Giáo trình Thực tập sinh học động vật - Quan Quốc Đăng

Nội dung text: Giáo trình Thực tập sinh học động vật - Quan Quốc Đăng

1. ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRUNG TÂM THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM SINH HỌC – MÔI TRƯỜNG Bộ môn Công nghệ Sinh học Giáo trình THỰC TẬP SINH HỌC ĐỘNG VẬT Dành cho Sinh viên chuyên ngành Sinh học và Công nghệ Sinh học Biên Soạn QUAN QUỐC ĐĂNG LƯU HÀNH NỘI BỘ Tp. Hồ Chí Minh - 2005
2. Giáo trình thực hành Sinh học Động vật Bài 1 PHƯƠNG PHÁP NHUỘM TIÊU BẢN MÁU VÀ PHÂN BIỆT CÁC LOẠI TẾ BÀO MÁU I. ĐẠI CƯƠNG A. Một số đặc điểm sinh lý của bạch cầu Số lượng tế bào bạch cầu ở người trưởng thành thông thường có từ 5.000 đến 10.000 tb/mm3 máu và chỉ chiếm trung bình 1% tổng số tế bào máu. Ở cơ thể người và động vật bậc cao, các tế bào bạch cầu có một vai trò quan trọng trong cơ chế chống kháng nguyên, bảo vệ cơ thể, ví dụ thực bào, sinh tổng hợp kháng thể (Ig), sản xuất interferon Trong các tình trạng bệnh lý, số lượng bạch cầu biến động dẫn đến tỷ lệ tế bào cũng thay đổi. Dựa trên cơ sở ấy, người ta thường lấy số lượng và tỷ lệ các loại tế bào bạch cầu máu ngoại vi ở người để chẩn đoán hiện trạng sinh lý, bệnh lý của cơ thể. Bạch cầu là những tế bào có nhân, có khả năng di động, hình dạng và kích thước có thể biến đổi tuỳ từng loại bạch cầu. Bạch cầu được chia làm hai loại: bạch cầu không hạt và bạch cầu có hạt căn cứ theo sự bắt màu của các hạt ở nguyên sinh chất của chúng. Sự bắt màu của các hạt nguyên sinh chất có thể khác nhau khi tế bào được nhuộm với các loại thuốc nhuộm khác nhau. B. Phân loại bạch cầu 1. Bạch cầu không hạt Các tế bào này không có các hạt bắt màu ở nguyên sinh chất, chúng bao gồm các dòng Lymphocyte và Monocyte. a. Bạch cầu Lymphocyte Trong dòng này có hai loại tế bào là Lymphocyte B (Bursa fabracius) và Lymphocyte T (Thymus). Điển hình của dòng này là tế bào có hình tròn, nhân hình cầu, nguyên sinh chất hẹp, ưa kiềm, chung quanh nhân có viền vòng sáng. 1
3. Giáo trình thực hành Sinh học Động vật Lymphocyte to có kích thước 6-10µm, nhân tròn bắt màu tím xanh, nhiễm sắc thô, nguyên sinh chất bắt màu xanh da trời, có viền xanh thẫm ngoại vi. Lymphocyte nhỏ có kích thước 5-9µm, nhân tròn, nhiễm sắc thô, bắt màu tím sẫm, chiếm 9/10 thể tích tế bào. Nguyên sinh chất của tế bào ưa bazơ mạnh, do vậy khi nhuộm bắt màu xanh. b. Bạch cầu Monocyte Là những tế bào lớn, có kích thước 20 – 25µm. Dòng này là các tế bào hình tròn, nguyên sinh chất bắt màu xanh, không có hạt, nhân hình bầu dục, hạt đậu, bắt màu tím đen. Các tế bào này có khả năng thực bào. 2. Bạch cầu có hạt Là những bạch cầu mà trong nguyên sinh chất của chúng có hạt, dựa vào sự bắt màu của các hạt này, người ta chia ra làm 3 loại tế bào khác nhau. a. Bạch cầu trung tính (neutrophil) Kích thước 10-15µm, nhân thắt eo, phân chia thành các thùy, nguyên sinh chất có hạt tròn khoảng 0,2-0,4µm có màu hồng xanh tím. Các hạt này có chứa este của acid hyanuronic là thành phần quan trọng của glycogen (đường động vật), lượng este này tăng song song với lượng glycogen của gan. Các tế bào này có khả năng thực bào. b. Bạch cầu ưa acid (eosinophil) Kích thước 10-15µm, nhân thắt eo, chia thùy. Nguyên sinh chất có hạt to, tròn đều khoảng 1µm, hạt ưa acid bắt màu da cam. Bản chất hạt acid là chứa nhiều histon, một số tác giả còn cho rằng có chứa histamine và acetylcholin cao, pH rất acid (khoảng 2). c. Bạch cầu ưa bazơ (basophil) Kích thước 10-15µm, nhân thắt eo, chia đoạn. Nguyên sinh chất có hạt màu xanh methylen hoặc xanh toluidin, nhuộm bắt màu xanh thẫm, hạt rất to khoảng 1-2µm và phân bố không đều trong nguyên sinh chất. C. Số lượng và công thức bạch cầu Bằng phương pháp sử dụng các tiêu bản cố định máu ngoại vi được dàn mỏng và nhuộm, người ta dựa vào hình dáng, kích thước, màu của nhân tế bào, màu của các hạt nguyên sinh chất trong bào tương, vừa phân loại 2
4. Giáo trình thực hành Sinh học Động vật vừa đếm ngẫu nhiên sao cho ít nhất có 100 tế bào. Từ đó xác định công thức bạch cầu (muốn có độ chính xác cao, có thể sử dụng nhiều lame kính cố định máu để có nhiều mẫu, qua đó thu được nhiều số liệu hơn). Số lượng bạch cầu ở người trưởng thành bình thường trung bình: Nam: 7000-9000 tb/mm3 máu ngoại vi. Nữ: 6000-8000 tb/mm3 máu ngoại vi. Hồng cầu BC Mono BC ưa Acid BC ưa Base BC trung tính Tiểu cầu BC Lympho Hình 1.1. Các loại tế bào máu trên tiêu bản đã nhuộm Ở trẻ em và phụ nữ có thai thì số lượng bạch cầu cao hơn. Số lượng bạch cầu tăng trong các bệnh nhiễm khuẩn cấp tính, đặc biệt tăng cao trong các bệnh bạch huyết cấp hoặc mãn tính. Số lượng bạch cầu giảm trong trường hợp nhiễm độc, nhiễm xạ, nhiễm khuẩn, bệnh suy tủy, kể cả một số trường hợp stress D. Một số chỉ thị bệnh lý ở người Sự thay đổi công thức bạch cầu có nhiều ý nghĩa quan trọng trong chẩn đoán bệnh lý ở người, ví dụ: - Bạch cầu trung tính tăng trong các trường hợp nhiễm trùng cấp, nhiễm nấm, nhiễm siêu vi, nhiễm ký sinh trùng, viêm, xuất huyết cấp, tiêu huyết, bệnh ác tính: ngộ độc thuốc Digitat, Corticoid, nọc rắn ; bạch cầu trung tính 3
5. Giáo trình thực hành Sinh học Động vật giảm trong trường hợp nhiễm kim loại nặng như Pb, Ar, suy tủy, nhiễm virus (quai bị, sởi ). - Bạch cầu ưa acid tăng trong trường hợp dị ứng, bệnh ký sinh trùng, bệnh ngoài da , trong khi đó chúng giảm số lượng trong các trường hợp bị kích động, chấn thương tâm lý, dùng thuốc ACTH (adrenocorticotropin), Cortisol - Bạch cầu ưa bazơ tăng trong bệnh cầu tủy, dị ứng, nhiễm phóng xạ, truyển nhiều huyết thanh , giảm khi dị ứng cấp, dùng ACTH, Thyrocin epinephrin. - Bạch cầu Monocyte tăng trong trường hợp bệnh có tổn thương ở hệ thống võng nội mạc, bệnh Lypus, viêm khớp, nhiễm ký sinh trùng sốt rét - Ngoài sự thay đổi công thức bạch cầu trong các trường hợp bệnh lý, còn có sự thay đổi về hình dạng, kích thước bạch cầu trong một số bệnh. E. Xác định hồng cầu mạng lưới Hồng cầu mạng lưới là loại hồng cầu mới từ tuỷ xương ra máu ngoại vi, mạng lưới đó là mạng nội bào tương bắt màu kiềm chưa bị tiêu hết. Sau 24 giờ máu ra ngoại vi, mạng lưới tiêu biến, hồng cầu mạng lưới trở thành hồng cầu trưởng thành, bào tương chỉ còn có huyết cầu tố. Nhuộm hồng cầu mạng lưới bằng phương pháp nhuộm sống, sau đó đếm số lượng của chúng trên 1000 hồng cầu và tính tỷ lệ phần trăm Ở người bình thường tỷ lệ hồng cầu lưới trong máu ngoại vi là: Nam: 0,7 ± 0,21% Nữ: 0,9 ± 0,25% II. CHUẨN BỊ a. Dụng cụ- thiết bị - Đèn cồn. - Kim chích máu. - Kính hiển vi (thị kính 15 hoặc 10, vật kính 90 hoặc 100). - Máy đếm tế bào (loại có nút bấm). - Tủ sấy. - Lame. - Giá để lame. 4
6. Giáo trình thực hành Sinh học Động vật - Lamelle. - Bông thấm. - Ống hút 1cc. b. Hóa chất - Dầu cèdre (dầu bá hương). - Dầu Xylène. - Cồn 950 - 990(Methylic). - Ether (tác dụng giảm đau). - Dung dịch thuốc nhuộm Giemsa Công thức dung dịch Giemsa: * Giemsa: 7,6g. * Cồn methylic: 750ml. * Glycerine: 250ml. - Dung dịch chống đông Citrat natri 5% (có thể sử dụng dung dịch heparin). - Nước cất trung tính. - Dung dịch nhuộm xanh Cresyl gồm: 1g xanh cresyl ánh, 100ml cồn tuyệt đối. c. Mẫu vật - Chuột nhắt trắng (để lấy máu). - Mẫu máu người (máu tươi hoặc có thể sử dụng máu ngoại vi đã nhuộm sẵn tại phòng thí nghiệm). III. THỰC HÀNH Có nhiều phương pháp nhuộm và loại thuốc nhuộm được khác nhau, bài thực tập này sử dụng phương pháp nhuộm đơn với thuốc nhuộm Giemsa. Mẫu máu có thể sử dụng từ hai nguồn: sinh viên tự lấy máu của bản thân từ đầu ngón tay hoặc từ mẫu máu có sẵn đã được xử lý tại phòng thí nghiệm. 1. Xác định bạch cầu a. Lấy mẫu máu - Trường hợp sử dụng máu ở đầu ngón tay: chuẩn bị 2 miếng lame sạch (1 và 2). 5
7. Giáo trình thực hành Sinh học Động vật Vẩy nhẹ cả bàn tay trái, sau đó vuốt nhiều lần từ cổ tay xuống tới đầu ngón tay cho máu dồn xuống. Dùng bông gòn và cồn 950 khử trùng kim chích và khử trùng các đầu ngón tay (thông thường máu được lấy từ đầu ngón tay thứ ba hoặc ngón áp út). Dùng ngón tay cái làm căng da của đầu ngón tay định lấy máu, tay phải cầm kim có tẩm ether chích vào đầu ngón tay đó một vết sâu khoảng 1 - 2mm, bóp nhẹ cho ra một giọt máu. Bỏ giọt máu đầu, lấy giọt máu thứ hai chấm nhẹ lên vị trí cuối lame 1. Cần thao tác nhanh để tránh bị đông máu. - Trường hợp sử dụng máu đã chống đông có sẵn: Nhỏ một giọt máu chống đông lên lame 1 ở vị trí cuối lame. b. Dàn mỏng mẫu máu Lấy lame 2 chạm vào giọt máu với góc 30 - 450, để giọt máu lan theo cạnh lame kính rồi kéo lame 2 từ đầu này sang đầu kia nhưng vẫn giữ nguyên góc 450, như vậy là đã dàn đều giọt máu thành lớp mỏng trên lame 1. Chú ý khi dàn máu đẩy lame 2 với tốc độ vừa phải, nếu đẩy lame 2 quá nhanh máu sẽ dàn không đều, ngược lại nếu đẩy quá chậm, lớp máu sẽ quá dày, khó đếm. Để tiêu bản máu khô (lame 1) tự nhiên (có thể dùng gió, tủ ấm hoặc hơ nhẹ lửa). c. Cố định tiêu bản Sử dụng cồn methylic nhỏ bao đều trên tiêu bản máu sau đó để đứng tiêu bản trên giá cho alcohol chảy hết và để tiêu bản khô tự nhiên. d. Nhuộm tiêu bản - Tiêu bản máu đã cố định bằng cồn được ngâm trong dung dịch Giemsa (2ml Giemsa pha với 18ml nước cất, lắc đều) trong 15 - 20 phút (có thể nhỏ dung dịch Giemsa phủ đều trên mẫu máu của tiêu bản đã cố định khi ta không dùng cốc ngâm lame). Gác các lame mẫu lên các thanh thủy tinh nằm ngang, tránh để hóa chất chạm tay người làm. - Đem tiêu bản rửa bằng nước cất (không để nước chảy thẳng vào chỗ có tiêu bản máu). - Để khô tự nhiên (hoặc sấy khô nhẹ trong tủ ấm hay trên ngọn đèn cồn). 6
8. Giáo trình thực hành Sinh học Động vật - Quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi với vật kính x 90 (hoặc x100) có sử dụng dầu cèdre và ánh sáng nhân tạo. Chú ý: đếm 3 lần cho một mẫu để lấy các trị số trung bình, di chuyển đều lame mẫu để đếm sao cho không bị trùng lặp. 1 2 450 1 2 1 2 1 Hình 1.2. Các bước làm tiêu bản máu 7
9. Giáo trình thực hành Sinh học Động vật e. Phương pháp sử dụng dầu cèdre Nhỏ một giọt dầu cèdre vào chỗ mỏng nhất của tiêu bản (thường là phần đuôi lame 1), dùng vật kính dầu x90 hoặc (x100) để quan sát trên một thị trường ngẫu nhiên hoặc thứ tự trên toàn bộ tiêu bản sao cho ít nhất xác định được 100 tế bào. Tránh tối đa sự lầm lẫn đếm đi đếm lại. Vì sử dụng vật kính x90 hoặc x100, tức tận dụng độ phóng đại lớn nhất, do vậy cần có độ tập trung ánh sáng tối đa. Nhưng nguồn sáng từ tụ quang chiếu lên qua tiêu bản bằng thủy tinh, tiếp theo qua một lớp không khí rồi mới lọt vào vật kính. Môi trường thủy tinh và không khí không cùng một độ chiết quang, những tia sáng qua thủy tinh gặp không khí sẽ bị khúc xạ không thể lọt vào thị kính được và vi trường sẽ không có ánh sáng, không quan sát được. Để khắc phục tình trạng trên, người ta nhỏ một giọt dầu cèdre lên lame kính, nhờ sự tiếp xúc trực tiếp của dầu với bề mặt lame kính, và vật kính, dầu sẽ có vai trò như một cầu nối liền giữa lame kính và vật kính, không còn lớp không khí trung gian nữa. Độ chiết quang của dầu cèdre và của thủy tinh là bằng nhau, nghĩa là chúng đã có một môi trường đồng nhất, do vậy, các tia sáng từ tụ quang chiếu lên sẽ đi qua thủy tinh rồi lớp dầu cèdre mà không bị khúc xạ sẽ chiếu thẳng vào vật kính, nhờ thế ánh sáng được tập trung đủ cho sự quan sát bằng mắt. 2. Xác định hồng cầu lưới a. Chuẩn bị tiêu bản -Nhỏ một giọt xanh Cresyl lên lame kính sạch và dàn đều như dàn tiêu bản công thức bạch cầu. Như thế, trên lame kính lúc này có một lớp thuốc nhuộm mỏng, để khô tự nhiên và đánh dấu vào mặt có thuốc nhuộm. -Nhỏ một giọt máu lên lame kính đã có sẵn xanh Cresyl rồi dàn máu đè lên lớp thuốc, sau đó để khô tự nhiên. -Cố định tiêu bản máu bằng cồn, sau đó nhuộm với giemsa như phương pháp nhuộm bạch cầu b. Cách đếm và tính kết quả 8
10. Giáo trình thực hành Sinh học Động vật Đếm số hồng cầu lưới gặp trên 1000 hồng cầu rồi tính tỷ lệ phần trăm. Bởi vì lượng hồng cầu lưới là ít, do đó thông thường ta đếm với số lượng rất lớn hồng cầu mới có thể gặp được hồng cầu lưới. Ví dụ: ta đếm 1000 hồng cầu gặp 10 hồng cầu lưới thì tỷ lệ là 1% -Sau khi nhuộm, hồng cầu lưới là những hồng cầu có hạt nhỏ hoặc những hạt màu xanh thẫm, phân bố đều trên bề mặt hồng cầu, số hạt này nhiều hay ít tuỳ thuộc vào mức độ trưởng thành của tế bào hồng cầu. Hồng cầu lưới Hình 1.3. Hình ảnh minh họa hồng cầu lưới IV. YÊU CẦU 1. Sinh viên sử dụng tốt kính hiển vi với độ phóng đại cao có dầu cèdre. 2. Sinh viên hiểu các nguyên tắc và biết phương cách thức thu nhận máu giọt (ở cơ thể người và động vật) trong phòng thí nghiệm. 3. Sinh viên nắm được phương pháp nhuộm tiêu bản máu sống. 4. Phân biệt được các tế bào hồng cầu, bạch cầu dưới kính hiển vi quang học. 5. Phân biệt các tế bào hồng cầu lưới, xác định tỷ lệ phần trăm 6. Phân biệt được các loại bạch cầu, xác định số lượng và lập công thức MỘT SỐ HÌNH ẢNH NHUỘM TIÊU BẢN MÁU THỂ HIỆN CÁC TẾ BÀO BẠCH CẦU Lymphocyte Monocyte 9
11. Giáo trình thực hành Sinh học Động vật Basophil Eosinophil Neutrophil 10
12. Giáo trình thực hành Sinh học Động vật Bài 2 KHẢO SÁT ĐỘ BỀN HỒNG CẦU I. ĐẠI CƯƠNG A. Aùp suất thẩm thấu Trong các mô sinh học sống, áp suất thẩm thấu giữ một vai trò quan trọng, đó là mối tương quan giữa các thành phần dịch mô với các cấu trúc khác trong mô thông qua đặc tính của các màng sinh học sống. Trên cơ sở các thí nghiệm của Dutrochet về hiện tượng thẩm thấu, Hamburger xây dựng phương pháp xác định áp suất thẩm thấu của một dung dịch không đồng nhất về nồng độ chất. Thẩm thấu là sự thấm qua màng ngăn của các phân tử hoà tan và các phân tử trong dung môi giữa hai môi trường có nồng độ khác nhau. Màng bán thấm chỉ để các phân tử dung môi thấm qua mà thôi, các phân tử hoà tan bị giữ lại. Do vậy, chúng tạo sự chênh lệch về nồng độ chất ở hai bên màng. Để cân bằng áp suất, màng bán thấm thường sử dụng nước (một cấu trúc dễ dàng vận chuyển) như một phương tiện để tăng (bằng cách thải nước) hoặc giảm (bằng cách hút nước) nồng độ các chất gây ra áp suất nói trên. Dung dịch đẳng trương (isotonic) là dung dịch có áp lực thẩm thấu bằng với dung dịch khác qua màng sinh học. Dung dịch được coi là ưu trương (hypertonic) khi chúng có áp lực thẩm thấu lớn hơn và ngược lại thì được coi là dung dịch nhược trương (hypotonic). Dung dịch nào càng chứa nhiều chất hoà tan thì áp suất thẩm thấu của nó càng cao. B. Độ bền của tế bào hồng cầu Độ bền của màng tế bào hồng cầu là một trong những chỉ tiêu sinh lý quan trọng của máu, chúng được đánh giá qua sức chịu đựng của màng tế bào hồng cầu dưới tác dụng của áp suất thẩm thấu trong huyết tương. Màng tế bào hồng cầu có tính bán thấm, chúng ngăn cách các yếu tố bên trong tế bào với dung môi. Aùp suất thẩm thấu của máu chủ yếu do NaCl quyết định, với nồng độ tương đương với áp suất thẩm thấu của một dung 11
13. Giáo trình thực hành Sinh học Động vật dịch có chứa NaCl 0,9%, do vậy đối với các tế bào trong cơ thể, dung dịch NaCl 0,9% chính là dung môi đẳng trương (áp suất cân bằng giữa trong và ngoài màng tế bào). Nếu cho tế bào hồng cầu vào dung dịch đẳng trương (là dung dịch có áp suất thẩm thấu bằng với áp suất thẩm thấu của hồng cầu) thì thể tích của nó không thay đổi bởi các phân tử dung môi (nước) ra vào qua màng tế bào bằng nhau, màu của dung dịch chứa tế bào cũng không thay đổi. Nếu cho tế bào hồng cầu vào dung dịch ưu trương (là dung dịch có áp suất thẩm thấu lớn hơn áp suất thẩm thấu của tế bào) thì hồng cầu sẽ bị mất nước khiến thể tích của nó co lại làm cho màng tế bào bị nhăn nheo (co nguyên sinh). Ngược lại nếu cho hồng cầu vào dung dịch nhược trương (là dung dịch có áp suất thẩm thấu nhỏ hơn hồng cầu) thì nước bị hút vào bên trong làm cho hồng cầu phình to (trương nguyên sinh). Hồng cầu bị trương tới một mức độ nào đó màng tế bào hồng cầu không chịu nổi sẽ bị vỡ, giải phóng hemoglobin (tiêu huyết), chính huyết cầu tố bị vỡ làm cho dung dịch có màu hồng nhạt cho tới đỏ trong. Nồng độ nhược trương làm những hồng cầu đầu tiên bị vỡ gọi là điểm bắt đầu tiêu huyết, nồng độ nhược trương làm toàn bộ hồng cầu đều vỡ gọi là điểm tiêu huyết hoàn toàn. Đối với các động vật khác nhau, áp suất thẩm thấu của tế bào cũng khác nhau. Ở người bình thường, độ bền thẩm thấu tối thiểu là 0,46- 0,48%; tối đa là 0,34- 0,36%. Trong một số bệnh, sức bền màng hồng cầu giảm như thiếu máu tan huyết, vàng da do xoắn trùng, sốt rét thì độ bền tối đa 0,5- 0,6%. Ngược lại, một số bệnh lại làm sức bền màng hồng cầu tăng lên như vàng da do sắc tố mật thì độ bền tối thiểu là 0,4-0,42%. Glycoprotein Dịch ngoại bào Glycolipid Cholesteron Carbohydrate Protein ngoại vi Các sợi của bộ xương tế bào Protein xen màng Tế bào chất Hình 2.1. Cấu trúc màng tế bào hồng cầu 12
14. Giáo trình thực hành Sinh học Động vật ( Đẳng trương) (Nhược trương) ( Ưu trương) a b c Hình 2.2. Các trạng thái của tế bào hồng cầu trong môi trường có Tuy nhiênnồng tế độ bào muối hồng khác cầu nhau được sinh ra trong tủy xương và được bổ xung vào tuần hoàn máu một cách liên tục, do vậy tuổi của hồng cầu trong máu hoàn toàn không đồng đều, có hồng cầu non, hồng cầu già (tế bào hồng cầu già nhất sẽ vào khoảng 120 ngày tuổi- đây là tuổi giới hạn của hồng cầu). Chính vì lý do đó, độ bền của tế bào hồng cầu với áp suất thẩm thấu cũng không thể giống nhau. Người ta có thể xác định độ bền hồng cầu gián tiếp qua lượng hemoglobin được giải phóng ra dung dịch khi hồng cầu bị vỡ hoặc xác định trực tiếp bằng số lượng hồng cầu còn lại trong dung dịch. Bài thực tập này sử dụng phương pháp xác định gián tiếp nồng độ của hồng cầu bằng máy so màu quang điện, đồng thời bằng cảm quan, xác định màu sắc dung dịch chứa hồng cầu. Khi cho hồng cầu vào trong dung môi là dung dịch NaCl có áp suất thẩm thấu giảm dần (tương ứng với nồng độ giảm dần), nếu áp suất thẩm thấu của dung môi có chứa hồng cầu giảm tới điểm bắt đầu tiêu huyết thì số lượng hồng cầu bắt đầu giảm dần cho đến khi tới điểm tiêu huyết hoàn toàn, lúc đó toàn bộ tế bào hồng cầu bị vỡ hết. Trong khoảng này, nồng độ hồng cầu có sự tương quan hàm mũ với nồng độ của dung dịch NaCl. Mặt khác, mật độ quang học (D) có mối liên quan tuyến tính với nồng độ của chất tan trong dung dịch. Ở đây, chất tan là hồng cầu vì thế đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa mật độ quang học và nồng độ dung dịch NaCl cũng biến thiên theo hàm mũ (đường biểu diễn dạng chữ S). Còn ở ngoài khoảng đó (trước lúc bắt đầu tiêu huyết và sau khi tiêu huyết hoàn toàn) nó sẽ là đường nằm ngang (mật độ quang học là hằng số). Chú ý rằng khi có sự tiêu huyết thì nồng độ hemoglobin tăng lên, nó có thể làm ảnh hưởng đến kết quả thu được từ phương pháp này. Vì thế phải 13
15. Giáo trình thực hành Sinh học Động vật chọn bước sóng ánh sáng 597nm, đây là bước sóng ánh sáng mà hemoglobin hấp thụ ít nhất. OD Điểm bắt đầu tiêu huyết 1,4 • • • • 1,3 • • • 1,2 1,0 • 0,9 0,8 0,7 0,6 • 0,5 • 0,4 Điểm tiêu huyết hoàn toàn 0,3 0,2 • 0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 C(%) Hình 2.3. Đồ thị biểu diễn độ bền hồng cầu II. CHUẨN BỊ a. Dụng cụ – thiết bị - 17 ống nghiệm nhỏ (thể tích10-20ml). - Giá đựng ống nghiệm. - 2 pipette 10ml. - 1 pipette 1ml. - Viết dầu - Màng nhựa mỏng. - Máy đo mật độ quang. b. Hóa chất - Dung dịch chống đông (có thể sử dụng heparin hoặc natri citrat 3- 5%). - Dung dịch NaCl 1% 14
16. Giáo trình thực hành Sinh học Động vật - Nước cất khử ion. Chú ý: kết quả đo áp suất thẩm thấu này không liên hệ tới tính chất hoá học của dung dịch, nói một cách khác, có thể thí nghiệm với bất kỳ hóa chất nào nếu như hóa chất đó không quá độc, dễ làm tan hồng cầu. c. Mẫu vật - Khoảng 3ml máu tĩnh mạch toàn phần có yếu tố chống đông (tốt nhất là đem ly tâm để tách huyết tương, chỉ dùng hồng cầu, có thể dùng máu động vật như chuột bạch, thỏ, gà ). - Có thể sử dụng máu đã loại bỏ các sợi fibrin bằng cách hứng lấy máu vào ống nghiệm có chứa sẵn các hạt thủy tinh nhỏ (đường kính trung bình từ 1-2mm), lắc nhẹ đều cho các sợi fibrin bám dính vào các hạt thủy tinh, sau đó gạn lấy máu. III. THỰC HÀNH - Chuẩn bị 17 ống nghiệm sạch, đặc biệt phải khô và đánh số từ 1 đến 17. - Pha từ dung dịch NaCl 1% thành 17 ống có nồng độ thứ tự từ 0,1% đến 1% NaCl (dùng bảng 2.1 đã tính dưới đây để pha sao cho thể tích dung dịcê¬3 các ống bằng nhau = 10ml). - Cho vào mỗi ống 0,1ml (4 giọt) máu chống đông hoặc 3 giọt tế bào hồng cầu đã được ly tâm, làm sạch. - Cắt màng nhựa mỏng bịt kín miệng ống nghiệm, giữ ngón tay cái bên trên và lắc nhẹ nhàng cho máu hoà đều trong dung dịch , để yên khoảng 3 phút , lắc đều lại rồi đem dung dịch đi đo mật độ quang học (D) ở bước sóng 597nm Bảng 2.1. Bảng hướng dẫn pha dung dịch Ống số Dung dịch Nước cất (ml) Nồng độ của dung dịch NaCl 1% (ml) cần pha (%) 1 1,0 9,0 0,10 2 2,0 8,0 0,20 3 2,5 7,5 0,25 4 3,0 7,0 0,30 5 3,5 6,5 0,35 6 4,0 6,0 0,40 15
17. Giáo trình thực hành Sinh học Động vật 7 4,5 5,5 0,45 8 5,0 5,0 0,50 9 5,5 4,5 0,55 10 6,0 4,0 0,60 11 6,5 3,5 0,65 12 7,0 3,0 0,70 13 7,5 2,5 0,75 14 8,0 2,0 0,80 15 8,5 1,5 0,85 16 9,0 1,0 0,90 17 10,0 0,0 1,00 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Hình 2.4. Sơ đồ mẫu bố trí thí nghiệm Quan sát: - Những ống đầu dung dịch không có màu, hầu hết tế bào hồng cầu còn nguyên vẹn, chưa vỡ và lắng xuống đáy ống nghiệm. - Các ống nghiệm ở giữa có màu hồng xẫm dần, các tế bào hồng cầu lắng dưới đáy ít dần, dung dịch ở trên thay đổi màu. Ống nghiệm đầu tiên trong số này có màu thì nồng độ NaCl ứng với sức bền tối thiểu. - Các ống cuối cùng có màu hồng xẫm như nhau và không còn tế bào hồng cầu lắng dưới đáy (hoặc chỉ còn các mảnh màng tế bào), như vậy ống đầu tiên trong số này có nồng độ NaCl ứng với sức bền tối đa của tế bào hồng cầu. 16
18. Giáo trình thực hành Sinh học Động vật IV. YÊU CẦU 1. Kết quả đo mật độ quang được trình bày vào bảng sau C% 0,10 0,20 0,25 0,30 0,35 0,40 0,45 0,50 0,55 0,60 0,65 0,70 0,75 0,80 0,85 0,90 1,00 OD 2. Vẽ đồ thị theo số liệu thu được trong bảng trên. 3. Xác định điểm bắt đầu tiêu huyết và điểm tiêu huyết hoàn toàn. 4. Các kết luận ứng dụng: - Máu của người bình thường có trị số tiêu huyết tối thiểu là 6,5/1000 NaCl, và tiêu huyết tối đa là 3,5/1000 NaCl. - Nếu tế bào hồng cầu có màng không bình thường, các trị số trên sẽ có sự biến động ở các nồng độ NaCl khác nhau. - Trong Y học, các dung dịch truyền vào máu phải đẳng trương so với tế bào chất của hồng cầu: dung dịch NaCl 9/1000 hoặc glucose 5/1000 - Qua phương pháp trên, người ta có thể xác định được áp suất thẩm thấu của bất kỳ một chất X riêng rẽ nào đó đối với tế bào máu trong phòng thí nghiệm. 17