›
›

Giáo trình Thực tập vi sinh cơ sở - Nguyễn Văn Minh

pdf 100 trang phuongnguyen 4230
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Giáo trình Thực tập vi sinh cơ sở - Nguyễn Văn Minh", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfgiao_trinh_thuc_tap_vi_sinh_co_so_nguyen_van_minh.pdf

Nội dung text: Giáo trình Thực tập vi sinh cơ sở - Nguyễn Văn Minh

  1. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh cơ sở - Trường Đại học Mở Tp. HCM Nguyễn Văn Minh BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giáo trình THỰC TẬP VI SINH CƠ SỞ Biên soạn: Nguyễn Văn Minh Dương Nhật Linh Tp. HCM, năm 2008 (Lưu hành nội bộ) 1
  2. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh cơ sở - Trường Đại học Mở Tp. HCM Nguyễn Văn Minh MỤC LỤC Bài 1: Các qui tắc an toàn trong phòng thí nghiệm vi sinh vật Bài 2: Trang thiết bị - dụng cụ - các phương pháp khử trùng Bài 3: Sử dụng kính hiển vi quang học quan sát tế bào vi sinh vật Bài 4: Pha chế môi trường dinh dưỡng Bài 5: Các phương pháp phân lập vi sinh vật Bài 6: Các phương pháp quan sát vi sinh vật Bài 7, 8: Các đặc tính sinh hóa của vi sinh vật Bài 9: Phương pháp kiểm tra số lượng tế bào vi sinh vật 2
  3. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh cơ sở - Trường Đại học Mở Tp. HCM Nguyễn Văn Minh Bài 1: CÁC QUI TẮC AN TOÀN TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT Thao tác an toàn là yêu cầu cực kỳ quan trọng đối với thí nghiệm vi sinh vật. Vi sinh vật có kích thước nhỏ bé mà mắt thường không nhìn thấy được. Trong quá trình làm thí nghiệm, chúng ta thường thao tác với số lượng rất lớn và đậm đặc tế bào vi sinh vật. Bên cạnh những giống, loài vi sinh vật có ích là những giống, loài có khả năng gây bệnh và có hại đối với sức khỏe con người. Mặt khác, trong quá trình thí nghiệm chúng ta cũng phải sử dụng nhiều loại hóa chất, trong đó có những hóa chất có độc tính. Chính vì thế, người làm thí nghiệm trong phòng thí nghiệm vi sinh vật cần tuân thử các qui tắc cơ bản sau đây: 1. Những qui định chung: - Những người không có nhiệm vụ không được vào phòng thí nghiệm. - Khi vào phòng thí nghiệm phải mặc áo Blouse (cài khuy kín), cột tóc gọn gàng. - Không nói chuyện ồn ào, giữ gìn trật tự. Không ăn uống, hút thuốc trong phòng kiểm nghiệm. - Mang khẩu trang, găng tay khi thao tác với vi sinh vật và hóa chất. - Trên bàn thí nghiệm chỉ để vật dụng thí nghiệm, số ghi chép, giấy ghi chép. Tất cả các vật dụng cá nhân, áo khoác, túi xách, sách vở, phải để đúng nơi qui định. - Trước và sau khi kết thúc thí nghiệm, phải sát trùng mặt bàn bằng các hóa chất sát trùng đã chuẩn bị sẵn và lau khô bằng giấy vệ sinh. 3
  4. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh cơ sở - Trường Đại học Mở Tp. HCM Nguyễn Văn Minh - Cần ghi chú tên chủng, ngày tháng thí nghiệm, người là thí nghiệm lên tất cả các hộp petri, ống nghiệm, - Tuyệt đối không để canh trường hay vật phẩm có vi sinh vật dấy lên quần áo, sách vở và dụng cụ cá nhân. Đồng thời cũng phải chú ý bảo vệ da và quần áo khỏi bị dính hóa chất và thuốc nhuộm. - Cẩn thận khi thao tác với đèn cồn hoặc đèn Bunsen. Tắt ngọn lửa khi chưa có nhu cầu sử dụng hoặc ngay sau khi thực hiện xong mỗi thao tác. Tuyệt đối không dùng đèn cồn để mồi lửa đèn cồn. - Sử dụng quả bóp cao su khi thao tác ống hút định lượng (pipette), Tuyệt đối không hút bằng miệng. - Không tự ý sử dụng trang thiết bị, dụng cụ trong phòng thí nghiệm khi chưa được hướng dẫn cụ thể. Sử dụng theo hướng dẫn, hết sức thận trọng, tránh làm đổ vỡ và hư hỏng. - Tất cả các vật liệu bị nhiễm bẩn cần phải được khử trùng trước khi vứt bỏ hoặc sử dụng lại. - Kết thúc thí nghiệm phải vệ sinh các thiết bị, dụng cụ đã sử dụng theo đúng qui trình và sắp xếp vào đúng nơi qui định. - Rửa tay sạch sẽ trước khi rời phòng thí nghiệm. - Tất cả các trường hợp tai nạn phải báo cáo cho cán bộ hướng dẫn thí nghiệm để kịp thời và xử lý. 2. Một số lưu ý với sinh viên nhằm đạt kết quả tốt trong thực hành vi sinh vật · Trước khi thực hành: - Cần đọc bài trước nội dung toàn bài để hình dung được khối lượng công việc sẽ làm. 4
  5. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh cơ sở - Trường Đại học Mở Tp. HCM Nguyễn Văn Minh - Hiểu rõ nguyên tắc, mục đích của các thí nghiệm. - Đọc cẩn thận cách tiến hành thí nghiệm. · Trong giờ thực hành: - Ghi chú cẩn thận những căn dặn của giảng viên về các thao tác và qui trình thực hành. - Thực hiện thí nghiệm theo đúng hướng dẫn của giảng viên. - Trong quá trình thí nghiệm có những thao tác, công đoạn không rõ cần hỏi lại giảng viên hướng dẫn. - Ghi chép cẩn thận các chú ý quan trọng của thí nghiệm và kết quả của mỗi thí nghiệm. · Kết thúc thực hành: - Làm báo cáo thực hành theo yêu cầu của giảng viên. Bài 2: TRANG THIẾT BỊ - DỤNG CỤ - CÁC PHƯƠNG PHÁP KHỬ TRÙNG I/ TRANG THIẾT BỊ - DỤNG CỤ. A. Một số trang thiết bị, dụng cụ thông dụng. 1. Tủ sấy (vacuum oven): to từ 60oC – 200oC, dùng để sấy khô, khử trùng các loại dụng cụ chịu được sức nóng khô, chủ yếu là dụng cụ thủy tinh, kim loại. Tùy vào đối tượng cần khử khuẩn mà sấy ở chế độ to và thời gian khác nhau, thường sấy ở 160oC/2 giờ, hoặc 180oC/30 phút. 5
  6. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh cơ sở - Trường Đại học Mở Tp. HCM Nguyễn Văn Minh Hình 1: Tủ sấy 2. Tủ ấm (incubator or etuve ): to từ 20oC – 60oC, có chế độ ổn định nhiệt độ, được sử dụng để nuôi cấy vi sinh vật tại nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của chúng. Tùy vào đối tượng nuôi cấy mà ủ ở to khác nhau để vi sinh vật có thể phát triển tốt. Ví dụ: Coliform 30oC/24h – 48h, E. coli thích hợp ở 44oC/24h – 48h. 3. Tủ lạnh hay tủ mát ( freezer ): dùng bảo quản môi trường đã pha chế, giống vi khuẩn, các chế phẩm sinh học (vaccin, huyết thanh, đĩa giấy kháng sinh, ), hóa chất, thuốc thử dễ phân hủy ở nhiệt độ thường. 4. Nồi hấp ướt ( Autoclave ): Thiết bị này cấp nhiệt bằng hơi nước ở áp suất cao (hơi nước bão hòa ở áp suất cao), được sử dụng để hấp khủ trùng môi trường, một số nguyên liệu và dụng cụ thí nghiệm. Tùy đối tượng mà sử dụng ở chế độ nhiệt độ và áp suất thích hợp, thường dùng ở 121oC/1 atm/ 15 phút. Hay 127oC/1.5 atm/30 phút với môi trường đất, 117oC/ 0.8 atm/15 phút với môi trường chứa nhiều đường, môi trường sữa 6
  7. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh cơ sở - Trường Đại học Mở Tp. HCM Nguyễn Văn Minh Chỉ số áp kế của nồi hấp áp suất: Chỉ số áp kế 0 0,2 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,5 2,0 (đơn vị:atm ) To sôi hơi 100 105 110 112 114 116 117 119 121 127 134 nước (đơn vị:oC) To sôi hơi 212 221 230 234 237 241 243 246 250 261 273 nước (đơn vị: oF) Hình 2 : Nồi hấp 5. Cân phân tích điện tử (analytical balance): trọng lượng từ 100µg – 200g. Độ chính xác 10-4g. Cân kỹ thuật (technical balance)- độ chính xác 10-2g. Dùng cân hóa chất, môi trường. 7
  8. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh cơ sở - Trường Đại học Mở Tp. HCM Nguyễn Văn Minh A B Hình 3 : A- cân phân tích, B- cân kỹ thuật 6. Tủ cấy vô khuẩn có đèn cực tím (UV) (flux laminar ): Có không gian vô trùng được sử dụng để thao tác với vi sinh vật nhờ hệ thống đèn tử ngoại và bộ phận thổi khí vô trùng. Hình 4: tủ cấy 7. Máy ly tâm (centrifuge): Dùng tách các chất ở các pha rắn-lỏng ra khỏi nhau như tách sinh khối tế bào ra khỏi môi trường nuôi cấy, tách hồng cầu, enzyme, 8
  9. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh cơ sở - Trường Đại học Mở Tp. HCM Nguyễn Văn Minh Hình 5: máy ly tâm 8. Máy lắc (shaker): Thiết bị dùng để nuôi cấy, nhân giống vi sinh vật bằng cách lắc các bình nuôi cấy theo các chiều khác nhau (lắc vòng và lắc ngang) một cách đều đặn để tăng lượng oxy hòa tan trong môi trường. Hình 6: máy lắc 9. Kính hiển vi (microscope): có vai trò rất quan trọng nghiên cứu vi sinh vật. Dùng nghiên cứu, quan sát tế bào vi sinh vật về đặc điểm hình thái, sinh lý nhờ vào khả năng phóng đại của kính (sẽ giới thiệu chi tiết ở bài sử dụng kính hiển vi). 10. Máy đo pH (pH meter): đo pH dung dịch, môi trường nuôi cấy, 9
  10. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh cơ sở - Trường Đại học Mở Tp. HCM Nguyễn Văn Minh A B Hình 7: A- máy đo pH để bàn, B- máy đo pH cầm tay 11. Máy cất nước (single/ double water stills): dùng để cất nước. Hình 8: máy cất nước 1 lần 12. Bể ổn nhiệt (water bath): chứa nước và được cài đặt ở nhiệt độ nhất định để ổn định nhiệt độ cho những thí nghiệm cần sự ổn định về nhiệt độ. 10
  11. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh cơ sở - Trường Đại học Mở Tp. HCM Nguyễn Văn Minh Hình 9: Bể ổn nhiệt 13. Nồi lên men (fermenter):thiết bị lên men nuôi cấy vi sinh vật. Hình 10: Nồi lên men 14. Các thiết bị khác như: máy đếm vi sinh vật, máy quang phổ, sấy đông khô, B. Dụng cụ Ø Thủy tinh: có nhiều loại với nhiều kích cỡ khác nhau như bình tam giác, ống nghiệm, đĩa petri, lam kính, đũa thủy tinh, que trang, ống đong, cốc đong, bình định mức, yêu cầu phải sạch, trong, trung tính. Trước khi dùng đựng môi trường phải được sấy khô, làm nút bông và khử trùng trong tủ sấy khô. 11
  12. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh cơ sở - Trường Đại học Mở Tp. HCM Nguyễn Văn Minh - Đối với dụng cụ mới: cần ngâm nước hoặc dung dịch H2SO4 loãng trong 24 giờ. Sau đó mới rửa lại bằng nước hoặc xà phòng nhiều lần cho đến khi pH trung tính. - Đối với dụng cụ đã qua sử dụng còn chứa môi trường và vi sinh vật, cần khử trùng rồi mới rửa sạch bằng xà phòng, phơi và sấy khô. - Đối với dụng cụ bị bám bẩn, cần ngâm thêm với dung dịch sulfocromic vài giờ, sau đó rửa lại bằng nước sạch. Dụng cụ sạch khi đưa lên ánh sáng không có vết mờ và vết bợn. 2. Các dụng cụ khác: như đèn cồn, giá ống nghiệm, que cấy, kẹp, kéo, bơm tiêm nhựa, đầu típ, bếp điện, II/ PHƯƠNG PHÁP KHỬ TRÙNG. Nguyên tắc. Diệt trùng hay khử trùng là phương pháp nhằm ức chế hoặc loại bỏ, cuối cùng là giết chết các vi sinh vật không mong muốn. Người ta thường khử trùng bằng 2 phương pháp chính: A. Phương pháp lý học. 1. Nhiệt khô. - Đối với dụng cụ cấy kim loại, đôi khi cả thủy tinh, phương pháp thường dùng là đốt: đốt trực tiếp trên ngọn lửa hoặc nhúng cồn đốt. - Đối với dụng cụ thủy tinh có thể gói giấy và sấy ở 160oC/ 1 giờ. Dụng cụ đưa vào sấy phải chịu được nhiệt độ cao và không buộc dây nhựa hoặc thun. 2. Nhiệt ẩm. - Phương pháp luột: cho vật khử trùng vào nước sôi, nhiệt sẽ thấm nhanh vào mẫu vật làm cho protein đông kết, dẫn đến giết 12
  13. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh cơ sở - Trường Đại học Mở Tp. HCM Nguyễn Văn Minh chết vi sinh vật. Tuy nhiên, chỉ diệt tế bào sinh dưỡng, bào tử vẫn còn. - Phương pháp Pasteur: Chỉ diệt vi khuẩn gây bệnh ( ký sinh ), không diệt bào tử và vi khuẩn hoạt sinh. Phương pháp này không diệt hoàn toàn mầm bệnh mà chỉ chọn một vài vi sinh vật đối kháng mạnh nhất. Vì vậy, phải biết nhiệt độ và thời gian diệt cho từng loại vi sinh vật. - Phương pháp Tyndall: đun cách thủy nhiều lần ở nhiệt độ 70- 80oC, mỗi lần 30-60 phút và liên tiếp trong 3 ngày liền. - Phương pháp hơi nước bảo hòa ở áp suất cao: dùng autoclave. 3. Diệt trùng bức xạ. - Tia tử ngoại hay UV: chỉ sát trùng bề mặt, không xuyên sâu vào mẫu vật. - Tia âm cực: dùng trong diệt trùng dụng cụ giải phẫu, thuốc, thực phẩm. Vật khử trùng phải bao gói kín. 4. Diệt trùng bằng sóng. - Sóng ngắn khi tác động với cường độ và thời gian thích hợp có thể pá vỡ tế bào vi sinh vật, làm chết các tế bào sống. 5. Diệt trùng bằng cách lọc. - Dụng cụ lọc thường là những màng xốp bằng sứ, aminate, cellulose, thường là những vật phẩm lỏng không khử trùng bằng nhiệt được. - Đối với khử trùng không khí thì thiết bị khử trùng là một máy lọc khí có trang bị màng lọc hay hấp phụ vi khuẩn. B. Phương pháp hóa học. 1. Chất sát khuẩn ngoài da: xà phòng, cồn, iod, phẩm màu ( phần lớn phẩm màu có tác dụng sát khuẩn như: xanh methylene). 2. Chất diệt khuẩn và tẩy uế: phenol, formol, hợp chất Clor, 13
  14. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh cơ sở - Trường Đại học Mở Tp. HCM Nguyễn Văn Minh III/ THỰC HÀNH. Giảng viên giảng nguyên lý, công dụng thiết bị và hướng dẫn sinh viên cách sử dụng các thiết bị có trong phòng thí nghiệm. IV/ BÁO CÁO KẾT QUẢ . Trình bày lại nguyên lý, công dụng và cách sử dụng các thiết bị đã được học. 14
  15. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh cơ sở - Trường Đại học Mở Tp. HCM Nguyễn Văn Minh Bài 3: SỬ DỤNG KÍNH HIỂN VI QUANG HỌC QUAN SÁT TẾ BÀO VI SINH VẬT I. GIỚI THIỆU CÁC LOẠI KÍNH HIỂN VI. 1. Kính hiển vi nền đen. Nguyên tắc: Ánh sáng thường chiếu từ dưới lên, qua rìa của tụ quang nền đen, chiếu hắt vào xung quanh tiêu bản, những tia sáng này bị tiêu bản làm khúc xạ rồi đưa vào vật kính. Tiêu bản được soi sáng rực trên nền đen, giống như trong phòng tối có một tia sáng mạnh chiếu vào, giúp thấy rõ từng hạt bụi trong không khí bị tia sáng chiếu vào. Chức năng: quan sát hình thái và đặc tính của một số vi khuẩn mà kính hiển vi thường khó quan sát. 2. Kính hiển vi đổi pha. Nguyên tắc: ánh sáng thường bị đổi pha và biên độ dao động bởi cấu trúc đặc biệt của tụ quang kính, vật kính và thị kính. Chức năng: dùng quan sát rõ nét các cấu trúc nhỏ như tiên mao, các lớp màng. 3. Kính hiển vi huỳnh quang. Nguyên tắc: chùm tia tử ngoại chiếu vào tiêu bản đã nhuộm màu bằng các chất huỳnh quang. Trong tế bào, các cấu trúc khác nhau sẽ phát quang với màu sắc khác nhau. Chức năng: quan sát và phân biệt được các cấu trúc khác nhau trong tế bào vi sinh vật. 4. Kính hiển vi điện tử. Nguyên tắc: chùm tia điện tử bước sóng rất ngắn, năng suất phân li rất lớn nên độ phân giải cao, giúp phân biệt 2 điểm rất gần nhau. 15
  16. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh cơ sở - Trường Đại học Mở Tp. HCM Nguyễn Văn Minh Chức năng: dùng quan sát virus, cấu trúc phân tử của tế bào. 5. Kính hiển vi quang học. II. KÍNH HIỂN VI QUANG HỌC. 1. Nguyên tắc: dùng ánh sáng có bước sóng từ 500nm – 560 nm trong chùm ánh sáng thường để tạo năng suất phân ly lớn giúp phân biệt 2 điểm cách nhau khoảng 0.2 µm trở lên. Hệ thống phóng to của kính hiển vi quang học gồm hai bộ phận: Vật kính (quay về phía vật quan sát) và thị kính (quay về phía mắt nhìn). Mỗi bộ phận này là một hệ thống thấu kính hội tụ phức tạp, mẫu vật cần quan sát AB được đặt trước vật kính một khoảng cách lớn hơn tiêu cự của vật kính một chút. Ảnh thật đảo ngược A’B’ của vật sẽ thu được ở bên kia vật kính, nằm trong khoảng tiêu cự của thị kính. Thị kính hoạt động như một kính lúp. Qua thị kính, người ta sẽ thấy ảnh ảo A’’B’’ được phóng to lên của ảnh thật A’B’. Hình 11. Nguyên tắc quang học của kính hiển vi. 2. Chức năng: quan sát tế bào vi sinh vật, ký sinh trùng, tế bào động vật,t hực vật. 3. Cấu tạo: gồm 2 phần. 16
  17. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh cơ sở - Trường Đại học Mở Tp. HCM Nguyễn Văn Minh - Hệ thống cơ học: giá kính gồm chân kính, thân kính, trụ đỡ và xoay thị kính, ổ gắn và xoay vật kính, bàn kính, thanh trượt di chuyển tiêu bản, ốc di chuyển thanh trượt, kẹp giữ tiêu bản, ốc di chuyển tụ quang kính, ốc điều chỉnh sơ thô cấp, ốc điều chỉnh thứ cấp (vi cấp). - Hệ thống quang học gồm: thị kính, vật kính, tụ quang kính, màn chắn sáng, nguồn chiếu sáng (đèn điện chiếu sáng và/ hoặc kính chiếu sáng. Ngoài ra, ở kính dùng nguồn chiếu sáng là đèn điện thì có thêm bộ phận cung cấp điện như phích cắm, dây điện, cầu chì, mạch điện (trong chân kính) và nút điều chỉnh cường độ chiếu sáng. Thò kính (x 10, x 15) Truï ñôõ vaø xoay thò kính OÅ gaén vaø xoay vaät kính Thaân kính Vaät kính Baøn kính Thanh keïp giöõ tieâu baûn c ñieàu chænh maøng Oác sô caáp (thoâ) Ố ý chaén saùngþ Tuï quang kính Oác thöù caáp (vi caáp) Göông chieáu saùng Chaân kính hieån vi Hình 12: Các bộ phận KHV quang học – dùng gương. 17
  18. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh cơ sở - Trường Đại học Mở Tp. HCM Nguyễn Văn Minh (Thò kính) (OÁng kính) (Thaân kính) (Vaät kính) (Baøn kính) (Nuùt chænh tinh) (Nuùt chænh thoâ) (Maøng chaén saùng) (Nuùt chænh (Nguoàn saùng) (Baøn kính ) (Nuùt chænh aùnh saùng nguoàn) (Nuùt chænh thoâ) Hình 13: Các bộ phận KHV quang học- dùng đèn. 4. Nguyên tắc hoạt động. Vật kính là hệ thống quang học phức tạp gồm một số thấu kính, trực tiếp phóng đại mẫu vật. Các thấu kính sắp xếp theo thứ tự, thấu kính nhỏ ngoài cùng hướng vào tiêu bản có độ phóng đại lớn nhất. Độ phóng đại của kính phụ thuộc tiêu cự, tức bán kính cong của thấu kính. Thấu kính càng cong, tiêu cự càng ngắn thì khả năng phóng đại càng lớn. Có 2 loại vật kính: Vật kính khô độ phóng đại nhỏ như x8, x10, x15, x40, x45. Vật kính dầu có độ phóng đại lớn như x90, x100. Thị kính cũng có cấu tạo phức tạp, gồm 2 thấu kính, một hướng về mắt người xem, một hướng về vật kính. Thị kính phóng đại một lần nữa ảnh do vật kính thu vào, làm ảnh to lên, xem rõ hơn. 18
  19. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh cơ sở - Trường Đại học Mở Tp. HCM Nguyễn Văn Minh Độ phóng đại của kính = độ phóng đại của vật kính x độ phóng đại của thị kính. Ví dụ: Độ phóng đại của vật kính: x100 Độ phóng đại của thị kính: x10 Độ phóng đại của kính: 100 x 10 = 1.000 lần. Năng suất phân ly của kính quan trọng hơn độ phóng đại, và là tiêu chuẩn chính để chọn kính hiển vi. Năng suất phân ly ( độ phân giải ) của kính hiển vi là đại lượng cho biết khả năng phân biệt hai điểm của vật quan sát nằm sát nhau. Nếu khoảng cách giữa 2 điểm nằm càng sát nhau mà vẫn có thể phân biệt được thì năng suất phân ly của kính càng cao. Khoaûng caùch naøy phuï thuoäc chieàu daøi soùng aùnh saùng söû duïng vaø soá löôïng tia saùng ñi vaøo vaät kính, ñöôïc bieåu hieän baèng coâng thöùc: l : Độ dài bước sóng phát ra từ mẫu vật. n : Chỉ số chiết quang của môi trường giữa mẫu vật và vật kính. a : Nửa góc mở của vật kính. 2nsina : Trị số mở của vật kính. Qua đó, ta thấy muốn có độ phân ly cao phải dùng ánh sáng có bước sóng thật ngắn, hoặc dùng vật kính có trị số mở lớn. Nếu dùng vật kính có trị số mở 0,65 và soi với ánh sáng trắng (có bước sóng trung bình l= 0,55 mm) thì khoảng cách nhỏ nhất có thể nhìn thấy rõ được là: 19
  20. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh cơ sở - Trường Đại học Mở Tp. HCM Nguyễn Văn Minh Với những chi tiết có khoảng cách nhau dưới 0,85 mm thì người ta không phân biệt được. Trong khi đó nếu dùng thị kính có độ phóng đại lớn hơn cũng không ích gì mà phải thay vật kính khác có trị số mở lớn hơn. Nếu thay vật kính chìm (vật kính dầu – x100) thì khoảng cách nhỏ nhất giữa các chi tiết của vật soi có thể thấy được là: Vì l đã xác định bởi nguồn ánh sáng thấy, muốn giảm d để tăng khả năng phân tích của kính thì chỉ có cách là tăng nsina. Trong số này góc a bị giới hạn bởi nhiều sai lệch khó điều chỉnh, còn lại là chỉ số chiết quang n. Nhưng n không được cao hơn chỉ số chiết quang của các thấu kính trong vật kính, nên người ta chỉ nâng n giữa vật kính và mẫu vật bằng một chất dầu gọi là dầu bách hương (dầu cede) để đạt chỉ số chiết quang tối đa mong muốn bằng chỉ số chiết quang của thấu kính. nkhoâng khí = 1,000 nthuûy tinh = 1,515 ndaàu soi = 1,520 Chiết suất ánh sáng của không khí nhỏ hơn thủy tinh, nên tia sáng khi đi qua tiêu bản thủy tinh sẽ bị khúc xạ một phần. Phần phía ngoài của tia sáng do bị khúc xạ nên không đi vào được vật kính. Vật kính có độ phóng đại lớn thì đường kính của thấu kính càng nhỏ, lượng tia sáng đi vào được vật kính rất ít, nên không 20
  21. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh cơ sở - Trường Đại học Mở Tp. HCM Nguyễn Văn Minh thấy rõ ảnh. Để hạn chế nhược điểm này ta dùng dầu soi có chiết suất ánh sáng gần bằng thủy tinh, thủy tinh và dầu soi được xem như một môi trường đồng nhất. Ánh sáng đi qua không bị khúc xạ, nên tập trung đầy đủ vào vật kính, giúp xem rõ ảnh. Năng suất phân ly của kính càng cao thì góc nghiêng càng lớn và bước sóng càng nhỏ. Tăng góc nghiêng bằng cách chế tạo vật kính sao cho vật quan sát ( tiêu bản ) được đặt gần vật kính. Hình 14: Đường đi của tia sáng Hình 15: Nguyên lý hoạt động của vật kính dầu Dưới đây các bảng thông số chính của vật kính và thị kính: Ký hiệu ghi Độ phóng Độ Khoảng cách từ Đường kính vi trường trên vật kính đại của mở VK đến tiêu bản khi quan sát bằng thị VK (A) (mm) kính x10 (mm) Vật kính khoâ 8 x 0,20 8 0,20 8,91 1,75 21
  22. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh cơ sở - Trường Đại học Mở Tp. HCM Nguyễn Văn Minh 10 x 0,25 10 0,25 6,80 40 x 0,65 40 0,65 0,60 0,35 Vật kính dầu 90 x 1,25 90 1,25 0,15 0,15 100 x 1,25 100 1,25 0,12 Kính tụ quang là hệ thống thấu kính dùng tập trung ánh sáng vào tiêu bản, tăng cường độ chiếu sáng, rất quan trọng khi dùng vật kính dầu. Với vật kính khô ta dùng tụ quang có độ mở (A): 0,20 – 0,65. Với vật kính dầu thường dùng tụ quang có độ mở từ: 1,20 – 1,30. Trong tụ quang có màng chắn sáng, khi tia sáng càng mạnh thì màu của vật quan sát càng mờ nhạt, nên khép bớt màn chắn sáng lại. Ngược lại, cần mở hết chắn sáng ra, khi dùng vật kính dầu. Điều chỉnh tụ quang cần lưu ý: - Khi nguồn sáng ở xa thì dùng gương phẳng, vì tụ quang chỉ tập trung được các tia sáng song song. - Điểm giữa của tụ quang phải trùng với trục quang học của kính. - Độ mở của tụ quang phải tương ứng hơn độ mở của vật kính. Vậy ta dùng màng chắn sáng điều chỉnh cho độ mở của tụ quang nhỏ đi, loại bớt ánh sáng khuếch tán làm ảnh rõ hơn. ( mối tương quan giữa vật kính và lá chắn điều chỉnh ánh sáng) - Nguồn sáng quyết định hình ảnh của tiêu bản, độ phóng đại càng cao thi nguồn sáng phải càng mạnh. Để điều khiển 22
  23. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh cơ sở - Trường Đại học Mở Tp. HCM Nguyễn Văn Minh cường độ chiếu sáng có thể dùng đèn chiếu sáng rời hoặc lắp vào để kính kết hợp với màng chắn sáng. Hình 16: Mối tương quan giữa độ phóng đại của vật kính với khoảng cách từ vật kính đến tiêu bản. 5. Cách sử dụng. Trước khi sử dụng phải kiểm tra tất cả các bộ phận của kính, dùng khăn mềm để lau các bộ phận của kính (Chú ý: chỉ lau bên ngoài, không tháo rời các bộ phận của kính), để kính ngay ngắn vừa với tầm ngồi, sau đó tiến hành tuần tự các bước tiếp theo để soi tiêu bản. Bước 1: Lấy ánh sáng. Đối với kính hiển vi phải dùng gương để lấy ánh sáng từ bên ngoài thì làm như sau: Chọn phía sáng nhất để làm nguồn sáng, quay gương về phía nguồn sáng đã chọn (nếu ánh sáng mạnh thì dùng mặt phẳng, nếu ánh sáng yếu thì dùng mặt lõm của gương), mở que chắn 23
  24. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh cơ sở - Trường Đại học Mở Tp. HCM Nguyễn Văn Minh sáng nếu hệ thống chắn sáng bị đóng. Mắt nhìn qua lổ trên mâm kính, tay điều khiển gương sao cho thấy mặt trên hộp tụ quang có 1 chùm sáng mạnh là đạt yêu cầu. Xoay vật kính nhỏ nhất (vật kính 10) về trục kính (khi nghe tiếng cạch nhẹ là đã đúng vị trí). Mắt nhìn vào thị kính, thấy vi trường sáng tròn đều là được Nếu vi trường chưa sáng tròn đều thì mắt nhìn vào thị kính, tay điều khiển gương cho đến khi được vi trường sáng tròn đều. Đối với kính hiển vi dùng ánh sáng đèn thì cắm dây đèn vào ổ cắm, bật công tắc, điều khiển núm chỉnh ánh sáng ở đế kính để có được ánh sáng thích hợp. Xoay vật kính nhỏ nhất (vật kính 10x) về trục kính như trên. Bước 2: Đặt tiêu bản vào mâm kính. Trước khi đặt tiêu bản vào mâm kính, phải chọn mặt phải, mặt trái của tiêu bản. Mặt phải của tiêu bản thường có dán lamen, dán nhãn (nếu có lamen và nhãn) hoặc làm giảm bớt độ lóa của gương khi để nghiêng soi ra ánh sáng (nếu không có lamen, không có nhãn). Để mặt phải của tiêu bản lên trên, tay phải mở kẹp tiêu bản, tay trái cầm phía đầu nhãn tiêu bản, đặt tiêu bản vào mâm kính và tay phải thả kẹp giữ tiêu bản ra. Tiêu bản được giữ chặt vào xe đẩy, trên mâm kính. Dùng ốc xe đẩy để điều chỉnh sao cho mẫu vật nằm đúng vào trục kính (giữa lổ mâm kính) Chú ý: Có thể dùng điểm sáng của hộp tụ quang để làm điểm chuẩn khi điều chỉnh mẫu vật về điểm trục kính, nếu mẫu vật nhỏ quá. Bước 3: Quan sát. Nguyên tắc bắt buộc khi quan sát là phải quan sát được ở vật kính có độ phóng đại nhỏ, rồi mới chuyển sang quan sát ở vật kính có độ phóng đại lớn hơn kề nó. 24
  25. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh cơ sở - Trường Đại học Mở Tp. HCM Nguyễn Văn Minh Xem tiêu bản ở vật kính X10: - Hạ tụ quang kính xuống dưới (tức tăng khoảng cách tụ quang với tiêu bản, thị trường mờ đi). - Xoay vật kính x10 vào khớp của ổ đỡ vật kính (hướng vật kính vào tụ quang). - Mắt nhìn vào bàn đặt tiêu bản (không nhìn vào thị kính), hai tay xoay ốc điều chỉnh sơ cấp đưa dần vật kính hướng đến tiêu bản(không được chạm vào tiêu bản). - Đặt mắt hướng vào thị kính, hai tay xoay chậm ốc điều chỉnh sơ cấp hướng ra xa tiêu bản đến khi mắt thấy rõ dần tiêu bản mẫu vật thì dừng lại. - Hai tay nắm ốc vi cấp điều chỉnh cho ảnh rõ nhất. - Mắt vẫn hướng vào thị kính, điều chỉnh một lần nữa khoảng cách của tụ quang kính với tiêu bản và màng chắn sáng sao cho ảnh rõ nhất. Xem tiêu bản ở vật kính X40: - Nâng tụ quang kính lên vừa phải (thị trường sáng hơn). - Xoay vật kính X40 vào khớp của ổ đỡ vật kính ( hướng vật kính vào tụ quang). - Đặt mắt hướng vào thị kính, có thể nhìn thấy ngay hình thái của mẫu vật (đôi khi không rõ lắm). Hai tay nắm ốc vi cấp điều chỉnh cho ảnh rõ nhất. - Mắt vẫn hướng vào thị kính, điều chỉnh một lần nữa khoảng cách của tụ quang kính với tiêu bản và màng chắn sáng sao cho ảnh rõ nhất. 25
  26. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh cơ sở - Trường Đại học Mở Tp. HCM Nguyễn Văn Minh Xem tiêu bản ở vật kính X90, X100: - Nâng tụ quang kính lên sát tiêu bản, mở cường độ sáng tối đa(thị trường sáng nhất). - Xoay vật kính x100 vào khớp của trụ đỡ vật kính (hướng vật kính vào tụ quang). - Nhỏ một giọt dầu soi vào giữa tiêu bản. - Mắt nhìn vào bàn đặt tiêu bản (không nhìn vào thị kính), hai tay xoay ốc điều chỉnh sơ cấp đưa dần vật kính hướng đến tiêu bản vừa chạm vào tiêu bản thì dừng lại. - Đặt mắt hướng vào thị kính, hai tay xoay chậm ốc điều chỉnh sơ cấp hướng ra xa tiêu bản đến khi mắt thấy rõ dần tiêu bản mẫu vật thì dừng lại. Lưu ý: Khi di chuyển vật kính quá xa, đầu vật kính không còn nhúng vào giọt dầu soi thì thị trường tối hẳn đi. - Hai tay nắm ốc vi cấp điều chỉnh cho ảnh rõ nhất. - Mắt vẫn hướng vào thị kính, điều chỉnh một lần nữa khoảng cách của tụ quang kính với tiêu bản và chỉnh màng chắn sáng sao cho ảnh rõ nhất. 6. Bảo quản. - Sau khi sử dụng xong, xoay tất cả các vật kính ra trước, mở kẹp tiêu bản, lấy tiêu bản ra trả về chỗ cũ, hạ mâm kính, hạ hộp tụ quang. Dùng hai tay bê kính cất vào tủ chống ẩm (tủ bảo quản KHV). - Phải giữ gìn kính luôn luôn sạch sẽ, không để bụi bẩn và hóa chất dính vào. Luôn luôn giữ kính ở nơi khô ráo, mát mẻ để các bộ phận quang học không bị mốc. - Khi lau kính, khi sử dụng kính, không được tháo rời các bộ phận của kính. Không được dùng tay xoa trên mặt các thấu kính, mà nên 26
  27. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh cơ sở - Trường Đại học Mở Tp. HCM Nguyễn Văn Minh dùng một bút lông nhỏ sạch để chải bụi ở các mặt kính hoặc dùng bông mềm, sạch để lau. - Nếu sử dụng vật kính x 100 thì phải dùng dung dịch phù hợp thấm vào giấy chuyên dụng để lau sạch dầu cede đầu vật kính x 100. - Tránh mọi sự va chạm mạnh vào kính, không đánh đổ, đánh rơi kính. Nếu di chuyển kính ra khỏi phòng thí nghiệm, nhất thiết phải đưa kính vào hộp của nó có chèn lót cẩn thận. - Nếu phát hiện có 1 hư hỏng nào đó, nhất thiết không được tự ý tháo ra sửa chữa mà phải báo với cán bộ hướng dẫn biết để xử lý. III/ THỰC HÀNH. 1. Sử dụng kính hiển vi quang học quan sát vi nấm tế bào nấm mốc và nấm men: Quan sát các tiêu bản: a/ Nấm mốc (X10 và X40): + Aspergillus + Penicillinum + Fusarium + Mucor + Rhizopus b/ Nấm men (X40 và X100): + Saccharomyces + Candida Xem chi tiết hình dáng, màu sắc của nấm mốc: khuẩn ty, cuống bào tử, thể bọng, thể bình, túi bào tử, bào tử, Tế bào nấm men: Xem ở vật kính x40 quan sát hình dạng tế bào: tế bào đứng riêng lẻ hay kết dính tạo sợi giả - sợi thật. Xem tổng thể hình dáng của nấm mốc, vẽ hình. 27
  28. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh cơ sở - Trường Đại học Mở Tp. HCM Nguyễn Văn Minh Penicillium Aspergillus Fusarium 28
  29. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh cơ sở - Trường Đại học Mở Tp. HCM Nguyễn Văn Minh Mucor Rhizopus Saccharomyces Candida Hình 17: Hình vẻ và hình chụp kính hiển vi các nấm mốc. 2. Quan sát tế bào vi khuẩn (x90 và x100): + Cầu Gram+ : Staphylococcus spp, Streptococcus spp. + Trực Gram+ có bào tử: Bacillus spp, Clostridium spp + Trực Gram+ không bào tử: Lactobacillus spp + Trực Gram- : E. Coli. + Phẩy khuẩn: Vibrio spp. SStaphylococcus spp. Streptococcus spp. 29
  30. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh cơ sở - Trường Đại học Mở Tp. HCM Nguyễn Văn Minh Clostridium spp. Lactobacillus spp. Bacillus subtilis A B E.coli: A- KHV x100; B-KHV điện tử 30
  31. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh cơ sở - Trường Đại học Mở Tp. HCM Nguyễn Văn Minh Vibrio spp. Hình 18: hình chụp kính hiển vi các vi khuẩn. IV/ BÁO CÁO KẾT QUẢ. Vẽ hình và chú thích các cơ quan của các vi sinh vật quan sát. 31
  32. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh cơ sở - Trường Đại học Mở Tp. HCM Nguyễn Văn Minh Bài 4: PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG I. KHÁI NIỆM. Các chất dinh dưỡng là những hợp chất tham gia vào quá trình trao đổi chất nội bào. Môi trường dinh dưỡng là hỗn hợp gồm các chất dinh dưỡng và các chất có nhiệm vụ duy trì thế oxy hoá khử, áp suất thẩm thấu của tế bào và sự ổn định độ pH của môi trường. Yêu cầu của môi trường dinh dưỡng: Có đủ các chất dinh dưỡng cần thiết; Có độ pH thích hợp; Có độ nhớt nhất định; Không chứa các yếu tố độc hại; Hoàn toàn vô trùng. II. PHÂN LOẠI MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG: Người ta dựa trên các cơ sở khác nhau để phân loại môi trường. a. Căn cứ vào thành phần dinh dưỡng và nguồn gốc. - Môi trường tự nhiên: nước thịt, môi trường sữa, trứng, khoai tây, cám, . thành phần hóa học không được xác định chính xác di tính chất không ổn định của sản phẩm tự nhiện. - Môi trường tổng hợp: các chất hóa học được xác định và định lượng chính xác. Ví dụ: NA (Nutrient Agar), EMB (Eosin methylene blue). - Môi trường bán tổng hợp: gồm chất tự nhiên và tổng hợp. b. Căn cứ vào mục đích sử dụng. - Môi trường cơ sở: thích hợp cho nhiều lọai vi sinh vật. ví dụ: canh dinh dưỡng (Nutrient broth ). - Môi trường chọn lọc: thích hợp cho sự tăng sinh khối ưu thế của một loài hay một nhóm loài vi sinh vật xác định. 32
  33. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh cơ sở - Trường Đại học Mở Tp. HCM Nguyễn Văn Minh - Môi trường sinh hóa: Thử khả năng phân giải hydratcacbon, các chất chứa nitơ - Môi trường chẩn đoán: dùng chẩn đoán vi khuẩn nhất định (ví dụ: EMB (Eosin methylene blue) cho E. coli, BP(Baird Parker) cho Staphylococcus aureus). c. Dựa vào trạng thái vật lý. · Trạng thái cơ học: - Môi trường đặc: cơ sở + 1,5-2% agar. - Môi trường bán lỏng: cơ sở + 0,35-0,7% g agar. - Môi trường canh lỏng: cơ sở không cho agar. · Hình dáng vật chứa: - Môi trường thạch đứng - Môi trường bán nghiêng - Môi trường thạch nghiêng III. PHƯƠNG PHÁP LÀM MÔI TRƯỜNG. Làm môi trường để thực hiện việc phân lập, nhân giống, giữ giống vi sinh vật, đồng thời để nuôi cấy và nghiên cứu các đặc điểm sinh học của chúng. 1. Nguyên tắc của việc chế tạo môi trường. Dựa trên cơ sở nhu cầu về các chất dinh dưỡng và khả năng đồng hoá các chất dinh dưỡng của từng loại sinh vật. Để đảm bảo sự cân bằng về áp suất thẩm thấu giữa môi trường và tế bào vi sinh vật nên cần điều chỉnh tỷ lệ và nồng độ các chất trong thành phần môi trường. Đảm bảo các điều kiện hoá lý cần thiết cho các hoạt động trao đổi chất của vi sinh vật. 33
  34. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh cơ sở - Trường Đại học Mở Tp. HCM Nguyễn Văn Minh 2. Các bước chế tạo môi trường dinh dưỡng. 1. Pha chế. Cân, đong thật chính xác từng thành phần môi trường và pha chế theo đúng trình tự hướng dẫn trong tài liệu. Môi trường lỏng: Cân, đong các chất rồi cho hoà tan vào nước hay nước ấm. Môi trường đặc: nếu là thạch bột thì cân cùng với các thành phần khác rồi hòa tan vào nước; còn nếu là thạch sợi thì phải cân thạch sợi, ngâm vào nước, với thạch ra vải màn vắt khô nước, cho thạch vào môi trường và đun tan. 2. Làm trong môi trường. Việc làm trong môi trường sẽ giúp ta dễ dàng quan sát sự phát triển của vi sinh vật. - Với môi trường lỏng: có thể dùng vải màn nhiều lớp, bông thấm, giấy lọc. - Với môi trường đặc: thường lọc qua vải màn 2 lớp. 3. Điều chỉnh độ pH của môi trường. Muốn điều chỉnh độ pH của môi trường người ta dùng HCl 10 % hay NaOH 10 %. Ngoài ra có thể dùng một số hoá chất khác như: H3PO4, H2SO4, KOH, NaHCO3, Na2CO3 Để xác định pH của môi trường có thể sử dụng giấy quỳ, xanh bromothymol, giấy đo pH. Tuy nhiên dùng máy đo pH (pH - metre) sẽ cho kết quả chính xác hơn. 4. Phân phối môi trường vào dụng cụ. Người ta thường phân phối môi trường vào ống nghiệm, đĩa petri, bình tam giác. Trình tự phân phối gồm các bước sau: Môi trường cần được đun cho hoá chất lỏng rồi đổ qua phễu thuỷ tinh vào các dụng cụ. Tay trái giữ dụng cụ chứa môi trường. 34
  35. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh cơ sở - Trường Đại học Mở Tp. HCM Nguyễn Văn Minh Tay phải kẹp nút bông và kéo ra. Nhanh tay rót môi trường vào dụng cụ và đậy nút bông lại. * Chú ý: Đối với ống nghiệm: nếu dùng môi trường làm thạch nghiêng thì lượng môi trường cần được phân phối chiếm 1/4 thể tích của ống nghiệm. Nếu làm thạch đứng thì lượng môi trường cần được phân phối từ 3/4 thể tích ống nghiệm. Các thao tác phân phối phải nhanh, gọn, khéo léo để môi trường không dính lên miệng dụng cụ hoặc nút bông và việc phân phối cần thực hiện xong trước khi môi trường bị đông đặc. 5. Khử trùng môi trường. Tuỳ theo tính chất và điều kiện cụ thể của từng loại môi trường mà có chế độ và phương pháp khử trùng khác nhau. Phương pháp thường được sử dụng là hấp tiệt trùng bằng hơi nước bão hòa ở áp suất cao. Ngoài ra cũng có thể sử dụng phương pháp lọc qua màng lọc đối với những môi trường có thành phần không chịu nhiệt. 6. Làm thạch nghiêng, thạch đứng, đổ thạch vào đĩa pêtri: - Làm thạch nghiêng: cần tiến hành ngay sau khi khử trùng môi trường vừa kết thúc và môi trường chưa đông đặc. Thông thường lượng môi trường bằng 1/3 thể tích ống nghiệm. Đặt ống nghiệm có môi trường lên giá đặt nghiêng nhưng không được để môi trường chạm vào nút bông. Để yên cho đến khi mặt thạch đông đặc. Yêu cầu mặt thạch phải phẳng, nhẵn, liên tục - Làm thạch đứng: đặt các ống nghiệm đã có môi trường làm thạch đứng vào giá ,để yên cho đến khi môi trường nguội và đông đặc. 35
  36. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh cơ sở - Trường Đại học Mở Tp. HCM Nguyễn Văn Minh - Đổ thạch vào đĩa pêtri (môi trường và đĩa petri đã được khử trùng): toàn bộ quy trình đổ thạch vào đĩa pêtri đều thực hiện trong tủ cấy vô trùng. Thao tác: + Mở bao giấy các đĩa petri đã hấp và sấy tiệt trùng + Tay phải cầm erlen chứa môi trường đã khử trùng + Tay trái lấy nút bông ra và hơ miệng bình trên ngọn lửa đèn cồn + Nghiêng bình và rót nhẹ môi trường vào đĩa petri sau khi tay trái mở hé nắp trên của đĩa. + Đậy nắp trên lại, đặt đĩa xuống mặt bàn tủ cấy, xoay tròn nhẹ đĩa petri để môi trường được phân phối đều + Để yên cho môi trường nguội và đông đặc + Lật ngược cho đáy dưới của đĩa petri lên trên và đặt vào tủ ấm 37°C,trong 18-24h để hơi nước bốc ra và khô dần đi, đồng thời kiểm tra độ vô khuẩn của môi trường. Chú ý: - Thao tác đổ thạch phải hết sức khẩn trương và khéo léo để hạn chế sự nhiễm khuẩn. - Mặt thạch phải phẳng, nhẵn, có độ dày khoảng 2mm. Thông thường cứ 1/4 lít môi trường có thể phân phối được 22 - 25 đĩa petri. - Sau khi đổ môi trường vào đĩa petri, 1 - 2 ngày sau khi kiểm tra lại xem môi trường có bị nhiễm khuẩn không rồi mới sử dụng để cấy hay phân lập. - Nhớ viết vào nhãn: Tên môi trường Khử trùng ngày tháng năm 7. Bảo quản và kiểm tra môi trường. 36
  37. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh cơ sở - Trường Đại học Mở Tp. HCM Nguyễn Văn Minh Môi trường chưa dùng cần được bảo quản ở chỗ mát, hạn chế tác dụng của ánh sáng, nhiệt độ từ 0 - 5 0C và không để môi trường bị khô. Trước khi sử dụng, để kiểm tra độ vô khuẩn của môi trường, người ta thường đặt chúng vào tủ ấm 37 0C, trong 48 - 72h. Sau lấy ra quan sát, loại bỏ các ống có vi sinh vật phát triển và chỉ sử dụng những ống nghiệm, những đĩa petri có môi trường đạt yêu cầu. IV/ THỰC HÀNH PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG. Nội dung thực hành này sẽ được lồng vào phần chuẩn bị môi trường nuôi cấy cho các bài thực hành có sử dụng môi trường. 37
  38. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh cơ sở - Trường Đại học Mở Tp. HCM Nguyễn Văn Minh BÀI 5: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP VI SINH VẬT I. KHÁI NIỆM Phân lập vi sinh vật là quá trình tách riêng các loài vi sinh vật từ quần thể ban đầu và đưa về dạng thuần khiết. Đây là một khâu có ý nghĩa rất quan trọng trong việc nghiên cứu và ứng dụng vi sinh vật. Vi sinh vật ở dạng thuần khiết là giống vi sinh vật được tạo ra từ 1 tế bào ban đầu. Trong thiên nhiên hoặc trong các vật phẩm nghiên cứu, vi sinh vật thường tồn tại ở dạng hỗn hợp gồm nhiều loài khác nhau. Muốn nghiên cứu về hình thái, sinh lý, lý hoá hoặc sử dụng vào thực tiễn một loài nào đó thì cần phải đưa chúng về dạng thuần khiết. Nguyên tắc: Tách rời các tế bào vi sinh vật; Nuôi cấy các tế bào trên trong môi trường dinh dưỡng đặc trưng để cho khuẩn lạc riêng rẽ, cách biệt nhau. II. PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP VI SINH VẬT THUẦN KHIẾT. Với hầu hết các loại mẫu nghiên cứu, quá trình phân lập vi sinh vật ở dạng thuần khiết gồm các bước cơ bản sau: - Tạo ra các khuẩn lạc riêng rẽ từ quần thể vi sinh vật ban đầu. - Phân lập vi sinh vật thuần khiết. - Kiểm tra độ tinh khiết của các khuẩn lạc. 38
  39. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh cơ sở - Trường Đại học Mở Tp. HCM Nguyễn Văn Minh II.1. PHÂN LẬP VÀ THUẦN KHIẾT VI SINH VẬT ĐƠN BÀO. 1. Tạo ra các khuẩn lạc riêng rẽ từ quần thể vi sinh vật trên các môi trường phân lập. a. Yêu cầu: Nếu mẫu ban đầu ở dạng rắn phải đưa về dạng lỏng bằng cách: - Nghiền mẫu. - Hoà tan mẫu trong nước cất vô trùng. Sau thực hiện như mẫu là dạng lỏng, tiếp tục pha loãng ở nồng độ cần thiết. Cấy mẫu trên môi trường đặc trưng của nó. Để có được chủng thuần, cần tiến hành lặp lại nhiều lần các kỹ thuật pha loãng nêu trên cho đến khi tất cả các khuẩn lạc xuất hiện trên môi trường đều đồng nhất. Mức độ thuần khiết của chủng có thể được kiểm tra như sau: - Việc tạo hộp ria từ một khuẩn lạc đơn của chủng thuần chỉ tạo ra một loại khuẩn lạc duy nhất trên bề mặt môi trường có hình thái giống với khuẩn lạc của chủng ban đầu. - Mỗi khuẩn lạc đơn chỉ chứa một loại tế bào có hình thái giống nhau trong quan sát dưới kính hiển vi. Trong thao tác tạo khuẩn lạc đơn cần lưu ý hạn chế thấp nhất nguy cơ bị nhiễm bằng cách thực hiện nghiêm túc các yêu cầu của thao tác vô trùng. b. Phương pháp tạo khuẩn lạc đơn. Có nhiều kỹ thuật ria khác nhau để thực hiện hộp ria và tạo khuẩn lạc đơn. Một số kỹ thuật ria thường dùng: kỹ thuật ria chữ T , kỹ thuật ria bốn góc , kỹ thuật ria tia ,kỹ thuật ria liên tục. Thao tác kỹ thuật tạo khuẩn lạc đơn đối với vi sinh vật hiếu khí được thực hiện như sau: 39
  40. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh cơ sở - Trường Đại học Mở Tp. HCM Nguyễn Văn Minh Ø Kỹ thuật hộp ria: Khử trùng bề mặt bàn và tay bằng cồn 700, chờ khô đốt đèn cồn. Đĩa môi trường mới đổ hoặc bảo quản lạnh to » 4oC – 8oC, trước khi dùng đặt vào tủ ấm 37oC khoảng 30 phút cho mặt thạch thật khô ráo. Thực hiện các bước như sau: - Dùng bút ghi lên đáy hộp petri tên mẫu ( bệnh phẩm, thực phẩm, ), ngày cấy, người cấy. - Ước lượng hoặc úp đĩa xuống rồi dùng bút và thước chia đĩa thành 4 phần bằng nhau. - Đốt que cấy trên ngọn lửa đèn cồn và thao tác lấy mẫu trong ống nghiệm. - Dùng ngón giữa và ngón cái ( bàn tay trái ) ấn vào tâm đĩa petri, các ngón còn lại xoay và hơ mép nắp đĩa trên đèn cồn trước khi cấy. - Cầm đĩa lọt vào lòng bàn tay trái, ngón cái và ngón út tỳ vào nắp để đẩy nắp lên sao cho nắp và đáy tạo một góc khoảng 45o. - Đưa đầu que cấy vào phết một góc nhỏ, sát thành đĩa. - Thực hiện cấy ria chữ T và ria bốn góc (xem hình). - Sau khi cấy đặt úp petri lại, gói lại đặt vào tủ ấm ở nhiệt độ và thời gian thích hợp. - Xem kết quả minh họa bên dưới. Chú ý: - Đốt que cấy, hơ miệng ống nghiệm và nút bông, hơ mép đĩa trước và sau khi thao tác. - Trong suốt quá trình cấy, miệng đĩa petri luôn ở gần ngọn lửa. Tránh nhiễm vi sinh vật từ không khí vào. 40
  41. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh cơ sở - Trường Đại học Mở Tp. HCM Nguyễn Văn Minh - Khi cấy, cầm ở góc cuối que bằng 3 ngón tay (cái, trỏ, giữa ), lướt nhẹ trên mặt thạch. Nếu tỳ quá mạnh sẽ làm vỡ mặt thạch. - Nếu dự đoán được số lượng vi khuẩn có trong dịch mẫu là nhiều, thì sau mỗi đường cấy đốt lại que cấy để làm giảm thiểu số lượng vi khuẩn ở đường ria kế tiếp. Nếu không sẽ khó tách biệt các khuẩn lạc. (c) 41
  42. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh cơ sở - Trường Đại học Mở Tp. HCM Nguyễn Văn Minh Hình 19: (a) -Sơ đồ cấy phân lập trên thạch đĩa; (b) - Kết quả cấy phân lập trên thạch đĩa ; (c) - Kết quả cấy phân lập trên thạch đĩa (4 đường cấy). Chú ý: có thể cấy ria từ 3 – 5 đường tùy theo Φ của đĩa. Ø Kỹ thuật hộp trải: - Hút 0,1 ml dịch mẫu đã pha loãng cho vào đĩa pêtri có môi trường thích hợp. - Dùng que gạt thủy tinh phân phối dịch mẫu trải đều khắp mặt thạch. - Tiếp tục sử dụng que gạt này gạt mẫu cho đều khắp mặt thạch đĩa pêtri thứ 2 rồi đĩa thứ 3. - Đặt các đĩa pêtri 1, 2, 3 trên vào tủ ấm ở nhiệt độ thích hợp sau một thời gian nhất định tuỳ giống vi sinh vật ta sẽ nhận được các khuẩn lạc riêng rẽ từ các đĩa thứ 2 và 3. Ø Kỹ thuật hộp đổ: - Dùng pipetman và đầu típ vô trùng, thao tác vô trùng chuyển 1 m dịch chứa giống vi sinh vật lên bề mặt môi trường trong đĩa pêtri. - Đổ khoảng 15 - 20 ml môi trường đã đun chảy và để nguội đến 45 - 550C vào đĩa petri đã cấy mẫu. - Xoay nhẹ đĩa petri cùng chiều và ngược chiều kim đồng hồ vài lần để dung dịch giống được trộn đều trong môi trường cấy. - Đậy nắp đĩa pêtri, để đông tự nhiên. Thao tác kỹ thuật tạo khuẩn lạc đơn đối với vi sinh vật kỵ khí được thực hiện như sau: Phân lập các vi sinh vật kị khí trên môi trường đặc ở đĩa pêtri. - Dùng môi trường đặc trong ống nghiệm đem chưng cách thuỷ để 42
  43. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh cơ sở - Trường Đại học Mở Tp. HCM Nguyễn Văn Minh loại bỏ không khí trong môi trường. - Để nguội môi trường còn 45 - 50 0C. - Hút 0,1 ml dịch nghiên cứu cho vào ống môi trường, đậy nút lại, lắc tròn quanh trục ống nghiệm. - Rót nhanh môi trường ở ống nghiệm vào nắp dưới của đĩa pêtri và đậy thật nhanh nắp trên lại, sao cho giữa mặt nắp và môi trường không còn không khí. - Dùng parafin hàn kín phần tiếp xúc giữa 2 nắp của đĩa petri. - Nuôi trong bình yếm khí: sau khi cấy vi khuẩn xong, cho vào bình yếm khí. Thoa một lớp parafin lỏng lên miệng bình, đốt đèn cồn hay đèn cầy lên và đặt vào bình, đậy nắp lại, hoặc dùng máy hút chân không. Cho vào tủ ấm, ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp. - Sau khi vi sinh vật phát triển, chọn các khuẩn lạc riêng rẽ trong khối môi trường, dùng que cấy cắt cả khối môi trường rồi cấy vào môi trường lỏng thích hợp. 2. Kiểm tra độ tinh khiết của giống mới phân lập. Có nhiều cách kiểm tra: 1. Kiểm tra vết cấy. Quan sát sự sinh trưởng của vi sinh vật qua vết cấy trên môi trường đặc: - Nếu vết cấy có bề mặt và màu sắc đồng đều, thuần nhất chứng tỏ giống mới phân lập tinh khiết thì giữ lại. - Nếu vết cấy không thuần nhất thì loại bỏ. 2. Kiểm tra lại độ thuần chủng của các loại khuẩn lạc. - Chọn các khuẩn lạc riêng rẽ trên môi trường thạch nghiêng. - Tách các khuẩn lạc này ra và hoà tan, pha loãng ở nồng độ cần thiết trong nước cất vô trùng. - Nhỏ 1 giọt dịch trên vào đĩa pêtri có môi trường. 43
  44. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh cơ sở - Trường Đại học Mở Tp. HCM Nguyễn Văn Minh - Dùng 1 que gạt phân phối giọt dịch đều khắp mặt thạch đĩa pêtri thứ nhất, rồi đĩa thứ 2, thứ 3. - Đặt các đĩa pêtri trên vào tủ ấm với nhiệt độ và thời gian thích hợp tuỳ loại vi sinh vật. - Sau lấy ra quan sát các khuẩn lạc riêng rẽ. Sự thuần khiết của khuẩn lạc là biểu hiện sự thuần khiết của giống. II.2. PHÂN LẬP VÀ THUẦN KHIẾT VI SINH VẬT ĐA BÀO DẠNG SỢI. Đối với xạ khuẩn, vi nấm, để tách riêng các khuẩn lạc có thể áp dụng phương pháp pha loãng bào tử và trãi như đơn bào. Hoặc dùng phương pháp khác như: - Phương pháp cắt ngọn: Dùng que cấy móc (đã khử trùng bằng cách đốt ), gạt nhẹ lên hệ sợi tơ hoặc bào tử (dạng bụi phấn trên mặt khuẩn lạc), chuyển sang đĩa petri. Đánh ngược phần lưng móc lên trên thành nắp petri cho bào tử rơi xuống. - Phương pháp cấy điểm: Dùng que cấy lấy bào tử hoặc sợi tơ, cắm đầu móc xuống mặt thạch (ống nghiệm hoặc Petri) thành 3 điểm. Ủ ở nhiệt độ phòng ( 30 ± 2oC ).Sau 2 ngày, lấy ra quan sát. Nếu trên mặt thạch chỉ có 1 loại tơ hoặc bào tử thì nấm mốc phân lập là đạt. Nếu còn lẫn mốc hoặc vi khuẩn khác thì cần tiếp tục phân lập tương tự cho đến khi chỉ còn 1 loại mốc mong muốn. III/ PHƯƠNG PHÁP CẤY TRUYỀN. Nguyên tắc: sau khi phân lập vài lần, từ khóm thuần cấy truyền sang ống môi trường thạch nghiêng hay ống nghiệm canh để gia tăng số lượng vi sinh vật. Chuẩn bị: giống như ở phần cấy phân lập, thay đĩa môi trường bằng ống thạch nghiêng hay ống nghiệm cạnh lỏng. 44
  45. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh cơ sở - Trường Đại học Mở Tp. HCM Nguyễn Văn Minh Thao tác: thao tác theo hình vẽ. Hình 20: Thao tác cấy truyền Hình 21: đường cấy truyền Lau chùi sạch và khởi động quạt hút của buồng cấy 30 phút trước khi cấy. Ống môi trường mới đổ hoặc bảo quản lạnh to » 4oC – 8oC, trước khi dùng đặt ở to phòng khoảng 10 phút. Sau đó, dùng bút ghi lên 1/3 trên của thành ống tên gốc vi khuẩn, ngày cấy, người cấy. Đốt que cấy trên ngọn lửa đèn cồn và thao tác lấy mẫu trong ống nghiệm, hoặc từ đĩa ( giống như đã học ở phần cấy lập phân ), cấy truyền sang ống môi trường mới. Đặt ống nghiệm mới cấy lên giá ống, cho vào tủ ấm 37oC, ủ từ 24h – 48h, xem kết quả. Chú ý: - Đốt que cấy, hơ miệng ống nghiệm và nút bông, hơ mép đĩa trước và sau khi thao tác. - Trong suốt quá trình cấy, miệng ống nghiệm luôn ở gần ngọn lửa. Tránh nhiễm vi sinh vật từ không khí vào. - Khi cấy, cầm ở góc cuối que bằng 3 ngón tay ( cái, trỏ, giữa ), lướt nhẹ trên mặt thạch. Nếu tỳ quá mạnh sẽ làm vỡ mặt thạch. 45
  46. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh cơ sở - Trường Đại học Mở Tp. HCM Nguyễn Văn Minh IV/ THỰC HÀNH. Ø Phân lập vi sinh vật. 1. Phân lập vi khuẩn. Sinh viên thực hành phân lập vi sinh vật bằng kỹ thuật hộp ria từ hỗn tạp vi sinh vật do phòng thí nghiệm cung cấp. 2. Phân lập nấm mốc Aspergillus oryzae, Aspergillus niger và Mucor: Có thể phân lập các loài nấm mốc này trên cơm nguội, xôi làm mốc tương, bánh mì để khô ít ngày. 3. Phân lập nấm men. Có thể phân lập nấm men dễ dàng từ các môi trường như: - Bề mặt trái cây và dịch ép một số trái cây như táo, lê, nho, dâu, mơ, dứa, - Trong rượu nếp, trong các bánh men rượu, trong bia, trong nước mía, . Ø Cấy truyền. Sinh viên thực hành cấy truyền từ ống nghiệm sang ống nghiệm và từ đĩa petri sang ống nghiệm. V/ BÁO CÁO KẾT QUẢ. Trình bày lại phương pháp phân lập và báo cáo kết quả phân lập. 46
  47. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh cơ sở - Trường Đại học Mở Tp. HCM Nguyễn Văn Minh Bài 6: CÁC PHƯƠNG PHÁP QUAN SÁT VI SINH VẬT I/ KỸ THUẬT SOI TƯƠI. Mục đích: Với thao tác đơn giản, tiến hành nhanh, phương pháp soi tươi được sử dụng để quan sát trạng thái sống của tế bào vi khuẩn, đặc biệt là sự chuyển động của vi khuẩn. Cách làm tiêu bản giọt ép: - Dùng que cấy hoặc ống hút lấy giống vi sinh vật để làm vết bôi ( theo trình tự phần 3). - Đặt lá kính lên giọt canh trường thật nhẹ nhàng tránh không tạo thành bọt khí. Muốn vậy để một mép lá kính tiếp xúc với phiến kính rồi từ từ hạ lá kính xuống. - Đưa tiêu bản lên quan sát trên kính hiển vi. - Chú ý: + Nếu giọt dịch nhiều quá, tràn ra phần ngoài tiếp xúc của phiến kính và lá kính ta dùng giấy thấm bớt nước đi. + Nếu cần quan sát tiêu bản lâu thì dùng vazơlin bôi quanh mép lá kính để giọt dịch khỏi bị khô. Cách làm tiêu bản giọt treo: Loại tiêu bản này dùng để theo dõi sự sinh sản, sự hình thành bào tử, khả năng di động và phản ứng của tế bào vi sinh vật với các loại kích thích. - Dùng phiến kính đặc biệt có phần lõm hình tròn ở giữa. - Bôi vazơlin quanh phần lõm của phiến kính. - Cho 1 giọt canh trường lên giữa lá kính. 47
  48. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh cơ sở - Trường Đại học Mở Tp. HCM Nguyễn Văn Minh - Thận trọng xoay ngược lá kính cho giọt canh trường xuống phía dưới rồi dặt lên phần lõm của phiến kính. - Chú ý: không để giọt canh trường lan rộng hay chạm vào phần đáy của phần lõm. - Đặt tiêu bản lên quan sát trên kính hiển vi (hình 41) Ưu điểm của loại tiêu bản này so với tiêu bản giọt ép là giúp ta quan sát tế bào vi sinh vật dễ dàng hơn và lâu hơn. II/ CÁC PHƯƠNG PHÁP NHUỘM. Nhuộm tế bào vi khuẩn dùng để phân biệt hình dáng tế bào vi khuẩn (cầu, trực, xoắn hay để phân biệt các thành phần riêng biệt trên một tế bào vi khuẩn. Có 2 phương pháp nhuộm cơ bản: 1/ Nhuộm đơn: Dùng một loại thuốc nhuộm để quan sát hình dạng tế bào. 2/ Nhuộm kép: Dùng 2 thuốc nhuộm để phân biệt vi khuẩn G+ và G-, phân biệt tế bào dinh dưỡng và bào tử, hay phân biệt vi khuẩn lao với các vi khuẩn khác A/ NGUYÊN TẮC CHUNG KHI LÀM TIÊU BẢN NHUỘM. 1/ Phết kính tiêu bản. Lau nhẹ tiêu bản sạch bằng giấy mềm, hơ qua đèn cồn. Dùng bút chì mỡ hoặc bút lông ghi tên mẫu, và vẽ vòng tròn f » 15mm, ở mặt dưới lame kính để đánh dấu vết khuẩn phía trên lame. Đốt nóng đỏ que cấy (trước và sau khi thao tác), mở nút bông, hơ nhanh miệng ống nghiệm. 48
  49. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh cơ sở - Trường Đại học Mở Tp. HCM Nguyễn Văn Minh Trường hợp 1: mẫu nuôi cấy trong canh dinh dưỡng, đưa đầu que cấy vào miệng ống nghiệm (vẫn giữ gần ngọn lửa), nhúng vào dung dịch canh cấy, lấy 1 vòng que cấy. Lấy que cấy ra, hơ nhanh miệng ống nghiệm và nút bông, đậy nút bông lại. Phết canh khuẩn trên vòng que cấy vào mặt trên lam, giữa vòng tròn, dàn đều ra xung quanh. Trường hợp 2: mẫu nuôi cấy trong thạch dinh dưỡng, nhỏ giọt dung dịch NaCl 9‰ lên giữa vòng tròn (mặt trên lam). Thao tác giống trường hợp 1, nhưng dùng cạnh vòng tròn của đầu que cấy đặt nhẹ lên khuẩn lạc vi khuẩn, rồi đặt vào giọt NaCl 9‰ trên lam, dàn mỏng và đều. 2/ Cố định mẫu: Mục đích giết chết vi khuẩn và làm cho vi khuẩn bám chặt vào lame. Cố định mẫu bằng cách để khô tự nhiên. Chú ý: Nếu cố định không tốt vi khuẩn sẽ trôi đi trong quá trình nhuộm. Khi cố định mẫu, chỉ hơ nhanh chứ không đốt trên ngọn lửa. Không được chạm vào thành khi đưa đầu que cấy vào và ra khỏi ống nghiệm vi khuẩn. 49
  50. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh cơ sở - Trường Đại học Mở Tp. HCM Nguyễn Văn Minh Hình 22: Sơ đồ thứ tự phết kính. B/ CÁC PHƯƠNG PHÁP NHUỘM. 1/ Phương pháp nhuộm gram (Christian Gram): Dùng phân biệt vi khuẩn gram dương và gram âm. Ø Nguyên tắc: Nhuộm Gram, là phương pháp nhuộm thông thường nhất trong các phòng thí nghiệm vi sinh. Phương pháp nhuộm Gram cho phép xác định được hình dạng, cách sắp xếp, và 50
  51. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh cơ sở - Trường Đại học Mở Tp. HCM Nguyễn Văn Minh phân biệt vikhuẩn là thuộc loại Gram[+] hay Gram [-]. Do sự khác biệt về cấu trúc vách tế bào nên trong quá trình nhuộm Gram, vi khuẩn Gram [+] sẽ giữ được phức hợp tím Gentian-iode không bị tẩy màu bởi alcool, trong khi vi khuẩn Gram [-] không giữ được phức hợp màu này, do vậy kết quả sau khi nhuộm là vi khuẩn Gram [+] vẫn giữ được màu tím của gentian, còn vi khuẩn Gram [-] ăn màu hồng của phẩm màu safranin hay fuchsin. Ø Thao tác: - Đặt tiêu bản đã phết kính và cố định mẫu lên thanh thủy tinh chữ U, trên thau nhựa. - Đặt miếng giấy lọc lên vòng phết kính. - Nhỏ dd Crystal violet thấm ướt hết giấy lọc. Để từ 1 – 2 phút ( nếu vi khuẩn lấy từ canh lỏng để 2 phút, lấy từ thạch dinh dưỡng để 1 phút ). Rửa nước, thấm khô. - Tẩy cồn 96o từ 15 – 30 giây ( từ canh lỏng tẩy 15 giây, từ thạch dinh dưỡng tẩy 30 giây ). Rửa nước, thấm khô. Tẩy cồn bằng cách để nghiêng tiêu bản, cho cồn chảy từ từ ở mép trên phiến kính. Quan sát ở mép dưới cho đến khi giọt cồn vừa mất màu tím. - Đặt miếng giấy lọc lên vết khuẩn, nhỏ dung dịch Fuschin kiềm loãng (hoặc Safranin O), để 1 phút. Rửa nước, thấm khô. - Quan sát bằng vật kính dầu, độ phóng đại 1.000 lần. Vi khuẩn Gr+ bắt màu tím Crystal violet, vi khuẩn Gr– bắt màu hồng Fuschin(Safranin O). Chú ý: - Trước mỗi lần nhỏ thuốc nhuộm lên tiêu bản, phải đặt miếng giấy lọc phủ lên vết bôi. - Sau mỗi lần nhuộm đều phải rửa nước và thấm khô tiêu bản. 51
  52. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh cơ sở - Trường Đại học Mở Tp. HCM Nguyễn Văn Minh Hình 23: Sơ đồ thứ tự nhuộm Gram Ø Đọc kết quả: - Quan sát phết nhuộm Gram qua kính hiển vi, dưới vật kính dầu, chúng ta sẽ thấy vi khuẩn Gram[+] ăn màu tím, còn vi khuẩn Gram[-] ăn màu hồng. - Khi trả lời một kết quả nhuộm Gram, phải trả lời các chi tiết sau: + Hình dáng vi khuẩn. + Cách sắp xếp các vi khuẩn. + Cách ăn màu của vi khuẩn, tức là vi khuẩn Gram [+] hay Gram [-]. 2/ Phương pháp nhuộm Ziehl – Neelsen: Dùng phân biệt vi khuẩn Lao với các vi khuẩn khác: 52
  53. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh cơ sở - Trường Đại học Mở Tp. HCM Nguyễn Văn Minh Ø Nguyên tắc: Do tế bào vi khuẩn kháng acid có lớp vỏ sáp bao bọc nên khi đã nhuộm được phức hợp màu carbolfuchsin, phức hợp này sẽ không bị tẩy màu bởi dung dịch tẩy màu mạnh (acid, alcool acid). Tuy nhiên để phức hợp màu này có thể thấm xuyên qua lớp vỏ sáp của vi khuẩn, có hai cách: (1) Đun nóng phết nhuộm với dung dịch màu carbolfuchin, nhờ đó mà carbolfuchsin thấm qua lớp vỏ sáp của vi khuẩn để nhuộm màu vi khuẩn; đây là phương pháp nhuộm nóng Ziehl Neelsen. (2) Phương pháp thứ hai là phương pháp nhuộm lạnh còn gọi là phương pháp Kinyoun, trong phương pháp này người ta dùng dung dịch carbolfuchsin đậm đặc, nhờ vậy khi phủ dung dịch màu đậm đặc này lên phết nhuộm với thời gian lâu, carbolfuchsin vẫn có thể thấm qua lớp vỏ sáp để nhuộm màu vi khuẩn. Ø Thao tác: - Đặt tiêu bản đã phết kính và cố định mẫu lên thanh thủy tinh chữ U, đặt trên thau nhựa. - Đặt miếng giấy lọc lên vòng phết kính. - Nhỏ dung dịch Fuschin đậm đặc thấm ướt hết giấy lọc, hơ nóng liên tục từ 5 – 7 phút. - Trong khi hơ phải nhỏ bổ sung thuốc nhuộm liên tục để giấy lọc luôn thấm ướt. - Rửa nước, thấm khô. - Tẩy cồn – acid đến khi không còn màu hồng của Fuschin đậm đặc (khoảng 30 giây). - Rửa nước, thấm khô. - Quan sát bằng vật kính dầu, độ phóng đại 1.000 lần. - Vi khuẩn lao bắt màu hồng Fuschin, vi khuẩn khác bắt màu xanh methylen. 53
  54. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh cơ sở - Trường Đại học Mở Tp. HCM Nguyễn Văn Minh Chú ý: Trước mỗi lần nhỏ thuốc nhuộm lên tiêu bản, phải đặt miếng giấy lọc phủ lên vết bôi. Sau mỗi lần nhuộm đều phải rửa nước và thấm khô. Trong khi hơ nóng: dung dịch nhuộm không được sôi, thuốc nhuộm phải luôn thấm ướt giấy, không được khô. Không được nhầm lãn giữa cồn – acid ( nhuộm Ziehl Neelsen ) và cồn 96o (dùng nhuộm Gram). Ø Đọc kết quả: - Quan sát phết nhuộm kháng acid qua kính hiển vi, dưới vật kính dầu, trực khuẩn kháng acid ăn màu đỏ cánh sen, còn vi - Khuẩn thường cũng như các nền khác như tế bào biểu mô hay bạch cầu ăn màu xanh methylene blue. - Khi trả lời một kết quả nhuộm kháng acid, không được kết luận là dương tính M. Tuberculosis mà chỉ trả lời có hiện diện trực khuẩn kháng acid. 3/ Nhuộm bào tử: Một số vi khuẩn như Bacillus hay Clostridium có khả năng tạo thành bào tử. Bào tử có thể tồn tại trong môi trường thiếu chất dinh dưỡng, chịu được nhiệt và một số các hóa chất mà thể sinh dưỡng không thể. Khác với bào tử nấm sợi (hay nấm mốc), bào tử vi khuẩn (nha bào ) không phải là cơ quan sinh sản và thường có hai dạng: hình cầu và hình bầu dục. Khi tế bào vi khuẩn sống trong môi trường không thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển, do thiếu chất dinh dưỡng hay độ ẩm thấp, thì bào tử được hình thành. Nhưng khi môi trường trở 54
  55. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh cơ sở - Trường Đại học Mở Tp. HCM Nguyễn Văn Minh nên thích hợp thì bào tử lại hồi sinh và tế bào lại có thể tiếp tục phân chia. Bào tử rất khó nhuộm bởi đa số các thuốc nhuộm do màng bào tử dày, chắc, khó bắt màu và chứa nhiều lipid. Vì thế, cần thiết phải có những phương pháp nhuộm đặc biệt đối với bào tử. Tuy nhiên, đối với bất kì phương pháp nào thì tế bào trước hết được xử lý bằng nhiệt hay/ và acid để tế bào chất bào tử dễ bắt màu. Sau đó, nhuộm cả tế bào chất của bào tử và tế bào với thuốc nhuộm có tính hoạt nhuộm mạnh rồi tẩy màu của tế bào chất đi và nhuộm nó với một thuốc nhuộm phân biệt khác. Khi đó, tế bào chất sẽ mang một màu, và bào tử sẽ mang màu khác. Đôi khi bào tử được nhìn thấy bên trong tế bào. Hình thái của bào tử còn giúp nhận diện vi khuẩn. Hình dáng và kích thước bào tử phụ thuộc vào vị trí của nó trong tế bào và kích thước bề ngang của tế bào mang nó. Bào tử thường nằm trong tế bào sinh dưỡng ở ba vị trí khác nhau: nếu nằm ở tâm tế bào thì được gọi là bào tử kiểu Bacillus, nếu nằm lệch tâm – kiểu Clostridium và nếu nằm ở cực tế bào thì gọi là bào tử kiểu Plectidium. Ở một số giống vi khuẩn khác, các bào tử có thể tồn tại tự do bởi vì các tế bào xung quanh nó đã tan rã. Vật liệu và dụng cụ: - Giống vi khuẩn Bacillus cereus trên môi trường thạch nghiêng dinh dưỡng đã ủ trong 3 – 4 ngày đến 2 tuần ở 30oC. - Thuốc nhuộm: 1 trong 3 cách 3. Lục malachite và thuốc nhuộm safranin. 4. Fuschin, HCl 0.5%, H2SO4 1%, và xanh methylene ( Loeffler). 5. Xanh methylene và đỏ trung tính. - Giá nhuộm và phiến phết kính nhuộm - Cốc beesse và bếp đun. 55
  56. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh cơ sở - Trường Đại học Mở Tp. HCM Nguyễn Văn Minh Cách tiến hành: a. Với thuốc nhuộm lục malachite và thuốc nhuộm safranin 1- Chẩn bị vết bôi trên phiến kính sạch và hơ nóng nhẹ. 2- Thêm 1 ít nước vào cốc beesse và đun sôi. 3- Đặt giá nhuộm lên cốc beesse rồi đặt phiến kính lên nó. 4- Đặt nhẹ mẫu giấy thấm (nhỏ hơn phấn kính một chút) lên trên phiến kính.Mẫu giấy này sẽ giúp giữ thuốc nhuộm lại trên phiến kính. 5- Phủ phiến kính với thuốc nhuộm lục malachite và hơ hơi nước trong vòng 5 phút. Tiếp tục thêm thuốc nhuộm để tránh tình trạng thuốc nhuộm bị khô trên phiến kính. 6- Khử màu với nước trong 30 giây bằng cách cho nước chảy lên phiến kính. Các tế bào sinh dưỡng sẽ bị mất màu, còn bào tử sẽ giữ màu lại. 7- Nhuộm lại với safranin trong 30 giây rồi rửa lại với nước trong 30 giây nữa. Thấm khô cẩn thận. 8- Quan sát dưới kính hiển vi với vật kính đâu (x100). Bào tử sẽ có màu xanh còn tế bào sinh dưỡng sẽ có màu hồng. Ghi lại kết quả. Lưu ý: Khi nhuộm Gram, các bào tử không bị nhuộm nên tế bào trông giống có các lỗ ở bên trong. b. Với thuốc nhuộm Fuschin, HCl 0.5, H2SO4 1% và xanh methylene 1- Làm vết bôi trên mọt phiến kính sạch và để khô tự nhiên. 2- Nhỏ vài giọt HCl 0.5% lên vết bôi, hơ nóng trên ngọn lửa đèn cồn cho bốc hơi trong 2 phút rồi rửa với nước. 3- Nhuộm vết bôi với thuốc nhuộm Fuschin, qua miếng giấy lọc, hơ nóng cho đến khi bốc hơi trong vòng 5 phút. 4- Rửa vết bôi bằng nước 56
  57. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh cơ sở - Trường Đại học Mở Tp. HCM Nguyễn Văn Minh 5- Tẩy màu bằng dung dịch H2SO4 1% trong 2 phút. 6- Rửa vết bôi bằng nước. 7- Nhuộm vết bôi bằng xanh methylene trong 5 – 15 phút. 8- Rửa lại với nước và để khô tự nhiên. 9- Quan sát dưới kính hiển vi với vật kính dầu ( x100). Bào tử sẽ có màu xanh còn tế bào sinh dưỡng sẽ có màu xanh. Ghi lại kết quả. c. Với thuốc nhuộm Xanh methylene và đỏ trung tính: 1- Làm vết bôi trên một phiến kính sạch. 2- Cố định tiêu bản trên ngọn lửa đèn cồn. 3- Nhuộm xanh methylene trong 1 phút có hơ nóng từ bên dưới 4- Rửa vết bôi bằng nước cho đến khi hết màu. 5- Nhuộm với đỏ trung tính 0.5% trong 1 phút. 6- Rửa lại bằng nước, để khô. 7- Quan sát dưới kính hiển vi với vật kính dầu ( x100 ).Bào tử sẽ có màu xanh còn tế bào sinh dưỡng sẽ có màu đỏ. Ghi lại kết quả. III/ THỰC HÀNH. Sinh viên thực hành làm các tiêu bản: - Giọt ép, giọt treo. - Nhuộm gram vi khuẩn được phòng thí nghiệm chuẩn bị. - Nhuộm Kháng acid từ vaccine BCG. - Nhuộm bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis (malachite và thuốc nhuộm safranin) IV/ BÁO CÁO. Sinh viên báo cáo cách tiến hành và kết quả nhuộm 57
  58. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh cơ sở - Trường Đại học Mở Tp. HCM Nguyễn Văn Minh Bài 7, 8: CÁC ĐẶC TÍNH SINH HÓA CỦA VI SINH VẬT Muốn định danh vi sinh vật, ta cần xác định một số đặc điểm sinh hóa của chúng. Các đặc điểm này biểu hiện sự trao đổi chất của vi sinh vật, thể hiện qua sự chuyển hóa các thành phần đã biết của môi trường dinh dưỡng dùng nuôi cấy vi sinh vật (chủ yếu là hoạt động của enzyme ). Phạm vi chương trình của môn học này chỉ giới thiệu sơ lược và tổng quát một số phản ứng sinh hóa cơ bản. I. XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG SỬ DỤNG CÁC CHẤT HYDRAT CARBON: Các vi sinh vật được đặc trưng bằng khả năng sử dụng khác nhau nguồn hydrat carbon để làm nguồn năng lượng. 1. Khả năng lên men đường. Thường sử dụng các loại đường Glucose, Lactose, Galactose, Frutose, Saccharose, Maltose, Rhamnose, và một số rượu như Glycerin, Mannit, Ø Cơ chế: VSV Các acid + CO2 Đường Acid pyruvic Các acid không CO2 Vi sinh vật có các enzyme phân giải các loại đường trên, tạo các acid hữu cơ, làm pH của môi trường nuôi cấy giảm, và có thể tạo một số chất khí như H2, CO2. pH của môi trường giảm, làm chỉ thị màu 58
  59. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh cơ sở - Trường Đại học Mở Tp. HCM Nguyễn Văn Minh phenol red chuyển từ đỏ sang vàng. Các chất khí sinh ra sẽ tích tụ vào ống Durham, phát hiện được bằng mắt thường. Ø Môi trường: - Canh dinh dưỡng (NB) bổ sung 1% đường, pH » 7 ( môi trường lên men đường). - Chỉ thị màu phenol red. - Ống durham. Ø Thao tác: cấy VK (E.coli ) vào môi trường lên men đường, sau khi ủ ở nhiệt độ 37oC/24h lấy ra đọc kết quả. Ø Kết quả: - Lên men, sinh hơi: Phenol red trong ống môi trường chuyển từ đỏ sang vàng, ống Durham có hơi. Ký hiệu: ( +, h ) hoặc ( +, G ). - Lên men, không sinh hơi: Phenol red trong ống môi trường chuyển từ đỏ sang vàng, ống Durham không có hơi. Ký hiệu: (+). - Không lên men: Phenol red vẫn giữ nguyên màu đỏ. Tất nhiên, ống Durham không có hơi. Ký hiệu: (-). 2. Phản ứng MR (Methyl Red). 59
  60. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh cơ sở - Trường Đại học Mở Tp. HCM Nguyễn Văn Minh Ø Cơ chế: Một số nhóm đường ruột như E. coli, Salmonella, chuyển hóa glucose thành acid pyruvic.Rồi tiếp tục chuyển hóa acid pyruvic thành ethanol, acid acetic, acid lactic, acid succinic. Các acid tạo ra làm pH môi trường giảm mạnh, pH » 4 – 4,5. Ở pH này methyl red màu đỏ, ngược lại, pH cao hơn thì Methyl red sẽ chuyển sang màu vàng. Ø Môi trường và thuốc thử: MT Clark – Lubs pH » 7, thuốc thử Methyl red Ø Thao tác: Cấy VK E. coli, vào MT Clark – Lubs, ủ 37oC/48h,lấy ra nhỏ 5 – 10 giọt MR, đọc kết quả. - + Ø Đọc kết quả: - Phản ứng Methyl red dương tính: dung dịch Methyl red trong môi trường vẫn giữ nguyên màu đỏ. Ký hiệu: MR (+). - Phản ứng Methyl red âm tính: dd Methyl red trong môi trường chuyển từ đỏ sang vàng. Ký hiệu: MR (-). 3. Phản ứng VP ( Voges – Proskauer ). Ø Cơ chế: Vi sinh vật chuyển hóa glucose thành acid pyruvic.Rồi tiếp tục chuyển hóa acid pyruvic thành acetyl methyl carbinol ( AMC ). AMC tác dụng với a - naphtol trong môi trường kiềm tạo thành diacetyl. Diacetyl phản ứng với nhân guanidine (arginine) có trong pepton để cho hợp chất màu hồng đỏ. 60
  61. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh cơ sở - Trường Đại học Mở Tp. HCM Nguyễn Văn Minh Ø Môi trường và thuốc thử: MT Clark – Lubs pH » 7, thuốc thử NaOH 40% ( KOH 10%) và a - naphtol 10% trong cồn. Ø Thao tác: Cấy VK ( Bacillus anthracis, B. cereus ) vào MT Clark – Lubs, ủ 37oC/24h,lấy ra nhỏ khoảng 10 giọt NaOH 40%, hơ nóng nhẹ, nhỏ tiếp khoảng 10 – 15 giọt a - naphtol, lắc đều, để yên 5 – 10 phút. Đọc kết quả. Ø Đọc kết quả: -Phản ứng VP dương tính: môi trường chuyển màu đỏ cam. Ký hiệu: VP(+). -Phản ứng VP âm tính: môi trường có màu vàng hoặc màu nâu đất. Ký hiệu: VP(-). - + 4. Phản ứng tìm khả năng thủy phân tinh bột. Ø Cơ chế: Vi sinh vật tiết enzym amylase, enzym này khuếch tán ra xung quanh khóm, phân giải tinh bột có trong môi trường thành đường. Khi nhỏ dung dịch thuốc thử Lugol vào, nơi nào trên môi trường có tinh bột thì Iod tác dụng với tinh bột tạo màu xanh tím. Nếu quanh khóm VSV không còn tinh bột thì quanh khóm có vòng trong. Ø Môi trường và thuốc thử: Đĩa môi trường Sabouraud, bổ sung 1% tinh bột, thuốc thử đ Iod 0.02N hay Lugol. Ø Thao tác: Sau khi đã chuẩn bị xong MT, cấy VSV ( Aspergillus ) theo từng khóm trên đĩa, ủ 37oC/24 – 48h, lấy ra nhỏ 1 – 2 ml dd Iod 0.02N hay Lugol, đọc kết quả. 61
  62. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh cơ sở - Trường Đại học Mở Tp. HCM Nguyễn Văn Minh Ø Đọc kết quả: - Phản ứng dương tính: môi trường xung quanh nấm không màu, trong suốt. Đó là vòng phân giải tinh bột. Nơi khác có màu xanh tím. - Phản ứng âm tính:toàn bộ môi trường xung quanh nấm màu xanh. Chú ý: vòng phân giải càng lớn, khả năng thủy phân tinh bột của vi sinh vật càng mạnh. II. XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI CÁC HỢP CHẤT CHỨA NITROGEN: Các hợp chất chứa Nitrogen thường là nguồn cung cấp N cho sự tổng hợp protein của tế bào vi sinh vật. Các vi sinh vật thường sản sinh các loại enzym tương ứng để phân giải chúng thành các chất dễ sử dụng như acid amin, NH3, Đồng thời cũng có thể sinh ra các chất có tính độc như Indol, H2S, 1. Khả năng tạo Indol. Ø Cơ chế: Vi sinh vật tiết enzym Tryptophanase, chuyển hóa Tryptophan thành Indol. Indol sẽ kết hợp với para – dimethylaminobenzaldehyd trong thuốc thử Kowac’s, tạo thành phức chất Rosindol màu đỏ. Ø Môi trường và thuốc thử: MT NB, pH » 7, thuốc thử Kowac’s. Ø Thao tác: cấy VSV ( E. coli ) vào canh NB, ủ 37oC/24h,lấy ra nhỏ 3 -5 giọt Kowac’s. Đọc kết quả. Ø Đọc kết quả: 62
  63. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh cơ sở - Trường Đại học Mở Tp. HCM Nguyễn Văn Minh - Phản ứng Indol dương tính: lớp mặt môi trường xuất hiện vòng đỏ. Ký hiệu: I (+). - Phản ứng Indol âm tính: môi trường có màu vàng chanh hoặc xanh nhạt. Ký hiệu: I (-). - + 2. Sự tạo thành H2S. Ø Cơ chế: Vài loại vi khuẩn có khả năng phân giải một số acid amin chứa S như Cystin, Cystein, Methionin có trong môi trường nuôi cấy, tạo thành H2S. Có thể phát hiện H2S bằng nhiều cách, phạm vi giáo trình này chọn 2 cách. - Vi sinh vật phân giải các acid amin chứa S, tạo thành H2S. - H2S sinh ra trong môi trường thạch chì (hoặc trong môi trường canh, H2S•) sẽ kết hợp với Pb(CH3COO)2 tạo thành PbS màu đen. H2S + Pb(CH3COO)2 ® PbS¯ ( đen ) + 2CH3COOH Ø Môi trường và thuốc thử: MT thạch chì hay NB có gài giấy tẩm acetat chì trên miệng ống nghiệm. Ø Thao tác: Cách 1: MT thạch chì. Dùng que cấy thẳng cấy VSV vào giữa ống nghiệm. Cho vào tủ ấm 37oC, ủ trong 24- 48 giờ. Cách 2: MT canh NB. Dùng que cấy vòng lấy VSV cấy sang ống nghiệm môi trường canh NB, gài giấy lọc tẩm acetat Pb 20% ( vô 63
  64. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh cơ sở - Trường Đại học Mở Tp. HCM Nguyễn Văn Minh khuẩn ) vào miệng ống nghiệm, dùng băng keo trong bản nhỏ bịt kín miệng ống nghiệm. Lưu ý: trong khi thao tác, không được để dung dịch môi trường nuôi cấy chạm vào giấy acetat Pb. Cho vào tủ ấm 37oC, ủ trong 24- 48 giờ. Ø Đọc kết quả: Cách 1: MT chuyển màu đen (+). MT không chuyển màu (-). Cách 2: Giấy tẩm chuyển màu đen (+). Giấy tẩm không chuyển màu (-). 3. Khả năng phân giải gelatin. Ø Cơ chế: một số VK có khả năng tổng hợp enzyme gelatinase ngoại bào thủy phân gelatin thành polypeptide và a.amin làm phá hủy đặc tính đông đặc của gelatin ngay khi ở to 25oC. Ø Môi trường: MT canh NB bổ sung 10% gelatin, pH » 7. Ø Thao tác: Dùng que cấy thẳng cấy VK ( Bacillus cereus hoặc Bacillus anthracis ) vào MT, ủ ở 37o/24h, thực hiện song song với ống đối chứng không cấy VK. Ø Đọc kết quả: sau khi ủ lấy ra cho vào ngăn dưới tủ lạnh 30 phút – 1h. + Nếu MT hóa lỏng ( + ). + Nếu MT đông đặc (-). 64
  65. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh cơ sở - Trường Đại học Mở Tp. HCM Nguyễn Văn Minh - + - 4. Khả năng sử dụng Nitrat ( khử NO3 ). Ø Cơ chế: Một số VK có khả năng sử dụng nitrat làm nguồn nhận hydro cơ chất trong quá trình hô hấp kỵ khí đồng thời sử dụng nitrat làm nguồn nitơ do có khả năng tổng hợp enzyme Nitratreductase. Nitrat bị khử thành nitrit và rồi có thể bị khử tiếp thành NH3 hoặc N2. Ø Thao tác: Cấy VK ( Staphylococcus aureus hoặc E. coli) vào MT nitrat, ủ ở 37o/24h. Lấy ra nhỏ vào giọt thuốc thử Gress A ( acid sulfanilic ) và vài giọt Gress B ( a - naphthylamin ). Ø Đọc kết quả: - + MT có màu hồng đỏ (+): Trong MT xuất hiện nhóm NO2 do - NO3 chuyển hóa. 65
  66. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh cơ sở - Trường Đại học Mở Tp. HCM Nguyễn Văn Minh - + MT không đổi màu ( ± ): Trong MT không có nhóm NO2 . Như vậy có 2 khả năng: - - · Trường hợp 1(-): NO3 không chuyển thành NO2 . - - · Trường hợp 2(+): NO3 chuyển thành NO2 , sau đó nitrit tiếp tục chuyển thành NH3 hay N2 nên thuốc thử Gress A và Gress B không phát hiện được. Tiếp tục cho bột kẽm vào, nếu xuất hiện màu đỏ thì âm tính, nếu không đổi màu là dương tính. - + 5. Khả năng phân giải urê –(NH)2CO. Ø Cơ chế: Vài loài VK có khả năng phân giải urê thành NH3, do có khả năng tổng hợp enzyme urease. Sự phó thích NH3 làm tăng pH MT và có thể theo dõi qua sự đổi màu của chất chỉ thị. Ø Môi trường: MT Christesen’s Urea bổ sung urê, chỉ thị màu phenol red, pH » 7,2. Ø Thao tác: Cấy VK (Proteus spp.) vào MT, ủ 37o/24h. Lấy đọc kết quả. Ø Đọc kết quả: + Phenol red chuyển từ hồng sang đỏ cánh sen (+). + MT không đổi màu (-). 66
  67. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh cơ sở - Trường Đại học Mở Tp. HCM Nguyễn Văn Minh + - III. XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HÓA KHÁC: 1. Hoạt tính Oxydase. Ø Cơ chế: Các loài vi khuẩn hiếu khí tuyệt đối có enzym oxydase ( cytochrom oxydase ). Có thể phát hiện Oxydase bằng 2 cách. Ø Môi trường: MT NA hoặc TSA, thuốc thử là giấm tẩy N- Dimethyl-Para phenylenediamine hay dd thuốc thử tetra methyl-para phenylenediamine. Ø Thao tác: Cách 1: Dùng que cấy vòng lấy vi khuẩn trong đĩa vi khuẩn đã nuôi cấy, phết lên giấy tẩm thuốc thử. Đọc kết quả trong vòng 30 giây – 1 phút. Cách 2: Dùng ống nhỏ giọt, nhỏ 1 giọt Tetrs methyl-p- phenylenediamine lên khuẩn lạc đã nuôi cấy vi khuẩn trong đĩa petri. Đọc kết quả từ 30 giây – 1 phút. 67
  68. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh cơ sở - Trường Đại học Mở Tp. HCM Nguyễn Văn Minh Ø Đọc kết quả: - Phản ứng Oxydase dương: que giấy tẩm hoặc giọt thuốc thử chuyển sang màu tím đen. Ký hiệu: Oxydase (+). - Phản ứng Oxydase âm: que giấy vẫn giữ màu trắng đục, hoặc thuốc thử vẫn màu hồng. Ký hiệu: Oxydase (-). + - 2. Hoạt tính Catalase. Ø Cơ chế: Enzym catalase thường gặp ở vi khuẩn hiếu khí tuyệt đối hay tùy nghi. Catalase có khả năng phân giải peroxyt tao O2 và nước. Vi khuẩn ¯ Enzyme catalase H2O2 H2O + [O]• Ø Môi trường: Đĩa thạch TSA hoặc NA, pH » 7,2. Đã cấy VK ( Staphyloccus aureus) ở 37oC/24h. Ø Thao tác và đọc kết quả: - Dùng que cấy vòng, lấy đầy 1 vòng cấy vi khuẩn hòa vào giọt H2O2, quan sát. - Phản ứng Catalase dương: Giọt H2O2 sủi bọt mạnh hoặc yếu. Ký hiệu: Catalase (+). - Phản ứng Catalase âm: không có hiện tượng sủi bọt. Ký hiệu: Catalase (-). 68
  69. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh cơ sở - Trường Đại học Mở Tp. HCM Nguyễn Văn Minh - Lưu ý: nếu lọ H2O2 3- 10% không đậy kín, hoặc không bảo quản lạnh » 4 – 8oC, hoặc để quá lâu.Thì kết quả sẽ sai ( âm tính giả). 3. Xác định khả năng làm dung huyết ( tan máu ). Ø Cơ chế: Một vài loài vi sinh vật có khả năng sinh enzym hemolysin làm tan máu (dung huyết ). Khi nuôi cấy trên môi trường giàu dinh dưỡng (MHA), có bổ sung 5 – 10% máu cừu hoặc thỏ, tùy theo loài vi khuẩn ta có 1 trong 3 loại tan máu sau: - Tan máu a: tan máu không hoàn toàn, vùng tan máu hẹp, màu xanh, đục mờ. - Tan máu b: tan máu hoàn toàn, vùng tan máu rộng, không màu, trong suốt. - Tan máu g: không tan máu. Ø Môi trường: Đĩa thạch MHA, bổ sung 5% máu cừu, còn gọi là thạch máu BA. 69
  70. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh cơ sở - Trường Đại học Mở Tp. HCM Nguyễn Văn Minh Ø Thao tác và đọc kết quả: - Dùng que cấy vòng lấy VK cấy lên MT thạch máu, có thể tiến hành với VK đối chứng không dung huyết như Salmonella. Cho vào tủ ấm 37oC, ủ trong 24 giờ. - Phản ứng tan máu dương (+): xung quanh khuẩn lạc có vùng tan máu như mô tả ở trên. - Phản ứng tan máu âm(-): không có vùng tan máu chung quanh. 4. Xác định khả năng di động. Ø Cơ chế: một số vi khuẩn có tiêm mao (lagella) nên có khả năng di động trong môi trường bán lỏng và làm đục môi trường hay mọc giống như rễ cây xung quanh đường cấy. Khi cần có thể dùng muối tetrazolium trong môi trường thử di động, tuy nhiên chất này có tính ức chế vài loại vi sinh vật. Triphenyltetrazolium chloride (TTC) thường được pha trước với nồng độ 1%, thanh trùng bằng màng lọc vi khuẩn 0,45µm. Việc bổ sung TTC giúp phát hiện di động dễ dàng hơn, đặc biệt những trường hợp khó đọc kết quả. Ø Môi trường: Môi trường bán lỏng NA, để đứng. Ø Thao tác và đọc kết quả: - Dùng que cấy thẳng lấy vi khuẩn (Bacillus subtilis, E.coli hoặc Salmonella trong ống cấy sang ống nghiệm thạch bán lỏng, trích thẳng từ trên xuống dưới ngay giữa ống MT. - Cho vào tủ ấm 37oC, ủ trong 24 – 48 giờ. Đọc kết quả. - Phản ứng di động dương (+): Vi khuẩn mọc lan ra khỏi đường cấy, xa hay gần tùy theo khả năng di động của vi khuẩn mạnh hay yếu. - Phản ứng di động âm (-): vi khuẩn chỉ mọc trên đường cấy. 70
  71. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh cơ sở - Trường Đại học Mở Tp. HCM Nguyễn Văn Minh Bán lỏng NA Bán lỏng NA bổ sung TTC + - + - + + 5. Xác định khả năng sử dụng Citrat. Ø Cơ chế: Một số VSV có enzyme citrat permease có khả năng sử dụng citrat trong MT có Na.citrat làm nguồn cacbon duy nhất. Khi sử dụng citrat chúng giải phóng ra MT ion Na+ làm tăng pH của MT. Đồng thời những VSV có khả năng sử dụng citrat làm nguồn cacbon thì cũng có khả năng sử dụng muối amonium vô cơ NH4H2PO4 làm nguồn nitơ tạo ra NH3 cũng làm kiềm hóa 71
  72. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh cơ sở - Trường Đại học Mở Tp. HCM Nguyễn Văn Minh MT, sự thay đổi pH của MT được nhận biết nhờ chỉ thị màu Bromothymol blue. Ø Môi trường: MT Simomns Citrat, chỉ thị màu Bromothymol blue, pH » 6.8. Ø Thao tác: Cấy VK (Salmonella) vào MT theo đường Zích – zắc, ủ 37o/24h. Lấy đọc kết quả. Ø Đọc kết quả: - Phản ứng citrat ( +): Xanh bromothymol chuyển từ màu lục sang màu xanh dương. - Phản ứng citrat âm (-): xanh bromothymol vẫn giữ màu lục. + - 6. Xác định khả năng làm đông huyết tương. Ø Cơ chế: một số VSV có khả năng tổng hợp enzym coagulase đặc biệt là các loài thuộc giống Staphylococcus, enzyme này làm đông huyết twong người hoặc thỏ ( enzyme này là một protein bền với to, có tính kháng nguyên yếu). Ø Môi trường: Huyết tương người hay thỏ đông khô dạng thương phẩm. Hoặc có thể tự điều chế như sau: Cách lấy huyết tương thỏ: - Dùng xylanh vô trùng hút 0,2ml dung dịch kháng đông citrat Na 3,8% ( vô trùng), sau đó rút lấy máu tim thỏ. 72
  73. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh cơ sở - Trường Đại học Mở Tp. HCM Nguyễn Văn Minh - Cho máu vào ống ly tâm, ly tâm 1500 vòng/phút/10 phút. Chiết lấy dịch trong là huyết tương thỏ. Ø Thao tác và đọc kết quả: - Phân huyết tương vào mỗi ống nghiệm nhỏ 0,5ml. Cấy VSV cần kiểm tra vào. Ủ 37o/4-24h. Lấy đọc kết quả. - Phản ứng Coagulase (+): huyết tương thỏ đông lại từ giờ thứ 4, thứ 8, thứ 12 hoặc 24 giờ. - Phản ứng đông tụ âm (-): huyết tương vẫn lỏng sau 24 giờ nuôi cấy ( như ống đối chứng ). + - 7.Thử nghiệm KIA (Kligler Iron Agar), TSI (Triple Sugar Iron Agar) Ø Cơ chế: được sử dụng để thử nghiệm đồng thời 2 khả năng: các nguồn cacbon khác nhau(glucose,lactose) và khả năng sinh H2S của VSV. Khi cấy VSV trên MT này, có 3 trường hợp xảy ra: - Chỉ sử dụng glucose: sau 18- 24h nuôi cấy phần nghiêng ( bề mặt) trở nên có pH kiềm và phần đứng ( phần sâu trong ống nghiệm ) có pH acid. Do glucose trên bề mặt của môi trường được VSV oxi hóa hoàn toàn thành CO2 và H2O để thu lấy năng lượng. Để đáp ứng nhu cầu năng lượng trong tăng trưởng, VSV tiếp tục dị hóa peptone qua đó giải phóng NH3 làm phần bề mặt cảu môi trường có pH kiềm. Trong khi đó, ở phần sâu trong môi trường có điều kiện oxy không đầy đủ, glucose được lên men kỵ khí sinh các acid hữu cơ làm pH môi trường giảm. 73
  74. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh cơ sở - Trường Đại học Mở Tp. HCM Nguyễn Văn Minh - Sử dụng cả glucose và lactose: sau 18-24h toàn bộ môi trường đều trở nên có pH acid vì sự biến dưỡng đồng thời cả 2 loại đường giúp VSV đủ năng lượng để tăng trưởng mà chưa cần sử dụng đến peptone. Nếu kéo dài thời gian nuôi cấy quá 24h, bề mặt môi trường sẽ trở nên kiềm do hết nguồn cacbon và VSV phải sử dụng đến peptone. - Không sử dụng glucose, lactose: VSV sẽ biến dưỡng peptone để thu lấy năng lượng và vật chất cho sự tăng trưởng. Tuy nhiên, do peptone chỉ được biến dưỡng trong điều kiện hiếu khí nên hiện tượng kiềm hóa môi trường chỉ diễn ra trên bề mặt của môi trường. - Khả năng sinh H2S: do trong môi trường sodium thiosulfat, VSV khử sunfate có thể khử chất này, nhờ có enzyme thiosunfat reductase để giải phóng H2S, H2S sẽ phản ứng với ion Fe2+ của chỉ thị ferric ammonium citrate tạo kết tủa màu đen FeS. - Trong các trường hợp trên, Nếu sự lên men đường tạo sản phẩm khí, thì khí sẽ kết tụ thành bọt khí trong ống nghiệm hay sẽ làm vỡ thạch Ø Môi trường: Môi trường KIA chứa 2 loại đường o.1% glucose, 1% lactose. Tương tự, môi trường TSI có thành phần như môi trường KIA nhưng có thêm 1% sucrose (saccharose). Ø Thao tác: dùng que cấy thẳng lấy sinh khối (Salmonella. E.coli, Shigella)cấy thẳng sâu vào ống nghiệm nhưng tránh chạm đáy ống,sau đó ria trên bề mặt thạch nghiêng. Ø Đọc kết quả: Ủ 37oC/18-24h - Đỏ/ vàng (kiềm/ acid): chỉ lên men đường glucose - Vàng/ vàng (acid/ acid): lên men glucose và lactose 74
  75. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh cơ sở - Trường Đại học Mở Tp. HCM Nguyễn Văn Minh - Môi trường vẫn đỏ, phần bề mặt đỏ đậm hơn so với sự biến dưỡng peptone: không lên men glucose và lactose - Nếu trong ống nghiệm sinh kết tủa màu đen: có khả năng sinh H2S. IV/ THỰC HÀNH. Sinh viên thực hành các cấy các phản ứng sinh hóa theo hướng dẫn. V/ BÁO CÁO. Sinh viên trình bày lại nguyên tắc và báo cáo kết quả các thử nghiệm sinh hóa. Bài 9: PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA SỐ LƯỢNG TẾ BÀO VI SINH VẬT I/ TÓM TẮT LÝ THUYẾT. Có 2 PP cơ bản để kiểm tra số lượng tế bào vi sinh vật: 75
  76. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh cơ sở - Trường Đại học Mở Tp. HCM Nguyễn Văn Minh - PP đếm trực tiếp trên kính HV: PP này đếm trực tiếp số lượng tế bào VSV - PP đếm gián tiếp: PP này đếm số lượng tế bào VSV thông qua số khuẩn lạc (colonies) mọc trên thạch đĩa và dựa vào sự lên men làm đục MT nuôi cấy từ đó ta có ống +,- ® tra bảng. Ø Nguyên tắt chung: - Mẫu phải được pha loãng. Tuỳ theo mức độ nhiễm khuẩn củ mẫu ta có sự ước lượng pha loãng 1/5; 1/10 ; 1/20 hay 1/10; 1/100; 1/1000 - Dung dịch dùng pha loãng mẫu thường là NaCl 9%0 hay phot phat đệm đã được vô trùng. - Cách pha: + Mẫu 1/5 : 1ml mẫu + 4ml NaCl 9%0 + mẫu 1/10: 1ml mẫu + 9ml NaCl 9%0 - Từ mẫu 1/10(10-1) lấy 1ml + 9ml NaCl 9%0 ta có độ pha loãng 10-2 , cứ như vậy ta có các độ pha loãng tiếp theo 10-3, 10- 4 II/ PHƯƠNG PHÁP ĐẾM TRỰC TIẾP. 1. Đếm trên lam phết kính: Tiêu bản VK đã được nhuộm màu (nhuộm đơn). S1 S2 S3 20 mm 20 mm å ≈ 30 – 50 VT 76
  77. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh cơ sở - Trường Đại học Mở Tp. HCM Nguyễn Văn Minh Hình: Diện tích hình vuông phết kính Sơ đồ: Di chuyển vật kính trong hình vuông phết kính, để đếm số VSV/1VT a. Phết kính: - Dùng lam sạch và bút chì mỡ (bút lông kim), kẻ một hình vuông S = 400 mm2, ở mặt trên lam. Mục đích không cho VK lan ra khỏi diện tích đếm. - Hút V( 0.02 – 0.2 ml) dung dịch đã pha loãng , nhỏ vào giữa hình vuông, ở mặt trên lam. - Đốt que cấy, để nguội, dùng cạnh vòng cấy ở đầu que dàn đều giọt mẫu ra xung quanh, vừa chạm vào cạnh hình vuông. - Cố định tiêu bản, nhuộm đơn bằng thuốc nhuộm blue methylen. - Nhỏ một giọt dầu soi, xem ở vật kính x100. b. Cách đếm - Đếm số tế bào VSV/ 1VT (VT: vi trường). - Đếm hết tất cả từ 30 – 50 VT/ hình vuông phết kính. Theo sơ đồ hình vẽ. c. Công thức tính X x 400 Số tế bào/1 ml mẫu = 0.0004 x V x H Trong đó: X = Số VK đếm được trong một vi trường 2Số vi trường có được 400 = diện tích hình vuông phết kính, bằng 400mm . 2 trong S: 4cm 0.0004 = diện tích của vi trường, pR2 = 0.0004 mm2. 77
  78. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh cơ sở - Trường Đại học Mở Tp. HCM Nguyễn Văn Minh V = thể tích giọt VK phết kính H = hệ số pha loãng mẫu 2. Đếm trong buồng đếm: a. Cấu tạo buồng đếm. Tên của loại buồng đếm. Rãnh buồng đếm, nơi cho dd vào Khung đếm Chiều cao của 1 ô nhỏ(1/10) Diện tích của 1 ô nhỏ(1/400) Hình 24: Buồng đếm tế bào Vi sinh vật - Buồng đếm là một phiến kính trong, dày, hình chữ nhật. - Giữa là phần lõm phẳng, có kẻ một hoặc hai khung đếm gồm 400 ô nhỏ. Bên ngoài có ghi tên loại buồng đếm, và ghi các thông số kỹ thuật như hình trên. b. Cấu tạo khung đếm. 78
  79. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh cơ sở - Trường Đại học Mở Tp. HCM Nguyễn Văn Minh Ô Ô Hình 25: Cấu tạo Khung đếm Thoma Ø Cấu tạo một khung đếm có: - Trường hợp1: 1 khung có 16 ô lớn, 1 ô lớn có 25 ô nhỏ. Vậy 1 khung có 400 ô nhỏ. - Trường hợp 2: 1 khung có 25 ô lớn, 1 ô lớn có 16 ô nhỏ. Vậy 1 khung có 400 ô nhỏ. 2 - Diện tích 1 ô nhỏ là 1/400 mm . Vậy Vô nhỏ = 0.1 mm x 1/400 mm2 = 1/4000mm3. c/ Cách tiến hành. - Đặt lammen sạch phủ lên khung đếm. - Dùng ống nhỏ giọt hút dung dịch nấm men đã pha loãng, bỏ đi vài giọt đầu, bơm nhẹ vào rãnh buồng đếm, dung dịch thấm vào kẽ buồng đếm và lammen. - Dung dịch chảy tràn từ từ vào các rãnh, lan tỏa lắp đầy khắp lammen, hơi thừa một ít. Nếu bị bọt kẹt lại trong lammen thì phải làm lại. 79
  80. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh cơ sở - Trường Đại học Mở Tp. HCM Nguyễn Văn Minh - Đặt buồng đếm lên bàn kẹp của kính hiển vi, dùng kẹp cố định buồng đếm. - Thao tác kính hiển vi, dùng vật kính x10 để điều chỉnh sơ bộ trước, sau đó dùng vật kính x40 để đếm. - Đếm số tế bào trong 5 ô lớn( 4 ô ở cạnh, 1 ô ở giữa), đếm lần lượt từng ô nhỏ trong 1 ô lớn . Trong tất cả các ô nhỏ cần đếm số tế bào nằm hẳn trong ô trước, sau đó đếm số tế bào nằm ở cạnh phía trên và cạnh bên phải ô. - Đếm tất cả 80 ô nhỏ có trong 5 ô lớn (T/h: 1 ô lớn có 16 ô nhỏ). - Hoặc đếm 125 ô nhỏ có trong 5 ô lớn (T/h: 1 ô lớn có 25 ô nhỏ). d. Công thức tính. a x 4.000 x 1.000 Số tế bào/1 ml mẫu = H Trong đó: a = số tế bào trung bình có trong 1 ô nhỏ (V = 1/ 4.000 mm3) 4.000 = số qui đổi từ 1/4.000 mm3 thành 1 mm3. 1.000 = số qui đổi từ 1 mm3 thành 1ml (1ml = 1.000 mm3) H = hệ số pha loãng (ví dụ: H = 10-2) e. Chú ý: - Chỉ đếm được tổng số tế bào, không thể biết tế bào nào còn sống, tế bào nào đã chết. - Nồng độ dịch huyền phù pha loãng sao cho mật độ trong mỗi ô nhỏ không quá 10 tế bào. - Sử dụng xong phải rửa buồng đếm ngay và lau khô. - Để đạt độ chính xác cao, thì số tế bào trung bình đếm được trong 1 ô nhỏ: 2.5 < a <10. 80
  81. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh cơ sở - Trường Đại học Mở Tp. HCM Nguyễn Văn Minh III/ Phương Pháp Đếm Gián Tiếp. 1. Phương pháp dùng màng lọc vi khuẩn. Phương pháp này thương đươc dùng để định lượng VSV chỉ thị trong mẫu nước khi tiến hành các thử nghiệm môi trường nơi có mật độ VSV tương đối thấp. Phương pháp này gồm bước lọc để tập trung VSV trong một mẫu nước trên màng lọc và xác định số tế bào VSV dựa vào số khuẩn lạc đếm được sau khi đặt màng lọc lên trên môi trường thạch có thành phần dinh dưỡng thích hợp cho loại VSV cấn kiểm. Dựa trên khối lượng mẫu nước ban đầu và quy ước là mỗi khuẩn lạc được hình thành từ một tế bào VSV, người ta quy ra số lượng VSV có trong một đơn vị thể tích nước. Như vậy, phương pháp này là sự kết hợp của phương pháp lọc vô trùng và phương pháp đếm khuẩn lạc trên đĩa petri. Màng lọc có kích thước lỗ là 0.45µm hoặc 0.2µm được chế tạo từ nguyên liệu là sợi thuỷ tinh siêu mảnh, sợi polypropylene, thường được cung cấp trong trạng thái vô trùng. Ngoài màng lọc bình thường hiện nay người ta còn sử dụng màng lọc lưới kỵ nước trên đó có in ô vuông bằng vật liệu kỵ nước. Các vạch chia ô bằng vật liệu này ngăn cản sự mọc la của các khuẩn lạc. Khác trường hợp màng lọc bình thường, từ số các ô vuông có khuẩn lạc mọc, mật độ VSV trong mẫu được tính và trình bày dưới dạng số có xác suất lớn nhất (MPN) của lượng VSV có trong một đơn vị thể tích mẫu theo công thức: MPN= N ln (N/N – x ); trong đó N là tổng số các ô vuông, x là ố có số khuẩn lạc mọc. 81
  82. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh cơ sở - Trường Đại học Mở Tp. HCM Nguyễn Văn Minh Hình 26: Định lượng vi sinh vật bằng phương pháp màng lọc. 2. Đếm số khuẩn lạc trên môi trường thạch đĩa. a. Nguyên tắc: Cấy một thể tích xác định dịch mẫu đã pha loãng lên đĩa petri môi trường thích hợp. Đếm số lượng khuẩn lạc mọc lên sau thời gian nuôi cấy vì mỗi khuẩn là kết quả phát triển của một tế bào. b. Thao tác đổ đĩa: Dùng bút lông kim ghi lên đáy hộp môi trường: tên mẫu, tên người thực hiện, ngày cấy, thể tích dịch cấy, nồng độ pha loãng. Cách 1: Dùng pipette vô khuẩn hút dịch pha loãng cho vào 3 đĩa petri môi trường, thể tích bằng nhau, mỗi đĩa có V từ 0,1 ml – 0,5 ml. Lấy que gạt dàn đều mẫu lên mặt thạch để tách riêng từng tế bào. Cách 2: Dùng pipette vô khuẩn hút Vml dịch pha loãng cho vào 3 đĩa petri vô khuẩn, thể tích bằng nhau, mỗi đĩa có V từ 0,1 ml – 0,5 ml. Môi trường pha sẵn trong bình 250ml, bảo quản lạnh. 82
  83. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh cơ sở - Trường Đại học Mở Tp. HCM Nguyễn Văn Minh Đun cách thủy môi trường cho tan đều, chờ nguội 40oC, đổ vào các đĩa chứa mẫu, mỗi đĩa 10 - 15 ml môi trường. Xoay tròn đĩa theo chiều kim đồng hồ và ngược lại cho môi trường hòa đều mẫu, để yên cho môi trường đặc hoàn toàn. Ở 2 cách trên, mỗi mẫu đều cấy 3 nồng độ liên tiếp. Mỗi nồng độ cấy 3 đĩa petri, sau đó lấy kết quả trung bình. Đặt tất cả các đĩa đã cấy vào tủ ấm, nuôi ở to và thời gian thích hợp. c. Cách đếm khuẩn lạc: Dùng bút lông kim và thước, kẻ các ô vuông ở đáy hộp, cạnh ô vuông từ 10 – 15 mm. Đếm số khuẩn lạc trong các ô vuông theo lần lượt theo hình zic zắc. d. Công thức tính: C N(//) CFU ghayCFU ml = å (n1 vd 1 + + ni vd i ) N: Số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn) vi khuẩn trong 1 g hay 1ml mẫu. SC: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên các hộp petri đã chọn. n1 : Số hộp petri cấy tại độ pha loãng thứ 1. di: Hệ số pha loãng thứ i. v: thể tích dịch mẫu(ml) cấy vào mỗi đĩa petri. 3. Phương pháp pha loãng tới hạn (MPN): Ø Nguyên tắc: Phương pháp MPN (phương pháp có số xác suất cao nhất ; số tối khả) còn được gọi là phương pháp pha loãng tới hạn hay phương pháp chuẩn độ. Đây là phương pháp dùng để đánh giá số lượng vi sinh vật theo số lượng vi sinh vật có xác suất lớn nhất hiện diện trong một đơn vị thể tích mẫu. Đây là phương pháp định lượng dựa trên kết quả định tính của một loạt thí nghiệm được lặp lại ở một số độ pha loãng khác nhau. Thông 83
  84. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh cơ sở - Trường Đại học Mở Tp. HCM Nguyễn Văn Minh thường, việc định lượng này được thực hiện lặp lại 3 lần ở 3 độ pha loãng bậc 10 liên tiếp, tổng cộng 3 x 3 = 9 ống nghiệm. Quy trình thực hiện định lượng theo phương pháp này là như sau : Cho vào các ống nghiệm có chứa môi trường thích hợp cho sự tăng trưởng của đối tượng vi sinh vật cần định lượng một thể tích chính xác dung dịch mẫu ở 3 nồng độ pha loãng bậc 10 liên tiếp (ví dụ 1/10, 1/100, 1/1000). Ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp. Dựa vào kết quả biểu kiển chứng minh sự tăng trưởng của vi sinh vật cần kiểm định trong từng ống nghiệm (thường là các hiện tượng như sinh hơi, đổi màu, đục ), ghi nhận số lượng các ống nghiệm dương tính ở từng độ pha loãng. Sử dụng các số liệu này và dựa vào bảng Mac Crady suy ra mật độ vi sinh vật được trình bày dưới dạng số MPN/100ml hay số MPN/1g mẫu. Độ chính xác của trị số MPN phụ thuộc vào số lượng ống nghiệm lặp lại trong mỗi độ pha loãng. Phương pháp MPN có thể dùng để định lượng bất kỳ loại vi sinh vật nào bằng cách nuôi cấy chúng trên môi trường tăng sinh chọn lọc (môi trường lỏng. Ø Thao tác: Cụ thể là đếm Coliforms trong thực phẩm, nước uống, nước sinh hoạt hoặc nước thải. - Lấy mẫu. - Pha loãng mẫu, chọn ba độ pha loãng liên tiếp (thích hợp). - Mỗi độ pha loãng hút 3 lần, mỗi lần 1 ml cấy vào 1 ống nghiệm môi trường Lactose broth. - Ủ ấm từ 35 – 37oC/24 – 48giờ. Cách đọc kết quả, tra bảng MPN theo hướng dẫn trên. 84
  85. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh cơ sở - Trường Đại học Mở Tp. HCM Nguyễn Văn Minh Trong phân tích mẫu, nếu không đoán được chất lượng vệ sinh của mẫu, ta có thể tăng số dãy kiểm tra lên tùy ý. Nhưng khi đọc kết quả, ta chỉ đọc 3 dãy liên tiếp nhau. 4. Phương pháp đo độ đục. Khi một pha lỏng có chưa nhiều phần tử không tan thì sẽ hình thành một hệ huyền phù và có độ đục bởi các phần tử hiện diện trong môi trường lỏng làm cản ánh sáng, làm phân tán chùm ánh sáng tới. Tế bào VSV là một thực thể nên khi hiện diện trong môi trường cũng làm môi trường trở nên đục. Độ đục của huyền phù tỷ lệ với mật độ tế bào. Trong một giới hạn nhất định của độ đục và mật độ tế bào, có thể xác lập được quan hệ tỷ lệ tuyến tính giữa mật độ tế bào và độ đục. Do vậy có thể định lượng mật độ tế bào một cách gián tiếp thông qua đo độ đục bằng máy so màu ở các bước sóng từ 550-610nm. Trong trường hợp này, trước tiên cần phải thiết lập được đường quan hệ tuyến tính giữa độ đục và mật độ tế bào bằng cách sử dụng một số huyền phù tế bào có độ đục xác định bằng một phương pháp trực tiếp khác, ví dụ như phương pháp đếm khuẩn lạc, phương pháp đếm trực tiếp * Xây dựng đường tương quan tuyến tính giữa độ đục và mật độ tế bào - Pha loãng một huyền phù chứa loại VSV cần kiểm nghiệm có mật độ bất kì thành các huyền phù khác nhau có độ đục đo ở OD610nm đạt các giá trị lân cận 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; và 0,5. Đo OD610nm của các huyền phù vừa được pha, ghi nhận số đo thực tế. - Dùng phương pháp đếm trực tiếp dưới kính hiển vi hoặc phương pháp đếm khuẩn lạc, xác định mật độ tế bào (N/ml) của các huyền phù này. 85
  86. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh cơ sở - Trường Đại học Mở Tp. HCM Nguyễn Văn Minh - Tính giá trị log (N/ml) cho mỗi giá trị mật độ N/ml tương ứng với mỗi mật độ đục. Vẽ đường biểu diễn của log (N/ml) (trục tung) theo OD610nm (trục hoành). Xác định khoảng tuyến tính giữa log(N/ml) và OD610nm. * Xác định mật độ tế bào theo độ đục - Đo độ đục của một huyền phù tế bào X cần xác định mật độ. - Từ trị số OD610nm đo được, dựa vào đường tương quan giữa log(N/ml) và độ đục OD610nm, suy ra trị số log(N/ml) và trị số mật độ N/ml (N/ml = 10a với a = log(N/ml) ). Phương pháp này có thể được dùng để so sánh mức độ tăng trưởng của hai hay nhiều chủng vsv trong môi trường lỏng. Trong trường hợp không cần biết giá trị tuyệt đối của mật độ tế bào thì không cần phải xây dựng đường tương quan tuyến tính giữa độ đục và mật độ. Phương pháp này cho kết quả nhanh thường được ứng dụng trong theo dõi hoặc nghiên cứu đặc trưng tăng trưởng của các chủng vsv trong PTN hoặc trong sản xuất tuy nhiên không thích hợp cho ứng dụng trong kiểm nghiệm vi sinh vật. IV/ THỰC HÀNH. - Định lượng trực tiếp số lượng vi khuẩn Bacillus subtilis trên lame - Định lượng trực tiếp số lượng tế bào nấm men bằng buồng đếm hồng cầu. - Định lượng gián tiếp vi khuẩn bằng phương pháp đỗ đĩa, màng lọc. - Định lượng coliforms bằng phương pháp MPN. 86
  87. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh cơ sở - Trường Đại học Mở Tp. HCM Nguyễn Văn Minh V/ BÁO CÁO. Sinh viên báo cáo kết quả định lượng vi sinh vật. 87
  88. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh cơ sở - Trường Đại học Mở Tp. HCM Nguyễn Văn Minh PHỤ LỤC A. HÓA CHẤT. 1. Cồn – Ether Tỷ lệ về thể tích 3:1. Đong 750 ml cồn 96o + 250 ml ether, ta được dung dịch cồn – ether tỷ lệ 3:1.Dung dịch này dùng để tẩy sạch vật kính dầu, hoặc các dụng cụ dính dầu soi. 2. Cồn – acid ( dùng để nhuộm Ziehl Neelsen ) o Cách pha: Đong 97 ml cồn 96 + 3 ml acid HCl hoặc H2SO4 đậm đặc. 3. Dung dịch sunfo – cromic: K2Cr2O7 + H2SO4 Công thức: K2Cr2O7 60g H2SO4 đậm đặc 66ml Nước 1000ml Cách pha: Cân 60g K2Cr2O7, hào vào 500ml nước. Thêm từ từ 66ml H2SO4 đậm đặc, cuối cùng lại thêm 500ml nước nữa. Bicromate kali sẽ tác dụng với acid sulfuric và làm sinh ra acid cromic. Chất này có tác dụng oxi hóa mạnh do đó có thể tẩy sạch các vết bẩn trên dụng cụ thủy tinh. Thời gian ngâm dụng cụ thủy tinh từ 1 – 2 ngày, xả thật kỹ bằng nước sạch, rửa bằng savon bột, rồi rửa lại bằng nước sạch. Dung dịch này có thể dùng nhiều lần cho đến khi dung dịch từ màu đỏ cam biến thành màu lục đen thì bỏ đi. 88
  89. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software For evaluation only. Thực tập vi sinh cơ sở - Trường Đại học Mở Tp. HCM Nguyễn Văn Minh Lưu ý: Dung dịch này rất độc. Do đó khi ngâm phải đậy kín,lúc rửa nên đeo khẩu trang, mang găng cao su và kính bảo hiểm. 4. Cồn 70%: Dùng để sát khuẩn tay, bàn , ghế, tủ cấy, Cách pha: cồn 70o từ cồn 96o. Vì không đòi hỏi chính xác,nên có thể áp dụng công thức: V1C1 = V2C2 5. Nước muối sinh lý 9‰ vô khuẩn: Cân chính xác 9g NaCl tinh khiết cho vào cốc có chứa 991ml nước cất (vừa đủ 1000ml ), dùng đũa thủy tinh khuấy đều. Đem hấp vô khuẩn ở to = 121oC (1atm)/ 15 – 20 phút. B. THUỐC NHUỘM. 1. Crystal violet ( C25H30N3Cl . 9H2O = 570,11 ): Công thức: a) Crystal violet 0,4g Cồn 96o 10ml b) Phenol 1g Nước cất 100ml Cách pha: Trộn hai dung dịch a và b lại với nhau, khuấy cho hòa tan đều rồi đem lọc. Chú ý: dung dịch thuốc nhuộm này luôn bảo quản trong chai màu, tránh ánh sáng. 89