Giáo trình Sinh học phân tử

110 trang phuongnguyen 30

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Giáo trình Sinh học phân tử", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

giao_trinh_sinh_hoc_phan_tu.pdf

Nội dung text: Giáo trình Sinh học phân tử

Chương 1 I. Nucleic acid , . (RNA). 1. Deoxyribonucleic acid 5’ . 5 m. Sinh học phân tử 5
Liên kết hydrogen (a) Cấu trúc của DNA RNA Hình 1.1. Chuỗi xoắn kép của DNA mạch . o 20 A 100 300 1.3). Sinh học phân tử 6
o 100 A đường kính 100 300 . Trong nhân tế bào, các sợi vừa kể trên kết hợp chặt chẽ với nhiều protein khác nhau và cả với các RNA tạo thành nhiễm sắc chất, mức độ tổ chức cao nhất của DNA. NH2 đầu 5 N N O H Adenine N N H O P O CH2 O O Phosphate H H Deoxyribose O H H O H N N H H Guanine O N N NH2 O P O CH2 O O H H NH2 H H O H H N Cytosine O H N O OH HOCH2 CH O O P O 2 O O H H H O H HO OH H CH H O H 3 N Thymine Ribose (RNA) (DNA) O H N O CH O O P O 2 H O H N O H H N O H H H O H Uracil (RNA) đầu 3’ Hình 1.2. Cấu trúc các nucleotide điển hình Sinh học phân tử 7
DNA xoắn kép Nhân của 8 phân tử histone 2 nm Histon H1 DNA 11 nm Nucleosome 30 nm 300 nm 700 nm 1400 nm DNA xoắn kép Nhân của 8 phân tử histone 2 nm DNA 11 nm Histone H1 30 nm 300 nm 700 nm 1400 nm Hình 1.3. Cấu trúc nucleosome và nhiễm sắc thể. Phân tử DNA được cuộn lại trên nhiễm sắc thể làm cho chiều dài ngắn lại hơn 50.000 lần. : - . 10-15% genome (hệ gen) - Sinh học phân tử 8
). - . - - 5S RNA. - . . , đ . 2. Ribonucleic acid sau: - . - . - . , s -protein. Sinh học phân tử 9
. : (mRNA) 2- . : Phiên mã Dịch mã DNA RNA Protein E. coli 1,2 kb. (tRNA) : - . - . 2.3. RNA ribosome (rRNA) n. Sinh học phân tử 10
E. coli 5S. exon. Ribosome là những phân tử cần thiết cho sự tổ . Người ta cũng thấy ribosome trong ty thể, ở đó có sự tổng hợp một số protein ty thể. E. coli (%) (S)1 (kDa) nucleotide 3 23 1,2 10 3700 rRNA 80 16 0,55 103 1700 5 3,6 101 120 tRNA 15 4 2,5 × 101 75 mRNA 5 2.3.1. Ribosome của prokaryote Tế bào được nghiên cứu về ribosome nhiều nhất là E. coli. Ribosome (70S) của E. coli gồm hai tiểu đơn vị: tiểu đơn vị nhỏ (30S) và tiểu đơn vị 1 S (Svedberg): đơn vị đo vận tốc lắng. Hệ số lắng của một tiểu đơn vị phụ thuộc không những vào khối lượng của tiểu đơn vị đó mà còn phụ thuộc vào hình dạng và độ rắn của nó, điều này giải thích tại sao sự kết hợp của hai tiểu đơn vị 50S và 30S lại tạo ra một ribosome 70S. Sinh học phân tử 11
lớn (50S). Căn cứ vào hệ số lắng, người ta phân biệt ba loại rRNA: 23S rRNA, 16S rRNA và 5S rRNA. - Tiểu đơn vị 30S chứa: 1 phân tử 16S rRNA (có 1540 nu) và 21 ribosomal protein khác nhau. - Tiểu đơn vị 50S chứa: 1 phân tử 5S rRNA (có 120 nu), 1 phân tử 23S rRNA (có 2900 nu) và 34 ribosomal protein. Hai tiểu đơn vị nhỏ và lớn khi kết hợp với nhau sẽ tạo ra một rãnh ở chỗ tiếp giáp của chúng để cho mRNA đi qua. 2.3.2. Ribosome của eukaryote Ribosome của eukaryote (80S) lớn hơn ribosome của prokaryote cũng bao gồm hai tiểu đơn vị: tiểu đơn vị nhỏ (40S) và tiểu đơn vị lớn (60S). - Tiểu đơn vị 40S chứa: 1 phân tử 18S rRNA (có 1900 nu) và 33 ribosomal protein. - Tiểu đơn vị 60S chứa: 3 phân tử rRNA (5S; 5,8S và 28S) và 49 ribosomal protein. Tó RNA polymerase. : - . - : ATP, CTP. 5’ - . Th . . E. coli . Sinh học phân tử 12
II. Protein (monome chung: COOH H2N CH R L- -amino acid amino acid, qu . (NH2 2 - L D- . của chúng. Những amino acid trung tính có một nhóm amine và một nhóm carboxyl. protein. L- - 20 L- - : Sinh học phân tử 13
- Amino acid t . Bao . - . Bao threonine. - . Bao - (-S-S-). - . Bao - . - . Bao . - Iminoacid. Proline. - . Bao . 2O. . . như sau (Hình 1.4): Sinh học phân tử 14
- 1. L ). . Lá phiến β (a) Cấu trúc sơ cấp (bậc 1) Xoắn α (b) Cấu trúc thứ cấp (bậc 2) (c) Cấu trúc bậc 3 (d) Cấu trúc bậc 4 Hình 1.4. Các mức độ tổ chức của phân tử protein - 2. L . Sinh học phân tử 15
( - - , cuộn xun . . - 3. L , l chuỗi polypeptide. . - 4. Là . Sinh học phân tử 16
. . Bảng 1.2. Các chức năng sinh học của protein và một số ví dụ Các nhóm chức năng Ví dụ Enzyme Ribonuclease Trypsin Phosphofructokinase Alcohol dehydrogenase Catalase Malic enzyme Protein điều khiển Insulin Somatotropin Thyrotropin lac repressor NF1 (nuclear factor 1) Catabolite activator protein (CAP) AP1 Sinh học phân tử 17
Protein vận chuyển Hemoglobin Serum albumin Glucose transporter Protein dự trữ Ovalbumin Casein Zein Phaseolin Ferritin Protein vận động và co rút Actin Myosin Tubulin Dynelin Kinesin Protein cấu trúc -Keratin Collagen Elastin Fibroin Proteoglycans Protein cấu trúc tạm thời Grb 2 (scaffold protein) crk shc stat IRS-1 Protein bảo vệ Immunoglobulins Thrombin Fibrinogen Antifreeze proteins Snake and bee venom proteins Diphtheria toxin Ricin Protein lạ/ngoại lai Monellin (exotic protein) Resilin Glue proteins Sinh học phân tử 18
1016 . , tu disulfite ). . 2 albumin. 1.5). Sinh học phân tử 19
. (a) (b) Bên ngoài Bên trong Hemoglobin Hb(O2)4 (Hb) 4O2 Glucose Phổi Vận chuyển glucose (một protein màng) Tuần hoàn tĩnh mạch Màng tế bào Tuần hoàn động mạch Tim Mô 4O2 Hemoglobin Hb(O2)4 (Hb) Hình 1.5. Hai kiểu vận chuyển cơ bản. (a): vận chuyển bên trong hoặc giữa các tế bào hoặc mô. (b): vận chuyển vào hoặc ra khỏi tế bào. Sinh học phân tử 20
. ). . Chẳng hạn: - . Fibroin ( - . . : ( -glutamyl-cysteinyl)n-glycine đ . Sinh học phân tử 21
109 nguyên. Trong cơ . . 0oC. 2.8. Protein lạ/ngoại lai . . III. Lipid . Sinh học phân tử 22
đôi. a NH2 NH2 Vị trí kết hợp với kháng nguyên H2N NH2 HOOC COOH Vị trí kết hợp với cytophage HOOC COOH NH NH 2 2 b H2N NH2 Kháng nguyên c Kháng thể Hình 1.6. Sơ đồ biểu diễn của kháng thể và kháng nguyên. a: kháng thể gồm 4 chuỗi polypeptide. b: kháng thể kết hợp với kháng nguyên. c: kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể. 1.7) . Sinh học phân tử 23
1.3. CH3(CH2)10 COOH Lauric CH3(CH2)14 COOH Palmitic CH3(CH2)7CH=CH (CH2)7 COOH Oleic CH3(CH2)4 CH= CH- CH2 CH= CH (CH2)7 COOH Linoleic Protein ngoại biên Oligosaccharide Glycoprotein Glycolipid Protein xuyên màng Hai lớp phospholipid Lớp tách rời Lõi kỵ nước kỵ Lõi Phospholipid Protein Gốc acid béo kỵ nước ưa nước Protein xuyên màng Đầu ưa nước Protein ngoại biên Glycoprotein Phân tử lưỡ ng Hình 1.7. Sơ đồ biểu diễn một đoạn cắttính của màng sinh học IV. Polysaccharide a C1 . Sinh học phân tử 24
. nucleic nucleic acid hay . Tài liệu tham khảo/đọc thêm 1. Hồ Huỳnh Thùy Dương. 1998. Sinh học phân tử. NXB Giáo dục, Hà Nội. 2. Alberts B, Bray D, Lewis J, Raff M, Roberts K and Watson JD. 2002. Molecular Biology of the Cell. 3rd ed. Garland Publishing, Inc. New York, USA. 3. Lewin B. 2000. Gene VII. Oxford University Press, Oxford, UK. 4. Lodish H, Berk A, Matsudaira P, Kaiser CA, Krieger M, Scott MP, Zipursky SL and Darnell J. 2004. Molecular Cell Biology. 5th ed. WH Freeman and Company, New York, USA. 5. Watson JD, Baker TA, Bell SP, Gann A, Levine M and Loscik R. 2004. Molecular Biology of the Gene. The Benjamin Cummings/Cold Spring Habor Laboratory Press, San Francisco, CA, USA. 6. Weaver RF. 2003. Molecular Biology. 2nd ed. McGraw-Hill Company Inc. New York, USA. Sinh học phân tử 25
Chương 2 Cấu trúc genome Genome (hệ gen, bộ gen) là thuật ngữ được dùng với các nghĩa khác nhau như sau: - Nguyên liệu di truyền của một cơ thể: 1) nhiễm sắc thể trong tế bào vi khuẩn (hoặc một trong mỗi loại nhiễm sắc thể nếu hơn một loại có mặt, ví dụ: các nhiễm sắc thể lớn hoặc bé của Vibrio cholerae), 2) DNA hoặc RNA trong một virion, 3) nhiễm sắc thể cùng với mọi plasmid được kết hợp (ví dụ: nhiễm sắc thể và hai plasmid nhỏ trong vi khuẩn Buchnera). - Tất cả các gen (khác nhau) trong tế bào hoặc virion. - Bộ nhiễm sắc thể đơn bội hoặc genome đơn bội trong tế bào. Chuỗi genome hoàn chỉnh (nghĩa là trình tự hoàn chỉnh của các nucleotide trong genome) đã được công bố cho một số loài vi khuẩn. Các trình tự khác cũng đã được công bố, ví dụ genome của cây cúc dại (Arabidopsis thaliana) và genome người. Genome chứa toàn bộ thông tin di truyền và các chương trình cần thiết cho cơ thể hoạt động. Ở các sinh vật nhân thật (eukaryote), 99% genome nằm trong nhân tế bào và phần còn lại nằm trong một số cơ quan tử như ty thể và lạp thể. Đa số genome vi khuẩn và phần genome chứa trong các cơ quan tử thường có kích thước nhỏ và ở dạng vòng khép kín. Ngược lại, phần genome trong nhân thường rất lớn và phân bố trên các nhiễm sắc thể dạng thẳng. Dự án genome là dự án xác định cấu trúc di truyền chính xác của một genome cơ thể sống, nghĩa là trình tự DNA của tất cả các gen của nó. Dự án genome của một số sinh vật mô hình (model organisms) đã được hoàn thành như sau: - Các genome vi khuẩn. Các trình tự hoàn chỉnh của genome Escherichia coli đã được xác định theo phương thức tổ hợp/tập hợp (consortium) của các phòng thí nghiệm. Năm 1995, hai trình tự genome hoàn chỉnh của vi khuẩn Haemophilus influenzae và Mycoplasma genitalium cũng được hoàn thành. Loài M. genitalium có một genome đơn Sinh học phân tử 26
giản (khoảng 580.067 base), do nó dựa vào vật chủ để vận hành nhiều bộ máy trao đổi chất của mình. Loài H. influenzae là một vi khuẩn đặc trưng hơn, và có genome khoảng 1.830.121 base với 1.749 gen. - Chuỗi genome hoàn chỉnh của nấm men Saccharomyces cerevisiae đã được hoàn chỉnh trong năm 1996, nhờ một consortium của các phòng thí nghiệm. Genome của chúng dài 12.146.000 base. - Các dự án genome ở động vật như: chuột, cừu, lợn, giun tròn (Caenorhabditis elegans), ruồi giấm (Drosophila melanogaster) , hoặc ở thực vật như: lúa nước, lúa mì, ngô, táo, cúc dại , mà nổi bật nhất trong số đó là dự án genome người cũng đã được thực hiện. Ngày 12. 2. 2001 genome người đã được công bố với khoảng 30.000 gen, ít hơn nhiều so với dự kiến trước đây (hàng trăm ngàn gen), và chỉ gấp hai lần giun tròn hoặc ruồi giấm. Người ta đã xác định hệ gen người giống 98% so với tinh tinh và có đến 99% là giống nhau giữa các dân tộc, các cá thể. Do đó, vấn đề hình thành và phát triển nhân cách, chỉ số thông minh phải chủ yếu trên cơ sở xã hội và sự rèn luyện của từng người để phát triển tiềm năng sinh học của bản thân. Trình tự genome của những sinh vật mô hình rất có ý nghĩa trong những nghiên cứu của một chuyên ngành khoa học mới đó là genome học (genomics). Dựa vào đây, các nhà sinh học phân tử có thể phân tích cấu trúc, hoạt động và chức năng của các gen, làm sáng tỏ được vai trò của DNA lặp lại, DNA không chứa mã di truyền, DNA nằm giữa các gen Điều đặc biệt có ý nghĩa là khi so sánh các genome với nhau, có thể hiểu được hoạt động của genome trong các cơ thể sống, mối quan hệ giữa chúng, sự đa dạng sinh học và mức độ tiến hóa. Kết quả bước đầu so sánh genome giữa các loài sinh vật với nhau đã cho thấy có ba đặc điểm nổi bật: 1) các gen phân bố trong genome không theo qui luật, 2) kích thước của genome thay đổi không tỷ lệ thuận (tương quan) với tính phức tạp của loài, 3) số lượng nhiễm sắc thể cũng rất khác nhau ngay giữa những loài rất gần nhau. I. Thành phần và đặc điểm của genome Genome chứa mọi thông tin di truyền đặc trưng cho từng loài, thậm chí cho từng cá thể trong loài. Genome có thể bao gồm các phân tử DNA Sinh học phân tử 27
hoặc RNA. Đối với sinh vật bậc cao, kích thước genome thay đổi từ 109 bp (động vật có vú) đến 1011 bp (thực vật). Khác với tế bào tiền nhân (prokaryote), các gen trong genome của eukaryote thường tồn tại nhiều bản sao và thường bị gián đoạn bởi các đoạn mã mù không mang thông tin di truyền (các intron). Vì vậy, một trong những vấn đề đang được quan tâm là cần phải biết số lượng các gen khác nhau có mặt trong genome cũng như số lượng các gen hoạt động trong từng loại mô, từng giai đoạn phát triển và tỷ lệ các gen so với kích thước genome 1. Genome của cơ quan tử Hầu hết genome của cơ quan tử, nhưng không phải luôn luôn, có dạng phân tử DNA mạch vòng đơn của một chuỗi duy nhất. Genome của cơ quan tử mã hóa cho một số, không phải tất cả, các protein được tìm thấy trong cơ quan tử. Do có nhiều cơ quan tử trong một tế bào, cho nên có nhiều genome của cơ quan tử trên một tế bào. Mặc dù bản thân genome của cơ quan tử là duy nhất. Nhưng nó cấu tạo gồm một chuỗi lặp lại1 liên quan với mọi chuỗi không lặp lại2 của nhân. Về nguyên tắc, các gen cơ quan tử được phiên mã và dịch mã bởi các cơ quan tử. 1.1. Genome của ty thể DNA ty thể (mitochondrial DNA-mtDNA) là một genome độc lập, thường là mạch vòng, được định vị trong ty thể. - DNA ty thể của tế bào động vật mã hóa đặc trưng cho 13 protein, 2 rRNA và 22 tRNA. - DNA ty thể của nấm men S. cerevisiae dài hơn mtDNA của tế bào động vật năm lần do sự có mặt của các đoạn intron dài. Các genome ty thể có kích thước tổng số rất khác nhau, các tế bào động vật có kích thước genome nhỏ (khoảng 16,5 kb ở động vật có vú) (Hình 2.1). Có khoảng một vài trăm ty thể trên một tế bào. Mỗi ty thể có 1 DNA lặp lại mô tả các chuỗi hiện diện hơn một bản sao trong mỗi genome. 2 DNA không lặp lại chứa các chuỗi duy nhất: chỉ có một bản sao trong genome đơn bội. Sinh học phân tử 28
nhiều bản sao DNA. Số lượng tổng số của DNA ty thể so với DNA nhân là rất nhỏ (<1%). Trong nấm men S. cerevisiae, genome ty thể có kích thước khá lớn (khoảng 80 kb) và khác nhau tùy thuộc vào từng chủng. Có khoảng 22 ty thể trên một tế bào, tương ứng khoảng 4 genome trên một cơ quan tử. Ở những tế bào sinh trưởng, tỷ lệ mtDNA có thể cao hơn (khoảng 18%). Kích thước của genome ty thể ở các loài thực vật là rất khác nhau, tối thiểu khoảng 100 kb. Kích thước lớn của genome đã gây khó khăn cho việc phân lập nguyên vẹn DNA, nhưng bản đồ cắt hạn chế (restriction map) trong một vài loài thực vật đã cho thấy genome ty thể thường là một chuỗi đơn, được cấu tạo như một mạch vòng. Trong mạch vòng này có những chuỗi tương đồng ngắn và sự tái tổ hợp giữa chúng đã sinh ra các phân tử tiểu genome (subgenome) mạch vòng nhỏ hơn, cùng tồn tại với genome “chủ” (master genome) hoàn chỉnh, đã giải thích cho sự phức tạp của các DNA ty thể ở thực vật. Cyt b D-loop ND5 ND6 12S rRNA 16S rRNA 16,6 kb ND4 ND1 ND4L ATPase 6 ND3 ND2 CO3 ATPase 8 CO2 CO1 Các gen tRNA Các vùng mã hóa Hướng của gen, 5’ đến 3’ CO: cytochrome oxidase ND: NADH dehydrogenase Hình 2.1. DNA ty thể của người. Bao gồm 22 gen tRNA, 2 gen rRNA, và 13 vùng mã hóa protein. Sinh học phân tử 29
Bảng 2.1 tóm tắt sự phân công của các gen trong một số genome ty thể. Tổng số gen mã hóa protein là khá ít, và không tương quan với kích thước của genome. Ty thể động vật có vú sử dụng các genome 16 kb của chúng để mã hóa cho 13 protein, trong khi đó ty thể nấm men S. cerevisiae dùng các genome từ 60-80 kb mã hóa cho khoảng 8 protein. Thực vật với genome ty thể lớn hơn nhiều mã hóa cho nhiều protein hơn. Các intron được tìm thấy trong hầu hết các genome của ty thể, nhưng lại không có trong các genome rất nhỏ của động vật có vú. Hai rRNA chính luôn được mã hóa bởi genome ty thể. Số lượng các tRNA được mã hóa bởi genome ty thể dao động từ không cho đến đầy đủ (25-26 trong ty thể). Nhiều protein ribosome được mã hóa trong genome ty thể của thực vật và sinh vật nguyên sinh, nhưng chỉ có một ít hoặc không có trong genome của nấm và động vật. Bảng 2.1. Các genome ty thể có các gen mã hóa cho các protein, rRNA và tRNA Ty thể mã hóa cho các RNA và protein Loài Kích thước Các gen mã Các gen mã (kb) hóa protein hóa RNA Nấm 19-100 8-14 10-28 Sinh vật nguyên sinh 6-100 3-62 2-29 Thực vật 186-366 27-34 21-30 Động vật 16-17 13 4-24 1.2. Genome của lạp thể DNA lạp thể (chloroplast DNA-ctDNA) cũng là một DNA genome độc lập, thường là mạch vòng, được tìm thấy trong lạp thể của thực vật. - Genome của lạp thể rất khác nhau về kích thước, nhưng đủ lớn để mã hóa cho khoảng 50-100 protein cũng như rRNA và tRNA. Sinh học phân tử 30
- DNA lạp thể dài từ 120-190 kb. Các genome của lạp thể đã được phân tích trình tự cho thấy có khoảng 87-183 gen. Bảng 2.2 mô tả các chức năng được mã hóa bởi genome lạp thể ở cây trồng. Bảng 2.2. Genome của lạp thể ở các cây trồng mã hóa cho 4 rRNA, 30 tRNA và khoảng 60 protein Các lạp thể có hơn 100 gen Các gen - Mã hóa RNA 16S rRNA 23S rRNA 4,5S rRNA 5S rRNA tRNA - Biểu hiện gen Các r-protein RNA polymerase Khác - Các chức năng của lạp thể Rubisco và thylakoids NADH dehydrogenase Nói chung, các đặc điểm của genome lạp thể tương tự ở ty thể, ngoại trừ lạp thể mang nhiều gen hơn. Genome lạp thể mã hóa cho tất cả các loại rRNA và tRNA cần thiết trong tổng hợp protein, và cho khoảng 50 protein, bao gồm cả RNA polymerase và các protein ribosome. Các intron trong lạp thể được chia thành hai nhóm: 1) những intron ở trên các gen tRNA thường (mặc dù không chắc chắn) được định vị trong vòng anticodon, giống như các intron được tìm thấy trong các gen tRNA Sinh học phân tử 31
của nhân nấm men S. cerevisiae; 2) những intron trong các gen mã hóa protein tương tự với các intron của các gen ty thể. Vai trò của lạp thể là thực hiện quá trình quang hợp. Do đó, nhiều gen của nó mã hóa cho các protein của các phức hợp định vị trong các màng thylakoid. Một vài phức hợp protein của lạp thể giống các phức hợp protein của ty thể: có một số tiểu đơn vị được mã hóa bởi genome của cơ quan tử và một số khác được mã hóa bởi genome của nhân. Nhưng các phức hợp còn lại được mã hóa hoàn toàn bởi genome lạp thể. 2. Động học của phản ứng lai DNA Bản chất chung của eukaryotic genome được phản ánh qua động học của sự tái liên kết các DNA (DNA reassociation kinetics) bị biến tính. Sự tái liên kết giữa các chuỗi DNA bổ sung xảy ra nhờ bắt cặp base, ngược lại với quá trình biến tính (denaturation) mà nhờ đó chúng được tách rời (Hình 2.2) để thực hiện sự tái bản hoặc phiên mã. Động học của phản ứng tái liên kết phản ánh sự khác nhau của các chuỗi hiện diện, vì thế phản ứng này có thể được dùng để định lượng các gen và các sản phẩm RNA của chúng. DNA sợi đôi Biến tính DNA sợi đơn Hồi tính DNA được hồi tính Hình 2.2. DNA có thể biến tính và hồi tính Sinh học phân tử 32
Bảng 2.3 mô tả phản ứng tái liên kết. Sự hồi tính của DNA (renaturation) phụ thuộc vào sự va chạm ngẫu nhiên của các chuỗi bổ sung. Phản ứng của các DNA riêng biệt có thể được mô tả bằng các điều kiện cần thiết cho sự hoàn thành một nửa (half-completion). Đây là tích số của C0 t1/2 và được gọi là C0t1/2. Giá trị này tỷ lệ nghịch với hằng số tốc độ. Do C0t1/2 là tích số của nồng độ và thời gian yêu cầu cho một nửa đường, nên một giá trị C0t1/2 lớn hơn dẫn đến một phản ứng chậm hơn. Bảng 2.3. Một phản ứng tái liên kết của DNA được mô tả bởi C0t1/2 Phản ứng lai phụ thuộc vào C0t Tốc độ phản ứng Phản ứng theo phương trình bậc hai dC kC2 dt C là nồng độ của DNA sợi đơn ở thời điểm t. K là hằng số tốc độ tái liên kết. Tiến độ phản ứng Lấy tích phân phương trình tốc độ giữa các giới hạn: nồng độ ban đầu của DNA = C0 ở thời điểm t = 0; nồng độ duy trì sợi đơn = C sau thời gian t C 1 C0 1 k.C0 t Thông số tới hạn là C0t1/2 Khi phản ứng hoàn thành một nửa ở thời điểm t = ½ C 1 1 C0 2 1 k.C0 t1/2 1 Vì thế C0t1/2 = C t 0 1/2 k Sinh học phân tử 33
Sự hồi tính của DNA thường có dạng đường cong C0t, đường cong biểu diễn đồ thị phân số của DNA được tái liên kết (1-C/C0) theo log của C0t. Hình 2.3 trình bày đường cong C0t của một số genome đơn giản. Các đường cong có dạng tương tự nhau, nhưng giá trị C0t1/2 của mỗi đường là khác nhau. Các genome trong hình 2.3 đại diện cho các nguồn DNA khác nhau (PolyU:PolyA, thực khuẩn thể MS2, thực khuẩn thể T4 và vi khuẩn E. coli). C0t1/2 liên quan trực tiếp với lượng DNA trong genome. Điều này phản ánh tình trạng khi genome trở nên phức tạp hơn, thì sẽ có thêm một số bản sao của một vài chuỗi đặc biệt trong một lượng DNA có trước. Ví dụ: nếu C0 của DNA là 12 pg, thì nó sẽ chứa khoảng 3.000 bản sao của mỗi trình tự trong genome vi khuẩn. Hình 2.3. C0t1/2 phụ thuộc vào độ phức tạp của genome. PolyU:PolyA, thực khuẩn thể MS2, thực khuẩn thể T4 và vi khuẩn E. coli. 3. Kích thước của genome Không phải tất cả các đoạn DNA trong genome đều tương ứng với các gen (mã hóa cho protein hoặc một sản phẩm cần thiết cho hoạt động sống của tế bào). Từ những năm 1970, bằng các thí nghiệm gây bão hòa đột biến người ta đã có thể xác định được số gen nằm trên một đoạn nhiễm sắc thể. Ngày nay, nhờ các kỹ thuật phân tích DNA và RNA hiện đại (Southern blot, Northern blot, microarray ) các nhà khoa học có thể xác định số gen hoạt Sinh học phân tử 34
động trong một tế bào. Ví dụ: ở tế bào nấm men S. cerevisiae (sinh vật eukaryote bậc thấp) có khoảng 4.000 gen hoạt động, còn tế bào động vật có vú khoảng 10.000-15.000 gen. Như vậy, nếu độ dài trung bình của một gen khoảng 10 kb thì tổng số chiều dài các gen hoạt động trong một tế bào cũng chỉ chiếm 1-2% genome. Hay nói cách khác, chỉ một phần rất nhỏ genome mang thông tin di truyền cần thiết cho hoạt động sống của tế bào. Vậy phần genome còn lại có vai trò gì, và tính phức tạp của loài có liên quan gì với kích thước genome hay không? Để làm sáng tỏ vấn đề trên, chúng ta cần xem xét kích thước genome của một số loài gần nhau trong bậc thang tiến hóa (có độ phức tạp loài tương tự nhau) cũng như genome của những loài xa nhau (có tính phức tạp khác nhau). Chẳng hạn: - Genome của người có kích thước khoảng 3,3 109 bp, trong khi đó genome của những loài lưỡng cư dài khoảng 3,1 109 bp hoặc thực vật có thể lên đến 1011 bp. Như vậy, có phải là các loài lưỡng cư có tính phức tạp tương tự cơ thể chúng ta? - Hay là ngay trong cùng một loại, chúng ta cũng nhận thấy có sự mâu thuẫn về kích thước genome? Ví dụ: ruồi nhà (Musca domestica) có genome khoảng 8,6 108 bp, lớn gấp sáu lần kích thước genome của ruồi giấm khoảng 1,4 108bp. Ngoài ra, trong các loài lưỡng cư kích thước genome của chúng cũng thay đổi khá lớn từ 109-1011 bp. Vì sao ngay trong cùng một loại mà kích thước genome lại biến thiên nhiều như vậy, có phải ruồi nhà có cấu tạo phức tạp hơn nhiều so với ruồi giấm? Từ những dữ liệu trên, chúng ta có thể nhận định rằng tính phức tạp của loài không liên quan đến kích thước của genome. Tuy nhiên, vai trò của phần genome còn lại (phần không mã hóa) đến nay vẫn chưa được biết nhiều. 4. Tổng số gen được biết ở một số loài eukaryote Có 6.000 gen ở nấm men S. cerevisiae, 18.500 gen ở giun tròn, 13.600 gen ở ruồi giấm, 25.000 gen ở Arabidopsis, và có khả năng 30.000 gen ở chuột và < 30.000 gen ở người. Như chúng ta đã biết, mối quan hệ giữa kích thước genome và số lượng gen đã không còn nữa. Genome của các sinh vật eukaryote đơn bào Sinh học phân tử 35
có cùng phạm vi kích thước với genome của vi khuẩn lớn nhất. Các eukaryote bậc cao có nhiều gen hơn, nhưng số lượng không tương quan với kích thước genome. Hình 2.4 cho thấy genome của loài nấm men S. cerevisiae dài 13.500 kb và loài nấm men S. pombe là 12.500 kb, có khoảng 6.000 gen và 5.000 gen tương ứng. Khung đọc mở trung bình khoảng 1,4 kb, vì thế khoảng 70% genome được chiếm giữ bởi các vùng mã hóa. Sự khác nhau chủ yếu giữa chúng là chỉ 5% gen của S. cerevisiae có intron, so với 43% của S. pombe. Genome của giun tròn có khoảng 18.500 gen. Mặc dù genome của ruồi giấm lớn hơn genome của giun tròn, nhưng chúng lại có số gen ít hơn. Đến nay, chúng ta chưa hiểu tại sao ruồi giấm-một cơ thể phức tạp hơn nhiều-chỉ có 70% số gen so với giun tròn. Điều này đã cho thấy không có một mối quan hệ chính xác giữa số gen và tính phức tạp của cơ quan. Hình 2.4. Số lượng gen của sinh vật eukaryote rất khác nhau. Thay đổi từ 6.000-40.000 nhưng không tương quan với kích thước genome hoặc độ phức tạp của cơ thể. Cây Arabidopsis có kích thước genome trung gian giữa giun tròn và ruồi giấm, nhưng lại có số gen lớn hơn cả hai (25.000). Điều này một lần nữa cho thấy không có một quan hệ rõ ràng, và cũng nhấn mạnh nét đặc biệt Sinh học phân tử 36
của thực vật, là có thể có nhiều gen hơn (do sự nhân đôi của ông bà tổ tiên truyền lại) các tế bào động vật. Đa số genome Arabidopsis được tìm thấy trong các đoạn được nhân đôi, gợi ý rằng có một sự nhân đôi xa xưa trong genome (tạo ra một dạng tứ bội). Chỉ 35% các gen của Arabidopsis hiện diện như các bản sao đơn. Genome của lúa lớn hơn Arabidopsis khoảng 4 lần, nhưng số gen chỉ lớn hơn khoảng 50%, có khả năng khoảng 40.000 gen. DNA lặp lại chiếm khoảng 42-45% genome. Hơn 80% gen tìm thấy trong Arabidopsis được hiện diện trong lúa. Trong số những gen chung này, khoảng 8.000 có trong Arabidopsis và lúa nhưng không thấy ở bất kỳ genome động vật hoặc vi khuẩn nào (những gen đã được phân tích trình tự). Có khả năng đây là tập hợp các gen mã hóa cho các chức năng đặc trưng của thực vật, chẳng hạn như quang hợp. II. Tính phức tạp của genome Kết quả nghiên cứu động học của các phản ứng lai được tiến hành giữa genomic DNA với cDNA (complementary DNA-DNA bổ sung), giữa DNA với mRNA cho thấy hầu hết các gen hoạt động đều nằm trong thành phần DNA không lặp lại. Như vậy, thành phần này có ý nghĩa rất quan trọng trong việc đánh giá tính phức tạp của genome. Hay nói cách khác, dựa vào thành phần DNA không lặp lại có thể biết được kích thước genome cũng như mức độ tiến hóa của loài. Nếu như kích thước genome (ở trạng thái đơn bội) được coi là một thông số động học (ký hiệu C), thì giá trị này đặc trưng cho từng loài và không phải luôn luôn tỷ lệ thuận với tính phức tạp của loài. Ngược lại, giá trị C phản ánh các đặc điểm sau: - Số lượng DNA mã hóa cho các sản phẩm cần thiết đối với hoạt động sống của cơ thể rất nhỏ so với số lượng DNA có trong genome. - Có sự biến đổi rất lớn của giá trị C giữa một số loài mà tính phức tạp của chúng không khác nhau nhiều. Genome vi khuẩn được xem là chỉ chứa các đoạn DNA không lặp lại và các gen thường tồn tại bản sao đơn. Ngược lại, genome của eukaryote thường chứa các gen có hai hoặc nhiều bản sao. Hơn nữa, trình tự nucleotide của các bản sao này có thể không giống nhau hoàn toàn mặc dù sản phẩm protein mà chúng mã hóa có cùng một chức năng. Các bản sao tương đồng của một gen được xếp chung vào một nhóm gọi là một họ gen Sinh học phân tử 37
(gene family). Như vậy, ngoài các gen có một bản sao giống như ở vi khuẩn, genome của eukaryote còn chứa các họ gen. Hầu hết các gen mã hóa cho protein đã được phân lập đều nằm trong các họ gen khác nhau. Các gen trong một họ thường hoạt động theo thời gian và không gian. Điều đó có nghĩa, mỗi thành viên trong họ thường hoạt động ở một thời điểm nhất định trong quá trình hình thành và phát triển cá thể hoặc hoạt động trong các mô chuyên biệt. Khi một thành viên trong họ bị đột biến (bất hoạt) thì thành viên khác có thể hoạt động thay thế. Khái niệm về gen được hình thành khi các nhà di truyền học cổ điển nghiên cứu biểu hiện các tính trạng mới do gây đột biến DNA của genome vi khuẩn hay thực khuẩn thể (bacteriophage). Một gen được xem là một đoạn DNA mà bất cứ đột biến nào xảy ra trên đó đều dẫn đến xuất hiện tính trạng mới. Điều này dễ hiểu đối với những genome chỉ chứa các gen có một bản sao (như genome của prokaryote). Tuy nhiên, ở genome của eukaryote, khi có nhiều gen cùng qui định một tính trạng hoặc các gen tương đồng trong một họ có thể hoạt động hỗ trợ thay thế nhau thì đột biến trên một gen không phải lúc nào cũng quan sát được ở mức độ phenotype. Mặt khác, các đoạn DNA tương ứng với trình tự mã hóa (coding sequence, exon) cho một protein thường bị ngắt quãng bởi các đoạn DNA không chứa thông tin di truyền (non-coding sequence, intervening sequence, intron). Các intron được phiên mã cùng với các exon sang phân tử RNA gọi là phân tử tiền thân mRNA (pre-mature mRNA hay pre-mRNA) nhưng sau đó chúng bị loại bỏ và các exon được nối lại với nhau tạo thành phân tử mRNA hoàn chỉnh (mature mRNA hay mRNA) được dùng cho quá trình sinh tổng hợp protein. Quá trình cắt các intron, nối exon không tuân theo một trật tự bắt buộc mà biến hóa đa dạng tạo ra các phân tử mRNA khác nhau từ một phân tử pre- mRNA (Hình 2.5). Bên cạnh mRNA, các phân tử rRNA và tRNA cũng được hình thành từ các phân tử tiền thân chứa intron. Ngoài ra, còn có hiện tượng mã di truyền của gen này nằm xen kẽ với các mã di truyền của gen khác (các gen nằm gối lên nhau-overlapping) hoặc trường hợp dịch chuyển khung đọc ngay trên một đoạn DNA. Chúng ta đã biết đến chức năng của các phân tử RNA trong hoạt động sống của tế bào. Bên cạnh ba loại RNA đã được nghiên cứu khá kỹ (mRNA, rRNA và tRNA), vai trò của một số loại RNA khác mới được phát hiện vào những năm cuối thế kỷ 20. Chúng kiểm soát sự hoạt động của gen (hiện Sinh học phân tử 38
tượng bất hoạt gen-gene silencing), tham gia phản ứng đọc sửa thông tin di truyền trên phân tử mRNA (hiện tượng RNA editing) hay quyết định tính bền vững của mRNA (các ribonuclease) Thậm chí có những phân tử pre- mRNA được tổng hợp không phải mã hóa cho protein mà với mục đích phân cắt tạo ra những phân tử RNA có kích thước nhỏ hơn tham gia quá trình kiểm soát hoạt động của các gen khác. Đột biến ở những đoạn DNA mã hóa cho tất cả các loại RNA này thường gắn liền với việc xuất hiện tính trạng mới. Do đó, cần xem xét các đoạn nucleotide đó như các gen mặc dù chúng không mã hóa cho protein. Trình tự mã hóa RNA DNA Promoter Terminator PHIÊN MÃ Mũ Đuôi Poly(A) Exon Intron Exon Intron Exon Pre -mRNA 5’ AAAAAAA 3’ Trình tự chỉ huy Đoạn kéo dài Hoàn chỉnh RNA: loại bỏ intron Trình tự mã hóa protein mRNA 5’ AAAAAAAA 3’ DỊCH MÃ Polypeptide Hình 2.5. Các gen bị gián đoạn được biểu hiện thông qua RNA tiền thân. Các intron được loại bỏ, trong khi đó các exon được nối lại với nhau. mRNA chỉ có các trình tự của exon được dịch mã thành chuỗi polypeptide. Ngày nay, theo quan điểm của sinh học phân tử, một gen được xem là một đoạn DNA mã hóa cho một sản phẩm cần thiết đối với hoạt động sống Sinh học phân tử 39
của tế bào. Rõ ràng rằng không phải chỉ có DNA mã hóa cho protein mà cả các DNA mã hóa cho rRNA, tRNA và các loại RNA khác tham gia vào những phương thức kiểm soát hoạt động của genome cũng được xác định là gen. III. Thay đổi trật tự của các đoạn DNA trong genome-Transposon 1. Sự thay đổi trật tự của các đoạn DNA trong genome Như đã biết kích thước và cấu trúc genome của các loài rất khác nhau. Nguyên nhân của sự đa dạng này là do: 1) trao đổi chéo giữa các cặp nhiễm sắc thể tương đồng xảy ra trong phân bào giảm nhiễm đã dẫn đến sự đa dạng trong loài; 2) trong genome trật tự các đoạn DNA cũng như cấu trúc các gen được sắp xếp lại, đặc trưng cho từng cá thể. Chính các yếu tố di truyền có khả năng di chuyển giữa các vị trí trong một genome hoặc giữa các genome khác nhau đã góp phần làm đa dạng di truyền giữa các cá thể trong loài. Các yếu tố di truyền có khả năng di chuyển được xếp vào ba nhóm chính tùy thuộc vào tính độc lập của chúng: - Nhóm thứ nhất gồm các yếu tố có khả năng di chuyển giữa các vị trí khác nhau trong genome. - Nhóm thứ hai gồm các yếu tố có khả năng ghép vào và tách ra khỏi genome để tồn tại độc lập trong tế bào (các episome như plasmid F, bacteriophage). - Nhóm thứ ba chỉ di chuyển dưới sự kiểm soát của tế bào ở những giai đoạn sinh trưởng phát triển nhất định để sắp xếp khởi động một số gen đặc biệt (hình thành cassette hoạt động ở nấm men S. cerevisiae, ký sinh trùng đơn bào Trypanosome). Sự di chuyển của các yếu tố ở nhóm thứ hai và thứ ba liên quan tới tái tổ hợp tương đồng hoặc tái tổ hợp ở các vị trí đặc hiệu. Mặc dù không có khả năng tồn tại độc lập bên ngoài genome, nhóm thứ nhất tự kiểm soát sự di chuyển của chúng trong genome và không đòi hỏi sự tương đồng giữa chúng với vị trí ghép vào. Do đó, có thể nói chúng di chuyển một cách tự do trong genome và được gọi tên chung là các yếu tố di chuyển (transposable elements, transposons). Trong khi thực khuẩn thể được xem là episome, Sinh học phân tử 40
thì thực khuẩn thể Mu và một số retrovirus ở eukaryote được xem là transposable elements. 2. Các transposon Các yếu tố di chuyển có thể được chia làm hai loại dựa vào cách thức di chuyển của chúng: - Loại thứ nhất được gọi là retroelement, chúng phải trải qua hình thức trung gian RNA trong quá trình di chuyển (RNA genome được sao chép nhờ reverse transcriptase tạo ra cDNA để ghép vào vị trí mới) (Hình 2.6). - Loại thứ hai là các đoạn DNA hoặc bị tách ra hoặc được tái bản tạo thêm bản sao để ghép vào vị trí mới. Thông thường, loại thứ hai này được gọi là transposon. Bản sao mới DNA của genome Retroelement của retroelement (1) Phiên mã (2) Dịch mã (5) Xen đoạn của RNA retroelement DNA (3) Phiên mã ngược RNA thành DNA Reverse transcriptase (4) Tổng hợp sợi DNA thứ hai Hình 2.6. Retroelement ( . Ở sinh vật eukaryote, các transposon còn được gọi là yếu tố kiểm soát (controlling elements). . Ở cây ngô, ngư Sinh học phân tử 41
. Khi di chuyển, các transposon gây ra việc sắp xếp và tổ chức lại genome của từng cá thể như tạo các đoạn DNA mới ở vị trí chúng ghép vào và tách ra. Chúng có thể di chuyển tới vị trí bất kỳ và hoàn toàn không cần một mối quan hệ nào giữa hai vị trí mới và cũ. Khi tách ra transposon có thể mang theo các đoạn DNA bên cạnh, gây ra sự mất đoạn tại vị trí cũ. Ngược lại, khi ghép vào vị trí mới, chúng gây ra hiện tượng thêm đoạn hoặc chuyển đoạn ở vị trí mới. Do đó, transposon giống như các vector chuyên chở DNA từ nơi này sang nơi khác trong một genome hoặc từ genome này sang genome khác. Ngoài ra, trao đổi chéo giữa các transposon tương đồng ở hai vị trí khác nhau trên một hoặc trên hai nhiễm sắc thể cũng tạo ra những biến đổi tương tự. Những biến đổi đó dẫn đến việc sắp xếp lại genome, tạo ra tính đa dạng giữa chúng và tính đặc thù riêng của từng cá thể. Đặc biệt, sự thay đổi vị trí của các transposon còn có thể ảnh hưởng đến hoạt động của các gen phân bố xung quanh ngay khi chúng không làm thay đổi trật tự nucleotide ở những gen này. Tần số ghép của các transposon vào genome khoảng 10-5- 10-7 sau mỗi thế hệ. Ngược lại, tần số tách ra khoảng 10-6 đến 10-10. Các transposon có thể chia làm hai nhóm dựa vào khả năng di chuyển độc lập hay phải phụ thuộc vào sự có mặt của transposon khác: - Nhóm thứ nhất gồm các đoạn DNA có khả năng di chuyển độc lập. Chúng chứa gen mã hóa cho các protein điều khiển quá trình đó, ví dụ như enzyme nhận biết hai đầu transposon để tách chúng ra khỏi vị trí cũ và ghép vào vị trí mới. Do đó, quá trình này được thực hiện hoàn toàn độc lập. Nhờ khả năng này, chúng tạo ra các đột biến không bền vững. - Nhóm thứ hai gồm các transposon không có khả năng tự hoạt động, tức là chúng không có khả năng di chuyển do không mang đủ thông tin di truyền mã hóa cho các enzyme cần thiết. Vì vậy, các transposon loại này tạo ra những đột biến gen một cách tự phát nhưng là đột biến bền vững. Việc di chuyển của transposon ở nhóm này phụ thuộc vào sự có mặt của transposon có khả năng hoạt động độc lập cùng nhóm. Hai transposon có thể xếp vào cùng nhóm khi chúng có cấu trúc tương đồng nhau, đặc biệt là các đoạn Sinh học phân tử 42
oligonucleotide phân bố ở hai đầu transposon. Đây là vị trí để enzyme nhận biết và cắt nối transposon ở vị trí đi và đến. Các transposon đơn giản nhất ở vi khuẩn được gọi là IS (insertion sequences). Chúng có thể nằm trên chromosome hoặc trên các plasmid. Transposon vi khuẩn không giữ một chức năng nào trong tế bào. Trình tự nucleotide ở một đầu IS thường lặp lại nhưng ngược chiều so với đầu kia (inverted repeat). Ví dụ như GGTAT-Xn-ATACC. Do đó, khi sợi đôi IS tách thành hai sợi đơn thì mỗi sợi này có khả năng hình thành liên kết bổ sung tại hai đầu của IS tạo cấu trúc thân-quai/cán-thòng lọng (stem-loop). Transposon thường mã hóa cho các enzyme transposase làm nhiệm vụ nhận biết chuỗi nucleotide lặp lại ngược chiều (inverted repeat) để cắt transposon và di chuyển. Khi một IS được ghép vào vị trí bất kỳ của genome thì một đoạn ngắn DNA tại vị trí này được nhân đôi, tức là hai đầu của IS được chặn bởi các nucleotide giống nhau, sắp xếp theo cùng một chiều. Vì vậy, đoạn ngắn DNA này được gọi là “lặp lại xuôi chiều” (direct repeat). Chiều dài của chúng thường khoảng 9 bp (Hình 2.7). Dựa vào sự có mặt của các đoạn cùng chiều và ngược chiều có thể xác định được vị trí transposon ghép vào hoặc chuyển đi. Ngoài các IS, ở vi khuẩn còn có các đoạn DNA có khả năng di chuyển với kích thước dài hơn, gọi là Tn. Các Tn thường phân bố trên plasmid (phân tử DNA dạng vòng, kích thước thường không lớn) và có khả năng chèn vào bất kỳ vị trí nào trong genome. Chúng thường mang thông tin di truyền mã hóa cho các protein kháng kháng sinh. Giữa IS và Tn có mối quan hệ về trình tự các nucleotide. Các Tn thường được giới hạn ở hai đầu bởi một loại IS nào đó. Quá trình di chuyển của một transposon từ vị trí cũ (vị trí cho, donor) sang vị trí mới (vị trí nhận, recipient) xảy ra theo hai cơ chế khác nhau: - Cơ chế sao y bản chính (transposon có mặt ở cả hai vị trí). Theo cơ chế này, phiên bản sau khi được sao chép từ vị trí cho sẽ được ghép vào vị trí nhận. Như vậy, mỗi lần di chuyển thì số lượng bản sao được tăng lên. Quá trình này liên quan đến hai loại enzyme: transposase (tác động vào hai đầu bản gốc transposon) và resolvase (tác động lên bản sao). - Cơ chế tách ra khỏi vị trí cũ di chuyển đến vị trí mới. Theo cơ chế này, một transposon có thể tách ra khỏi vị trí cũ và ghép vào vị trí mới. Như vậy, số lượng transposon không thay đổi. Kiểu di chuyển này chỉ cần Sinh học phân tử 43
enzyme transposase. Khi transposon chuyển đi, vị trí cũ bị gãy và nó được nối lại nhờ cơ chế sửa chữa DNA trong tế bào. 123456789 987654321 123456789 987654321 Transposase gene ATGCA TACGT DNA chủ Vị trí đích DNA chủ ATGCA123456789 987654321ATGCA 987654321TACGT TACGT123456789 Lặp lại Lặp lại Transposon Lặp lại Lặp lại xuôi chiều ngược chiều ngược chiều xuôi chiều Chiều dài tổng số Chọn lọc đích IS1 9 bp 23 bp 768 bp ngẫu nhiên IS2 5 bp 41 bp 1327 bp các điểm nóng IS4 11-13 bp 18 bp 1428 bp AAAN20TTT IS5 4 bp 16 bp 1195 bp các điểm nóng IS10R 9 bp 22 bp 1329 bp NGCTNAGCN IS50R 9 bp 9 bp 1531 bp các điểm nóng IS903 9 bp 18 bp 1057 bp ngẫu nhiên Hình 2.7. Một transposon có đoạn lặp lại ngược chiều gồm 9 nucleotide (123456789) gắn vào vị trí có 5 nucleotide (ATGCA). Đoạn ngắn ATGCA có mặt ở cả hai đầu của IS và có trình tự nucleotide sắp xếp theo cùng một chiều. Khi transposon ghép vào vị trí mới, một đoạn nucleotide ngắn ở đó được sao thành hai bản, mỗi bản nằm ở một đầu của transposon (direct repeat). Tại vị trí nhận, mỗi sợi đơn DNA bị cắt lệch nhau vài nucleotide. Transposon nối vào các đầu cắt, tạo ra hai khoảng trống (gaps). Chúng được sửa chữa theo nguyên tắc tạo cặp bổ sung. Do đó, đoạn nucleotide nằm giữa hai vết cắt được sao chép thành hai bản, mỗi bản ở một đầu và trình tự sắp xếp các nucleotide giống nhau. Vì vậy, chúng được gọi là lặp lại xuôi chiều. Sinh học phân tử 44
IV. Tương tác của T-DNA với genome thực vật Sự di chuyển DNA từ genome vi khuẩn sang genome thực vật được nghiên cứu khá kỹ đối với tương tác giữa Argobacterium tumefaciens hoặc A. rhizogenes với hầu hết các cây hai lá mầm. Hiện tượng di chuyển DNA này gây những biến đổi về mặt di truyền, biểu hiện ở việc xuất hiện các khối u trên thân cây (A. tumefaciens) hoặc mọc rất nhiều rễ tơ (A. rhizogenes) tại nơi bị nhiễm vi khuẩn. A. tumefaciens A. rhizogenes thực vật. Tuy nhiên, sau đó bệnh được duy trì lại không phụ thuộc sự tồn tại của vi khuẩn. Đó là do một số gen của vi khuẩn đã được chuyển vào genome cây chủ và hoạt động gây bệnh. Các gen vi khuẩn có khả năng di chuyển và hoạt động trong tế bào thực vật nằm trên Ti-plasmid (tumor inducing plasmid) của A. tumefaciens hoặc trên Ri-plasmid (hairy-root inducing plasmid) của A. rhizogenes. Cũng như các khối u động vật, các tế bào thực vật có DNA vi khuẩn ghép vào genome bị chuyển sang trạng thái mới, ở đó sự phát triển và biệt hóa của chúng hoàn toàn khác với các tế bào bình thường. Đó là do hoạt động của các gen vi khuẩn trong genome của thực vật. Bình thường, những gen này có mặt trong genome vi khuẩn nhưng chúng chỉ được hoạt động (mở) sau khi hợp nhất vào genome thực vật và chịu sự kiểm soát của tế bào cây chủ. Quá trình này có tính chất đặc hiệu vật chủ, tức là một loại vi khuẩn chỉ có khả năng gây khối u trên một số loại cây chủ này mà không tương tác được với các loại cây khác. Việc tạo khối u hay thực hiện quá trình chuyển gen từ vi khuẩn sang genome thực vật dẫn đến biến đổi trạng thái sinh lý của tế bào thực vật đòi hỏi các điều kiện sau: - Phải có hoạt động của các gen trên ba vùng chvA, chvB, pscA nằm trên nhiễm sắc thể của vi khuẩn để khởi động việc bám dính vi khuẩn vào thân cây. - Ti-plasmid hoặc Ri-plasmid phải mang vùng vir (nằm ngoài vùng T-DNA). Vùng này mang các gen cần thiết cho việc tách và vận chuyển T-DNA sang tế bào thực vật. - Các gen trên vùng T-DNA của Ti-plasmid hoặc Ri-plasmid được ghép vào genome thực vật gây biến đổi trạng thái các tế bào này. Sinh học phân tử 45
1. Ti-plasmid và Ri-plasmid - . Agrobacterium mang các vùng T-DNA, vir (virulence region), gen chuyển hóa opine, và vùng ori khởi đầu sao chép trong tế bào vật chủ. Sự khác nhau giữa Ti-plasmid và Ri-plasmid ở chỗ, vùng T-DNA của Ti-plasmid chứa các gen tổng hợp auxin, cytokinin và opine. Trong khi đó, vùng T-DNA của Ri-plasmid chỉ mang gen tổng hợp auxin và opine. Đây là điểm khác nhau gây ra hiệu quả tác đ Agrobacterium - A. tumefaciens A. rhizogenes . 2. T-DNA - , cytokinin và opine (trường hợp Ti-plasmid) hoặc auxin và opine (trường h - - (right border-RB) và biên trái (left border-LB), mỗi biên có chiều dài 25 bp. 3. Vùng vir - - - vir vir virA, virE2, virB, virD, virD2, vir - Sinh học phân tử 46
. 4. Quá trình chuyển T-DNA vào tế bào thực vật Quá trình cắt đoạn T-DNA ra khỏi plasmid và vận chuyển nó vào tế bào thực vật trước hết phụ thuộc vào sản phẩm của các gen vir. Vi khuẩn xâm nhiễm tại bất kỳ vị trí tổn thương nào trên thân cây. Cây có vết thương do sự hỏng ngẫu nhiên của màng tế bào thực vật hoặc do vi khuẩn tiết ra hỗn hợp những chất được mã hóa bởi các gen vir. Hoạt động của các gen này được hoạt hóa bởi hợp chất phenolic của cây (ví dụ như acetosyringone, catechol, các dẫn xuất của chalcone ). Ngoài ra, các monosaccharide như glucose, arabinose có mặt trong môi trường cũng làm tăng khả năng gây cảm ứng nhóm gen vir. Protein VirA đóng vai trò quan trọng trong việc quyết định loại cây chủ bị nhiễm bởi Agrobacterium. Trong thực tế, Agrobacterium không có khả năng xâm nhập vào cây một lá mầm, có thể protein VirA không nhận biết các tín hiệu do cây một lá mầm tiết ra. Nói chung, Agrobacterium - Agrobacterium . Hiện nay, người ta cũng đã thành công trong việc chuyển gen vào một số cây một lá mầm như lúa, mía qua trung gian A. tumefaciens. A. tumefaciens, do T-DNA hợp - A. rhizogenes - A. rhizogenes . Để gắn T-DNA vào tế bào thực vật, đầu tiên vi khuẩn A. tumefaciens phải tiếp xúc với thành tế bào thực vật bị tổn thương. Quá trình này được thực hiện nhờ các gen chvA và chvB. Gen chvB mã hóa một protein liên Sinh học phân tử 47
quan đến hình thành β-1,2 glucan mạch vòng, trong khi đó gen chvA xác định một protein vận chuyển, định vị ở màng trong của tế bào vi khuẩn. Protein vận chuyển giúp vận chuyển β-1,2 glucan vào khoảng giữa thành tế bào và màng sinh chất. β-1,2 glucan giữ vai trò quan trọng để vi khuẩn Agrobacterium tiếp xúc với thành tế bào thực vật. Nếu không có sự tiếp xúc này, sẽ không có sự dẫn truyền T-DNA. Các sản phẩm protein của vùng vir có tác dụng cho việc dẫn truyền T- DNA từ vi khuẩn vào tế bào thực vật. Các loại protein đó rất cần thiết cho quá trình cắt T-DNA khỏi plasmid, cảm ứng thay đổi màng tế bào thực vật mà chúng tiếp xúc, tham gia di chuyển phần T-DNA qua màng vi khuẩn tới tế bào chất của tế bào thực vật, vận chuyển tới nhân rồi cuối cùng xâm nhập vào genome của cây chủ. Thực chất, chỉ riêng T-DNA của plasmid được chuyển vào genome tế bào thực vật, mà không còn phần nào khác. Quá trình dẫn truyền chỉ do sản phẩm của các gen vir và gen chv quyết định mà không liên quan đến các gen khác trên T-DNA. Tuy nhiên, chuỗi DNA 25 bp (RB và LB của T-DNA) có vai trò là vị trí cảm ứng cho các sản phẩm của tổ hợp các gen vùng vir, đặc biệt là protein từ gen virE mang chúng dẫn truyền vào tế bào thực vật. Chúng hoạt động như các tín hiệu nhận biết và khởi động quá trình dẫn truyền. Trước hết gen virA trong tổ hợp gen vùng vir được phosphoryl hóa nhờ tác động của các hợp chất phenol như acetosyringone giải phóng ra từ các tế bào thực vật tổn thương. Sản phẩm của quá trình này lại tiếp tục phosphoryl hóa gen virG. Sản phẩm của gen virG liên tiếp làm hoạt hóa toàn bộ các gen vir còn lại, mà hai gen cuối cùng được hoạt hóa là gen virB và virE. Trước đó, khi gen virD được hoạt hóa, sản phẩm của nó cảm ứng nhận biết RB và LB của T-DNA và làm đứt phần T-DNA ra khỏi DNA của plasmid thành các sợi đơn. Đồng thời, quá trình phosphoryl hóa này cũng làm thay đổi thẩm suất màng tế bào thực vật, màng tế bào bị mềm ra và bị thủng. Các sợi đơn T-DNA được gắn vào protein do gen virE tổng hợp và dịch chuyển về phía màng tế bào vi khuẩn. Ngay sau đó, sợi T-DNA được trượt từ vi khuẩn vào tế bào thực vật. Cầu nối chính là sự tiếp hợp (conjugation) giữa hai tế bào do cảm ứng sản phẩm gen virB mà thành. Khi T-DNA đã được chuyển giao vào tế bào thực vật, chúng nhanh chóng hợp nhất vào genome tế bào thực vật được ổn định và di truyền như các gen bình thường khác. Sinh học phân tử 48
V. Sắp xếp và khuếch đại các gen trong genome 1. Sắp xếp lại các gen Nói chung, genome có cấu trúc và tổ chức bền vững. DNA của genome thường không bị biến đổi bởi sự phát triển vô tính, nhưng thỉnh thoảng các trình tự của chúng cũng có thể bị chuyển chỗ trong gen, bị cải biến, khuếch đại hoặc thậm chí biến mất, như là một trường hợp tự nhiên. Trao đổi chéo trong phân bào giảm nhiễm là một trong những nguyên nhân gây ra biến đổi của genome. Tuy nhiên, điều này xảy ra chủ yếu trong tế bào sinh dục mà không có trong các tế bào soma. Việc sắp xếp lại genome sẽ dẫn đến những thay đổi sau: - Tạo ra các gen mới cần thiết cho sự biểu hiện trong các trường hợp đặc biệt. - Sự tái sắp xếp có thể đáp ứng cho việc mở hoặc đóng gen. Đây cũng chính là cơ chế của sự điều hòa biểu hiện gen. Một ví dụ điển hình là hiện tượng sắp xếp lại các gen trong genome của nấm men S. cerevisiae và của ký sinh trùng Trypanosome châu Phi khi gây chứng ngủ li bì ở vật chủ. 1.1. Chuyển đổi dạng giao phối của nấm men Nấm men có thể tồn tại ở cả hai dạng đơn bội hoặc lưỡng bội. Các dạng lưỡng bội là dị hợp tử ở trường hợp locus kiểu giao phối, và các tế bào đơn bội có thể hoặc là MATa hoặc MATα. Việc chuyển đổi trạng thái được thông qua giao phối, kết hợp các bào tử đơn bội thành lưỡng bội và qua việc tái tạo giao tử mới. Tuy nhiên, giao phối chỉ xảy ra giữa hai loại tế bào đơn bội a và α. Các tế bào đơn bội cùng loại không thể kết hợp với nhau tạo thành tế bào lưỡng bội. MAT (mating type locus) là vị trí hoạt động hay cassette hoạt động: một vùng đặc biệt của nhiễm sắc thể số 3 chứa các gen qui định dạng giao phối (a và α). Các gen này còn tồn tại ở hai vị trí khác trong genome. Tuy nhiên, ở đó chúng đều bị bất hoạt. Hai vị trí này được gọi là hai vị trí tĩnh (hay cassette tĩnh HML và HMR). Mỗi vị trí tĩnh chỉ mang các gen qui định cho một dạng giao phối. Khi các gen được sao chép từ một vị trí tĩnh vào vị trí hoạt động thì mRNA mới được tổng hợp từ các gen đó. Như vậy, quá Sinh học phân tử 49
trình sao chép quyết định dạng giao phối của nấm. Bản gốc luôn được bảo tồn ở vị trí tĩnh và bản thứ hai xuất hiện ở vị trí hoạt động. Nếu vị trí tĩnh có mang đột biến thì chúng sẽ được sao chép vào vị trí hoạt động. Tuy nhiên, nếu xảy ra đột biến ở cassette MAT thì tính trạng mới xuất hiện không bền. Một khi dạng giao phối chuyển đổi thì các gen cũ ở vị trí MAT bị thay thế bởi bản sao của vị trí tĩnh khác. Lúc đó, đột biến bị loại đi và tính trạng mới sẽ biến mất. So sánh giữa các dạng cùng sợi nấm (homothallic) và khác sợi nấm (heterothallic) người ta nhận thấy dạng heterothallic có gen HO hoạt động và có thể chuyển đổi tự động giữa các kiểu giao phối, và vì thế một bào tử đơn có thể làm tăng quần thể tự phối, trong khi dạng homothallic không có gen HO và duy trì cùng một kiểu giao phối trong suốt chu trình sinh trưởng đơn bội. Phân tích di truyền cho thấy các gen sau đây cần cho việc chuyển đổi kiểu giao phối: - MAT - HO, mã hóa cho enzyme endonuclease - HML (cho MATa chuyển thành MAT ) - HMRa (cho MAT chuyển thành MATa) Trình tự các nucleotide ở vị trí tĩnh và vị trí hoạt động chỉ khác nhau một đoạn ngắn ký hiệu là Ya và Yα (Hình 2.8). Enzyme HO-endonuclease nhận biết vị trí đặc hiệu tại ranh giới phân cách giữa Z và Y và của cassette hoạt động MAT và cắt cả hai sợi DNA tại đó. Điều đặc biệt là enzyme này không cắt DNA khi chúng hiện diện ở cassette tĩnh. Sau khi đoạn Y của vùng MAT bị phân hủy hết, đoạn Y của một trong hai cassette tĩnh được dùng làm khuôn mẫu để sao chép vào vị trí bị phân hủy (Hình 2.8). Nếu đột biến xuất hiện ở vùng MAT (đoạn Y), tính trạng mới chỉ biểu hiện tạm thời. Một khi dạng giao phối chuyển đổi, các gen bình thường được sao chép vào vùng MAT và đột biến bị loại đi. 1.2. Chuyển đổi gen ở Trypanosome Trypanosome có khả năng lẩn tránh được hệ thống miễn dịch của vật chủ thường bằng cách thay đổi kháng nguyên bề mặt (surface antigen) của chúng. Mỗi loại kháng nguyên được tổng hợp nhờ hoạt động của một gen Sinh học phân tử 50
tương ứng tại vị trí hoạt động. Gen này có thể bị thay thế bởi một gen mã hóa cho loại kháng nguyên khác nằm ở một vị trí tĩnh nào đó trong genome. Mỗi vị trí tĩnh chứa một gen ở trạng thái không hoạt động. Gen này chỉ được mở khi chuyển đến vị trí hoạt động. Trong genome của Trypanosome, có rất nhiều vị trí tĩnh nhưng chỉ có một vị trí hoạt động. W X Y Z HML MATa Ya Cắt HO Xâm lấn sợi Kéo dài đầu 3’ Chuyển trạng thái Y HML Y MAT Hình 2.8. Quá trình chuyển đổi dạng giao phối từ a sang α nhờ trao đổi gen giữa vùng MATa và HMLα trên nhiễm sắc thể số 3 Bình thường, Trypanosome sẽ trải qua một số lần biến đổi hình thái khi được truyền từ ruồi châu Phi sang vật chủ. Bề mặt của tế bào Trypanosome được bao bọc một lớp đơn gồm 5×106 phân tử của một loại glycoprotein (VSG-variable surface glycoprotein). Đây chính là kháng nguyên bề mặt của Trypanosome khi chúng xâm nhập vào vật chủ. Điều đáng chú ý là chúng có khả năng thay đổi kháng nguyên bề mặt, do đó tránh được phản ứng miễn dịch của tế bào vật chủ. Quá trình thay thế kháng nguyên bề mặt phụ thuộc vào sự chuyển đổi các gen mã hóa cho chúng xảy Sinh học phân tử 51
ra ở một vị trí đặc biệt trong genome (vị trí hoạt động). Chuyển đổi gen mã hóa kháng nguyên bề mặt nhằm mục đích hoạt hóa gen mã hóa kháng nguyên bề mặt mới thay thế cho kháng nguyên tồn tại trước đó. Khi một gen đang hoạt động bị thay thế bởi một gen khác sẽ tương ứng với việc xuất hiện kháng nguyên mới và loại bỏ kháng nguyên cũ. - Cấu trúc của một VSG ở Trypanosome Cấu trúc chung của một VSG được mô tả trên hình 2.9 và 2.10. Một VSG vừa được tổng hợp dài khoảng 500 amino acid gồm tín hiệu N- terminus, tiếp theo là đoạn peptide quyết định tính kháng nguyên; đoạn peptide bảo thủ giữa các VSG và đuôi kỵ nước. Phân tử này được tổng hợp dưới dạng protein tiền thân (pre-protein). Do đó, chúng phải trải qua biến đổi ở hai đầu NH2 và COOH để trở thành dạng protein hoàn chỉnh (mature form). Dạng này được đính vào màng tế bào ở đầu COOH. Một loại Trypanosome có thể tạo ra ít nhất khoảng 100 VSG từ khi nhiễm cho đến khi gây chết vật chủ. Số gen mã hóa cho VSG có thể nhiều hơn 1.000 gen, tất cả các gen này đều nằm trong genome. Tuy nhiên, tại một thời điểm bất kỳ chỉ có một gen hoạt động tổng hợp nên một loại VSG. Do đó, sự thay đổi kháng nguyên tương ứng với sự thay đổi hoạt động của gen. Khi một gen mới được mở, gen hoạt động trước nó phải bị ức chế hoàn toàn. Lúc đó, một kháng nguyên mới sẽ thay thế kháng nguyên tồn tại trước nó. Hình 2.9 cho thấy chuỗi polypeptide chứa khoảng 500 amino acid. N- terminus chứa một peptide tín hiệu cho sự vận chuyển qua ER (lưới nội sinh chất, endoplasmic reticulum) và tới màng plasma, được tách ra khỏi protein hoàn chỉnh. Vùng biến thiên là khác nhau ở mỗi VSG, điều đó cho thấy các VSG có ít hoặc không có tính đồng nhất. Hướng tới phần C-terminus, chuỗi polypeptide được bảo toàn tốt hơn và phần này được gọi là vùng tương đồng. Đuôi kỵ nước chứa một tín hiệu nhận biết để gắn với mỏ neo glycolipid (glycolipid anchor) (Hình 2.10). Khi mỏ neo được gắn thì 20 amino acid cuối cùng sẽ được tách ra. Glycoprotein biến đổi bề mặt (VSG) được gắn với màng thông qua một mỏ neo glycolipid chứa ethanolamine, một cấu trúc glycan mang một số gốc mannose (mannose moiety), một glucosamine và một phosphoinositol liên kết với 1,2-dimyristoyglycerol có gai trong màng plasma. Gốc glycolipid là yếu tố quyết định phản ứng lai (cross-reacting) Sinh học phân tử 52
(CRD) được nhận biết bằng các kháng thể phản ứng với tất cả dạng biến đổi của VSG, nhưng chỉ khi VSG được phóng thích khỏi màng. Màng liên kết với VSG không được nhận biết bởi các kháng thể anti-CRD. Sự phóng thích VSG được xúc tác bởi hoạt tính của trypanosome-specific phospholipase C được giả định là hiện diện ở mặt bên trong (inner face) của màng plasma. Người ta không biết rằng enzyme có thể cắt liên kết phosphoester trên mặt khác của màng như thế nào. Peptide tín hiệu N-terminus Vùng tương đồng Vùng biến thiên COOH H2N 20 360 100 20 Đuôi kỵ nước C-terminus Hình 2.9. Sơ đồ minh họa chuỗi protein của một VSG đặc trưng Protein C-terminal amino acid Ethanolamine Glycan Glucosamine Inositol Phospholipase C Màng 1,2-Dimyristoylglycerol Hình 2.10. Cấu trúc của mỏ neo glycolipid của VSG - Hoạt động của gen VSG Gen mã hóa cho một VSG được gọi là bản gen gốc (basic copy gene). Các gen này được phân thành hai nhóm tùy thuộc vào vị trí của chúng trên nhiễm sắc thể. Sinh học phân tử 53
+ Các gen nằm ở telomere (khoảng 5-15 kb)>200 gen. + Các gen nằm cách telomere hơn 50 kb. Tương tự như ở nấm men, các gen mã hóa cho VSG nằm rải rác trong genome và ở trạng thái không hoạt động. Một gen bất kỳ được hoạt hóa chỉ khi nó được sao chép vào vị trí hoạt động (expression site) trong khi nguyên bản của nó vẫn được bảo tồn ở vị trí tĩnh. Bản sao của bản gen gốc vào vị trí hoạt động được gọi là ELC (bản sao hoạt động-expression linked copy). Vị trí hoạt động nằm ở gần telomere. Như vậy, việc chọn một bản gen gốc để sao chép tạo bản sao hoạt động sẽ phụ thuộc vào vị trí của bản gen gốc ở telomere hoặc nằm phía trong telomere. Có hai giả thiết để một gen trở nên hoạt hóa như sau: - Vị trí hoạt động không thay đổi mà chỉ có các ELC thay thế cho nhau. Bản sao của một bản gen gốc sẽ thay thế cho bản sao của một gen khác ở tại vị trí đó, điều này xảy ra tương tự như các gen ở cassette tĩnh được sao chép vào cassette hoạt động trong trường hợp với nấm men. - Vị trí hoạt động thay đổi, khi cần tổng hợp một VSG mới, gen ở vị trí hoạt động cũ bị ngừng và gen ở một vị trí khác (gần telomere) được khởi động. Một số phân tử mRNA tương ứng với các VSG khác nhau được phân lập và được xác định trình tự nucleotide (thông qua cDNA). Điều ngạc nhiên là phần oligonucleotide ở đầu 3’ của mọi gen VSG đều khác với phần 3’ của các mRNA được phiên mã từ các gen đó. Mặt khác, các gen này không có phần 5’ giống như các mRNA. Như vậy, các mRNA không được tổng hợp hoàn toàn trên khuôn mẫu các gen này. Phần 3’ của các mRNA tương ứng với phần 3’ của vị trí hoạt động ELC, trong khi phần 5’ (gồm 35 nucleotides) được tổng hợp từ những đoạn DNA khác và được gắn vào mRNA (hiện tượng trans-splicing). 2. Khuếch đại các gen Số lượng bản sao của một số gen cũng có thể được tăng lên tạm thời trong quá trình phát triển các tế bào soma. Việc tăng số lượng của một gen đặc biệt nào đó phụ thuộc vào từng điều kiện cụ thể của tế bào và xảy ra không phổ biến. Các bản sao có thể nằm tập trung thành một nhóm gồm bản sao này nối tiếp bản sao khác hoặc có thể tồn tại như những đoạn DNA có khả năng tái bản độc lập. Chẳng hạn: Sinh học phân tử 54
- Sự nhân bản của gen mã hóa cho rRNA ở trứng ếch. Trứng ếch có đường kính khoảng 2-3 mm, dự trữ rất nhiều rRNA. Chúng được phiên mã từ rất nhiều gen rDNA. Các gen này được nhân lên (khoảng 2.000 lần) theo cơ chế “vòng tròn quay” (xem chương 4) trong quá trình phát triển và tồn tại dưới dạng các vòng tròn khép kín. - Khi nuôi cấy các tế bào động vật có vú trong môi trường đặc biệt, DNA tại một số vị trí trong genome được nhân lên. Ví dụ: nuôi cấy các tế bào ung thư trong môi trường chứa độc tố methotrexate. Chất này ức chế hoạt tính của enzyme dihydrofolate reductase (DHFR) giữ vai trò trong tổng hợp các nucleotide của DNA. Các tế bào ung thư nuôi cấy trong môi trường có chất độc này phát triển thành các quần lạc tế bào kháng lại độc tố. Khi nồng độ chất độc tăng dần, nồng độ DHFR cũng tăng theo, có thể đạt tới 1.000 lần lớn hơn mức bình thường. Nồng độ enzyme tăng do số lượng các gen mã hóa cho chúng tăng. Cơ chế chính xác của hiện tượng này chưa rõ ràng, nhưng có thể xảy ra theo hai cách: - Trao đổi chéo không cân bằng giữa hai nhiễm sắc tử (chromatid) của nhiễm sắc thể dẫn đến một số tế bào không có gen dhfr và một số khác có hai bản sao của gen này. Trong môi trường có độc tố, trao đổi chéo không cân bằng được lặp đi lặp lại và các tế bào chứa nhiều gen dhfr vẫn phát triển tốt trong môi trường này. - Các đoạn DNA (100-1.000 kb) chứa 2-4 gen dhfr (~31 kb/gen) được sao chép từ nhiễm sắc thể bình thường tạo ra các nhiễm sắc thể rất nhỏ, không có tâm động. Các nhiễm sắc thể nhỏ này ghép vào các nhiễm sắc thể bình thường khác. Quá trình này lặp đi lặp lại và qua một số lần phân bào nguyên nhiễm, tế bào nào mang số lượng lớn các gen dhfr càng có điều kiện phát triển thuận lợi trong môi trường có chứa độc tố. 3. Biến nạp gen Một phương thức tăng khả năng di truyền là ứng dụng các tương tác vật chủ cộng sinh-ký sinh, trong đó DNA lạ được chuyển vào tế bào vật chủ từ một vi khuẩn. Cơ chế này tương tự với sự tiếp hợp của vi khuẩn. Sự biểu hiện của DNA vi khuẩn trong vật chủ mới của nó sẽ làm thay đổi kiểu hình Sinh học phân tử 55
của tế bào. Ví dụ điển hình là vi khuẩn A. tumefaciens cảm ứng tạo khối u ở tế bào thực vật bị chúng xâm nhiễm. Khi DNA lạ được đưa vào tế bào eukaryote, nó có thể tồn tại ngoài nhiễm sắc thể hoặc được hợp nhất trong genome. Nếu xảy ra theo trường hợp thứ hai, genome sẽ mang những đột biến di truyền và nhiều khi DNA lạ vẫn tiếp tục hoạt động làm xuất hiện các tính trạng mới. Việc đưa các gen lạ vào tế bào soma hoặc tế bào sinh dục mà vẫn duy trì hoạt động của những gen đó được gọi là chuyển nhiễm (transfection). Cá thể biểu hiện tính trạng mới nhờ hoạt động của gen lạ đưa vào tế bào sinh dục được gọi là cá thể chuyển gen. Quá trình này có thể làm thay đổi sự ổn định của genome. DNA sau khi được tiêm vào trong các tế bào trứng động vật có thể được hợp nhất trong genome và truyền cho thế hệ sau như một thành phần di truyền bình thường. Khả năng đưa một gen chức năng đặc trưng có thể trở thành một kỹ thuật y học sử dụng cho việc chữa bệnh di truyền. Tài liệu tham khảo/đọc thêm 1. Võ Thị Thương Lan. 2002. Sinh học phân tử. NXB Đại học Quốc gia Hà Nội, Hà Nội. 2. Alberts B, Bray D, Lewis J, Raff M, Roberts K and Watson JD. 2002. Molecular Biology of the Cell. 3rd ed. Garland Publishing, Inc. New York, USA. 3. Cantor CR and Smith CL. 1999. Genomics. John Wiley & Sons, Inc. New York, USA. 4. Dale JW and Von Schanzt M. 2002. From Gene to Genome. John Wiley & Sons, Ltd. West Sussex, UK. 5. Lewin B. 2000. Gene VII. Oxford University Press, Oxford, UK. 6. Lodish H, Berk A, Matsudaira P, Kaiser CA, Krieger M, Scott MP, Zipursky SL and Darnell J. 2004. Molecular Cell Biology. 5th ed. WH Freeman and Company, New York, USA. 7. Watson JD, Baker TA, Bell SP, Gann A, Levine M and Loscik R. 2004. Molecular Biology of the Gene. The Benjamin Cummings/Cold Spring Habor Laboratory Press, San Francisco, CA, USA. 8. Weaver RF. 2003. Molecular Biology. 2nd ed. McGraw-Hill Company Inc. New York, USA. Sinh học phân tử 56
Chương 3 Cấu trúc và chức năng của gen I. Định nghĩa gen Chúng ta có thể điểm qua những mốc chính trong lịch sử nghiên cứu về gen như sau: Mendel (1865) là người đầu tiên đưa ra khái niệm nhân tố di truyền. Johansen (1909) đã đề xuất thuật ngữ gen (từ genos, nghĩa là sản sinh, nguồn gốc) để chỉ nhân tố di truyền xác định một tính trạng nào đó. Sau đó, Morgan trong những năm 1920 đã cụ thể hóa khái niệm về gen, khẳng định nó nằm trên nhiễm sắc thể và chiếm một locus nhất định, gen là đơn vị chức năng xác định một tính trạng. Vào những năm 1940, Beadle và Tatum đã chứng minh gen kiểm tra các phản ứng hóa sinh và nêu giả thuyết một gen-một enzyme. Tuy nhiên, trường hợp hemoglobin là một protein nhưng lại gồm hai chuỗi polypeptide do hai gen xác định, do đó giả thuyết trên buộc phải điều chỉnh lại là một gen-một polypeptide. Vào những năm 1950, DNA (deoxyribonucleic acid) được chứng minh là vật chất di truyền. Mô hình cấu trúc DNA của Watson và Crick được đưa ra và lý thuyết trung tâm (central dogma) ra đời. Gen được xem là một đoạn DNA trên nhiễm sắc thể mã hóa cho một polypeptide hay RNA. Cuối những năm 1970, việc phát hiện ra gen gián đoạn ở sinh vật eukaryote cho thấy có những đoạn DNA không mã hóa cho các amino acid trên phân tử protein. Vì thế, khái niệm về gen lại được chỉnh lý một lần nữa: Gen là một đoạn DNA đảm bảo cho việc tạo ra một polypeptide, nó bao gồm cả phần phía trước là vùng 5’ không dịch mã (5’ untranslation) hay còn gọi là vùng ngược hướng (upstream) và phía sau là vùng 3’ không dịch mã (3’ untranslation) hay còn gọi là vùng cùng hướng (downstream) của vùng mã hóa cho protein, và bao gồm cả những đoạn không mã hóa (intron) xen giữa các đoạn mã hóa (exon). Hiện nay, có thể định nghĩa gen một cách tổng quát như sau: Gen là đơn vị chức năng cơ sở của bộ máy di truyền chiếm một locus nhất định trên Sinh học phân tử 57
nhiễm sắc thể và xác định một tính trạng nhất định. Các gen là những đoạn vật chất di truyền mã hóa cho những sản phẩm riêng lẻ như các mRNA được sử dụng trực tiếp cho tổng hợp các enzyme, các protein cấu trúc hay các chuỗi polypeptide để gắn lại tạo ra protein có hoạt tính sinh học. Ngoài ra, gen còn mã hóa cho các tRNA, rRNA và snRNA Bảng 3.1. Tóm tắt lịch sử nghiên cứu về di truyền học Mốc Năm Các sự kiện chính thời gian 1850 1865 Gen là các nhân tố hạt 1871 Khám phá ra nucleic acid 1900 1903 Nhiễm sắc thể là các đơn vị di truyền 1910 Gen nằm trên nhiễm sắc thể 1913 Nhiễm sắc thể là các dãy sắp xếp mạch thẳng của gen 1927 Đột biến là những thay đổi vật lý của gen 1931 Sự tái tổ hợp xuất hiện bởi hiện tượng vắt chéo 1944 DNA là vật liệu di truyền 1945 Gen mã hóa cho protein 1950 1951 Trình tự protein đầu tiên 1953 DNA có dạng xoắn kép 1958 DNA tái bản theo phương thức bán bảo thủ 1961 Mã di truyền là bộ ba 1977 Các gen của sinh vật eukaryote bị gián đoạn 1977 DNA có thể được phân tích trình tự 1995 Genome của vi khuẩn được phân tích trình tự 2000 2001 Genome người được phân tích trình tự Sinh học phân tử 58
II. Lý thuyết trung tâm 1. Sự xác định di truyền cấu trúc bậc một của protein Cấu trúc không gian của chuỗi polypeptide được xác định bởi trình tự sắp xếp của các amino acid tức cấu trúc bậc một. Như vậy, mặc dù có nhiều mức độ cấu trúc không gian khác nhau, nhưng cấu trúc bậc một tức trình tự sắp xếp các amino acid chi phối toàn bộ các mức độ cấu trúc khác. Việc xác định di truyền phân tử protein ở trạng thái tự nhiên có đầy đủ hoạt tính sinh học chỉ quy tụ lại chủ yếu ở xác định cấu trúc bậc một là đủ. 2. Các enzyme mất hoạt tính do đột biến Nhiều nghiên cứu cho thấy, việc mất hoạt tính enzyme nhiều khi không phải do vắng mặt của enzyme, mà chỉ do các biến đổi trên phân tử (modification). Có trường hợp đột biến dẫn đến những thay đổi tinh vi, enzyme vẫn có hoạt tính nhưng sẽ biểu hiện khác nếu thay đổi điều kiện. Chẳng hạn: Ở nấm mốc Neurospora crassa, enzyme tyrosinase do gen T xác định, xúc tác cho phản ứng chuyển hóa tyrosine thành dihydroxyphenylalanine. Alelle T+ của dòng hoang dại sản xuất tyrosinase có hoạt tính ở nhiệt độ bình thường và cả ở 60oC. Một đột biến TS sản xuất tyrosine có hoạt tính ở nhiệt độ bình thường, nhưng lại mất hoạt tính ở 60oC. Như vậy, trong đa số trường hợp, đột biến của một gen không làm biến mất enzyme mà chỉ biến đổi cấu trúc dẫn đến thay đổi hoạt tính. Các đột biến của cùng một gen có thể gây ra những biến đổi khác nhau trên enzyme. Các hiện tượng đó chứng tỏ rằng cấu trúc của enzyme chịu sự kiểm soát trực tiếp của gen. 3. Bản chất các biến đổi di truyền của protein Bản chất đó chính là quan hệ một gen-một polypeptide. Như đã nêu trên, người ta khám phá ở người có những gen tạo ra hemoglobin (Hb) khi biến dị sẽ tạo ra những hemoglobin bất thường do sai hỏng ở các chuỗi polypeptide α hoặc β (Bảng 3.2 và 3.3) và gây ra các bệnh di truyền. Sinh học phân tử 59
Bảng 3.2. Các loại hemoglobin ở chuỗi polypeptide α Thứ tự amino acid 1 2 16 57 58 68 116 141 Tên amino acid Val Leu Lys Glu His Asp Glu Arg Loại hemoglobin Hb I Asp Hb Nocfolk Asp Hb M Boston Tyr Hb B Philadelphia Lys Hb O Indonesia Lys Ở trường hợp này, thứ tự các amino acid có thể bị sai lệch. Từ những dữ liệu trên ta thấy các dạng đột biến tạo một Hb bất thường đó là thay một amino acid này bằng một amino acid khác. Bảng 3.3. Các loại hemoglobin ở chuỗi polypeptide β Thứ tự amino acid 1 2 3 6 26 67 121 146 Tên amino acid Val His Leu Glu Glu Val Glu His Loại hemoglobin Hb S Val Hb C Lys Hb E Lys Hb M Minvauki Glu Hb O Ả Rập Lys Qua hai chuỗi polypeptide α và β chúng ta thấy có một số dạng hemoglobin bất thường ở người. Trên mỗi chuỗi, chỉ trình bày những amino acid đã bị thay đổi ở dạng đột biến. Số thứ tự chỉ vị trí của amino acid trong chuỗi polypeptide. Mỗi hemoglobin bất thường có thể được đặt cho một chữ cùng tên (nếu có) của địa phương được tìm thấy. Sinh học phân tử 60
Đột biến được biểu hiện bởi sự thay thế vị trí của một amino acid này bằng một amino acid khác. 4. Sự tương quan đồng tuyến tính gen-polypeptide 4.1. Đột biến tryptophan synthetase-sự đồng tuyến tính giữa gen và chuỗi polypeptide Nghiên cứu trên enzyme tryptophan synthetase xúc tác cho phản ứng tổng hợp tryptophan của E. coli người ta nhận thấy có nhiều đột biến xảy ra trên cùng một gen mã hóa cho tryptophan synthetase. Thực hiện tái tổ hợp trong gen (nguyên tắc là gen ở các vị trí càng xa nhau trên nhiễm sắc thể càng dễ tái tổ hợp), người ta đã nhận được các dạng biến dị có tính chất khác nhau, và tính được khoảng cách tương đối giữa những điểm khác nhau của đột biến đã được xác định. Vị trí biến dị trên thể nhiễm sắc tương ứng với vị trí của amino acid trên chuỗi polypeptide. Như vậy, có thể cho rằng có sự đồng tuyến tính giữa gen và chuỗi polypeptide (Hình 3.1). Các vị trí của đột biến trên DNA + - H3N COO 1 15 22 49 175 177 183 211 213 234 235 243 268 Các gốc amino acid Lys Phe Glu Tyr Leu Thr Gly Gly Gly Ser Gln bị thay đổi STOP Leu Val Gln Met Cys Arg Ile Arg Glu Val Cys Asp Leu STOP Hình 3.1. Tương quan đồng tuyến tính giữa gen và enzyme tryptophan synthetase của E. coli thông qua các vị trí đột biến và các gốc amino acid bị thay đổi Nhiều dạng đột biến của tryptophan synthethase đã được tạo ra. Bằng cơ chế tái tổ hợp, những khoảng cách tương đối giữa những điểm khác nhau Sinh học phân tử 61
của đột biến đã được xác định. Sản phẩm protein của mỗi dạng đột biến đã được phân tích, và những thay đổi các amino acid khác cũng được xác định. Người ta đã tìm thấy mối tương quan hoàn toàn giữa những khoảng cách của các đột biến được tìm thấy trên gen với khoảng cách của amino acid bị thay đổi trong phân tử protein. 4.2. Đột biến 4.2.1. Khái niệm Một gen (DNA) có 4 loại base và một phân tử protein có 20 loại amino acid1, nhưng giữa chúng có mối tương quan như thế nào. Đầu tiên, người ta cho rằng một base qui định một amino acid, nhưng những tính toán cho thấy không hợp lý. Vì chỉ có 4 base trong DNA và 20 amino acid trong protein, cho nên mỗi codon phải chứa ít nhất 3 base. Hai base cũng không thể làm thành một codon bởi vì chỉ có 42 = 16 cặp hợp lý của 4 base. Nhưng 3 base thì có thể bởi vì sẽ có 43 = 64 bộ ba hợp lý. Vì số lượng bộ ba hợp lý lớn hơn 20, cho nên sẽ có trường hợp một vài codon chỉ định cùng một amino acid. Ví dụ: UCU, UCC, UCA, UCG, AGU và AGC đều cùng mã hóa cho serine. Từ đó, người ta đưa ra khái niệm mã di truyền (tín hiệu di truyền). Mã di truyền cho phép đọc thứ tự trên DNA để biết thứ tự trên chuỗi polypeptide. Mã di truyền không mơ hồ, có nghĩa với một trình tự chẳng hạn ATA ta biết nó ghi mã cho một amino acid gì, và cũng thấy rằng có nhiều mã di truyền xác định cho một amino acid (Bảng 3.4). 4.2.2. Đột biến điểm Là đột biến chỉ tác động một vị trí, nói rõ hơn đó là một base. Khi thay đổi một base trên DNA sẽ tạo ra sự thay đổi một amino acid (Hình 3.2). 1 Hai mươi amino acid được tìm thấy trong các phân tử protein là: Alanine (Ala), Arginine (Arg), Asparagine (Asn), Aspartic acid (Asp), Cysteine (Cys), Glutamic acid (Glu), Glutamine (Gln), Glycine (Gly), Histidine (His), Isoleucine (Ile), Leucine (Leu), Lysine (Lys), Methionine (Met), Phenylalanine (Phe), Proline (Pro), Serine (Ser), Threonine (Thr), Tryptophan (Trp), Tyrosine (Tyr) và Valine (Val). Sinh học phân tử 62
Đột biến dĩ nhiên xảy ra trên DNA và được sao lại trên mRNA trong phiên mã, rồi trên protein trong dịch mã. Bảng 3.4. Mã di truyền chung Vị trí Vị trí thứ hai Vị trí thứ nhất thứ ba U C A G U Phe (F) Ser (S) Tyr (Y) Cys (C) U U Phe (F) Ser (S) Tyr (Y) Cys (C) C U Leu (L) Ser (S) STOP STOP A U Leu (L) Ser (S) STOP Trp (W) G C Leu (L) Pro (P) His (H) Arg (R) U C Leu (L) Pro (P) His (H) Arg (R) C C Leu (L) Pro (P) Gln (Q) Arg (R) A C Leu (L) Pro (P) Gln (Q) Arg (R) G A Ile (I) Thr (T) Asn (N) Ser (S) U A Ile (I) Thr (T) Asn (N) Ser (S) C A Ile (I) Thr (T) Lys (K) Arg (R) A A Met (M) Thr (T) Lys (K) Arg (R) G G Val (V) Ala (A) Asp (D) Gly (G) U G Val (V) Ala (A) Asp (D) Gly (G) C G Val (V) Ala (A) Glu (E) Gly (G) A G Val (V) Ala (A) Glu (E) Gly (G) G Chú thích Những đơn vị mã (codon) được đọc theo chiều 5’ 3’. STOP: codon kết thúc (còn gọi là vô nghĩa). Sinh học phân tử 63
Đột biến điểm có các dạng sau: - Đột biến sai nghĩa. Thay đổi một amino acid trong protein, có thể dẫn đến một trong ba kết quả sau: + Không hậu quả nào cả, vì amino acid không nằm trong vị trí hoạt động hoặc không có vai trò trong cấu trúc enzyme. + Có biến đổi nhẹ ở chuỗi polypeptide sẽ tạo ra tính mẫn cảm yếu với nhiệt, làm giảm sự ổn định chuỗi polypeptide. + Mất hẳn hoạt tính enzyme nếu đúng ngay vị trí hoạt động của enzyme đó. - Đột biến vô nghĩa. Thay đổi một base. Nếu đó là một codon vô nghĩa sẽ làm ngừng kéo dài (tổng hợp) chuỗi polypeptide ở vị trí amino acid này. Tức là nếu codon này nằm ở đầu sẽ không có chuỗi polypeptide hoạt động. - Đột biến acridine hoặc đột biến dịch khung. Đột biến này do chất acridine màu da cam tạo ra (hoặc còn gọi là đột biến dịch khung, frameshift, do thêm vào hoặc bớt đi một base) (Hình 3.2 E và D). Như vậy, một đột biến trên khung đọc khi thêm vào (C) hoặc mất đi (A) thường sẽ dẫn đến xuất hiện một codon stop làm ngừng chuỗi polypeptide và enzyme sẽ không có hoạt tính. 4.2.3. Đột biến kìm hãm Đến nay, người ta nhận thấy mọi sai lệch trong việc tổng hợp protein nếu có đều xảy ra từ DNA, còn quá trình diễn ra từ RNA đến polypeptide luôn luôn đúng. Nghiên cứu một vài kiểu protein đột biến ta thấy: - Đột biến sai nghĩa. Làm xuất hiện một bất thường trong trình tự amino acid. Kết quả protein mất hoạt tính. Hoạt tính này có thể được phục hồi, hoặc do một đột biến ngược để cho lại protein cấu trúc ban đầu. - Đột biến vô nghĩa. Làm mất đi một phần chuỗi polypeptide, phần còn lại không có hoạt tính, và hoạt tính này có thể có lại được nhờ đột biến trong một codon đã bị đột biến. Thông thường, những gen kìm hãm đột biến vô nghĩa không nằm ở gần vị trí của đột biến ấy. Đó là những gen làm biến đổi hệ thống dịch mã khi tổng hợp protein. Sinh học phân tử 64
A AUG ACU CGG AAG UCA CUA ACG AUU AGG CUU UAC Met Thr Arg Lys Ser Leu Thr Ileu Arg Leu Tyr B AUG ACU AGG AAG UCA CUA ACG AUU AGG CUU UAC Met Thr Pro Lys Ser Leu Thr Ileu Arg Leu Tyr C AUG ACU CGG AAG UGA CUA ACG AUU AGG CUU UAC Met Thr Arg Lys Kết thúc D AUG ACU CGG ACA GUG ACU AAC GAU UAG GCU UUA Met Thr Arg Thr Val Thr Asp Asp Kết thúc E AUG ACU CGG AGU GAC UAA CGA UUA GGC UUU AC Met Thr Arg Ser His Kết thúc Hình 3.2. Các dạng đột biến điểm A: trình tự các codon và các amino acid tương ứng ở dạng tự nhiên. B: thay đổi một base (C thành A) làm thay đổi một amino acid (Arg thành Pro) gây nên đột biến sai nghĩa. C: thay đổi một base (C thành G) sinh ra một codon vô nghĩa (UGA). D: thêm một base (C) gây nên đột biến acridine hoặc đột biến dịch khung, có sự dời khung đọc. E: mất một base (A), gây nên đột biến acridine, chấm dứt đọc. 5. Lý thuyết trung tâm của sinh học phân tử Tổng hợp protein trong tế bào có các đặc điểm sau: - Các phân tử thông tin như nucleic acid và protein được tổng hợp theo khuôn. Tổng hợp theo khuôn vừa chính xác vừa ít tốn enzyme. Tuy Sinh học phân tử 65
nhiên, căn cứ vào hàng loạt tính chất hóa học các protein không thể làm khuôn mẫu cho sự tổng hợp của chính chúng. Vì vậy, khuôn mẫu để tổng hợp nên protein không phải là protein. - Sinh tổng hợp protein tách rời về không gian với chỗ chứa DNA. Nhiều nghiên cứu cho thấy tổng hợp protein có thể xảy ra khi không có mặt DNA. Sự kiện này thể hiện rõ ràng nhất ở những tế bào eukaryote. Trong những tế bào này, hầu như toàn bộ DNA tập trung ở nhiễm sắc thể trong nhân, còn tổng hợp protein chủ yếu diễn ra ở tế bào chất. Tảo xanh đơn bào Acetabularia khi bị cắt mất phần chứa nhân vẫn tổng hợp được protein và sống vài tháng nhưng mất khả năng sinh sản. Rõ ràng, nơi chứa DNA mang thông tin di truyền và chỗ sinh tổng hợp protein tách rời nhau về không gian. - DNA không phải là khuôn mẫu trực tiếp để tổng hợp protein, do đó phải có chất trung gian chuyển thông tin từ DNA ra tế bào chất và làm khuôn để tổng hợp protein. Chất đó phải có cả trong nhân và tế bào chất với số lượng phụ thuộc vào mức độ tổng hợp protein. - Chất trung gian đó được xem chính là RNA nhờ các đặc điểm sau: + RNA được tổng hợp ngay ở trong nhân có chứa DNA, sau đó nó đi vào tế bào chất cho tổng hợp protein. + Những tế bào giàu RNA tổng hợp protein nhiều hơn. + Về phương diện hóa học RNA gần giống DNA: chuỗi polyribo- nucleotide thẳng cũng chứa 4 loại ribonucleotide A, G, C và uracil (U). Nó có thể nhận được thông tin từ DNA qua bắt cặp bổ sung. Nói chung, trong tế bào không thể tìm thấy chất nào khác ngoài RNA có thể đóng vai trò trung gian cho tổng hợp protein. Mối quan hệ này chính là thông tin di truyền đi từ DNA qua RNA rồi đến protein và được biểu diễn ở hình 3.3. Mối quan hệ này còn được gọi là lý thuyết trung tâm (central dogma), được Crick đưa ra từ 1956 đến nay về căn bản vẫn đúng. Vào những năm 1970, người ta đã phát hiện quá trình phiên mã ngược từ RNA tổng hợp nên DNA nhờ enzyme reverse transcriptase. Đến nay, việc sao chép (tổng hợp) RNA trên khuôn mẫu RNA cũng đã được chứng minh ở nhiều loại virus. Ngoài ra, thông tin từ protein cũng có thể được truyền sang protein (prion của bệnh bò điên). Riêng dòng thông tin từ protein ngược về mRNA/DNA thì chưa được tìm thấy (Hình 3.4). Sinh học phân tử 66
Phiên mã Dịch mã DNA mRNA Protein Sao chép Hình 3.3. Lý thuyết trung tâm của Crick Phiên mã Dịch mã DNA mRNA Protein Phiên mã ngược ? Sao chép (virus) (prion) Hình 3.4. Những bổ sung mới vào lý thuyết trung tâm của Crick 6. DNA và mã di truyền Chúng ta đã biết có sự liên quan đồng tuyến tính giữa DNA và phân tử protein, từ đó dễ dàng dự đoán rằng trình tự đặc hiệu của các amino acid trên phân tử protein sẽ được mã hóa bằng nhóm các nucleotide trên phân tử DNA. Có tất cả 4 loại base, nếu các base có nhóm đôi tức 2 nucleotide mã hóa cho một loại amino acid thì tất cả chỉ có 16 tổ hợp, không đủ cho 20 loại amino acid. Như vậy, đơn vị mã hóa (codon) phải gồm 3 nucleotide (xem phần 4.2). Vấn đề tiếp theo là xác định chính xác các codon nào mã hóa cho từng amino acid. Nirenberg và Matthaei đã sử dụng enzyme để tổng hợp nhân tạo RNA. Khi dùng chỉ một loại nucleotide là U sẽ nhận được RNA là poly(U), nếu chỉ dùng A sẽ nhận được poly(A). Năm 1961, Nirenberg và Matthaei đã dùng poly(U) thay cho khuôn mẫu mRNA để tổng hợp protein trong hệ thống vô bào (có amino acid, enzyme tổng hợp protein, nhưng không có DNA ), sản phẩm thu được là chuỗi polypeptide polyphenylalanine chỉ chứa một loại amino acid là phenylalanine. Điều đó chứng tỏ codon UUU mã hóa cho phenylalanine. Đây là codon đầu tiên được xác định. Sau đó, họ cũng chứng minh được rằng AAA mã hóa cho lysine, GGG cho glycine và CCC cho proline. Sinh học phân tử 67
Năm 1964, Khorana tìm ra phương pháp tổng hợp mRNA nhân tạo với trình tự lặp lại (như AAG AAG AAG ) và nhờ nó giải quyết xong các vấn đề còn chưa rõ ràng. Bảng mã di truyền (Bảng 3.4) cho thấy trong 64 codon, có 3 codon UAA, UAG, UGA không mã hóa cho amino acid được gọi là vô nghĩa (non- sense), đồng thời là codon kết thúc (termination) tức dấu chấm câu, chấm dứt chuỗi polypeptide. Mã di truyền có tính suy biến (degeneration) tức một amino acid có nhiều codon mã hóa, chỉ trừ methionine và tryptophane chỉ có một codon (tương ứng là ATG và TGG). Các codon đồng nghĩa tức mã hóa cho cùng một amino acid thường có hai base đầu tiên giống nhau, nhưng khác nhau ở cái thứ ba. Ví dụ: CCU, CCC, CCA và CCG tất cả đều mã hóa cho proline. Trên thực tế, U và C luôn luôn tương đương nhau ở vị trí thứ ba, còn A và G tương đương nhau trong 14 trên 16 trường hợp. Trừ một số ngoại lệ, mã di truyền có tính phổ biến (universal) tức toàn bộ thế giới sinh vật có chung bộ mã di truyền. III. Cấu trúc và chức năng của gen Khi nghiên cứu các quy luật di truyền Mendel và học thuyết di truyền nhiễm sắc thể, gen được quan niệm như một điểm trên nhiễm sắc thể, vừa là đơn vị chức năng xác định một tính trạng, vừa là đơn vị đột biến, vừa là đơn vị tái tổ hợp. Cùng với sự phát triển của di truyền học, khái niệm về gen được cụ thể hóa thêm, cấu trúc và chức năng của gen được hiểu chi tiết hơn. 1. Cấu trúc gen Một gen thường được xem gồm có hai phần, phần mang mã di truyền được phiên mã sang phân tử mRNA và phần DNA làm nhiệm vụ điều khiển hoạt động của gen (Hình 3.5). Cả hai phần đều có cấu trúc cơ bản khá giống nhau ở mọi sinh vật prokaryote và eukaryote. Tuy nhiên, gen eukaryote còn có cấu trúc đặc thù liên quan đến các cơ chế kiểm soát khác nhau đối với hoạt động của gen. Cấu trúc một gen điển hình nói chung đều có promoter, vị trí để RNA polymerase hoạt động khởi đầu phiên mã. Đôi khi nằm rất xa gen, có thể thấy các enhancer (vùng tăng cường) hoặc silencer (vùng ức chế) có vai trò Sinh học phân tử 68
liên quan đến quá trình phiên mã. Độ dài của một gen thay đổi tùy theo số lượng và độ dài của các intron chứa trong nó. Vùng 5’ Vùng 3’ Đơn vị phiên mã ngược hướng cùng hướng Vùng promoter Các exon Các enhancer Hộp CCAAT Hộp TATA Các enhancer Chuỗi 5’ Các intron Chuỗi 3’ không mã hóa không mã hóa Hình 3.5. Cấu trúc chung của một gen Vùng DNA mang mã di truyền sẽ được phiên mã sang phân tử mRNA. Quá trình này thực hiện theo chiều 5’ 3’ trên sợi mRNA đang được tổng hợp. Không phải mọi phiên mã di truyền trên phân tử mRNA đều được dịch mã sang phân tử protein. Hai đầu 5’ và 3’ của phân tử mRNA gồm một số nucleotide không được dịch mã mà lại liên quan đến tính bền vững của phân tử mRNA hoặc tham gia kiểm soát quá trình dịch mã. Hai đoạn này gọi là vùng không dịch mã 5’ và 3’ (untranslated region). Vùng không dịch mã 5’ nằm trước điểm khởi đầu dịch mã (3 nucleotide AUG mã hóa cho methionine đầu tiên của chuỗi polypeptide) và vùng không dịch mã 3’ nằm sau điểm kết thúc dịch mã (stop codon có thể là UAA, UGA và UAG). Do tế bào prokaryote không có cấu trúc nhân nên quá trình phiên mã (tổng hợp mRNA) và dịch mã (tổng hợp protein) xảy ra đồng thời. Còn phân tử mRNA của eukaryote được phiên mã trong nhân, sau đó phải cắt bỏ intron và gắn các exon lại, chịu biến đổi tại các đầu 5’ và 3’ trước khi vận chuyển ra ngoài tế bào chất để dùng làm khuôn mẫu tổng hợp protein. Hoạt động của một gen được đánh giá thông qua quá trình phiên mã (tổng hợp mRNA) và quá trình dịch mã (tổng hợp protein). Hoạt động này được kiểm soát rất chặt chẽ bằng các cơ chế khác nhau ở mọi giai đoạn, như bắt đầu và kết thúc phiên mã, quá trình biến đổi mRNA, quyết định tính bền vững và kiểm tra lại thông tin di truyền trên các phân tử này Do cấu trúc Sinh học phân tử 69
sắp xếp các gen prokaryote khác với gen eukaryote nên sự phối hợp giữa các cơ chế điều khiển mang tính chất riêng biệt cho từng loại genome. Các gen prokaryote thường sắp xếp nằm gần nhau và chịu sự điều khiển chung của một promoter, tức là chúng được phiên mã sang cùng một phân tử mRNA. Cấu trúc này được gọi là operon. Như vậy, một operon gồm hai hay nhiều gen nằm cạnh nhau trên một nhiễm sắc thể. Thông thường, đó là các gen cùng tham gia vào một con đường chuyển hóa, ví dụ như các gen mã hóa cho các enzyme cần thiết cho quá trình chuyển hóa glucose. Do có chung promoter điều khiển cho mọi gen nằm trong một operon cho nên chỉ có một loại phân tử mRNA được tổng hợp từ một operon (mang thông tin di truyền của tất cả các gen nằm trong đó). Nói cách khác, quá trình phiên mã của các gen trong một operon xảy ra đồng thời và phân tử mRNA đặc trưng cho operon được gọi là mRNA-polycistron. Tuy nhiên, điều cần ghi nhớ là quá trình dịch mã trên các phân tử mRNA-polycistron xảy ra hoàn toàn độc lập với nhau. Mỗi đoạn tương ứng với một gen trên phân tử này đều có vị trí bám của ribosome, có mã bắt đầu và kết thúc tổng hợp chuỗi polypeptide riêng biệt. Do đó, tốc độ tổng hợp các protein trên các phân tử mRNA-polycistron hoàn toàn khác nhau (Hình 3.6). Operon Operator Gen cấu trúc Gen a Gen b Gen c Promoter Hình 3.6. Cấu trúc operon trong genome vi khuẩn. Một operon là một đơn vị phiên mã đơn bao gồm một chuỗi các gen cấu trúc (structural genes), một promoter và một operator. 2. Sự phân chia nhỏ của gen Khái niệm locus được đưa ra để chỉ vị trí của gen trên nhiễm sắc thể, là vị trí của tất cả các allele của dãy đa allele. Bản thân hiện tượng đa allele Sinh học phân tử 70
cho thấy gen có cấu tạo phức tạp, sự biến đổi của gen có thể dẫn đến nhiều trạng thái allele khác nhau. 2.1. Hiện tượng allele giả Theo quan niệm cổ điển gen là đơn vị tái tổ hợp. Nếu cá thể mang hai allele lặn a1/a2 của một dãy đa allele sẽ tạo thành hai loại giao tử là a1 và a2, lai phân tích với bố mẹ đồng hợp tử lặn sẽ chỉ cho kiểu hình đột biến a1 và a2 mà không có dạng tái tổ hợp hoang dại. Ví dụ: Bố mẹ a1/a2 × a1/a1 Giao tử a1 và a2 a1 Các con lai a1/a1 và a2/a1 - cả hai đều là kiểu hình đột biến Tuy nhiên, nhiều thí nghiệm cho thấy nếu tăng số cá thể thí nghiệm lên 10.000 hoặc 100.000, thì có thể phát hiện có dạng kiểu hình hoang dại do tái tổ hợp. Ví dụ: Trường hợp locus mắt quả trám ở ruồi giấm, có 18 allele. Khi tăng số cá thể nghiên cứu lên nhiều lần, người ta phát hiện các allele xếp thành 3 nhóm A, B và C. Các allele của cùng một nhóm, khi lai lẫn nhau, không cho kiểu hình tái tổ hợp hoang dại mắt bình thường, mà chỉ có kiểu hình mắt quả trám. Nhưng lai allele của nhóm này với allele của nhóm khác sẽ có xuất hiện kiểu hình hoang dại do tái tổ hợp. Hiện tượng này được gọi là allele giả. Hiện tượng allele giả cho thấy gen phân chia nhỏ về mặt tái tổ hợp, có thể xảy ra tái tổ hợp giữa các phần trong gen. Lúc đầu, hiện tượng allele giả được coi là trường hợp ngoại lệ, nhưng khi tăng số cá thể nghiên cứu lên nhiều lần thì rõ ràng đó là hiện tượng phổ biến. Nó được tìm thấy ở nhiều đối tượng khác nhau như nấm men S. cerevisiae, ngô, bồ câu, chuột, bacteriophage 2.2. Locus rII của bacteriophage T4 Nghiên cứu chi tiết về các đột biến rII của bacteriophage T4 đã làm + sáng tỏ hơn về cấu trúc gen. Bacteriophage T4 ở dạng hoang dại r có khả năng xâm nhiễm đồng thời hai chủng E. coli B và K, trong khi các đột biến rII chỉ xâm nhiễm chủng B mà không xâm nhiễm chủng K (Hình 3.7). Sinh học phân tử 71
Chủng vi khuẩn E. coli B K Dạng hoang dại Vết tan (plaque) nhỏ Vết tan nhỏ Đột biến rII Vết tan lớn Không có vết tan Hình 3.7. Kiểu hình của các đột biến rII của phage T4 Benzer (1955) đã thu được vài nghìn đột biến rII có nguồn gốc độc lập với nhau. Ông cho lai các đột biến này với nhau và căn cứ vào sự xuất hiện các dạng tái tổ hợp hoang dại r+ mà lập bản đồ các điểm đột biến (mutation sites). Trước thí nghiệm của ông, rII được coi là một locus. Tuy nhiên, thí nghiệm của ông đã cho thấy các đột biến xếp thành hai nhóm rIIA và rIIB. Lai các đột biến rIIA × rIIB sẽ có r+, nhưng lai rIIA × rIIA và rIIB × rIIB thì kiểu hình đột biến là r. Cho đến nay, chúng ta định nghĩa một gen là nhờ dựa trên kiểu hình đột biến và vị trí trên bản đồ của nó. Bacteriophage là một mô hình di truyền đơn giản (genome của E. coli dài khoảng 4.600.000 bp, trong khi bacteriophage T4 là 165.000 bp và bacteriophage λ khoảng 46.500 bp), chúng có thể sinh sản một số lượng lớn rất nhanh (1010 hoặc hơn thế) và dễ dàng phân tích. Các thí nghiệm thực hiện với đột biến rII của T4 được thiết lập dựa trên cơ sở sau: - Các gen có một phạm vi và ranh giới hạn chế. - Các gen có thể chia được, có thể có sự tái tổ hợp giữa hai allele trong một gen đơn. - Hoạt động của gen có thể được phân tích bởi sự phân tích bổ sung. Sinh học phân tử 72
Kết quả thí nghiệm cho thấy, gen có thể phân chia nhỏ về mặt đột biến. Các đoạn rIIA và rIIB được gọi là cistron, đơn vị chức năng nhỏ nhất đảm bảo khả năng xâm nhiễm chủng K. Thuật ngữ cistron thực chất là gen, ngày nay nó chỉ có tính chất lịch sử, ít được sử dụng. Theo quan niệm hiện nay, rIIA và rIIB là hai locus. Hai khái niệm mới được đưa ra là muton-đơn vị đột biến và recon-đơn vị tái tổ hợp. Benzer đã tìm thấy 2.000 điểm đột biến trên đoạn gen được nghiên cứu, chúng phân bố không đều nhau, có những điểm tập trung nhiều đột biến hơn. Chiều dài gen khoảng 900 nucleotide. Đơn vị đột biến muton ở đây tương ứng với 900/2.000. Số đột biến ghi nhận có thể thấp hơn so với thực tế nên muton có thể tương ứng với một cặp nucleotide. Giống như vậy recon có thể tương ứng với một cặp nucleotide. Tóm lại, gen là đơn vị chức năng, có thể chia nhỏ bởi các đơn vị đột biến tái tổ hợp. 3. Thử nghiệm chức năng allele Muốn nghiên cứu cấu trúc bên trong một gen, phải tìm hiểu nhiều allele của gen đó. Nhiều đột biến có kiểu hình giống nhau nhưng không allele với nhau. Thử nghiệm chức năng allele được sử dụng để xác định xem hai đột biến có allele với nhau không. Đây chính là thử nghiệm mà Benzer dùng để lập bản đồ locus rII. Thử nghiệm này còn được gọi là thử nghiệm bổ sung (complementary test) vì nó cho biết sai hỏng chức năng ở hai đột biến có bổ sung tức bù trừ cho nhau được không. Phương pháp thử này cũng được gọi là thử nghiệm đều-lệch (cis-trans test). Sở dĩ như vậy là vì phép thử nghiệm này so sánh hiệu quả kiểu hình của các gen đột biến ở hai vị trí khác nhau trên nhiễm sắc thể tương đồng. Ở vị trí lệch (trans) các đột biến nằm trên hai nhiễm sắc thể, còn ở vị trí đều (cis) các đột biến nằm trên cùng một nhiễm sắc thể. Trường hợp sai hỏng ở hai gen khác nhau nên có thể bổ sung được, còn trường hợp sai hỏng ở cùng một gen không bù đắp được sẽ dẫn đến kiểu hình đột biến. Sinh học phân tử 73
cis trans 1 2 a1 a2 + a1 + + I: Hai đột biến trên một cistron + + + + a2 + Gen A Gen B Gen A Gen B 3 4 a1 + b a1 + + II: Hai đột biến trên hai cistron + + + + + b Gen A Gen B Gen A Gen B Hình 3.8. Thử nghiệm chức năng allele. I: có kiểu hình đột biến do sai hỏng cùng một gen nên không bù đắp được. II: có kiểu hình hoang dại do sai hỏng khác gen nên bù trừ được cho nhau. 4. Gen là đơn vị chức năng nhỏ nhất Thử nghiệm chức năng allele có thể được thực hiện dễ dàng trên các đối tượng vi sinh vật với các đột biến hóa sinh, thường là các đột biến khuyết dưỡng (auxotroph mutant: mất khả năng tổng hợp một chất nào đó). Ví dụ: Ở nấm mốc Neurospora crassa có nhiều đột biến mất khả năng tổng hợp adenine (Ade-). Các đột biến này dễ phát hiện vì có khuẩn lạc màu đỏ. Có hai dạng đột biến Adex và Adey, nếu dị hợp tử Adex/Adey có kiểu hình đột biến tức là cho khuẩn lạc màu đỏ, thì Adex và Adey là hai allele của một gen. Thử nghiệm chức năng allele cho thấy các đột biến Ade ở N. crassa tạo thành 9 nhóm. Điều đó chứng tỏ có 9 gen tổng hợp adenine ở loài nấm này: ade1, ade2, ade3 trong đó ade3 có hai locus nằm kề sát nhau là ade3A và ade3B (Hình 3.9). Qua nghiên cứu các gen sản xuất adenine người ta nhận thấy quá trình tổng hợp adenine có liên quan đến 9 nhóm đột biến của gen này hoặc gen kia, và đều cùng có một kết quả là mất khả năng tổng hợp adenine. Như vậy, khái niệm gen không chỉ kiểm tra di truyền cả chu trình tổng hợp adenine, mà gen là đơn vị chức năng nhỏ nhất, kiểm tra một giai đoạn cơ bản nào đó Sinh học phân tử 74
của chu trình. Nếu biến đổi di truyền làm sai hỏng chức năng đó sẽ dẫn đến xuất hiện đột biến mất khả năng tổng hợp adenine. ade3 ade5 A B I ade4 ade2 III ade6 IV ade7 V ade8 ade1 VI Hình 3.9. Vị trí các gen ade trên các nhiễm sắc thể của nấm mốc Neurospora crassa Tài liệu tham khảo/đọc thêm 1. Hồ Huỳnh Thùy Dương. 1998. Sinh học phân tử. NXB Giáo dục, Hà Nội. 2. Phạm Thành Hổ. 2003. Di truyền học. NXB Giáo dục, Hà Nội. 3. Alberts B, Bray D, Lewis J, Raff M, Roberts K and Watson JD. 2002. Molecular Biology of the Cell. 3rd ed. Garland Publishing, Inc. New York, USA. 4. Lewin B. 2000. Gene VII. Oxford University Press, Oxford, UK. 5. Pierce BA. 2003. Genetics: A Conceptual Approach. W.H. Freeman & Co. New York, USA. 6. Watson JD, Hopkins NH, Roberts JW and Weiner AM. 2004. Molecular Biology of the Gene. The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. California, USA. Sinh học phân tử 75
Chương 4 Tái bản DNA I. Chứng minh tái bản DNA theo cơ chế bán bảo thủ 1. Cơ chế tái bản bán bảo thủ 1.1. Cơ chế tái bản ở prokaryote Đặc điểm cơ bản của sự tái bản đó là tái bản theo phương thức bán bảo thủ (semiconservative replication). Tái bản bán bảo thủ nghĩa là trong hai chuỗi của tất cả các phân tử DNA bao giờ cũng có: - Một chuỗi của DNA cũ (từ một trong hai chuỗi của DNA mẹ). - Một chuỗi của DNA mới (mới được tổng hợp). Mỗi một lần tái bản đều có sự tách rời của hai chuỗi của DNA mẹ, đồng thời mỗi chuỗi mẹ tiến hành sao chép để cho một chuỗi con, chuỗi này sau đó lại kết hợp với chuỗi mẹ. Vị trí mở xoắn kép và tổng hợp DNA mới cùng một lúc trên DNA gọi là chạc ba tái bản (replication fork) do cấu trúc của vùng tái bản có hình chữ Y. Sự tổng hợp DNA mới gắn liền với việc mở xoắn DNA cũ. 1.2. Cơ chế tái bản ở eukaryote Sự tái bản ở tế bào eukaryote phức tạp hơn so với ở tế bào prokaryote nhưng cơ chế của sự tái bản ở eukaryote cũng tương tự như ở prokaryote và tiến hành theo các nguyên tắc: - Hai hướng. - Bổ sung, đối song song, theo chiều 5’ 3’. - Không liên tục ở một trong hai chuỗi. - Cần những RNA primer. Tuy nhiên, có một số điểm khác như sau: - Trong khi ở prokaryote chỉ có một điểm khởi đầu, thì sự tái bản ở eukaryote bắt đầu cùng một lúc ở nhiều điểm khởi đầu. Điều này là cần thiết do DNA của eukaryote có chiều dài rất lớn. - Vận tốc phát triển của chạc ba tái bản ở eukaryote (khoảng 50 nucleotide/s) chỉ bằng 1/10 so với ở E. coli. Sinh học phân tử 76
2. Thí nghiệm của Meselson và Stahl Những thí nghiệm của Meselson và Stahl (1957) đã chứng minh lý thuyết tái bản DNA theo kiểu bán báo thủ (Hình 4.1). Các tác giả trên đã 15 nuôi cấy E. coli trong nhiều thế hệ trong một môi trường chứa NH4Cl làm nguồn cung cấp nitrogen duy nhất. Bằng cách này, DNA được tổng hợp có 15N (15N là một chất phóng xạ nặng hơn chất phóng xạ thông thường 14N). Ở một thời điểm nhất định (thời điểm 0), các tác giả này đã chuyển nuôi cấy 14 vào một môi trường chứa NH4Cl. Tiếp đến, sau từng thời gian đều đặn, họ phân tích DNA chiết xuất từ vi khuẩn bằng phương pháp ly tâm theo gradient CsCl. DNA được tách chiết và ly tâm để cân bằng theo grandient mật độ CsCl Các phân tử bố mẹ gốc DNA nặng (15N) H H Chuỗi mới Chuỗi mẹ Các phân tử con 15 14 DNA lai ( N/ N) thế hệ thứ nhất H L L H DNA nhẹ (14N) Các phân tử con DNA lai thế hệ thứ hai L L H L L H L L Hình 4.1. Minh họa sự tái bản bán bảo thủ. Sơ đồ trình bày sự hợp thành các sợi đôi DNA sau 0, 1, và 2 vòng sao chép. H: chuỗi nặng (15N), L: chuỗi nhẹ (14N). Kết quả thực nghiệm cho thấy: - Ở thời điểm 0: chỉ có một phân tử tương ứng với DNA nặng 15N. Sinh học phân tử 77
- Sau một thế hệ trong môi trường chứa 14N: những phân tử DNA gồm một chuỗi nặng 15N (chuỗi mẹ) và một chuỗi nhẹ 14N (mới được tổng hợp). - Sau hai thế hệ trong môi trường chứa 14N: có hai phân tử lai (gồm một chuỗi nặng và một chuỗi nhẹ) và hai phân tử đều gồm những chuỗi nhẹ không có chuỗi nặng. II. Mô hình tái bản DNA-chạc ba tái bản 1. Mô hình tái bản Mô hình tái bản được nghiên cứu trên thể nhiễm sắc của vi khuẩn E. coli, DNA có dạng mạch vòng sợi đôi (Hình 4.2). Để tự tái bản DNA phải tháo ra đơn giản ở một vị trí nhất định và nơi đó xuất hiện chạc ba tái bản (Hình 4.3). Thí nghiệm của Cairns. Sử dụng nucleotide được đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ trong môi trường đang phân chia, ta sẽ biết được tiến trình tái bản do hạt bạc xuất hiện dưới kính hiển vi điện tử. Sợi đôi của con Sợi đôi của bố mẹ Hình 4.2. DNA dạng mạch vòng sợi đôi. Chiều dài thực tế 1,6 mm (4,7×106 bp). 2. Chạc ba tái bản Hình 4.4 mô tả cấu trúc của chạc ba tái bản. Nhờ vào phương pháp phóng xạ ảnh tự ghi, người ta nhận thấy sự tái bản thực hiện theo hai hướng (bidirectional synthesis). Đồng thời cũng chứng minh được vi khuẩn E. coli (prokaryote) có duy nhất một điểm gốc tái bản, đó là điểm mà hai chuỗi xoắn kép của DNA mẹ được tách ra, tương ứng với hai chạc ba tái bản phát triển ngược chiều nhau. Chuỗi DNA sau khi tách ra được dùng làm khuôn mẫu cho sự tổng hợp DNA mới (Hình 4.5). Sinh học phân tử 78
A B Chuyển động của chạc ba tái bản Gốc Điểm đứt (nick) 1 Quay trong Một điểm đứt được bịt kín, một Hướng hướng cuộn điểm đứt khác được tạo ra cuộn Điểm đứt 2 Hình 4.3. Sự tái bản của phân tử DNA sợi đôi mạch vòng của E. coli. A: sự chuyển động không cuộn lại của các nhánh trong quỹ đạo tái bản, không có các vị trí quay tự do, gây ra sự cuộn lại quá chặt của phần không được tái bản. B: cơ chế sợi đơn bị đứt (nick) phía trước của chạc ba tái bản cho phép sự quay xảy ra. 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 5’ (a) 3’ (b) (c) Hình 4.4. Sơ đồ cấu trúc của các chạc ba tái bản. (a): Chạc ba đơn trình bày sợi chủ (leading strand) được tổng hợp liên tục và sợi thứ (lagging strand) được tổng hợp gián đoạn. (b): Chạc ba đôi, phổ biến trong hầu hết mọi sự tái bản DNA của genome. (c): Các hướng hình học của sự tái bản DNA, mũi tên ngắn chỉ sự chuyển động dịch mã của chạc ba, mũi tên dài và cong chỉ sự quay vòng DNA cần thiết quanh các chạc ba. Sinh học phân tử 79
Sợi đôi bố mẹ không tái bản Hướng di chuyển của chạc ba tái bản Sợi con được tái bản Hình 4.5. Hình ảnh dưới kính hiển vi điện tử. Phân tử DNA mạch vòng nhỏ của E. coli có chiều dài thực tế 0,01 mm (3.000 bp) tái bản bằng kiểu θ. Các đoạn DNA bố mẹ và con được trình bày trong hình vẽ. Hình 4.6 so sánh sự khác nhau giữa tái bản DNA không định hướng và tái bản theo hai hướng. Trong tái bản không định hướng, chỉ có một chạc ba tái bản. Trong khi tái bản theo hai hướng yêu cầu hai chạc ba tái bản. Mũi tên cong chỉ hướng chuyển động của các chạc ba. Hầu hết DNA tái bản theo hai hướng. Gốc tái bản Gốc tái bản Tái bản đồng thời Tái bản chỉ trong cả hai hướng trong một hướng Tái bản không Tái bản theo định hướng hai hướng Gốc tái bản Gốc tái bản Chạc ba Chạc ba Chạc ba tái bản tái bản tái bản Hình 4.6. Tái bản DNA không định hướng và theo hai hướng Hình 4.7 và 4.8 mô tả phương thức hợp nhất các vòng tái bản DNA ở ruồi giấm (D. melanogaster). Quá trình tái bản diễn ra đồng thời trên hàng chục ngàn vị trí khác nhau của phân tử DNA và tạo thành các vòng tái bản, các vòng tái bản sau đó sẽ mở rộng theo hai hướng để cuối cùng hợp nhất với nhau tạo thành hai phân tử DNA. Sinh học phân tử 80
Hình 4.7. Hình ảnh dưới kính hiển vi điện tử của một đoạn nucleotide ở ruồi giấm. Phân tử DNA sợi đôi dài 30 kb cho thấy có 7 vòng tái bản. Sự tái bản bắt đầu Gốc tái bản và theo hai hướng Gốc tái bản Sự tổng hợp khởi đầu ở gốc thứ hai và cũng theo hai hướng Hình 4.8. Phương thức hợp nhất các vòng tái bản DNA của ruồi giấm. Hai gốc tái bản được trình bày trên hình vẽ, các mũi tên nhỏ chỉ hướng chuyển động của các chạc ba tái bản. 3. Tái bản DNA theo vòng tròn quay Trường hợp bacteriophage λ (thực khuẩn thể λ) có vật chất di truyền là một phân tử DNA mạch thẳng sợi đôi, khi ta chuyển chúng vào vi khuẩn thì các đầu dính kết DNA (cos) của nó gắn lại theo dạng vòng tròn. Sự dính Sinh học phân tử 81
kết lại này là do hoạt động của enzyme DNA ligase giúp tạo lại dạng xoắn. Khi đó, sự tái bản DNA tiến hành theo cơ chế vòng tròn quay (Hình 4.9). Các nucleotide được bổ sung vào Sự kéo dài tiếp tục nhóm 3’-OH, chiếm chỗ của sợi của đầu 3’ có đầu tận cùng 5’-P Hướng quay 3’-OH 5’-P Nuclease cắt DNA Sợi có đầu tận cùng tạo ra nhóm 3’-OH 5’-P cũng được sao và nhóm 5’-P chép Hình 4.9. Tái bản vòng tròn quay ở bacteriophae . DNA được tổng hợp mới có màu nhạt. Sợi thay thế được tái bản trong các đoạn ngắn. III. Bản chất xoắn của DNA-Các giai đoạn của sự tái bản Hình 4.10 mô tả toàn bộ quá trình tái bản DNA. Quá trình này trải qua ba giai đoạn chính sau: 1. Mở xoắn Trước tiên ta thấy quá trình mở xoắn của hai sợi DNA cần thiết phải có một enzyme rất quan trọng đó là helicase (còn gọi là enzyme mở xoắn). Chẳng hạn, trên phân tử E. coli chỉ có một gốc tái bản (ký hiệu là ori C) dài 245 bp. Có ít nhất 8 enzyme hoặc protein tham gia vào giai đoạn khởi đầu của sự tái bản. Những enzyme-protein này mở xoắn DNA ở gốc ori C và thiết lập một phức hợp tiền mồi (prepriming complex) để chuẩn bị cho những phản ứng của giai đoạn sau. Một phức hợp khoảng 20 protein Dna A được kết hợp với một vùng của ori C bắt đầu cho quá trình mở xoắn và khởi đầu sự tái bản. Phản ứng này cần ATP và một protein giống như histone của vi khuẩn (HU). Tiếp đó, protein Dna C giúp protein Dna B gắn vào vùng ori C, Dna B chính là helicase sẽ mở xoắn DNA theo hai hướng để tạo ra hai chạc ba tái bản. Các phân tử protein liên kết sợi đơn (single stranded binding protein, protein SSB) gắn vào chuỗi đơn DNA để ổn định chuỗi này. Enzyme gyrase (DNA topoisomerase II) mở xoắn để tạo siêu xoắn trái ( ). Enzyme primase Sinh học phân tử 82
(protein Dna G) sẽ xúc tác tổng hợp RNA primer để gắn vào khuôn mẫu DNA. Kẹp Sợi chủ Polymerase III dimer Helicase Chạc ba tái bản DNA bố mẹ Khuôn mẫu sợi chủ Primase RNA primer Khuôn mẫu sợi thứ Các protein liên kết DNA sợi đơn (SSB) Ligase Polymerase I Đoạn Okazaki Hình 4.10. Quá trình tái bản DNA 2. Kéo dài-Tổng hợp chuỗi Okazaki Giai đoạn kéo dài bao gồm sự tổng hợp cùng một lúc hai chuỗi DNA. Một chuỗi được tái bản cùng hướng phát triển của chạc ba sẽ liên tục (sợi chủ), còn chuỗi kia sẽ không liên tục bao gồm các đoạn Okazaki (sợi thứ). Các nucleotide gắn vào đầu 3’ tự do, và kéo dài chuỗi ra nhờ enzyme DNA polymerase III theo chiều 5’ 3’. Trong giai đoạn này, nhiều enzyme đã tham gia vào sự tổng hợp hai chuỗi DNA tại chạc tái bản. DNA helicase tiếp tục tách hai chuỗi DNA mẹ, DNA gyrase mở xoắn, protein SSB ổn định những chuỗi DNA đơn đã được tách ra, DNA ligase gắn các đoạn Okazaki trên sợi thứ. - Sinh học phân tử 83