy nhiên, các khĩm vi khuẩn này cần phải được cấy, định danh và thử nghiệm lại - Biện luận đường kính vịng vơ khuẩn dựa theo tiêu chuẩn NCCLS và ghi nhận kết quả vi khuẩn nhạy cảm hay trung gian hay kháng đối với kháng sinh thử nghiệm. II. PHƯƠNG PHÁP MIC(Minimum Inhibitory Concetration) - Phương pháp Kirby Bauer chỉ cho biết kết quả theo định tính. Muốn biết nồng độ ức chế tối thiểu là bao nhiêu thì ta phải làm kháng sinh đồ theo phương pháp pha lỗng liên tiếp - Kháng sinh cĩ thể được pha lỗng theo 3 cách: + Một dãy ống nghiệm liên tiếp + Trên các giếng nhựa cứng + Trên các đĩa Petri chứa thạch MHA Trong bài thực hành này ta pha lỗng kháng sinh trong một dãy ống nghiệm. 25
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh gây bệnh - Trường Đại học Mở Tp. HCM Dương Nhật Linh + Phương pháp này chỉ tiến hành được ở các phịng xét nghiệm cĩ đủ điều kiện trang thiết bị, bột kháng sinh chuẩn, khơng khí sạch, mục đích là xác định nồng độ ức chế tối thiểu, từ đĩ cĩ thể tìm ra nồng độ tối thiểu diệt khuẩn (nồng độ kháng sinh thấp nhất để giết chết vi khuẩn). + Người ta dùng phương pháp này cho những nghiên cứu chuyên sâu về độ nhạy cảm của vi khuẩn đối với kháng sinh hoặc để kiểm chứng lại phương pháp Kirby Bauer. 1. Nguyên tắc. Dựa trên sự tương quan giữa nồng độ pha lỗng của kháng sinh đối với sự tăng trưởng của vi khuẩn trong mỗi nồng độ kháng sinh khác nhau mà ta xác định được nống độ ức chế tối thiểu của kháng sinh cĩ khả năng ngăn chặn sự tăng trưởng của vi khuẩn 2. Chuẩn bị vật liệu. 2.1 Chuẩn bị kháng sinh pha lỗng cĩ nồng độ 200µg/ml. Để cĩ thể pha lỗng kháng sinh chuẩn cĩ nồng độ 200µg/ml thì tuỳ thuộc vào loại bột kháng sinh tan trong dung dịch nào phù hợp thì ta chọn dung dịch đĩ làm dung dịch chuẩn để pha lỗng kháng sinh cĩ nồng độ theo yêu cầu. 2.2 Chuẩn bị vi khuẩn thử nghiệm. Vi khuẩn thử nghiệm cĩ số lượng cần đạt là 5. 105 tế bào/ml được pha như sau: 26
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh gây bệnh - Trường Đại học Mở Tp. HCM Dương Nhật Linh + Dùng vi khuẩn thử nghiệm được cấy vào canh trường để mọc tốt. Điều chỉnh độ đục của canh cấy vi khuẩn tương đương với độ đục chuẩn 0,5McFarland, cĩ nghĩa là lượng vi khuẩn đạt 108 tế bào/ ml. + Pha lỗng ống vi khuẩn 108 tế bào/ ml sang ống cĩ nồng độ 5.105 tế bào/ml như sau: + Pha lỗng 1/100 ống vi khuẩn ống vi khuẩn 108 tế bào/ ml với mơi trường NB hay nước muối sinh lý 0.85%. Như vậy ta cĩ ống đạt 106 tế bào/ml. + Hút 1 ml vi khuẩn 106 tế bào/ml cho vào 1ml kháng sinh đã pha lỗng ta sẽ cĩ mầm cấy cuối cùng đạt 5. 105 tế bào/ml. 3. Quy trình thực hiện thử nghiệm. - Đánh số ống nghiệm từ 1 đến 10. - Cho vào các ống nghiệm từ 2 –10 một lượng là 0.5ml mơi trường lỏng NB. - Pha lỗng kháng sinh liên tiếp theo tỉ lệ ½ từ ống số 2 đến ống số 9, ống 10 giữ nguyên (khơng cĩ kháng sinh). - Cho vào các ống nghiệm từ 1 đến 10 một lượng là 0.5ml huyền dịch vi khuẩn. - Lắc đều ống nghiệm và ủ trong tủ ấm 370C/ 18- 24h. Độ đục tăng dần hướng về ống 10 ống 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 nghiệm MT 0 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 27
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh gây bệnh - Trường Đại học Mở Tp. HCM Dương Nhật Linh NB(ml) K/sinh 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0 200µg/ml (ml) Hút bỏ 0.5ml từ ống số 9 VK 5.105 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 tế bào/ml (ml) Nồng độ 100 50 25 12.5 6.25 3.12 1.562 0.7812 0.3906 0 k/s 5 5 5 25 4. Đọc kết quả. - Ống 10 : đục do cĩ vi khuẩn mọc và khơng cĩ kháng sinh. - Ống 1: vi khuẩn khơng mọc dưới tác dũng của kháng sinh. - Cĩ một loạt ống đục hướng về ống số 10 và một loạt ống trong hướngvề ống số 1 - Quan sát 10 ống nghiệm, tìm xem ống nào là ống trong cuối cùng và trả lời kết quả nồng độ kháng sinh ở ống đĩ (đơn vị tính là µg/ml) và vi khuẩn nhạy cảm ở nồng độ bao nhiêu. 28
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh gây bệnh - Trường Đại học Mở Tp. HCM Dương Nhật Linh PHẦN 2: MỘT SỐ KỸ THUẬT ĐỊNH DANH VI KHUẨN 29
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh gây bệnh - Trường Đại học Mở Tp. HCM Dương Nhật Linh BÀI 1: KỸ THUẬT ĐỊNH DANH NHĨM CẦU KHUẨN I. TỤ CẦU KHUẨN STAPHYLOCOCCI. 1. NƠI CƯ TRÚ VÀ TÍNH GÂY BỆNH. Ø Tụ cầu khuẩn cĩ hơn 20 loại được phân thành 2 nhĩm lớn: coagulase dương và coagulase âm. Trong số này Staphylococcus aureus thuộc loại coagulase dương- tác nhân chính gây bệnh cho người và thủ phạm của nhiều nhiễm khuẩn trầm trọng. Những loại coagulase âm thường là những vi khuẩn thường trú. Tuy nhiên, S.epidermidis đơi khi gây nhiễm khuẩn máu, viêm nội tâm mạc, S.saprophyticus cĩ thể gây nhiễm khuẩn đường tiểu, S. homonis, S. haemolyticus và S. simulans cũng cĩ thể gây bệnh cho người. Ø Cĩ 3 loại tụ cầu khuẩn quan trọng thường gặp nhất. 1.1 Staphylococcus aureus (nhĩm coagulase dương). Ø Cĩ thể gây các bệnh nhiễm khuẩn thơng thường như mụn, mụn nhọt, mụn bọc, viêm lỗ tai và xoang mũi đến nhiễm khuẩn trầm trọng như sưng phổi, nhiễm khuẩn huyết, viêm màng não, viêm màng trong tim và nhiễm khuẩn đường tiểu. Ø Ngồi ra, một số loại tụ cầu nhiễm khuẩn vào thức ăn, khi vào cơ thể sẽ tiết ra độc tố đường ruột (Enterotoxin) làm người ăn bị nơn mửa, tiêu chảy dữ dội ngay sau vài giờ. 1.2 Staphylococcus epidermidis (nhĩm coagulase âm). Thường là tác nhân các bệnh nhiễm khuẩn, do tụ cầu cĩ tại bệnh viện gây ra. Chẳng hạn như nhiễm khuẩn do dùng các loại ống thơng (catheter) đưa vào các nơi sâu bên trong cơ thể. 30
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh gây bệnh - Trường Đại học Mở Tp. HCM Dương Nhật Linh 1.3 Staphylococcus saprophyticus (nhĩm coagulase âm). Thường gặp trong các bệnh nhiễm khuẩn đường tiểu ở phụ nữ. Một số người nhiễm tụ cầu khuẩn nhưng khơng biểu hiện ra các triệu chứng bệnh, đĩ gọi là người lành mang mầm bệnh. 2. ĐẶC TÍNH HÌNH THỂ VÀ NHUỘM. Hình cầu, đường kính khoảng 1μm, cĩ thể đứng riêng lẻ, đơi hay chuỗi ngắn (nhưng khơng quá 4-5 tế bào). Cách sắp xếp chủ yếu là thành hình chùm nho khơng đều nhau. Vi khuẩn bắt màu nhuộm Gram dương, nhưng cĩ thể biến thành Gram âm trong lứa cấy già. Khơng di động, khơng bào tử 3. ĐẶC TÍNH NUƠI CẤY. Ø Staphylococci mọc dễ dàng trên hầu hết các loại mơi trường nuơi cấy, trong điều kiện hiếu khí, vi hiếu khí và kỵ khí tuỳ nghi. Nhiệt độ thích hợp nhất là 370C, nhưng ở nhiệt độ phịng (20- 250C) là tốt nhất để vi khuẩn tiết sắc tố. Sau khi ủ từ 18- 24h, các khúm vi khuẩn cĩ hình trịn, đường kính khoảng 2-4mm, lồi, biên đều, đục, cĩ màu từ trắng, vàng chanh đến vàng kim. ( S. aureus cho khĩm màu vàng, S. epidermidis cho khĩm xám hay trắng, S. citreus cho khĩm màu vàng chanh ). Màu biến mất khi cấy yếm khí và xuất hiện khi cho lứa cấy tiếp xúc với khơng khí. Ø Staphylococci tăng trưởng được trên mơi trường chứa 7.5% NaCl. 31
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh gây bệnh - Trường Đại học Mở Tp. HCM Dương Nhật Linh Ø Trên thạch máu BA, gốc gây bệnh thường cho phản ứng tiêu huyết. 4. ĐẶC TÍNH SINH HĨA VÀ ĐỊNH DANH. 4.1 Khảo sát hiển vi Nhuộm Gram trực tiếp từ bệnh phẩm hay từ lứa cấy. 4.2 Thử nghiệm Catalase - Mục đích: chẩn đốn phân biệt khĩm vi khuẩn Staphylococci với khĩm vi khuẩn Streptococci và Pneumococci. - Nguyên tắc: Staphylococci cĩ emzyme catalase sẽ phĩng thích O2 từ nứơc oxy già tạo hiện tượng sủi bọt. - Kỹ thuật: theo giáo trình VSCS - Kết quả: + Hiện tượng sủi bọt xảy ra ngay lập tức sau khi H2O2 tiếp xúc với vi khuẩn à catalase dương à cocci này là Staphylococci. + Khơng cĩ hiện tượng sủi bọt à catalase âm à cocci này là Streptococci Chú ý: Khi lấy vi khuẩn trên mơi trường thạch máu nên lấy ở phần trên khĩm vi khuẩn, tránh khuyên cấy tiếp xúc với thạch máu vì hống cầu cĩ khảng năng làm phản ứng dương tính giả. Khuyên cấy bằng platin sẽ cho phản ứng dương tính giả. 32
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh gây bệnh - Trường Đại học Mở Tp. HCM Dương Nhật Linh 4.3 Thử nghiệm Coagulase. - Mục đích: dùng để định danh Staphylococcus aureus, và phân biệt với các Staphylococci khác. - Nguyên tắc: enzyme coagulase hiện diện dưới 2 dạng : coagulase liên kết và coagulase tự do, được phát hiện khi gặp huyết tương gây nên hiện tượng lợn cợn hoặc đơng đặc huyết tương. Vi khuẩn S. aureus cĩ chứa enzyme coagulase cĩ khả năng làm đơng huyết tương. - Kỹ thuật: + Trên lame: tìm coagulase liên kết. + Trong ống nghiệm: tìm coagulase tự do ( kỹ thuật trên ống nghiệm cho kết quả chắc chắn hơn). Lấy 3 ống nghiệm vơ trùng loại 10 x 75mm, ghi trên ống nghiệm lần lượt là U (Unknown), C+ (coagulase dương chuẩn), C- (coagulase âm chuẩn). Cho 0.5ml huyết tương thỏ vào mỗi ống. Cho 1 vịng que cấy vi khuẩn cần xác định đã cấy 24h vào ống U. Cho 0.1ml canh cấy lỏng của gốc vi khuẩn chuẩn cĩ coagulase dương vào ống C+ Cho 0.1ml nước muối sinh lý vơ trùng vào ống C-. Đặt tất cả 3 ống vào tủ ấm 370C, hầu hết các chủng S. aureus coagulase dương đều làm đơng huyết tương trong vịng 4giờ. - Kết quả: sau 1- 4h nếu cĩ hiện tượng đơng đặc huyết tương à coagulase dương à S. aureus cĩ khả năng làm đơng huyết tương. 33
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh gây bệnh - Trường Đại học Mở Tp. HCM Dương Nhật Linh Chú ý: nếu sau 4h khơng quan sát thấy hiện tượng đơng đặc huyết tương thì phải ủ lại ở nhiệt độ phịng thí nghiệm và đọc kết quả sau 18giờ. + - 4.4 Thử nghiệm kháng Novobiocin. - Mục đích: dùng để định danh Staphylococcus saprophyticus. - Nguyên tắc: S. saprophyticus cĩ khả năng đề kháng với Novobiocin. - Kỹ thuật: thực hiện giống kỹ thuật kháng sinh đồ phương pháp khuếch tán trên thạch (Bài 6), dùng đĩa kháng sinh Novobiocin (Nv) cĩ tẩm với hàm lượng 5μg đặt lên trên mặt thạch, ủ 370C trong 18-24h. - Kết quả: + Nhạy cảm: đường kính vịng vơ khuẩn > 16mm. + Đề kháng: đường kính vịng vơ khuẩn < 16mm à S. saprophyticus. 34
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh gây bệnh - Trường Đại học Mở Tp. HCM Dương Nhật Linh 4.5 Khả năng tăng trưởng và lên men trên mơi trường MSA (Chapman). Các loại tụ cầu khuẩn đều tăng trưởng được trên mơi trường MSA chứa 7.5% NaCl. Riêng gốc gây bệnh S. aureus do cĩ khả năng lên men được trên mơi trường Mannitol nên sẽ tạo một vùng màu vàng bao quanh khĩm vi khuẩn. 4.6 Thử nghiệm Urea. - Mục đích: dùng để định danh S. epidermidis và S. simulans - Nguyên tắc: 2 vi khuẩn S. epidermidis và S. simulans cĩ khả năng sản xuất enzyme urease thủy phân urea trong mnơi trường thành CO2 và NH3 , làm mơi trường bị kiềm hĩa và chuyển sang màu hồng đỏ. - Kỹ thuật: theo giáo trình VSCS - Kết quả: mơi trường chuyển sang màu hồng đỏ à dương tính à S. epidermidis và S. simulans. Mơi trường khơng đổi màu à âm tính à Staphylococci coagulase âm khác. + - 35
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh gây bệnh - Trường Đại học Mở Tp. HCM Dương Nhật Linh 5. QUY TRÌNH ĐỊNH DANH. Khĩm VK trên mt BA Nhuộm Gram: cầu khuẩn Gram [+] CATALASE [+] CATALASE CATALASE [-] Staphylococci Coagulase Streptococci [+] [-] S.epidermidis S. aureus S.saprophyticus S.simulans is S.capit [+] [-] Kháng Novobiocin [+] S.saprophyticus Urease [-] S.epidermidis S.capitis S.simulans S. hemolyticus 36
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh gây bệnh - Trường Đại học Mở Tp. HCM Dương Nhật Linh II. CHUỖI CẦU KHUẨN STREPTOCOCCI. 1. NƠI CƯ TRÚ VÀ TÍNH GÂY BỆNH. Ø Chuỗi cầu khuẩn cĩ khắp mọi nơi trong thiên nhiên, là một thành phần trong hỗn tạp vi sinh đường hơ hấp, ở đường tiêu hĩa của người và động vật. Ø Tùy loại và tùy vị trí nhiễm khuẩn, chuỗi cầu khuẩn sẽ là tác nhân gây bệnh hoặc chỉ là vi khuẩn sống hoại sinh. Ø Chuỗi cầu khuẩn cĩ thể gây các chứng nhiễm khuẩn trực tiếp như: · Viêm cổ họng, viêm amygdale, thanh quản, yết hầu, viêm xoang, viêm tai giữa và cĩ thể gây viêm màng não. · Viêm màng trong tim bán cấp tính, nhiễm khuẩn hậu sản, hậu giải phẩu, nhiễm khuẩn huyết và nhiễm trùng đường tiểu. · Nhiễm khuẩn ở da: nhọt, mụn nước cĩ mủ. Ø Chuỗi cầu khuẩn cĩ thể gây bệnh gián tiếp như viêm hay siêu cảm ứng cho các mơ trong chứng phong thấp cấp tính, viêm màng trong tim và viêm cầu thận. Ø Việc phân loại chuỗi cầu khuẩn rất phức tạp. Trong chẩn đốn phịng thí nghiệm người ta thường kết hợp 2 yếu tố: kiểu tiêu huyết và cấu trúc kháng nguyên để xác định 1 chủng gây bệnh. 2. ĐẶC TÍNH HÌNH THỂ VÀ NHUỘM. Hình cầu, đường kính khoảng 0.8- 1μm,sắp xếp thành hình chuỗi, uốn khúc dài ngắn khác nhau. Khơng di động, khơng bào tử. 3. ĐẶC TÍNH NUƠI CẤY. 37
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh gây bệnh - Trường Đại học Mở Tp. HCM Dương Nhật Linh Ø Streptococci tăng trưởng kém, khơng mọc trên mơi trường thơng thường, chỉ mọc được trong các mơi trường cĩ đầy đủ chất dinh dưỡng như: BHI hoặc các mơi trường cĩ huyết thanh hay hồng cầu. Vi khuẩn tăng trưởng mạnh trong điều kiện cĩ CO2, glutamine, riboflavin, Hiếu khí hay kỵ khí tùy nghi. Ø Nhiệt độ thích hợp cho đa số các loại Streptococci là 370C. Tuy nhiên các vi khuẩn thuộc nhĩm D (Enterococci) cĩ thể mọc ở 15 – 450C. Ø Sau 24h nuơi cấy trên mơi trường thích hợp, khĩm vi khuẩn cĩ hình trịn, đường kính khoảng 1mm hay nhỏ hơn, trong, trắng xám, hơi nhám và lồi. 4. ĐẶC TÍNH SINH HĨA VÀ ĐỊNH DANH. 4.1 Khảo sát hiển vi. Nhuộm Gram trực tiếp từ bệnh phẩm hay từ lứa cấy Lưu ý: Trong khảo sát kính hiển vi trực tiếp dịch não tủy, nếu kết quả tìm thấy cĩ cầu khuẩn Gram dương xếp thành chuỗi, nên báo cáo ngay kết quả lâm sàng vì nĩ cĩ giá trị đặc biệt trong trường hợp viêm màng não cần điều trị ngay tức khắc. 4.2 Thử nghiệm Catalase. Dùng phân biệt các nhĩm vi khuẩn nghi ngờ là tụ cầu khuẩn với chuỗi cầu khuẩn (xem phần I) 4.3 Phản ứng tiêu huyết. - Mục đích: Quan sát và ghi nhận phản ứng tiêu huyết quang các khĩm khuẩn trên thạch máu. Từ đĩ định hướng và lựa chọn các thử nghiệm cần thực hiện tiếp theo. - Nguyên tắc và kỹ thuật: xem giáo trình VSCS. 38
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh gây bệnh - Trường Đại học Mở Tp. HCM Dương Nhật Linh - Kết quả: Tùy loại chuỗi cầu khuẩn sẽ cho 1 trong 3 kiểu tiêu huyết sau: + Tiêu huyết α (tiêu huyết khơng hồn tồn): hồng cầu bị ly giải khơng hồn tồn, tạo nên vùng tiêu huyết nhỏ, mờ, hơi màu xanh. + Tiêu huyết β (tiêu huyết hồn tồn) : hồng cầu bị ly giải hồn tồn, tạo nên vịng tiêu huyết rộng, sáng và trong bao quang khĩm vi khuẩn trên thạch máu. + Tiêu huyết γ (khơng tiêu huyết) : hồng cầu khơng bị ly giải nên khơng tạo ra vịng tiêu huyết. 4.4 Thử nghiệm Taxo P (thử nghiệm nhạy cảm Optochin) - Mục đích: để phân biệt Pneumococcus với các Streptococci tiêu huyết α khác (S.viridans). - Nguyên tắc: Pneumococcus nhạy cảm với Optochin. - Kỹ thuật: Dùng vịng cấy hay tăm bơng vơ trùng , lấy 1 quệt vi khuẩn nghi ngờ là Pneumococci mọc khơng quá 24h trên mặt thạch máu cừu BA, cấy zic-zac với đường cấy dày và sít nhau trên mặt thạch. Dùng kẹp vơ khuẩn lấy 1 đĩa Optochin (Taxo P) đặt lên giữa vùng cấy. Ủ hộp BA thử nghiệm trong bình nến ở 350C/24h. 39
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh gây bệnh - Trường Đại học Mở Tp. HCM Dương Nhật Linh - Kết quả: vi khuẩn nhạy cảm với Optochin cĩ đường kính vịng vơ khuẩn > 13mm quang đĩa Optochin à và cĩ thể định danh Streptococci tiêu huyết α này là S. pneumonia. 4.5 Thử nghiệm nhạy cảm Bactrim. - Mục đích: cĩ thể xác định Streptococci thử nghiệm này khơng phải nhĩm A hay B - Kỹ thuật: Dùng vịng cấy hay tăm bơng vơ trùng , lấy 1 quệt vi khuẩn nghi ngờ là Pneumococci mọc khơng quá 24h trên mặt thạch máu cừu BA, cấy zic-zac với đường cấy dày và sít nhau trên mặt thạch. Dùng kẹp vơ khuẩn lấy 1 đĩa Bactrim đặt lên giữa vùng cấy. Ủ hộp BA thử nghiệm trong bình nến ở 350C/24h. - Kết quả: Vi khuẩn nhạy cảm với Bactrim cĩ vịng vơ khuẩn > 15mm quanh đĩa Bactrim à và cĩ thể xác định Streptococci thử nghiệm này khơng phải nhĩm A hay B. 40
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh gây bệnh - Trường Đại học Mở Tp. HCM Dương Nhật Linh 4.6 Thử nghiệm Bile esculin. - Mục đích: xác định Streptococci thử nghiệm này là Streptococci nhĩm D. - Nguyên tắc: Streptococci nhĩm D cĩ khả năng thủy phân Esculin (dưới điều kiện mơi trường chứa 4% muối mật) để cho ra Glucose và Esculetin. Esculetin sẽ phản ứng với muối Fe cho ra màu nâu đậm hay đen trên bề mặt mơi trường. - Kỹ thuật: Dùng vịng cấy lấy 1 quệt vi khuẩn mọc khơng quá 24h trên mơi trường BA, cấy zic-zac lên mặt nghiêng thạch hay tube thạch Bile esculin. Ủ bình nến ở 350C/24h. - Kết quả: xuất hiện màu nâu đậm hay đen trên bề mặt mơi trường à Bile esculin dương tính à kết luận vi khuẩn Streptococci nhĩm D. - + 4.7 Thử nghiệm dung nạp NaCl 6.5%. 41
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh gây bệnh - Trường Đại học Mở Tp. HCM Dương Nhật Linh - Mục đích: phân biệt Enterococci và Non enterococci trong Streptococci nhĩm D - Nguyên tắc: Enterococci cĩ thể dung nạp NaCl 6.5% hay cĩ thể mọc được trên mơi trường này. - Kỹ thuật: Dùng vịng cấy lấy 1 quệt vi khuẩn mọc khơng quá 24h cấy vào mơi trường TSB bổ sung 6.5% NaCl. Ủ 350C/24h. - Kết quả: dung nạp NaCl 6.5% khi vi khuẩn mọc được trong mơi trường. + Vi khuẩn Streptococci nhĩm D (bile esculin dương) nếu dung nạp được NaCl 6.5% thì định danh là S. faecalis + Khơng dung nạp thì định danh là S. faecium. - + 4.7 Thử nghiệm Taxo A (thử nghiệm nhạy cảm với Bacitracin). - Mục đích: định danh Streptococci tiêu huyết β này là Streptococci tiêu huyết β nhĩm A - Nguyên tắc: Streptococci tiêu huyết β nhĩm A cĩ khả năng nhạy cảm với Bacitracin - Kỹ thuật: Dùng vịng cấy hay tăm bơng vơ trùng , lấy 1 quệt vi khuẩn Streptococci tiêu huyết β mọc khơng quá 24h trên mặt thạch máu cừu BA, cấy zic-zac với đường cấy dày và sít nhau trên mặt thạch. Dùng kẹp vơ khuẩn lấy 1 đĩa Bacitracin (Taxo A) đặt lên giữa vùng cấy. Ủ hộp BA thử nghiệm trong bình nến ở 350C/24h. 42
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh gây bệnh - Trường Đại học Mở Tp. HCM Dương Nhật Linh - Kết quả: Vi khuẩn nhạy với Bacitracin khi cĩ vịngvơ khuẩn quanh đĩa Bacitracin mà khơng cần đo đường kính vịng vơ khuẩn này à định danh là Streptococci tiêu huyết β nhĩm A. 4.8 Thử nghiệm CAMP (Christie, Atkins, and Munch- Peterson). - Mục đích: dùng để định danh Streptococci tiêu huyết β là nhĩm B ( S. agalactiae). - Nguyên tắc: yếu tố CAMP là một chất ngoại bào được sản xuất bởi Streptococci nhĩm B cĩ tác dụng hợp đồng tiêu huyết với β- lysin của S. aureus. - Kỹ thuật: + Trên hộp thạch máu cừu BA, dùng que cấy lấy 1 quệt vi khuẩn S. aureus cĩ men tiêu huyết β- lysin cấy 1 vạch vào giữa mặt thạch. + Sau đĩ dùng vịng cấy lấy 1 quệt vi khuẩn Streptococci tiêu huyết β thử nghiệm, cấy 1 đường thẳng gĩc với vạch cấy S. aureus và ngừng cách vạch cấy S. aureus khoảng 2-3mm. + Ủ ở 350C/ 24h, khơng bình nến. 43
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh gây bệnh - Trường Đại học Mở Tp. HCM Dương Nhật Linh - Kết quả: CAMP test dương : khi tại đầu vạch cấy tiếp cận với vạch S. aureus cĩ 1 vùng tiêu huyết hình mũi tên hướngvề vạch cấy S. aureus à Streptococci nhĩm B (S. agalactiae). TĨM LẠI : Trong định danh chuỗi cầu khuẩn cần xác định rõ: Ø Kiểu tiêu huyết α, β, γ trên BA Ø Định nhĩm: · Nhĩm A: bằng đĩa Taxo A cho riêng vi khuẩn nghi ngờ chuỗi cầu tiêu huyết β. · Nhĩm B: bằng thử nghiệm CAMP cho khĩm vi khuẩn nghi ngờ chuỗi cầu cho tiêu huyết β. · Nhĩm D: bằng thử nghiệm Bile esculin, khả năng dung nạp NaCl 6.5% cho tất cả 3 kiểu tiêu huyết. Ø Ghi kết quả định danh cuối cùng bao gồm 2 phần: · Kiểu tiêu huyết α, β, γ và định nhĩm A, D hoặc khơng thuộc A, D · Ví dụ: β hemolytic Streptococci group A ßà chuỗi cầu tiêu huyết β nhĩm A. 44
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh gây bệnh - Trường Đại học Mở Tp. HCM Dương Nhật Linh 5. QUY TRÌNH ĐỊNH DANH. Khĩm VK trên mt BA Nhuộm Gram: cầu khuẩn Gram [+] CATALASE [+] CATALASE CATALASE [-] Staphylococci Streptococci Tiêu huyết a g b Th ử nghi ệ m nh ạ y c ả m BA Optochin trên [+] [-] · Thử nghiệm nhạy · Thử nghiệm nhạy cảm cảm BACTRIM BACITRACIN · Thử nghiệm · Thử nghiệm nhạy cảm S.pneumoniae Streptococci BILE-ESCULIN BACTRIM · Thử nghiệm mọc · Thử nghiệm CAMP tiêu huyết a trên TSB cĩ 6.5% · Thử nghiệm BILE- NaCl ESCULIN 45 · Thử nghiệm mọc trên TSB cĩ 6.5% NaCl
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh gây bệnh - Trường Đại học Mở Tp. HCM Dương Nhật Linh Nhạy cảm Nhạy Bile CAMP TSB + Tiêu Tiêu Bacitracin cảm esculin 6,5% huyết huyết a Bactrim NaCl b hay g Streptococci + - - - - + - nhĩm A Streptococci - - - + - + - nhĩm B Streptococcus - - + - + +/- +/- faecalis (nhĩm D) Streptococcus - + + - - +/- +/- faecium (nhĩm D) Streptococci - + - - - +/- +/- nhĩm khác 46
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh gây bệnh - Trường Đại học Mở Tp. HCM Dương Nhật Linh BÀI 2: KỸ THUẬT ĐỊNH DANH PHẨY KHUẨN TẢ I. PHẦY KHUẨN TẢ VIBRIO CHOLERAE 1. NƠI CƯ TRÚ VÀ TÍNH GÂY BỆNH. Ø Dịng Vibrio gồm cĩ loại hoại sinh, hợp sinh gây bệnh cho người và thú. Loại gây bệnh dịch tả cho người là Vibrio cholerae thuộc nhĩm O1 (Vibrio cholerae type cổ điển và Vibrio cholerae type eltor) Ø Phẩy khuẩn tả xâm nhập cơ thể bằng đường tiêu hĩa, tăng trưởng mau lẹ tại niêm mạc ruột, khơng xâm nhập vào đường máu, các vi khuẩn bị tiêu bào phĩng thích nội độc tố, phá hoại thượng bì ruột gây ra triệu chứng thổ tả, đưa đến tình trạng cơ thể mất nước nhanh và mất thăng bằng các chất điện giải. Bệnh nhân chết nếu khơng phục hồi lại lượng nước đã mất. Ø Phẩy khuẩn tả cĩ thể tìm thấy trong phân bệnh nhân, trong chất nơn mửa và thực phẩm bị nhiễm khuẩn. Phân của người bị nhiễm khuẩn tả rất đặc bu\iệt, phân như nước đục như nước vo gạo, chứa những hạt lợn cợn như hạt gạo. 2. ĐẶC TÍNH HÌNH THỂ VÀ NHUỘM. Ø Là những trực khuẩn cong hay cịn được gọi là phẩy khuẩn, ngắn, mảnh, kích thước khoảng 0.5 x 3µm, Gram âm. Tính chất phẩy biến mất sau nhiều lần cấy truyền. 47
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh gây bệnh - Trường Đại học Mở Tp. HCM Dương Nhật Linh Ø Di dộng nhanh, khơng sinh nha bào. 3. ĐẶC TÍNH NUƠI CẤY. Ø Phẩy khuẩn tả mọc dễ dàng trong mơi trường nuơi cấy bình thường, khơng địi hỏi yếu tố tăng trưởng đặc biệt, nhưng cần 5 -15mmol/l NaCl kích thích vi khuẩn mọc tốt hơn. Ø Ưa mơi trường kiềm pH 7.8 -9. Sống được ở nhiệt độ 16- 420C, nhiệt độ tối ưu 370C. Thuộc loại hiếu khí . Ø Vibrio cholerae chết nhanh trong mơi trường acid, dễ bị diệt bởi các chất tẩy uế, đặc biệt nhạy cảm với sự khơ, chỉ tồn tại 10min ở 550C. Tuy nhiên cĩ thể sống được 4 – 7 ngày trên rau trái tươi để ở mát và ẩm. Ø Trong mơi trường peptone pH= 8: phẩy khuẩn tả tăng trưởng nhanh sau 6-8h/370C, làm đục đều và cĩ váng nổi trên mặt mơi trường. Ø Trên mơi trường MacConkey (MC): khĩm vi khuẩn trịn, biên đều, phẳng hay lồi, màu hồng nhạt do khơng lên men đường Lactose. Ø Trên mơi trường TCBS: khĩm vi khuẩn trịn, biên đều, lồi trịn, màu vàng do lên men đường Succrose. 4. ĐẶC TÍNH SINH HĨA VÀ ĐỊNH DANH 4.1 Cấy phân lập Ø Cấy trực tiếp · Lấy trực tiếp từ bệnh phẩm cấy lên bề mặt mơi trường MC hoặc TCBS 48
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh gây bệnh - Trường Đại học Mở Tp. HCM Dương Nhật Linh · Lấy trực tiếp từ bệnh phẩm cấy vào mơi trường peptone Ø Sau khi mơi trường peptone mang đi ủ, vi khuẩn mọc, lấy từ váng trên mơi trường peptone cấy lại trên mơi trường MC hoặc TCBS 4.2 Khảo sát hiển vi Ø Nhuộm Gram: khảo sát tính chất hình phẩy và cách ăn màu Ø Soi tươi: khảo sát tính di động của vi khuẩn tả 4.3 Thử nghiệm Oxidase: đã học ở thực tập vi sinh cơ sở. 4.4 Thử nghiệm KIA: đã học ở thực tập vi sinh cơ sở. 4.5 Thử nghiệm IMVIC: đã học ở thực tập vi sinh cơ sở. 4.6 Thử nghiệm Urea: đã học ở thực tập vi sinh cơ sở. 4.7 Thử nghiệm lên men các loại đường Mannitol, Succrose, Arabinose: đã học ở thực tập vi sinh cơ sở. 4.8 Thử nghiệm Motility: đã học ở thực tập vi sinh cơ sở. 4.9 Thử nghiệm PAD (Phenyl Alanine Deaminase). Ø Nguyên tắc: một số vi khuẩn cĩ khả năng sảm xuất men deaminase khử amin của amino acid phenylalanine thành một Keto acid, chất này kết hợp với ion Fe trong thuốc thử Ferric chloride 10% để tạo phức hợp màu xanh lá cây Ø Kỹ thuật: cấy vi khuẩn cần định danh lên mặt nghiêng của mơi trường, ủ 370C/18-24h. Nhỏ 4-5 giọt Ferric chloride 10% lên mặt nghiêng của thạch, nghiêng tube qua lại nhiều lần. Quan sát sự đổi màu Ø Kết quả: xuất hiện màu xanh lá cây ở phần nghiêng mơi trường à dương tính Khơng đổi màu thuốc thử à âm tính à V. cholorea. 49
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh gây bệnh - Trường Đại học Mở Tp. HCM Dương Nhật Linh TÍNH CHẤT SINH HĨA CỦA PHẨY KHUẨN TẢ Thử nghiệm Đặc tính sinh hĩa Oxidase + KIA Lactose - Glucose + H2S - CO2 - Motility + Urea - Indol + Methyl Red - VP +( V.cholerae type eltor) - ( V. cholerae type cổ điển) Citrate + PAD - Sucrose + Mannitol + Arabinose - 4.10 Thử nghiệm huyết thanh ngưng kết Ø Kỹ thuật: § Chọn các khĩm vi khuẩn nghi ngờ trên mơi trường TCBS hoặc MC, làm huyền dịch với nước muối sinh lý trong ống nghiệm sạch § Lấy lame kính chia thành 3 ơ bằng bút chì mỡ. Nhỏ vào mỗi ơ 1 giọt huyền dịch vi khuẩn 50
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh gây bệnh - Trường Đại học Mở Tp. HCM Dương Nhật Linh § Nhỏ lần lượt mỗi ơ 1 giọt huyết thanh Ogawa, Inaba và nước muối sinh lý. § Dùng mỗi ơ 1 que cấy riêng biệt, trộn 2 giọt cho đều nhau, quan sát sự ngưng tụ dưới ánh sát thích hợp. Ø Kết quả. Ogawa Inaba Nước Kết luận muối + - - Phẩy khuẩn tả gốc Ogawa - + - Phẩy khuẩn tả gốc Inaba + + - Phẩy khuẩn tả gốc Hikojima - - - Khơng phải phẩy khuẩn tả 4.11 Thử nghiệm ngưng kết hồng cầu gà. Ø Mục đích: phân biệt V. cholerae giữa 2 type cổ điển và eltor. Ø Kỹ thuật: Dùng bút chì mỡ kẻ 2 ơ trên lame kính sạch. Nhỏ 1 giọt hồng cầu gà 3% vào mỗi ơ. Sau đĩ, nhỏ 1 giọt vi khuẩn và 1 giọt nước muối sinh lý lần lượt vào mỗi ơ. Dùng mỗi ơ 1 que cấy riêng biệt, trộn đều 2 giọt. Quan sát sự ngưng kết. Ø Kết quả: Ngưng kết hồng cầu gà: V. cholerae type eltor. Khơng ngưng kết hồng cầu à V. cholerae type cổ điển. 51
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh gây bệnh - Trường Đại học Mở Tp. HCM Dương Nhật Linh BÀI 3: KỸ THUẬT ĐỊNH DANH TRỰC KHUẨN MỦ XANH 1. NƠI CƯ TRÚ VÀ TÍNH GÂY BỆNH. Ø Giống Pseudomonas thường sống trong thiên nhiên: trong đất, trong nước, khơng khí, nhất là nơi ẩm thấp, kể cả trong mơi trường bệnh viện, mơi trường ẩm ướt là quan trọng nhất đối với vi khuẩn này. Ø Ở người, vi khuẩn cĩ thể sống ở những vùng da ẩm như nách, háng và 1 số ít trong ruột. Cịn gọi là trực khuẩn mủ xanh. Ø Trực khuẩn mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa) gây bệnh: nhiễm khuẩn tai, mắt, vết thương, vết phỏng, đường tiểu và đường hơ hấp. Chúng gây nhiễm khuẩn huyết và viêm màng não Ø Pseudomonas aeruginosa là tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện. Vi khuẩn này cĩ thể được tìm thấy trong các túi máu, huyết tương nhiễm khuẩn của ngân h àng máu, và trong cả các dung dịch sát trùng như Zepheran, Benzal konium chlorise hay các loại xà phịng cĩ Hexachlorophene 2. ĐẶC TÍNH HÌNH THỂ VÀ NHUỘM. Trực khuẩn Gram âm, thẳng hay hơi cong, hình thể thay đổi trong lứa cấy già, di động, khơng bào tử. Kích thước 0.6 x 2µm, đứng một mình hay thành đơi hay thành chuỗi ngắn 3. ĐẶC TÍNH NUƠI CẤY. 52
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh gây bệnh - Trường Đại học Mở Tp. HCM Dương Nhật Linh Hiếu khí tuyệt đối, mọc dễ trên hầu hết các mơi trường thơng dụng. Mọc tốt ở nhiệt độ 37 -420C và cĩ thể mọc ở nhiệt độ 5- 420C Trực khuẩn mủ xanh tạo được sắc tố Pyocyanin hịa tan trong mơi trường làm mơi trường cĩ màu xanh lục hay nâu. Lứa cấy tỏa mùi thơm nhẹ. Trên mơi trường BA: tiêu huyết β, khĩm vi khuẩn lớn, phẳng hay hơi lồi, biên khơng đều Trên MC: khơng lên men đường Lactose, khĩm vi khuẩn khơng màu Trong canh cấy lỏng: vi khuẩn hiếu khí mọc thành váng nổi trên mặt. 4. ĐẶC TÍNH SINH HĨA VÀ ĐỊNH DANH. 4.1 Khảo sát hiển vi trực tiếp. Nhuộm Gram à trực khuẩn Gram âm. 4.2 Khảo sát đặc tính lứa cấy. Cần lưu ý đến khả năng sinh sắc tố, tiêu huyết và cĩ mùi thơm nhẹn đặc trưng. Lấy những khuẩ lạc nghi ngờ trên mơi trường MC cấy ria trên mơi trường thạch Pseudomonas phát hiện fluorescin và mơi trường thạch Pseudomonas phát hiện pyocyanin. Ủ 370C/ 3 ngày. Kiểm tra dưới ánh sang của tia tử ngoại để xác định khuẩn lạc đặc trưng. 53
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh gây bệnh - Trường Đại học Mở Tp. HCM Dương Nhật Linh ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI CỦA P.AERUGINOSA TRÊN CÁC MƠI TRƯỜNG Mơi trường Thạch Pseudomonas Thạch Pseudomonas phát hiện fluoresin phát hiện pyocyanin Đặc điểm hình Khơng màu đến màu Màu xanh dương thái khuẩn lạc vàng nhạt Huỳnh quang ở Xanh vàng ánh sáng cực tím 4.3 Thử nghiệm Oxidase: đã học ở thực tập vi sinh cơ sở. 4.4 Thử nghiệm KIA: đã học ở thực tập vi sinh cơ sở. 4.5 Thử nghiệm Motility: đã học ở thực tập vi sinh cơ sở. 4.6 Thử nghiệm Indol: đã học ở thực tập vi sinh cơ sở. 4.7 Thử nghiệm Citrate: đã học ở thực tập vi sinh cơ sở. 4.8 Thử nghiệm LDC: ( thử nghiệm Lysin decarboxylase) - Nguyên tắc: tìm sự hiện diện enzyme decarboxylase thủy phân các amino đặc hiệu. Đầu tiên vi khuẩn lên men đường Glucose, acid hĩa mơi trường, mơi trường chuyển thành màu vàng. Nếu vi khuẩn cĩ khả năng sản xuất enzyme thủy phân các amino acid và các alkaline amines được tạo thành thì sẽ làm kiềm hĩa trở lại và mơi trường trở lại màu tím. - Tiến hành: dung que cấy thẳng lấy 1 quệt vi khuẩn nghi ngờ cấy thẳng vào mơi trường LDC. Ủ 370C/24h - Kết quả: Phản ứng dương: vi khuẩn mọc, mơi trường giữ màu tím - Phản ứng âm : vi khuẩn mọc, mơi trường chuyển thành màu vàng hay vi khuẩn khơng mọc 54
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh gây bệnh - Trường Đại học Mở Tp. HCM Dương Nhật Linh LƯU Ý: Khi đọc kết quả LDC, nếu vi khuẩn chỉ mọc trên bề mặt, khơng thấy vi khuẩn mọc xuống dưới sâu dọc theo đường cấy, thì đây là vi khuẩn hiếu khí tuyệt đối. Như vậy phải đọc kết quả là LDC (-) dù mơi trường vẫn giữ màu tím. Và đây cũng là trường hợp của P. aeruginos. TÍNH CHẤT SINH HĨA CỦA TRỰC KHUẨN MỦ XANH Thử nghiệm Đặc tính sinh hĩa Oxidase + KIA Đỏ/ đỏ – khơng H2S Motility + Indol - Citrate + LDC - 55
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh gây bệnh - Trường Đại học Mở Tp. HCM Dương Nhật Linh Bài 4: KỸ THUẬT ĐỊNH DANH VI KHUẨN THƯƠNG HÀN SALMONELLA TYPHI 1. NƠI CƯ TRÚ VÀ TÍNH GẬY BỆNH. - Bệnh thương hàn do nhiễm Salmonella typhi là bệnh nhiễm trùng tồn thân với những biểu hiện chính là sốt và triệu chứng ở bụng, người bị mắc phải cĩ những dấu hiệu về thần kinh như lú lẫn, kích động, cĩ gan lách to, yếu cơ , sụt cân, suy kiệt. Và những biến chứng của thương hàn gây thủng ruột với sốt, đau bụng, xuất huyết tiêu hĩa. Ngồi ra cịn cĩ một số biến chứng hiếm gặp như viêm nội tâm mạc, nhiễm trùng tại chỗ, áp xe gan lách, viêm tinh hồn, . - S.typhi là tác nhân gây ra bệnh thương hàn. Ngồi ra S.paratyphi A, S.paratyphi B, S.paratyphi C gây ra bệnh phĩ thương hàn cĩ triệu chứng giống thương hàn nên người ta gọi chung là thương hàn. - Bệnh thương hàn do S.typhi gây ra, vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể theo đường tiêu hĩa do thức ăn, nước uống bị nhiễm bẩn. Sau khi vào ống tiêu hĩa, vi khuẩn thương hàn bám vào niêm mạc ruột non rồi xâm nhập qua niêm mạc ruột vào các hạch mạc treo ruột. Ơ đây vi khuẩn nhân lên rồi qua hệ thống bạch huyết và ống ngực đi vào máu, lúc này các dấu hiệu lâm sàng bắt đầu xuất hiện. Từ máu vi khuẩn đến lách và các cơ quan khác. Tới gan theo mật đổ xuống ruột rồi được đào thải qua phân. Tới thận một số vi khuẩn được đào thải ra ngồi theo nước tiểu. Tới mảng payer, vi khuẩn tiếp tục nhân lên. 56
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh gây bệnh - Trường Đại học Mở Tp. HCM Dương Nhật Linh 2. ĐẶC TÍNH HÌNH THỂ VÀ NHUỘM. S.typhi là một lồi thuộc nhĩm vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae, dạng trực , Gram âm, cĩ kích thước 2-3µm x 0.4 -0.6µm, khơng tạo giáp mơ, khơng tạo bào tử, cĩ khả năng di động nhờ lơng mao quanh tế bào. 3. ĐẶC TÍNH NUƠI CẤY. S.typhi là loại hiếu khí tuỳ nghi. Nhiệt độ thích hợp: 37oC, pH thích hợp : 7,2 – 7,6. Dễ mọc trên các mơi trường dinh dưỡng tối thiểu: - Trên NA: S.typhi tạo khĩm trắng ướt, hơi lồi, tạo 2 dạng khĩm S (Smooth) và R (Rough). - Trên canh lỏng NB: tạo đục đều để lâu lắng cặn - Trên MC (Mac Conkey): khuẩn lạc S.typhi nhẵn láng, màu trắng. - Trên BA (Blood Agar): S.typhi khơng gây dung huyết, cĩ khuẩn lạc màu trắng, trơn láng. - Trên thạch Deoxycholate: S.typhi tạo khuẩn lạc dẹt, màu đỏ cĩ thể cĩ tâm đen. - Trên SS (Salmonella Shigella Agar): khuẩn lạc của S.typhi cĩ màu trắng cĩ thể cĩ tâm đen. - Trên HE (Hektoen enteric) : khuẩn lạc S.typhi màu xanh (cùng màu với mơi trường) cĩ thể cĩ tâm đen. - Trên BSA (Bismuth Sunfit Agar): S.typhi tạo khuẩn lạc đen hoặc xanh đen. 57
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh gây bệnh - Trường Đại học Mở Tp. HCM Dương Nhật Linh 4. ĐẶC TÍNH SINH HĨA VÀ ĐỊNH DANH. 4.1 Chẩn đốn trực tiếp. 4.1.1 Nhuộm soi trực tiếp từ bệnh phẩm. Nhuộm soi trực tiếp từ phân ít cĩ giá trị chẩn đốn. Thường tiến hành nhuộm đếm bạch cầu đa nhân để định hướng chẩn đốn. Trong bệnh thương hàn, mật độ bạch cầu đa nhân trong phân khoảng 20 trên một vi trường ( độ phĩng đại X400 ) 4.1.2 Cấy máu. - Cấy máu được tiến hành khi bệnh nhân đang sốt cao, cần lấy máu trước khi điều trị kháng sinh. Theo tiêu chuẩn thì mơi trường cấy máu phải là mơi trường thạch máu cĩ bổ sung TSB hoặc BHI broth. Tuy nhiên cĩ thể dùng mơi trường thạch máu, hoặc MC để phân lập. Mơi trường MC được sử dụng nhiều bởi khả năng chọn lọc của nĩ. Trong MC cĩ muối mật, cĩ khả năng ức chế các vi khuẩn gram dương và các vi khuẩn gram âm khơng chịu được muối mật, vì vậy giảm được khả năng tạp nhiễm. Sau khi cấy xong đem ủ ấm ở 37oC / 18-24 giờ. - Khi thấy cĩ vi khuẩn mọc, tiến hành nhuộm gram, xem hình thể và tính chất bắt màu. Cấy chuyển sang mơi trường đặc, quan sát tính chất khuẩn lạc. - Thực hiện lứa cấy tinh khiết: quan sát khĩm vi khuẩn trên mơi trường thạch sau khi đã ủ 18- 24h. Chọn 1 khĩm vi khuẩn mọc riêng lẻ cấy vào mơi trường BHI lỏng. Ủ 370C/ 2-4h. - Kiểm tra tính chất sinh hĩa: dùng lứa cấy tinh khiết đã ủ, cấy vào mơi trường sinh hĩa. - Cuối cùng xác định cơng thức kháng nguyên bằng kháng huyết thanh mẫu: Nhỏ trên phiến kính một giọt nước muối sinh lý, 58
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh gây bệnh - Trường Đại học Mở Tp. HCM Dương Nhật Linh trộn vi khuẩn vào để đối chứng (B). Bên đối chứng là một hỗn dịch trắng đục đều. Nhỏ vào ơ thứ 2, một giọt kháng huyết thanh định ngưng kết, trộn vi khuẩn (A). + Phản ứng ngưng kết dương (+): sau 5 phút, cĩ ngưng kết thành những hạt nhỏ, lợn cợn. + Phản ứng ngưng kết âm (–): hỗn dịch vẫn đục đều. - Nếu chưa điều trị kháng sinh, ở tuần lễ đầu tỉ lệ cấy máu dương tính tới 90%, tuần thứ hai khoảng 70-80%, tuần thứ ba khoảng 40-60%. Cấy máu dương tính cho phép ta xác định chắc chắn bệnh nhân mắc bệnh thương hàn. 4.1.3 Cấy phân: Trong phân cĩ nhiều loại vi khuẩn vì vậy bệnh phẩm cần phải được cấy vào mơi trường ức chế chọn lọc. Mơi trường chọn lọc để cấy phân thường được sử dụng là những mơi trường sau: - Mac Conkey agar (MC). - Desoxycholate citrat agar - Xylose-Lysine-Desoxycholate agar ( XLD ) - Hektoen enteric agar (HE) - Salmonella Shigella (SS) - Bismuth sulfite agar (BSA) Sau khi cấy đem ủ ấm ở 37°C/ 24 giờ. Sau thời gian ủ ấm, cĩ thể phát hiện ra sự hiện diện của vi khuẩn thương hàn bằng cách nhận diện các khuẩn lạc điển hình trên mơi trường chuyên biệt Chọn khuẩn lạc điển hình để tiến hành nhuộm soi, và tiến hành làm các phản ứng sinh hố . 59
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh gây bệnh - Trường Đại học Mở Tp. HCM Dương Nhật Linh Một trong những phản ứng sinh hố tiêu biểu của S.typhi là phản ứng KIA cho kết quả đỏ/ vàng cĩ sinh H2S. S.typhi cĩ khả năng lên men đường glucose khơng sinh hơi (đây là đặc điểm để phân biệt với các lồi Salmonella khác). ĐẶC TÍNH SINH HĨA CỦA SALMONELLA TYPHI. Thử nghiệm Đặc điểm sinh hĩa Nitrate + LDC + Mannitol + Oxidase - Urea - Indol - Bile esculin - MR + VP - Citrate - Malonate - Motility + Chỉ riêng cấy phân, dù phân lập được vi khuẩn cũng khơng cho phép ta xác định chắc chắn bệnh nhân mắc bệnh thương hàn vì người lành cũng cĩ thể mang vi khuẩn thương hàn. Cấy phân ngồi mục đích chẩn đốn bệnh cịn cĩ giá trị kiểm tra sau khi bệnh nhân đã hết các dấu hiệu lâm sàng cĩ cịn tiếp tục đào thải vi khuẩn nữa hay khơng. Cấy phân cịn là phương pháp phát hiện người lành mang vi khuẩn. 60
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh gây bệnh - Trường Đại học Mở Tp. HCM Dương Nhật Linh Bảng so sánh các đặc tính sinh hố của vi khuẩn gây thương hàn với các vi khuẩn gram âm gây bệnh khác. Vi khuẩn KIA MIU Citrate Glu Lac H2S Khí Motil Indol Urê i-ty S.typhi + - + - + - - - S.paratyphi A + - - + + - - - Samonnella spp. + - +/- +/- + - - +/- E.coli + + - + + + - - Klebsialla spp. + + - + - +/- + + Citrobacter spp. + +/- + + + +/- - + Proteus spp. + - + + + +/- + +/- 4.2 Chẩn đốn gián tiếp. Tiến hành phản ứng Widal để xác định kháng thể trong huyết thanh. Sau khi nhiễm 8 ngày , trong máu bệnh nhân xuất hiện kháng thể O và sau 10-12 ngày xuất hiện kháng thể H . Thời gian tồn tại kháng thể trong máu trung bình là 3 tháng đối với kháng thể O và 1-2 năm đối với kháng thể H . Lấy 5ml máu, để đơng , lấy huyết thanh, pha lỗng ra nhiều nồng độ khác nhau và sau đĩ cho vào một lượng kháng nguyên nhất định ( kháng nguyên O, H, Vi). Để tủ ấm 37°C / 2 giờ, lấy ra để nhiệt độ phịng thí nghiệm, sau 24 giờ đọc kết quả. Trong giai đoạn đầu cĩ thể chỉ thấy kháng thể O. Đến giai 61
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh gây bệnh - Trường Đại học Mở Tp. HCM Dương Nhật Linh đoạn tồn phát sẽ thấy cả kháng thể O và H , tuy nhiên kháng thể H cao hơn kháng thể O. Việc phân tích kết quả xét nghiệm ở lần thứ nhất nhiều khi rất khĩ và thường khơng cho phép ta kết luận chắc chắn. Phản ứng cần được làm 2 lần để xác định động lực kháng thể: lần đầu làm ở tuần thứ nhất, lần hai làm ở tuần thứ hai của bệnh. Nếu động lực kháng thể cao mới cho phép cĩ chẩn đốn chắc chắn. Nhược điểm của phương pháp chẩn đốn này là cho kết quả chậm. 62
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh gây bệnh - Trường Đại học Mở Tp. HCM Dương Nhật Linh PHẦN 3: KỸ THUẬT PHÂN TÍCH BỆNH PHẨM 63
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh gây bệnh - Trường Đại học Mở Tp. HCM Dương Nhật Linh BÀI 1: PHƯƠNG PHÁP LẤY VÀ GỬI BỆNH PHẨM Trong cơng tác phân tích bệnh phẩm để chẩn đốn một bệnh nghi ngờ nhiễm khuẩn thì kỹ thuật cấy, gửi bệnh phẩm và kỹ thuật định danh đều là những giai đoạn quan trọng, do đĩ các sai sĩt xảy ra ở bất cứ giai đoạn nào đều cũng đem lại kết quả sai lạc. 1.CÁCH LẤY BỆNH PHẨM. Vị trí lấy bệnh phẩm. Vị trí lấy bệnh phẩm trên bệnh nhân được chia thành 2 nhĩm: - Chỗ khơng cĩ hỗn tạp vi sinh: gồm các lưu chất (máu, dịch não tủy, dịch khớp, dịch màng phổi, màng tim, màng bụng, ), các mảng sinh thiết ở mơ sâu. Cần phải kiểm sốt chặt chẽ sự ngoại nhiễm khi lấy và phân tích bệnh phẩm - Chỗ cĩ hỗn tạp vi sinh: gồm các chất bài tiết (đàm, phân, nước tiểu, niêm mạc ở các lỗ thiên nhiên, da, ) phải dùng kỹ thuật chọn lọc để phân lập vi khuẩn gây bệnh ra khỏi hỗn tạp hoại sinh. Thời gian lấy bệnh phẩm. - Tuỳ thuộc vào quá trình bệnh lý của bệnh. - Thời gian lấy bệnh phẩm rất quan trọng và thường do y bác sĩ quyết định, vì kết quả cấy khuẩn chỉ cĩ thể hữu nghiệm đúng vào thời gian nào đĩ của bệnh, trong một vài trường hợp kết quả vơ nghiệm từ mẫu thử duy nhất khơng hẳn đã chẩn đốn được bệnh nhiễm khuẩn mà đơi khi phải lấy mẫu thử nhiều lần trong vịng 24- 48h. Phải lấy bệnh phẩm trước khi dùng thuốc kháng sinh hay Sulfamid. Trường hợp khơng thể được, phải ghi rõ cách trị liệu: nếu bệnh nhân đã dùng 64
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh gây bệnh - Trường Đại học Mở Tp. HCM Dương Nhật Linh Penicillin cần thêm Penicillinase vào mơi trường nuơi cấy hay đã dùng Sulfamides thì cho thêm vào mơi trường nuơi cấy chất para aminobenzoic acid. Quy luật lấy bệnh phẩm. Khi lấy bệnh phẩm cần tuyệt đối tuân thủ các quy luật sau: - Các dụng cụ để lấy bệnh phẩm (kim, ống tiêm, que bơng) phải tuyệt đối vơ khuẩn. - Các dụng cụ chứa đựng bệnh phẩm phải cĩ nắp đậy kín và phải vơ khuẩn ngoại trừ lọ đựng phân (nhưng phải sạch). - Khơng cho bệnh phẩm chạm vào bất cứ hĩa chất diệt khuẩn nào. - Tất cả bệnh phẩm phải được ghi nhãn và phiếu thử nghiệm rõ rang. - Phải gửi bệnh phẩm ngay đến phịng thí nghiệm và phân tích bệnh phẩm ngay sau khi nhận. - Phải cấy bệnh phẩm trước khi làm tiêu bản hay các thử nghiệm khác. - Khi cần đếm tế bào trong bệnh phẩm lỏng phải trộn đều bệnh phẩm và rút ra thể tích cần thiết trong điều kiện tuyệt đối vơ trùng trước khi quay ly tâm bệnh phẩm, sau đĩ dùng cặn lắng để cấy và phần nước nổi làm các xét nghiệm sinh hố. Các phương tiện để lấy bệnh phẩm. Các phương tiện này tuỳ thuộc vào loại bệnh phẩm: Ø Dụng cụ lấy bệnh phẩm. - Ống tiêm và kim: để lấy các bệnh phẩm cần đâm xuyên qua da. - Dao lấy máu: cào các vết đau trên da. 65
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh gây bệnh - Trường Đại học Mở Tp. HCM Dương Nhật Linh - Ống mao quản và khuyên cấy khuẩn: để lấy chất ngoại tiết lỏng bên ngồi. - Que bơng: dùng lấy bệnh phẩm ở các lỗ tự nhiên, nhọt vỡ. Ø Dụng cụ đựng bệnh phẩm. - Chai cĩ nắp vặn: đựng đàm, nước dạ dày, mảnh mơ, phân. - Ống nghiệm cĩ nắp vặn: đựng bệnh phẩm lỏng. - Hộp petri. - Chai lớn: đựng nước tiểu tìm trực khuẩn lao. 2. CÁCH GỬI BỆNH PHẨM. 2.1 Ngoại trừ máu, phải cho vào chai hay ống mơi trường cấy máu sau khi lấy. 2.2 Các bệnh phẩm khác nên cho vào chai mơi trường chuyên chở Cary Blair với que bơng tẩm bệnh phẩm. 2.3 Nếu cần chở đi xa nên hàn nắp chai mơi trường chuyên chở bằng parafin và cho vào 1 hộp cĩ 2 lớp, chèn bơng cẩn thận cho khỏi vỡ (phiếu thử nghiệm chèn vào 2 lớp của hộp). 2.4 Phải gửi bệnh phẩm ngay đến phịng thí nghiệm trong vịng 24h. 66
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh gây bệnh - Trường Đại học Mở Tp. HCM Dương Nhật Linh BÀI 2: PHÂN TÍCH BỆNH PHẨM- CÁC MẨU MỦ VÀ CHẤT DỊCH 1. Chỉ định. - Tất cả các trường hợp cĩ mủ, chất dịch như: - Mủ áp xe. - Vết thương nhiễm trùng, bao gồm các vết loét, cắt, lở, mổ hậu phẩu, loét do nằm lâu. - Các mạch lươn. - Các mạch dẫn từ xoang hay hạch bạch huyết. - Các dịch tiết như dịch màng phổi, khớp, màng bụng. - Các mẫu nạo mủ xương khi giải phẩu. 1. Các loại bệnh phẩm và cách lấy. Mủ áp xe, dịch màng phổi, màng bụng, khớp: lấy bằng phương pháp vơ trùng như khi làm tiểu phẩu, sau khi sát trùng vùng da bên ngồi và chờ khơ, chọc kim hút lấy mủ hay chất dịch. Cho mủ hay chất dịch vào lọ lấy bệnh phẩm vơ trùng (nắp vặn chật) hay tube Eppendorf biopure (tinh sạch sinh học), hay để nguyên ống kim hút mủ, rồi gửi ngay đến phịng thí nghiệm để yêu cầu cấy ngay. Cĩ thể tẩm mủ vào tăm bơng rồi cho vào mơi trường chuyên chở Stuart-Amies (dùng cặp tube đũa tăm bơng vơ trùng/tube đũa Stuart-Amies), hay cĩ thể cấy ngay tại giường bệnh với chai 2 mặt thạch cấy các dịch khơng tạp nhiễm (xem giới thiệu chai 2 mặt thạch cấy DNT và các dịch khơng tạp nhiễm) rồi chuyển về phịng thí nghiệm. Các vết thương nhiễm trùng: lau sạch vùng da lành chung quanh với cồn 70%. Lau sạch mủ trên vết thương bằng gạc vơ trùng thấm nước muối sinh lý vơ trùng. Dùng tăm bơng vơ trùng lấy mẫu để quệt lấy mủ, chất dập nát, hay mơ (ngay dưới lớp mủ đã chùi 67
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh gây bệnh - Trường Đại học Mở Tp. HCM Dương Nhật Linh sạch); hay lấy mẫu cho vào lọ lấy bệnh phẩm vơ trùng, hay tube Eppendorf biopure rồi gửi ngay đến phịng thí nghiệm để yêu cầu cấy ngay. Nếu chưa cĩ thể gửi ngay, cho tăm bơng đã quệt mủ vào mơi trường chuyên chở Stuart-Amies (dùng cặp tube đũa tăm bơng vơ trùng/tube đũa Stuart-Amies). Các nạo mủ hay mơ khi giải phẩu: cũng được lấy bằng quệt tăm bơng hay trực tiếp cho mẫu vào lọ lấy bệnh phẩm vơ trùng, hay tube Eppendorf biopure rồi gửi ngay đến phịng thí nghiệm. Nếu chưa cĩ thể gửi ngay, cho vào mơi trường chuyên chở Stuart-Amies (dùng cặp tube đũa tăm bơng vơ trùng/tube đũa Stuart-Amies). Các mạch lươn hay mạch dẫn: dùng tăm bơng mãnh vơ trùng luồn vào mạch lươn; hay pipette Pasteur nhựa hút lấy mủ cho vào lọ lấy bệnh phẩm vơ trùng, hay tube Eppendorf biopure rồi gửi ngay đến phịng thí nghiệm. Nếu chưa cĩ thể gửi ngay, cho vào mơi trường chuyên chở Stuart-Amies (dùng cặp tube đũa tăm bơng vơ trùng/tube đũa Stuart-Amies). 2. Khảo sát đại thể. - Màu: đỏ, vàng, xanh - Mùi: thối, tanh, hăng - Tính chất: đặc, lỏng, nhầy, cĩ máu 3. Khảo sát vi thể. - Nhộm Gram. Nếu kết quả nhuộm Gram thấy cĩ vi khuẩn thuần khiết, cĩ thể làm kháng sinh đồ trực tiếp mẫu bệnh phẩm. - Nhuộm kháng acid (nếu cĩ yêu cầu). 4. Nuơi cấy. - Cấy ngay vào các hộp thạch phân lập: - Tối thiểu là BA hay BA cĩ Nalidixic acid (BANg) và MC hay 68
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh gây bệnh - Trường Đại học Mở Tp. HCM Dương Nhật Linh EMB. - Nếu cĩ điều kiện, cấy thêm MSA hay DNA agar, BA cĩ Gentamicin. - Nếu nghi nấm, cấy thêm thạch Sabouraud. - Các hộp BA phải được ủ 35-37oC trong tủ ấm CO2 hay bình nến. Các trường hợp khác, ủ khí trường bình thường. - Quan sát hộp thạch liên tục trong 3 ngày, một khi cĩ khúm vi khuẩn mọc, tiến hành định danh và làm kháng sinh đồ ngay. - Cấy dự phịng vào một ống Thioglycollate hay BHI, ủ đồng thời với các hộp thạch phân lập. Nếu trên hộp thạch phân lập khơng cĩ vi khuẩn mọc mà ống BHI hayThioglycollate đục thì cấy phân lập từ các ống mơi trường nầy. 5. Các vi khuẩn gây bệnh cĩ thể phân lập được. Ø Thường gặp. - Streptococcus pyogenes. - Staphylococcus aureus. Ø Ít gặp hơn. - Các trực khuẩn Enterobacteriaceae. - Pseudomonas và các trực khuẩn Gram (-) khơng lên men. - Streptococci ( các lồi khác), - Clostridium perfringens, - Bacteroides và các vi khuẩn kỵ khí khác. Ø Rất hiếm gặp. - Bacillus anthracis. - M. tuberculosis. - M. ulcerans. 69
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh gây bệnh - Trường Đại học Mở Tp. HCM Dương Nhật Linh - Pasteurella multocida 70
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh gây bệnh - Trường Đại học Mở Tp. HCM Dương Nhật Linh PHẦN 4: PHẢN ỨNG HUYẾT THANH HỌC 71
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh gây bệnh - Trường Đại học Mở Tp. HCM Dương Nhật Linh BÀI 1: PHẢN ỨNG NGƯNG KẾT KHÁNG NGUYÊN – KHÁNG THỂ. I. (Agglutination). Kháng nguyên thường là vi khuẩn sống (hay chết). Khi gặp kháng thể tương ứng, các vi khuẩn này kết lại với nhau thành đám, đĩ là hiện tượng ngưng kết. Kết quả phản ứng cĩ thể quan sát bằng mắt thường. 1. Cơ chế phản ứng: Trong hỗn dịch kháng nguyên hữu hình, vi khuẩn phân tán xa nhau do các lực, chủ yếu là lực tĩnh điện. Khi cho hỗn hợp kháng nguyên tiếp xúc với kháng thể, kháng thể sẽ gắn vào kháng nguyên tạo nên đám ngưng kết lợn cợn. 2. Thực hành và đọc kết quả: Nhỏ trên phiến kính (gạch men) một giọt nước muối sinh lý, trộn vi khuẩn vào để đối chứng (B). Bên đối chứng là một hỗn dịch trắng đục đều. Nhỏ ở cạnh bên, một giọt kháng huyết thanh định ngưng kết, trộn vi khuẩn (A). Phản ứng ngưng kết dương (+): sau 5 phút, cĩ ngưng kết thành những hạt nhỏ, lợn cợn. Phản ứng ngưng kết âm (–): hỗn dịch vẫn đục đều. 72
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh gây bệnh - Trường Đại học Mở Tp. HCM Dương Nhật Linh 1 giọt Kháng huyết thanh đa giá O + 1 vịng vi khuẩn Salmonella (A) (B) (+) (–) 1 giọt nước muối sinh lý + vi khuẩn Salmonella Hình: Kết quả phản ứng ngưng kết 73
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh gây bệnh - Trường Đại học Mở Tp. HCM Dương Nhật Linh BÀI 2: PHẢN ỨNG NGƯNG KẾT HỒNG CẦU HA (Hemagglutination test) và PHẢN ỨNG NGĂN TRỞ NGƯNG KẾT HỒNG CẦU HI (Hemagglutination Inhibition test) I/ PHẢN ỨNG NGƯNG KẾT HỒNG CẦU HA (Hemagglutination test). 1. Nguyên lý: Một số virus cĩ khả năng kết dính trên mặt hồng cầu, tạo cầu nối và làm kết tụ hồng cầu, cĩ thể thấy bằng mắt thường hoặc qua kính lúp. Đây là phương pháp quan trọng để chứng minh khả năng ngưng tụ hồng cầu của virus và các thành phần của chúng khi nuơi cấy tế bào trong phơi gà, giúp ta định tính và định lượng được virus. 2. Thực hành: Ø Pha hồng cầu gà 1%: Lấy 10ml máu gà cho vào bình tam giác cĩ 3,5 ml dung dịch Natri citrat 3,8% để chống đơng máu. Ly tâm 1.500 vịng/ phút cho hồng cầu lắng xuống, hút bỏ huyết tương, bạch cầu và tiểu cầu đi, cho NaCl 9‰ vơ khuẩn vào rửa hồng cầu. Tiếp tục ly tâm, hút bỏ phần nước trong ở trên (rửa và ly tâm 3 lần). Giử lại phần hồng cầu, pha hồng cầu 1% trong NaCl 9‰ vơ khuẩn. Ø Chuẩn bị nước trứng chứa virus: Lấy não gà nghi ngờ mắc bệnh Newcastle nghiền thành huyền dịch 1/10 với NaCl 9‰, khử tạp khuẩn bằng kháng sinh 74
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh gây bệnh - Trường Đại học Mở Tp. HCM Dương Nhật Linh rồi cấy vào xoang niệu mơ của phơi gà đã ấp từ 10 – 11 ngày, ấp tiếp ở 38oC – 39oC, sau 2 – 4 ngày phơi chết (tùy độc lực của mầm bệnh), lấy phơi cho vào tủ lạnh từ 0oC – 4oC trong 4 giờ để các mạch máu co lại, hút lấy nước trứng. Ø Thử phản ứng: Dùng vĩ nhựa hoặc 9 ống nghiệm sạch. Lấy pipette 1 hút vào ống thứ nhất 0,9 ml NaCl 9‰, các ống từ 2 – 8 mỗi ống 0,5 ml NaCl 9‰. Dùng pipette 2 hút vào ống thứ nhất 0,1 ml nước trứng nuơi virus, trộn đều. Hút 0,5 ml từ ống 1 sang ống 2, trộn đều. Lại hút 0,5 ml từ ống 2 sang ống 3, cứ thế cho đến ống thứ 8. Hút 0,5 ml trong ống thứ 8 bỏ đi. Vậy hiệu giá pha lỗng nước trứng từ ống thứ 1 đến 8: 1/10, 1/20, 1/40, 1/80, 1/160, 1/320, 1/640, 1/1280. Cho hồng cầu gà 1% vào tất cả các ống, mỗi ống 0,5 ml, lắc đều. Để yên từ 5 – 10 phút, đọc kết quả. - Phản ứng âm tính: Ống thứ 9 chỉ cĩ 0,5 ml NaCl 9‰ và 0,5 ml hồng cầu gà 1%. Do đĩ hồng cầu gà bị lắng xuống đáy thành một cục máu trịn đỏ, phần dịch ở trên trong. Đĩ là hiện tượng hồng cầu đĩng nút. - Phản ứng dương tính: hồng cầu ngưng kết thành những mảng hồng trải đều ở phần đáy ống nghiệm, cĩ những vệt rạn nứt. Hiệu giá ngưng kết đọc ở ống cĩ độ pha lỗng lớn nhất mà vẫn cĩ hiện tượng ngưng kết. 75
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh gây bệnh - Trường Đại học Mở Tp. HCM Dương Nhật Linh Đơn 1 2 3 4 5 6 7 8 9 vị Đối chứng NaCl 9‰ ml 0,9 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Nước trứng ml 0,1 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0 cĩ KN Bỏ đi 0,5 ml từ ống 8 [C] pha 1/10 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 1/1280 0 lỗng KN Hồng cầu ml 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 gà 1% Lắc đều, để yên từ 15 – 20 phút, đọc kết quả. Quan sát hiện tượng Kết quả (+) (+) (+) (+) (+) (+) ( + ) (–) (–) (–) Hiệu giá n = 1/160 kháng nguyên II. PHẢN ỨNG NGĂN TRỞ NGƯNG KẾT HỒNG CẦU HI (Hemagglutination Inhibition test) 1. Nguyên lý: Một số virus cĩ khả năng ngưng kết hồng cầu, kháng huyết thanh (antiserum) tương ứng cĩ khả năng làm mất hiện tượng này. Phản ứng HI dùng phát hiện và chuẩn độ kháng thể (định tính và định lượng) cĩ trong kháng huyết thanh. 76
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh gây bệnh - Trường Đại học Mở Tp. HCM Dương Nhật Linh 2. Thực hành: Ø Lấy huyết thanh gà bệnh: Lấy máu tim hoặc động mạch cổ của gà bệnh cho vào bình tam giác vơ khuẩn, để trong tủ lạnh 4oC/30 – 60 phút. Nghiêng bình tam giác, dùng bơm + kim tiêm hút dịch trong hơi hồng ở trên, cho vào ống nghiệm vơ khuẩn. Ø Pha kháng nguyên hiệu giá (n – 2): Giả sử hiệu giá đọc được ở phản ứng HA là: n = 1/160 Þ (n – 2) = 1/40. Dùng pipette 1ml, hút 0,1ml nước trứng chứa virus (ống gốc) ở phản ứng HA, cho vào ống nghiệm nhỏ, vơ khuẩn. Lấy pipette 5ml, hút vừa đủ 3,9ml nước NaCl 9‰, bổ sung vào ống nghiệm. Ta được 4ml dịch kháng nguyên hiệu giá (n – 2) = 1/40. Ø Thử phản ứng: Dùng vĩ nhựa hoặc 10 ống nghiệm sạch. Lấy pipette 1 hút vào 9 ống đầu, mỗi ống 0,25ml NaCl 9‰, ống thứ 10: 0,5ml NaCl 9‰. Dùng pipette 2 hút vào ống thứ nhất 0,25ml huyết thanh gà bệnh, trộn đều. Hút 0,25ml từ ống 1 sang ống 2, trộn đều. Lại hút 0,25ml từ ống 2 sang ống 3, cứ thế cho đến ống thứ 8. Hút 0,25ml trong ống thứ 8 bỏ đi. Vậy hiệu giá pha lỗng huyết thanh từ ống thứ 1 đến 8: 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64, 1/128, 1/256. Dùng pipette 3 hút kháng nguyên đã chuẩn độ (n – 2) = 1/40 cho vào ống thứ 1 đến 9, mỗi ống 0,25ml. Lắc đều, để yên từ 5 – 10 phút, để KN kết hợp với KT (nếu tương ứng). Cho hồng cầu gà 1% vào tất cả các ống, mỗi ống 0,5 ml, lắc đều. Để yên từ 5 – 10 phút. 77
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh gây bệnh - Trường Đại học Mở Tp. HCM Dương Nhật Linh 3. Đọc kết quả: Ống thứ 9: đối chứng (–), trong đĩ cĩ KN và hồng cầu, KN kết hợp với HC tạo hiện tượng ngưng kết. Ống thứ 10: đối chứng (+), trong đĩ chỉ cĩ hồng cầu, hồng cầu đĩng nút (tức bị ngăn trở ngưng kết). - Phản ứng dương tính: những ống nghiệm cĩ hiện tượng đĩng nút hồng cầu. Hiệu giá kháng thể là độ pha lỗng huyết thanh cao nhất mà vẫn cĩ khả năng ngăn trở ngưng kết HC. - Phản ứng âm tính: những ống nghiệm cĩ hiện tượng ngưng kết. Đơn 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 vị Đối Đối chứng chứng âm dương NaCl ml 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,5 9‰ Huyết ml 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0 0 thanh gà bệnh Bỏ đi 0,25 ml từ ống 8 [C] pha 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 0 0 lỗng HT KN đã ml 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0 78
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh gây bệnh - Trường Đại học Mở Tp. HCM Dương Nhật Linh chuẩn độ (n- 2) Trộn đều, để yên từ 5 – 10 phút, để KN kết hợp KT (nếu cĩ) Hồng ml 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 cầu gà 1% Trộn đều, để yên từ 15 – 20 phút, để KN cịn thừa (sau phản ứng kết hợp KN – KT), sẽ ngưng kết HC Quan sát hiện tượng Kết (+) (+) (+) (–) (–) (–) (–) (–) (–) (+) quả Hiệu 1/8 giá kháng thể 79
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh gây bệnh - Trường Đại học Mở Tp. HCM Dương Nhật Linh TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bộ mơn xét nghiệm (2002), Vi sinh y học. ĐH Y Dược TPHCM. 2. Bộ mơn vi sinh (2001), Thực tập vi sinh miễn dịch. ĐH Y Dược TPHCM. 3. Bộ mơn vi sinh (2002), Vi khuẩn học. ĐH Y Dược TPHCM. 4. Bộ mơn vi sinh (2001), Thực tập vi sinh miễn dịch. ĐH Y Dược TPHCM 5. Nguyễn Hữu Chí (2001), Các bệnh nhiễm trùng đường tiêu hĩa thường gặp. NXB Y học. 6. Phan Hữu Nghĩa, Tơ Minh Châu (2000), Thực hành Vi sinh miễn dịch. Trường ĐH Mở Bán Cơng Tp. HCM 7. Lê Đình Tiềm và cộng sự (1972), Kỹ thuật xét nghiệm.NXB Y học. 8. Phạm Hùng Vân (2002), Các kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sang. ĐH Y Dược TPHCM. 9. 80