Giáo trình Nguyên lý và kỹ thuật chẩn đoán bệnh thủy sản - Đặng Thị Hoàng Oanh

Nội dung text: Giáo trình Nguyên lý và kỹ thuật chẩn đoán bệnh thủy sản - Đặng Thị Hoàng Oanh

1. THÔNG TIN VỀ TÁC GIẢ PHẠM VI VÀ ĐỐI TƯỢNG SỬ DỤNG CỦA GIÁO TRÌNH 1. THÔNG TIN VỀ TÁC GIẢ Họ và tên: Đặng Thị Hoàng Oanh Sinh năm:1969 Cơ quan công tác: Bộ môn: Sinh học và Bệnh Thuỷ sản Khoa: Thuỷ sản Trường: Đại học cần Thơ Địa chỉ Email để liên hệ: dthoanh@ctu.edu.vn 2. PHẠM VI VÀ ĐỐI TƯỢNG SỬ DỤNG Giáo trình có thể dùng tham khảo cho những ngành: Nuôi trồng thuỷ sản và bệnh học thuỷ sản Có thể dùng cho các trường nào: các trường Cao đẳng và đại học Các từ khóa: vi khuẩn, vi-rút, vi nấm, nguyên sinh động vật, PCR, kỹ thuật miễn dịch, bệnh cá, bệnh tôm, chẩn đoán, thủy sản Yêu cầu kiến thức trước khi học môn này: sinh học cơ bản, sinh hoá, sinh học phân tử đại cương Đã xuất bản in chưa, nếu có thì Nhà xuất bản nào: Giáo trình lưu hành nội bộ Đại Học Cần Thơ. Chưa xuất bản chính thức ở nhà xuất bản 2
2. MỤC LỤC THÔNG TIN VỀ TÁC GIẢ 2 MỤC LỤC 3 LỜI CẢM TẠ 8 GIỚI THIỆU 9 CHƯƠNG I: NHỮNG KIẾN THỨC TỔNG QUÁT 10 I.1. SỨC KHỎE VÀ ĐỘNG VẬT THỦY SẢN 10 I.2. NHỮNG VẤN ĐỀ CHUNG TRONG CHUẨN ĐOÁN BỆNH THỦY SẢN 10 I.2.1. Sự đồng nhất trong thao tác thu, xử lý và phân tích mẫu 10 I.2.2. So sánh kết quả giữa các phòng thí nghiệm 10 I.2.2.1. Các dạng kết quả và ý nghĩa của chúng 10 I.2.2.2. Phương thức so sánh, ví dụ: 11 I.2.3. Những vấn đề cần lưu ý 11 I.2.3.1. Giá trị giới hạn cho những phép phân tích 11 I.2.3.2. Tính hiệu lực của phương pháp chẩn đoán 11 I.2.3.3. Tính ổn định của phương pháp 11 I.2.3.4. Đối chứng 11 I.2.4. Phát hiện và chẩn đoán bệnh 12 I.2.4.1. Chẩn đoán lâm sàng 12 I.2.4.2. Những biện pháp sàng lọc (screening) 12 I.2.4.3. Phát hiện bệnh (detection) 12 I.2.4.4. Chẩn đoán bệnh (diagnostic) 12 I.2.4.5. Các con đường lây truyền bệnh (disease transmission) 12 I.2.5. Vai trò của chẩn đoán trong quản lý dịch bệnh thủy sản 13 I.2.6. Các mức độ trong chẩn đoán bệnh thủy sản 13 I.2.6.1. Mức I: 13 I.2.6.2. Mức 2: 14 I.2.6.3. Mức 3: 14 I.2.7. Phân nhóm kỹ thuật phát hiện/chẩn đoán bệnh ở thủy sản 14 I.2.8. Các kỹ thuật quan sát 17 I.2.8.1. Những kỹ thuật quan sát 17 I.2.8.2. Những kỹ thuật mô học đặc biệt 17 I.2.8.3. Kỹ thuật hiển vi điện tử 17 I.2.8.4. Các kỹ thuật nuôi vi sinh vật 17 I.2.9. Các kỹ thuật huyết thanh 17 I.2.10. Các kỹ thuật phân tử 17 I.3. TÀI LIỆU THAM KHẢO CHƯƠNG 1 18 CHƯƠNG II: CÁC PHƯƠNG PHÁP QUAN SÁT 19 II.1. QUAN SÁT DẤU HIỆU BỆNH, MẪU GIẢI PHẪU TƯƠI VÀ MÔ BỆNH HỌC 19 II.1.1.Phương pháp quan sát dấu hiệu bệnh 19 II.1.1.1.Những vấn đề cần lưu ý khi quan sát bệnh lý thủy sản 19 3
3. II.1.1.2. Quan sát bệnh lý ở tôm 20 II.1.1.3.Phương pháp quan sát bệnh lý ở cá 22 II.1.2. Phương pháp quan sát mẫu giải phẫu tươi 25 II.1.3. Phương pháp mô học 26 II.1.3.1. Mục tiêu 27 II.1.3.2. Những điều cần lưu ý khi sử dụng phương pháp mô bệnh học: 27 II.1.3.3. Phương pháp mô học bao gồm các bước: 27 II.2. KỸ THUẬT HÓA MÔ MIỄN DỊCH 28 II.2.1. Nguyên tắc 28 II.2.2. Ứng dụng 28 II.2.3. Mẫu phân tích 29 II.2.4. Thao tác 29 II.2.5. Ưu và nhược điểm của phương pháp 29 II.2.5.1. Ưu điểm: 29 II.2.5.2. Nhược điểm: 30 II.3. KỸ THUẬT NUÔI VI SINH VẬT 30 II.2.1. Nuôi vi khuẩn 30 II.2.1.1. Ứng dụng 30 II.2.1.2. Phương pháp 30 II.2.1.3. Mẫu phân tích 31 II.2.1.4. Ưu và nhược điểm của phương pháp 31 II.2.2. Nuôi nguyên sinh động vật 31 II.2.2.1. Ứng dụng 31 II.2.2.2. Phương pháp 31 II.2.2.3. Mẫu phân tích 31 II.2.2.4. Ưu và nhược điểm của phương pháp 31 II.2.3. Nuôi vi-rút 31 II.2.3.1. Ứng dụng 31 II.2.3.2. Phương pháp 32 II.2.3.3. Mẫu phân tích 32 II.2.3.4. Đọc kết quả 32 II.3. TÀI LIỆU THAM KHẢO CHƯƠNG II 33 CHƯƠNG III: CÁC KỸ THUẬT HUYẾT THANH 34 III.1. PHƯƠNG PHÁP KẾT TỦA MIỄN DỊCH 34 III.1.1. Nguyên lý 34 III.1.2. Ứng dụng 35 III.1.3. Mẫu phân tích 35 III.1.4. Các dạng khuếch tán miễn dịch 35 III.1.4.1. Kết tủa trong môi trường lỏng 35 III.1.4.2. Tủa trong môi trường gel 37 III.1.4.3. Miễn dịch khuếch tán điện 38 III.1.4.4. Miễn dịch khuếch tán: Điện di với miễn dịch khuếch tán in situ 38 III.1.5. Ưu và nhược điểm của phương pháp 39 III.1.5.1. Ư u đi ểm: 39 III.1.5.2. Nhược điểm: 39 4
4. III.2. PHƯƠNG PHÁP NGƯNG KẾT MIỄN DỊCH 39 III.2.1. Nguyên lý 39 III.2.2. Xếp loại các phản ứng ngưng kết 40 III.2.2.1. Ngưng kết trực tiếp: 40 III.2.2.2. Ngưng kết gián tiếp: 40 III.2.2.3. Ngưng kết nhân tạo: 40 III.2.3. Ứng dụng 41 III.2.4. Mẫu phân tích 41 III.2.5. Ưu và nhược điểm của phương pháp 41 III.2.5.1. Ư u đi ểm: 41 III.2.5.2. Nhược điểm: 41 III.3. KỸ THUẬT MIỄN DỊCH HUỲNH QUANG 41 III.3.1. Nguyên lý 41 III.3.2. Phương pháp 42 III.3.2.1. Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang trực tiếp 42 III.3.2.2. Kỹ thuật miễn dịch huỳng quang gián tiếp 42 III.3.3. Ứng dụng 43 III.3.4. Mẫu phân tích 43 III.3.5. Ưu và nhược điểm của phương pháp 43 III.3.5.1. Ưu điểm: 43 III.3.5.2. Nhược điểm: 43 III.4. KỸ THUẬT MIỄN DỊCH LIÊN KẾT ENZYM 44 III.4.1. Nguyên lý 44 III.4.2. Ứng dụng 45 III.4.3. Mẫu phân tích 45 III.4.4. Phương pháp 45 III.4.4.1. Kỹ thuật ELISA gián tiếp 45 III.4.4.2. Kỹ thuật ELISA trực tiếp 46 III.4.5. Ưu và nhược điểm của phương pháp 47 III.4.5.1. Ưu điểm: 47 III.4.5.2. Nhược điểm: 47 III.5. TÀI LIỆU THAM KHẢO CHƯƠNG III 47 CHƯƠNG 4: CÁC KỸ THUẬT PHÂN TỬ 48 IV.1. KỸ THUẬT PHẢN ỨNG CHUỖI TRÙNG HỢP 48 IV.1.1. Nguyên tắc 48 IV.1.1.1. Giai đoạn biến tính (denaturation): 48 IV.1.1.2. Giai đoạn lai (hybridization): 48 IV.1.1.3. Giai đoạn tổng hợp (hay kéo dài) (extension): 48 IV.1.2. Ứng dụng 49 IV.1.3. Phương pháp 50 IV.1.3.1. Ly trích DNA hay RNA từ vật chủ để sử dụng làm mạch khuôn 50 IV.1.3.2. Chuẩn bị 50 IV.1.3.3. Đối chứng 51 IV.1.4. Các hạn chế của phương pháp PCR 52 IV.1.5. Các dạng PCR 52 5
5. IV.1.5.1. PCR truyền thống 52 IV.1.5.2. PCR phiên mã ngược 53 IV.1.5.3. PCR thời gian thật 54 IV.2. KỸ THUẬT PHÂN TÍCH TÍNH ĐA DẠNG VỀ CHIỀU DÀI ĐOẠN GIỚI HẠN 54 IV.2.1. Nguyên lý 54 IV.2.2. Phương pháp 54 IV.2.3. Hệ thống phi phóng xạ DIG 55 IV.2.4. Ứng dụng của kỹ thuật lai Southern 56 IV.2.5. Mẫu phân tích 57 IV.2.6. Ưu và nhược điểm 57 IV.2.6.1. Ưu điểm: 57 IV.2.6.2. Nhược điểm: 57 IV.3. KỸ THUẬT LAI IN SITU 57 IV.3.1. Nguyên lý 57 IV.3.2. Ứng dụng 57 IV.3.3. Mẫu phân tích 57 IV.3.4. Ưu và nhược điểm của phương pháp 58 IV.3.4.1. Ưu điểm: 58 IV.3.4.2. Nhược điểm: 58 IV.4. TÀI LIỆU THAM KHẢO CHƯƠNG IV 58 CHƯƠNG V: MỘT SỐ QUI TRÌNH PHÁT HIỆN BỆNH Ở THỦY SẢN 59 V.1. PHÁT HIỆN VI-RÚT ĐỐM TRẮNG Ở TÔM BẰNG KỸ THUẬT PCR 59 V.1.1. Ðối tượng và phạm vi áp dụng 59 V.1.2. Tài liệu tham khảo xây dựng tiêu chuẩn ngành 59 V.1.3. Giải thích thuật ngữ 59 V.1.4. Thiết bị, dụng cụ, mồi và hóa chất 60 V.1.4.1. Thiết bị, dụng cụ 60 V.1.4.2. Mồi, hóa chất 61 V.1.5. Chuẩn bị mẫu 62 V.1.5.1. Số lượng mẫu 62 V.1.5.2. Yêu cầu đối với mẫu để phân tích 63 V.1.6. Phương pháp tiến hành 63 V.1.6.1. Xử lý mẫu 63 V.1.6.2. Phản ứng khuếch đại PCR 63 V.1.6.3. Tiến hành điện di 64 V.1.7. Ðọc kết quả 64 V.1.8. Quy định về đảm bảo an toàn 65 V.2. PHÁT HIỆN YHV VÀ GAV BẰNG KIT IQ2000 YHV/GAV 65 V.2.1. Giới thiệu 65 V.2.2. Thành phần 65 V.2.3. Thiết bị và hóa chất 66 V.2.4. Giới hạn phát hiện và tính nhạy 67 V.2.5. Chuẩn bị mẫu và ly trích RNA 67 6
6. V.2.5.1 Thao tác ly trích RNA 67 V.2.5.2. Hoà tan RNA 68 V.2.6. Qui trình khuếch đại 68 V.2.6.1. Chuẩn bị hoá chất phản ứng 68 V.2.6.2. Điều kiện phản ứng 68 V.2.6.3. Phương thức chuẩn bị phản ứng 69 V.2.7. Điện di 70 V.2.7.1. Chuẩn bị bản thạch (gel) 70 V.2.7.2. Điện di 70 V.2.7.3. Thuốc nhuộm gel và đọc kết quả 71 V.2.8. Đọc kết quả 71 V.2.9. Khắc phục sự cố kỹ thuật 73 V.3. PHÁT HIỆN VI KHUẨN Ở CÁ BẰNG PHƯƠNG PHÁP RFLP 74 V.3.1 Phương pháp thu mẫu bệnh phẩm và phân lập vi khuẩn 74 V.3.2 Phương pháp RFLP 74 V.3.2.1. Ly trích DNA 74 V.3.2.2. Cắt DNA bằng enzym giới hạn 74 V.3.2.3. Quá trình khử puria, biến tính và thấm chuyển 75 V.3.2.4. Quá trình tiền lai và lai DNA trên màng 75 V.3.2.5. Phát hiện các vạch DNA 75 V.3.3. Xử lý thống kê 75 V.3.4. Đọc kết quả 76 PHỤ LỤC 1: CÁC BƯỚC THU MẪU CHẨN ĐOÁN BỆNH 77 1. Phụ lục 1a. Các bước thu mẫu chẩn đoán bệnh ở cá 77 2. Phụ lục 1b. Các bước thu mẫu chẩn đoán bệnh ở tôm 79 3. Phụ lục 1c. Các bước thu mẫu chẩn đoán bệnh ở nhuyễn thể 80 PHỤ LỤC 2: CÁC DẤU HIỆU BỆNH THƯỜNG GẶP Ở TÔM 83 PHỤ LỤC 3: CÁC DẤU HIỆU BỆNH THƯỜNG GẶP Ở CÁ 87 PHỤ LỤC 4: PHƯƠNG PHÁP NHUỘM HEMATOXYLIN VÀ PHLOXINE/EOSIN 90 1. Công thức pha thuốc nhuộm Hematoxylin và Phloxine/Eosin (H&E) 90 2. Qui trình nhuộm Mayer-Bennett Hematoxylin và Phloxine/Eosin (H&E) 90 PHỤ LỤC 5: CÔNG THỨC DUNG DỊCH DAVIDSON,S AFA CỦA HUMASON,1972) 92 PHỤ LỤC 6: PHƯƠNG PHÁP NHUỘM NHANH PHÁT HIỆN MBV, YHV VÀ WSSV 93 A. Phát hiện MBV bằng phương pháp nhuộm Malachite Green 93 B. Phát hiện YHV bằng phương pháp nhuộm Wright - Giemsa 94 C. Phát hiện WSSV bằng phương pháp nhuộm Haematoxyline và Eosin 95 7
7. LỜI CẢM TẠ Tác giả chân thành cảm tạ Tiến sỹ Ngô Thị Thu Thảo và Thạc sỹ Trần Thị Tuyết Hoa đã góp ý về mặt hình thức và nội dung cho giáo trình. Xin cảm ơn sự giúp đở của Cô Phạm Trần Nguyên Thảo và hai em sinh viên Phạm Thị Ngọc Yến và Hoàng Tuấn lớp bệnh học thủy sản khoá 29 trong quá trình chỉnh sửa và chuẩn bị bản in giáo trình. 8
8. GIỚI THIỆU Quá trình xét nghiệm bệnh phẩm thủy sản thường có nhiều khả năng người phân tích thu được kết quả chẩn đoán là các tác nhân gây bệnh cơ hội hơn là tác nhân gây bệnh chủ yếu. Kết quả chẩn đoán bệnh phụ thuộc rất lớn vào tính sẵn có của phương pháp chẩn đoán đang được áp dụng ở phòng thí nghiệm, lãnh vực nghiên cứu của người thực hiện việc chẩn đoán hoặc những phép chẩn đoán được phát triển trên cơ sở các loài địa phương. Nắm vững nguyên tắc của các kỹ thuật đoán và cách đọc kết quả một cách chuẩn xác có ý nghĩa rất quan trọng. Môn học nguyên lý và kỹ thuật chẩn đoán bệnh thủy sản là môn học kỹ thuật chuyên ngành bệnh học thủy sản cung cấp cho sinh viên những hiểu biết về nguyên lý và phương pháp thực hiện các kỹ thuật chẩn đoán bệnh ở thủy sản. Đồng thời môn học cũng giới thiệu các lãnh vực ứng dụng của các phương pháp trong chẩn đoán bệnh thủy sản. Một phương pháp có thể được ứng dụng để phát hiện/chẩn đoán nhiều mầm bệnh. Phần thực hành của môn học cung cấp những kiến thức và kỹ năng hỗ trợ cho phần lý thuyết và cũng là cơ sở để sinh viên tiếp cận các phương pháp cơ bản trong chẩn đoán bệnh thủy sản. Phần tài liệu tham khảo được sử dụng để xây dựng giáo trình được trình bày sau mỗi chương. Sinh viên có thể tìm thấy các tài liệu này từ trung tâm học liệu Đại học Cần thơ, thư viện Khoa Thủy sản hay tài liệu cá nhân của giảng viên. 9
9. CHƯƠNG I: NHỮNG KIẾN THỨC TỔNG QUÁT I.1. SỨC KHỎE VÀ ĐỘNG VẬT THỦY SẢN Khác với các vật nuôi ở trên cạn, động vật thủy sản thường đòi hỏi sự theo dõi nhiều hơn về môi trường và sức khỏe của chúng. Do sống ở dưới nước nên hoạt động của động vật thủy sản thường rất khó quan sát trừ khi chúng được bắt ra khỏi mặt nước hoặc khi bị bệnh. Động vật thủy sản lại sống trong môi trường sinh thái phức tạp và thường xuyên biến động. Thêm vào đó, thức ăn thừa, thủy sản chết và nhiều thứ khác luôn ẩn ở dưới đáy ao. Các đối tượng nuôi thủy sản rất đa dạng về loài, về môi trường sống, mức độ thâm canh của kỹ thuật nuôi và hệ thống nuôi được áp dụng. Các dạng bệnh ở động vật thủy sản cũng đa dạng và có nhiều biến đổi, trong đó có một số bệnh chưa xác định được vật chủ và có nhiều bệnh không có dấu hiệu lâm sàng riêng biệt. Bệnh trong nuôi thủy sản thường không do một nguyên nhân riêng lẻ mà là kết quả của một loại các sự kiện/nguyên nhân có liên quan với nhau trong đó có cả sự tương tác giữa vật chủ (bao gồm các điều kiện về sinh lý, sinh sản và giai đoạn phát triển), môi trường và sự hiện diện của mầm bệnh. Sự hiện diện của một mầm bệnh trong mô tôm/cá không có nghĩa mầm bệnh đó là nguyên nhân chính gây ra bệnh. Phần lớn nguyên nhân đầu tiên gây bệnh là do những biến đổi xấu về môi trường gây tổn thương đến cơ thể hoặc làm giảm đi khả năng kháng bệnh của tôm/cá. Trong lúc đó mầm bệnh sẵn có trong môi trường sẽ nhân cơ hội này xâm nhập vào cơ thể chúng. Do vậy cần phải xem xét cả vật chủ, mầm bệnh và môi trường để xác định nguyên nhân gây bệnh nhằm có biện pháp phòng ngừa và xử lý thích hợp. I.2. NHỮNG VẤN ĐỀ CHUNG TRONG CHUẨN ĐOÁN BỆNH THỦY SẢN I.2.1. Sự đồng nhất trong thao tác thu, xử lý và phân tích mẫu Thao tác thu, xử lý và phân tích mẫu là một trong những yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến kết quả của các phép chẩn đoán bệnh. Thời gian thu mẫu, khoảng cách giữa các lần thu mẫu, phương pháp cố định mẫu, nhiệt độ bảo quản mẫu, chất lượng của môi trường phân lập, thời gian sử dụng của các dung dịch hoá chất sau khi chuẩn bị, vv, đều là những vấn đề cần được cân nhắc trong quá trình phân tích mẫu. Số lần mẫu được đông lạnh rồi rả đông cũng ảnh hưởng đến kết quả phân tích. Giữa các phòng thí nghiệm và các phép phân tích được sử dụng phải đồng nhất thì kết quả đạt được mới có ý nghĩa về mặt so sánh. I.2.2. So sánh kết quả giữa các phòng thí nghiệm Để so sánh kết quả phân tích hay kết quả chẩn đoán từ các phòng thí nghiệm chẩn đoán bệnh thủy sản, các yếu tố sau đây cần phải được xem xét: I.2.2.1. Các dạng kết quả và ý nghĩa của chúng 10
10. I.2.2.2. Phương thức so sánh, ví dụ: - Mật số vi-rút so với hàm lượng kháng thể - Giới hạn xác định kết quả dương và âm tính - Độ nhạy của phương pháp (ví dụ như % kết quả dương tính thật trên số kết quả dương tính) - Tính chuyên biệt (ví dụ như % kết quả âm tính thật trên số kết quả âm tính) - Các tính toán và đọc kết quả - Các đối chứng I.2.3. Những vấn đề cần lưu ý I.2.3.1. Giá trị giới hạn cho những phép phân tích Cần phải thiết lập những giá trị giới hạn cho những phép phân tích mà kết quả thu được có tính định lượng để xác định kết quả âm tính và dương tính. Giá trị giới hạn này sẽ ảnh hưởng đến kết quả âm tính và dương tính giả cũng như kết quả âm và dương tính thật. I.2.3.2. Tính hiệu lực của phương pháp chẩn đoán Một phương pháp phân tích mẫu hay thử nghiệm có tính hiệu lực là phương pháp có thể cho ra kết quả phân biệt rõ ràng giữa kết quả dương tính và âm tính hoặc giữa cá thể bị nhiễm bệnh và không bị nhiễm bệnh. Tính hiệu lực của phương pháp biểu hiệu qua hai đặc điểm là tính nhạy (khả năng xác định chính xác mẫu có nhiễm hay không) và tính chuyên biệt (khả năng phát hiện mẫu không có nhiễm bệnh). Tính hiệu lực của phương pháp được xác định bằng cách so sánh các cá thể cùng loài trong cùng một mẫu. Trong trường hợp khác kết quả phải được kiểm định bằng các kỹ thuật mô học. I.2.3.3. Tính ổn định của phương pháp Một phương pháp được gọi là ổn định khi phương pháp đó cho ra kết quả tin cậy và giống nhau sau nhiều lần lập lại. Hai yếu tố quyết định cho tính ổn định của phương pháp là: biến động giữa các cá thể phân tích và biến động giữa các lần đọc kết quả. I.2.3.4. Đối chứng Đối chứng phải được bố trí trong tất cả các phân tích, gồm có đối chứng dương và đối chứng âm. Lý tưởng nhất là đối chứng chuyên biệt cho loài cho tất cả các phân tích. Các xét nghiệm phân tử như trường hợp của phản ứng chuỗi trùng hợp (polymerase chain reaction-PCR) phải 11
11. có đối chứng DNA để theo dõi khả năng tạp nhiễm giữa các mẫu trong quá trình ly trích, đối chứng là DNA của vật chủ để kiểm soát khả năng khuếch đại DNA của mẫu và đối chứng PCR để kiểm soát sự tạp nhiễm trong quá trình thực hiện phản ứng. I.2.4. Phát hiện và chẩn đoán bệnh I.2.4.1. Chẩn đoán lâm sàng Qua chẩn đoán lâm sàng những ảnh hưởng của bệnh được ghi nhận và mô tả, từ việc quan sát tổng quát, những thay đổi về tập tính hay hoạt động, những vết lở loét hay những vùng bị tổn thương khác ở bên ngoài cho đến những quan sát, ghi nhận và mô tả ở mức hiển vi bệnh lý của các nội quan. I.2.4.2. Những biện pháp sàng lọc (screening) Những biện pháp sàng lọc bao gồm tất cả những phương pháp xét nghiệm được áp dụng trên cơ thể sinh vật khoẻ nhằm để kiểm tra xem chúng có bị nhiễm những mầm bệnh truyền mhiễm có khả năng gây bệnh về sau hay không. I.2.4.3. Phát hiện bệnh (detection) - Xác định sự hiện diện của nhóm hay loại mầm bệnh nào đó - Xác định mức độ cảm nhiễm (tự nhiên hoặc nhân tạo) của mầm bệnh trong mẫu phân tích I.2.4.4. Chẩn đoán bệnh (diagnostic) - Xác định sự hiện diện của mầm bệnh chuyên biệt ở mức loài, chủng hay các dạng biến hoá của mầm bệnh đó - Mức độ cảm nhiễm dù ít hay nhiều của mầm bệnh qua chẩn đoán có ý nghĩa là vật chủ đang bị nguy hiểm • Chẩn đoán sơ bộ (Presumptive Diagnosis) – các chẩn đoán bước đầu dựa trên những quan sát tổng quan và những chứng cứ gián tiếp. Qua chẩn đoán sơ bộ thường thấy có nhiều tác nhân gây bệnh. • Chần đoán xác định (Confirmatory Diagnosis) – kết quả xét nghiệm dương tính thật của mầm bệnh với độ tin cậy của phương thức xét nghiệm cao. I.2.4.5. Các con đường lây truyền bệnh (disease transmission) Trong chẩn đoán và xác định nguyên nhân gây bệnh thì các con đường lây truyền bệnh thường được biết đến như là dịch tể (epidemiology hoặc epizootiology) của bệnh đó. Những hình thức lây truyền của bệnh và các yếu tố tác động đến quá trình lây truyền bệnh (môi trường, thao tác, giai đoạn phát triển, ổ bệnh, vv.) thường phải được tìm hiểu, ghi nhận trong quá trình khảo sát, điều tra, theo dõi và nghiên cứu về bệnh. 12
12. I.2.5. Vai trò của chẩn đoán trong quản lý dịch bệnh thủy sản Chẩn đoán có hai vai trò quan trọng trong quản lý và khống chế bệnh thủy sản. Trước hết, các kỹ thuật chẩn đoán bệnh thủy sản được ứng dụng rất hiệu quả để sàng lọc những cá thể mang những mầm bệnh nguy hiểm nhất là trong chọn giống thủy sản hoặc chọn những cá thể khỏe mạnh để vận chuyển từ nơi này đến nơi khác. Việc sàng lọc bệnh có hai lợi ích: (a) làm giảm rủi ro bộc phát bệnh do những cá thể mang mầm bệnh gây nên do sốc, thao tác hay do môi trường thay đổi trong quá trình vận chuyển và (b) làm giảm rủi ro lây bệnh của những cá thể mang mầm bệnh nhưng kháng được bệnh. Vai trò thứ hai của chẩn đoán bệnh là giúp xác định nguyên nhân gây nên tình trạng sức khỏe kém hoặc những biểu hiện bất thường về sinh sản, tăng trưởng hay hoạt động để có thể đề xuất những bước tiếp theo trong quá trình tìm ra nguyên nhân gây bệnh và đề xuất giải pháp khống chế hoặc xử lý bệnh tùy theo từng điều kiện cụ thể. Đây là vai trò trực tiếp và rõ ràng nhất của việc chẩn đoán bệnh thủy sản. Chẩn đoán chính xác một bệnh thường được xem xét một cách không đúng là do quá phức tạp và tốn kém. Điều này có thể chỉ đúng trong trường hợp phải đối phó với những bệnh khó chẩn đoán hoặc với những bệnh mới xuất hiện. Chẩn đoán bệnh không chỉ đơn thuần là thực hiện các xét nghiệm trong phòng thí nghiệm. Kết quả xét nghiệm giúp xác định sự hiện diện của một mầm bệnh nào đó, hoặc có thể loại trừ sự có mặt của mầm bệnh tùy vào mức độ phát hiện của phương pháp được sử dụng. Chẩn đoán sai dẫn đến phòng và trị bệnh không hiệu quả và thậm chí là rất tốn kém. Ví dụ như có một tác nhân gây bệnh mới xuất hiện ở một vùng nuôi thủy sản trọng điểm nào đó hay đối tượng thủy sản được thả nuôi chết hàng loại trong quá trình vận chuyển hay thao tác trong trại như chuyển ao, đóng túi để vận chuyển, vv. Việc chẩn đoán phải được thực hiện bằng những quan sát, theo dõi liên tục bắt đầu từ trại sản xuất, thật ra đây là việc cần làm trước khi bệnh xảy ra. I.2.6. Các mức độ trong chẩn đoán bệnh thủy sản Theo tài liệu hướng dẫn chẩn đoán bệnh ở thủy sản nuôi ở Châu Á (Asia Diagnostic guide for aquatic animal disease. FAO fisheries technical paper 402/2) thì chẩn đoán bệnh thủy sản được chia thành ba mức độ (xem chi tiết ở bảng 1) với những bước thực hiện và yêu cầu tùy theo mỗi mức độ chẩn đoán. Các mức độ chẩn đoán không có ý nghĩa từng mức độ riêng lẻ mà mang tính liên hoàn bổ sung dữ liệu và thông tin cho nhau để đạt được một chẩn đoán hoàn hảo. Mức độ 1 cung cấp những thông tin căn bản làm cơ sở cho chẩn đoán mức 2 và 3 do việc chẩn đoán ở các mức độ cao hơn chỉ có thể được xác định chính xác khi có sự liên kết với những quan sát và kết quả thu được ở những mức độ chẩn đoán thấp hơn. I.2.6.1. Mức I: Gồm những quan sát về trại nuôi, thông tin về sản xuất, những ghi nhận trong quá trình nuôi và việc quản lý sức khỏe. Những thông tin này cho biết về các nhân tố kích thích sự bộc phát bệnh để làm cơ sở cho mức độ chẩn đoán 2 và 3. 13
13. I.2.6.2. Mức 2: Gồm những xét nghiệm chuyên biệt về ký sinh trùng, mô bệnh học, vi khuẩn hay nấm. Những xét nghiệm này có những yêu cầu nhất định về kinh phí cho dụng cụ, thiết bị và hoá chất cũng như đào tạo cán bộ chuyên môn. Nhìn chung chẩn đoán mức hai không thể thực hiện ở trại nuôi. I.2.6.3. Mức 3: Gồm những dạng chẩn đoán có tính chuyên biệt cao yêu cầu có sự đầu tư thích đáng về kinh phí cho dụng cụ, thiết bị và hoá chất cũng như đào tạo cán bộ chuyên môn. Chẩn đoán mức 3 bao gồm những kỹ thuật phân tử và kỹ thuật miễn dịch. Mặc dù hiện tại có một vài bộ kít được phát triển cho việc chẩn đoán nhanh tại các trại nuôi (mức 1) hay sử dụng trong các phòng thí nghiệm vi sinh vật và mô học (mức 2). Một trong số các vấn đề quan trọng để đạt hiệu quả chẩn đoán cao nhất ở cả ba mức độ chẩn đoán bệnh là phải đảm bảo rằng những người làm công việc chẩn đoán ở mức 1 phải có liên lạc và biết cách liên lạc với các phòng thí nghiệm thực hiện chẩn đoán mức 2 và 3 và ngược lại các phòng thí nghiệm mức 2 và 3 cũng phải có mối liên lạc với những người thực hiện chẩn đoán mức 1. Chẩn đoán mức 3 thường cung cấp những thông tin thuần túy về mặt xét nghiệm trong phòng thí nghiệm nên cần phải có những thông tin về các điều kiện thực tế ở trại nuôi thì việc chẩn đoán mới thật sự mang lại hiệu quả thực tế. Như vậy, chẩn đoán mức 1 là nhằm mục đích chẩn đoán bước đầu về bệnh và được xem như là cái mốc của quá trình chẩn đoán. Các chẩn đoán xác định (mức 2 và 3) chỉ có thể được thực hiện khi mà khả năng chẩn đoán bước 1 đã được thiết lập. Việc thành lập các phòng thí nghiệm cho chẩn đoán mức 2 và 3 thường là tùy thuộc vào tình hình và mức độ nghiêm trọng của dịch bệnh mà những người thực hiện việc chẩn đoán mức 1 phải đối phó và giải quyết. I.2.7. Phân nhóm kỹ thuật phát hiện/chẩn đoán bệnh ở thủy sản Các kỹ thuật phát hiện/chẩn đoán bệnh ở thủy sản có thể được phân nhóm theo nhiều cách dựa vào dạng mầm bệnh (ví dụ: kỹ thuật vi khuẩn, kỹ thuật vi-rút ) hoặc dựa vào phương pháp được sử dụng (ví dụ: kỹ thuật hiển vi điển tử, kỹ thuật miễn dịch ). Trong giáo trình này các kỹ thuật chẩn đoán bệnh thuỷ sản được chia thành 3 dạng chính dựa theo tài liệu của IAAAM (International Association of Aquatic Animal medicine, (1) các kỹ thuật quan sát bằng mắt thường và bằng kính hiển vi; (2) các kỹ thuật huyết thanh và (3) các kỹ thuật phân tử. 14
14. Bảng 1. Các mức độ chẩn đoán bệnh và các điều kiện liên quan Mức Những việc Kiến thức cần phải có Người thực hiện Yêu cầu về mặt kỹ thuật độ cần làm I Quan sát vật Hiểu biết về phương thức cho ăn, quan Người nuôi thủy Những hiểu biết về chính về quan sát thực địa nuôi và môi sát hoạt động và sự tăng trưởng của thủy sản/quản đốc trại nuôi trường sản nuôi Mẫu theo dõi các thông tin về trại nuôi Cán bộ khuyến ngư Xét nghiệm Thường xuyên theo dõi ao nuôi Các dụng cụ cần thiết lâm sàng tổng Cán bộ hỗ trợ về quát Thường xuyên ghi nhận thông tin về môi ngư y Mẫu quan sát lâm sàng trường và những diễn biến của ao nuôi để hỗ trợ cho các chẩn đoán ở mức 2 và 3 Cán bộ phụ trách kỹ Mẫu theo dõi ao nuôi thuật nuôi thủy sản Hiểu biết các bước cần thực hiện để liên Lưu trữ mẫu/vận chuyển mẫu đến phòng thí lạc và gởi mẫu xét nghiệm mức 2 và 3 ở nghiệm phân tích mức 2 các PTN bệnh thủy sản. Các bước quan sát, theo dõi phát hiện bệnh. Tài liệu hướng dẫn chẩn đoán bệnh thủy sản II Ký sinh trùng PTN được trang bị cơ bản về thiết bị và Cán bộ chuyên môn Hệ thống lưu trữ mẫu dụng cụ phục vụ cho việc phát hiện/chẩn về sinh học thủy sản Vi khuẩn đoán mầm bệnh cũng như cán bô có trình Lưu trữ mẫu/vận chuyển mẫu đến phòng thí độ chuyên môn về bệnh thủy sản. Cán bộ chuyên môn nghiệm phân tích mức 3 Nấm về bệnh Lưu giữ, ghi nhân đầy đủ và duy trì bài Thiết bị và hoá chất cho xét nghiệm mức 2 Mô bệnh học bản và chính xác kết quả chẩn đoán. Cán bộ chuyên môn về ký sinh trùng Qui trình xét nghiệm và cán bộ có trình độ xét Có khả năng lưu giữ và duy trì nguồn mẫu nghiệm ở mức 2 Cán bộ chuyên môn
15. đạt tiêu chuẩn cho chẩn đoán mức 3. về nấm Các tài liệu hướng dẫn chẩn đoán bệnh thủy Hiểu biết sự cần thiết khi phải chẩn đoán Cán bộ chuyên môn sản mức 3 và cách liên lạc, chuẩn bị mẫu và về vi khuẩn chuyển mẫu để chẩn đoán mức 3 Cán bộ chuyên môn về mô bệnh học III Vi-rút Đòi hỏi PTN có trang bị thiết bị và dụng Cán bộ chuyên môn Thiết bị và hoá chất cho xét nghiệm mức 3 cụ hiện đại cũng như cán bộ kỹ thuật về vi-rút Hiển vi điện phải có trình độ chuyên môn cao. Qui trình xét nghiệm và cán bộ có trình độ xét tử Cán bộ chuyên môn nghiệm ở mức 3 Lưu giữ, ghi nhân đầy đủ và duy trì bài về mô bệnh học Sinh học bản và chính xác kết quả chẩn đoán. Qui trình lưu giữ mẫu và các thao tác chuẩn phân tử Chuyên gia và kỹ hoá/đồng nhất phương pháp với các phòng thí Có khả năng lưu giữ và duy trì nguồn thuật viên về sinh nghiệm khác Miễn dịch mẫu đạt tiêu chuẩn cho các mục đích học phân tử nghiên cứu Các tài liệu hướng dẫn chẩn đoán bệnh thủy sản Duy trì sự liên hệ với những người có Tài liệu chẩn đoán bệnh bằng phương pháp trách nhiệm và các cơ quan chức năng phân tử gởi mẫu xét nghiệm. 16
16. I.2.8. Các kỹ thuật quan sát I.2.8.1. Những kỹ thuật quan sát Gồm những kỹ thuật quan sát mẫu bệnh phẩm bằng mắt thường, quan sát tiêu bản tươi bằng kính hiển vi giải phẫu. Qua những thủ thuật quan sát này người chẩn đoán có thể ghi nhận những thông tin ban đầu về bệnh như các dấu hiệu lâm sàng, ký sinh trùng và tình trạng các mô của cơ thể trước và sau khi tử vong. Mẫu cũng có thể được cố định bằng những dung dịch cố định thích hợp để quan sát bằng kỹ thuật mô bệnh học. I.2.8.2. Những kỹ thuật mô học đặc biệt Một số kỹ thuật mô học đặc biệt như kỹ thuật hóa mô miễn dịch hay hóa huỳnh quang miễn dịch, sử dụng các kỹ thuật miễn dịch trực tiếp trên tiêu bản mô bệnh, được sử dụng trong chẩn đoán mức 2 và 3. I.2.8.3. Kỹ thuật hiển vi điện tử Kính hiển vi điện tử được sử dụng ở những phòng thí nghiệm mức 3 để quan sát vi sinh vật. Qua kính hiển vi điện tử người ta có thể quan sát cấu tạo bề mặt của các vi sinh vật, hình thái bên ngoài của chúng, hoặc cấu tạo bên trong ở mức độ mô và vi mô. I.2.8.4. Các kỹ thuật nuôi vi sinh vật Các kỹ thuật nuôi vi sinh vật (như vi khuẩn, vi-rút, ký sinh trùng và nấm) bằng các môi trường chọn lọc chuyên cho một số mầm bệnh cũng được mộ số phòng thí nghiệm dùng trong chẩn đoán. I.2.9. Các kỹ thuật huyết thanh Gồm có những xét nghiệm sử dụng kháng thể hoặc sử dụng kháng nguyên. Những xét nghiệm sử dụng kháng thể giúp xác định đáp ứng của kháng thể vật chủ với kháng nguyên. Tuy nhiên những xét nghiệm này không có tính xác định tình trạng nhiễm bệnh. Trong khi đó những xét nghiệm sử dụng kháng nguyên giúp phát hiện những phân tử kháng nguyên bề mặt của vi sinh vật nên có vai trò trong chẩn đoán xác định. I.2.10. Các kỹ thuật phân tử Những kỹ thuật phân tử giúp xác định sự hiện diện của tác nhân gây bệnh bằng cách phát hiện DNA hay RNA của mầm bệnh. Các kỹ thuật này cho phép phát hiện mầm bệnh trên cả mẫu bệnh phẩm còn sống lẫn mẫu đã chết.
17. I.3. TÀI LIỆU THAM KHẢO CHƯƠNG 1 1. Austin, B., and Austin, D. A. (999). Bacterial fish Pathogens: Disease of farmed and wild fish 3rd Edition. 2. Từ Thanh Dung, Đặng Thị Hoàng Oanh và Trần Thị Tuyết Hoa. (2005). Giáo trình bệnh học thủy sản. 3. Ellis, A. E. (1985). Fish and Shellfish Pathology. 4. FAO Asia Diagnostic guide for aquatic animal disease. fisheries technical paper 402/2. 5. Lightner, D. V. (1996). A Handbook of shrimp Pathology and Diagnostic Procedures for Deseases of Culutred Penaeid Shrimp. 6. Noga, E. J. (1999). Fish Disease: Diagnosis and Treatment. 7. OIE (2006). Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals. 8. Post, G. (1983). Textbook of Fish health. 9. Roberts, R. J. (1985). Fish pathology. 18
18. CHƯƠNG II: CÁC PHƯƠNG PHÁP QUAN SÁT II.1. QUAN SÁT DẤU HIỆU BỆNH, MẪU GIẢI PHẪU TƯƠI VÀ MÔ BỆNH HỌC II.1.1.Phương pháp quan sát dấu hiệu bệnh II.1.1.1.Những vấn đề cần lưu ý khi quan sát bệnh lý thủy sản Thông tin về dấu hiệu bệnh, mô học và tế bào học của mẫu bệnh phẩm thực hiện khi giải phẫu là phần rất quan trọng cho các chẩn đoán có liên quan nhằm cung cấp thông tin cho một chẩn đoán đầy đủ. Trong đa số các trường hợp, kết quả chẩn đoán đòi hỏi phải có những bằng chứng cho thấy sự liên quan giữa mầm bệnh và những tổn thương của cơ thể do mầm bệnh đó gây nên. Ngoài vai trò xác định tương quan giữa mầm bệnh và vật chủ, những thông tin từ kết quả quan sát còn giúp xác định/phân biệt những yếu tố tham gia gây bệnh khác. Những biến đổi về hình thái của mô và tế bào phải được xác định và phân ra thành các nhóm ví dụ như những biểu hiện của vật chủ với sự tấn công của mầm bệnh nhằm có những biện pháp chẩn đoán khác nhau để có kết quả xác định do cơ thể có rất nhiều loại mô và chúng có những biểu hiện khác nhau về mặt bệnh lý. Để có thể lựa chọn phương pháp chẩn đoán hợp lý, người làm công tác chẩn đoán phải thu thập, ghi nhận hoặc phải đuợc cung cấp những thông tin sau: 1. Vị trí xuất hiện của những dấu hiệu bệnh lý trên cơ thể, các nội quan và mô cũng như những những thay đổi trong thời gian gần nhất được phán đoán thông qua: (i) quá trình diễn biến bệnh (Đã chết hay đang bị bệnh nặng; Tình trạng bệnh: số còn sống, số khỏe, số bệnh và số đã chết) ; (ii) báo cáo chi tiết về quan sát lâm sàng; (iii) mẫu mô bệnh và (iv) kết quả xét nghiệm mô bệnh học trên nhiều tiêu bản mô. 2. Kết quả chẩn đoán lâm sàng trước và sau khi tử vong 3. Những thông tin liên quan đến khả năng bị nhiễm độc tố 4. Chấn thương hoặc những thông tin liên quan đến tình trạng kiệt sức 5. Các điều kiện về dinh dưỡng, sinh sản, mật độ và môi trường nuôi. 6. Thông tin về biện pháp phòng bệnh được áp dụng như loại thuốc hay vắc xin được sử dụng, thời gian và phương thức sử dụng. 7. Thông tin về kết quả các chẩn đoán trước đây (nếu có). Những xáo trộn về mặt sinh lý hay trao đổi chất của cơ thể thường không thấy được qua phân tích mô bệnh học mà chỉ có thể bằng các quan sát những tổn thương hay những thay đổi về mặt hình thể do những xáo trộn có liên quan gây ra. Mẫu được thu để phục vụ cho việc chẩn đoán để định dạng mầm bệnh, xác định tác nhân gây bệnh hay cung cấp thông tin cho việc xác định nguyên nhân gây bệnh tùy 19
19. thuộc vào việc chọn lựa phương pháp chẩn đoán như đã nêu ở trên. Chi tiết các bước thu mẫu được trình bày ở phụ lục 1. II.1.1.2. Quan sát bệnh lý ở tôm Việc phát hiện ra bệnh ở tôm rất khó khăn, trừ khi có hiện tượng tôm chết hàng loạt. Dấu hiệu bệnh thường xuất hiện ở một số ít cá thể trong ao nuôi do vậy cần phải quan sát tôm nuôi thường xuyên nhằm xác định được bệnh ở giai đoạn sớm nhất. Trong hầu hết các trường hợp, biểu hiện bên ngoài thường giống nhau mặc dù tác nhân gây bệnh khác nhau. Nếu phiêu sinh vật phát triển, chất lượng nước và tôm đều ở trong điều kiện tốt thì kể từ tuần lễ nuôi thứ ba sẽ không thể nhìn thấy tôm nữa. Khi tôm bị những tác động do môi trường xấu hoặc bị bệnh chúng thường nổi lên mặt nước hoặc tập trung ven bờ. Khi thấy tôm xuất hiện ở ven bờ hay trên mặt ao thì đó là dấu hiệu nghiêm trọng. Vì thế cần phát hiện sớm những dấu hiệu khác thường qua sàn ăn hoặc chài. Tôm thường thích lên mặt ao hay ven bờ vì nước ở đó có hàm lượng oxy cao. Trong nhiều trường hợp cũng có thể là để tránh hàm lượng chất độc cao ở đáy ao. Kiểm tra các ao nuôi vào ban đêm và lúc sáng sớm là rất quan trọng vì tôm bệnh sẽ nổi lên mặt nước hoặc ven bờ rất nhiều vào những lúc này. Khi thấy tôm tập trung ven bờ thì nên kiểm tra đáy ao để biết số tôm chết, nhất là ở khu vực đặt máy sục khí, ở giữa ao nơi tích cặn bã và quanh cống thoát. Trong hầu hết các trường hợp, không thể xác định bệnh trong ao nuôi qua một lần thu mẫu cho dù có phân tích nhiều chỉ tiêu đi nữa thì ý nghĩa của nó rất nhỏ. Điều cần thiết ở đây là cần theo dõi đàn tôm trong suốt quá trình nuôi. Phát hiện được bệnh ở giai đoạn sớm thường dựa vào những dấu hiệu xuất hiện trên tôm, chất lượng nước và những ghi nhận trong sản xuất bao gồm thức ăn tôm sử dụng và quá trình sinh trưởng. Điều này chỉ có thể thực hiện được ở những trại có các số liệu theo dõi đầy đủ về xu hướng phát triển, tỉ lệ sống, tình trạng sức khỏe, sinh khối và tỉ lệ chuyển hóa thức ăn ở mỗi thời điểm thu mẫu. Mật độ thả nuôi ảnh hưởng rất lớn đến quá trình phát triển của tôm trong ao. Mật độ thả quá dày chắc chắn sẽ gặp trở ngại, vì tôm sẽ cạnh tranh nhau về thức ăn và môi trường sống. Mật độ thả phù hợp cho từng ao tùy thuộc vào nhiều yếu tố như: điều kiện về thổ nhưỡng, chất lượng nước, khí hậu ở vùng nuôi; kiểu thiết kế và cấu trúc ao nuôi; trang thiết bị; cỡ tôm thu hoạch dự kiến và kinh nghiệm của người quản lý. Thiết kế ao tốt có thể bù đắp cho một số trở ngại về môi trường và cỡ tôm thu hoạch có thể bị giới hạn bởi môi trường xấu. Khi chất lượng nước tại chỗ xấu hoặc quá thay đổi thì thả tôm với mật độ cao thường không có hiệu quả. Những thay đổi về thời tiết và chất lượng nước theo mùa có ảnh hưởng đến tôm nuôi. Thời gian chuẩn bị ao và thả giống phù hợp cho việc nuôi tôm cũng phải được xem xét. Các thông tin về môi trường và quản lý ao nuôi cần lưu ý bao gồm: chất lượng nước đặc biệt là hàm lượng oxy hòa tan, pH và nhiệt độ; những biến động về thời tiết như mưa lớn; tình trạng đáy ao; sự phát triển của tảo và hình thức quản lý nước. Sự xấu đi của nền đáy ao có thể dẫn đến chất lượng nước kém và gây bệnh cho tôm, tuy nhiên nó cũng gây ra các ảnh hưởng trực tiếp. Chế độ sục khí trong ao ảnh hưởng đến sự tích tụ chất thải ở đáy ao. Nếu như phần diện tích sạch ở đáy ao giảm sẽ làm tăng số lượng tôm đến sàn ăn và tôm ăn hết thức ăn nhanh hơn. Cũng có thể có trường hợp ngược lại, nếu các sàn ăn đặt ở nơi dơ bẩn trong ao thì số tôm đến sàn ăn cũng sẽ giảm. Thường 20
20. có nhiều dấu hiệu khác xuất hiện trên tôm cũng cho biết chất lượng nước xấu như màu sắc bất thường ở mang, vỏ bẩn, phồng đuôi, ăn lẫn nhau và phụ bộ bị thương. Nếu có nghi ngờ về sự xấu đi của nền đáy ao thì nên lội khắp ao để xem lượng chất thải tích tụ và sự phân bổ của chúng ra sao. Mặc dù tảo phát triển tốt thường có lợi cho ao nuôi, nhưng trong ao nuôi thay nước ít có thể gặp rắc rối do tảo phát triển quá mức vì các chất dinh dưỡng tích lũy trong ao. Phương thức quản lý và xử lý nước cần phải được lưu tâm đặc biệt. Mục đích của giai đoạn lấy nước, xử lý nước và bón phân là để thúc đẩy phiêu sinh vật phát triển tốt và ngăn ngừa các sinh vật khác vào ao nuôi, trong đó có các sinh vật gây bệnh và sinh vật mang mầm bệnh. Các sinh vật này bao gồm các loài cá, giáp xác và các động vật không xương sống khác. Các sinh vật này có thể cạnh tranh hoặc giết hại tôm và chúng có thể mang mầm bệnh vào ao nuôi như các mầm bệnh vi-rut rất nguy hiểm. Những dấu hiệu bệnh lý bên ngoài cơ thể tôm nuôi thường không cung cấp những thông tin nhất định nào về tác nhân gây bệnh. Phức tạp hơn là dấu hiệu bệnh lý do nhiều tác nhân cùng gây ra cộng với những biến đổi bất lợi về các yếu tố môi trường. Việc chẩn đoán bệnh nếu chỉ đơn thuần dựa vào dấu hiệu bên ngoài sẽ không chính xác mà cần phải được thực hiện cùng với phương pháp phân tích mô bệnh học hay các phương pháp chẩn đoán khác. Dấu hiệu bệnh được tiến hành qua các bước như sau: 1. Quan sát hoạt động của tôm 2. Quan sát màu sắc cơ thể như: - Hiện tượng đỏ thân hay đỏ phụ bộ - Sự xuất hiện những đốm trắng trên vỏ - Hiện tượng vỏ tôm có màu xanh - Hiện tượng đầu vàng - Thịt tôm có màu trắng đục 3. Quan sát màu sắc mang như: - Hiện tượng mang tôm có màu hơi nâu hay đen - Hiện tượng mang tôm có màu xanh 4. Phụ bộ 5. Lớp biểu bì 6. Cơ 7. Túi tinh 8. Tăng trưởng chậm hay tôm bị còi 21
21. 9. Dị dạng 10. Mềm vỏ 11. Màu sắc và độ đầy của ruột 12. Màu sắc của phân Thông tin chi tiết về phương pháp quan sát dấu hiệu bệnh trên cơ thể tôm được trình bày trong phần bệnh tôm, giáo trình bệnh học thủy sản (Khoa Thủy sản, 2005). Các dấu hiệu bệnh thường gặp ở tôm được trình bày ở phụ lục 2. II.1.1.3.Phương pháp quan sát bệnh lý ở cá II.1.1.3.1. Quan sát hoạt động của cá Hoạt động của cá phải được quan sát thường xuyên mới có thể phát hiện sớm những biểu hiện bất thường. Bầt kỳ một dấu hiệu hoạt động bất thường của cá cũng cần phải được ghi nhận và tìm hiểu nguyên nhân. Trước khi có dấu hiệu bệnh lý rõ ràng, cá thường ăn nhiều hơn bình thường và sau đó ngừng ăn, hoặc có một số cá tách đàn khi bắt mồi. Sự ghi nhận thường xuyên những thông tin về hệ số chuyển hóa thức ăn, tỉ số chiều dài/trọng lượng cơ thể hoặc những dấu hiệu về hình dạng cơ thể sẽ giúp dự đoán/phát hiện bệnh sắp xảy ra. Những biểu hiện bất thường của cá như bơi gần mặt nước, chìm xuống đáy ao, mất thăng bằng hoặc thiếu oxy hay có bất kỳ những dấu hiệu hoạt động bất thường nào. Sự xuất hiện đột ngột của những hoạt động bất thường của cá thường liên quan đến tình trạng hôn mê của cơ thể cá. Những thay đổi về hoạt động của cá thường xảy ra khi cá bị sốc. Thiếu oxy làm cá bị ngạt thở, lờ đờ, phình bụng hay bơi lắc lư mất hăng bằng và thậm chí làm ảnh hưởng xấu đến mang và máu. Những hoạt động lạ thường còn có thể do những rối loạn về thần kinh liên quan đến bệnh (bệnh do vi-rút gây viêm não và võng mạc). Phải theo dõi xem cá chết dưới hình thức nào và mức độ ra sao. Nếu cá cứ tiếp tục chết dai dẳng thì phải thu mẫu gởi đến phòng thí nghiệm để thực hiện các chẩn đoán ở mức 2 và 3. Nếu cá chết đồng loạt hoặc chết theo vùng ngẫu nhiên thì phải xem xét ngay lập tức và các chỉ tiêu về môi trường trước và sau khi cá chết cần phải được ghi nhận và xem xét. Cá chết lan từ vùng này sang vùng khác có thể là do tác nhân gây bệnh truyền nhiễm và phải thu mẫu định dạng mầm bệnh ngay lập tức. Việc làm tức thời (nếu có thể) là cách ly cá bị bệnh và cá khỏe trong thời gian xác địng nguyên nhân gây tử vong. Tăng trưởng hàng ngày của cá cần phải được ghi nhận càng đầy đủ càng tốt. Tốt nhất là thu mẫu định kỳ hoặc ước lượng khi cho cá ăn mỗi ngày. Bên cạnh thông tin về tăng trưởng của cá thông tin về hoạt động bắt mồi và cá chết (nếu có) cũng cần được ghi nhận đầy đủ. Thời gian thay bể hay thay nước, vệ sinh dụng cụ/ống dẫn nước hay khử trùng trại cũng càn được ghi chép lại. Trong nhiều trường hợp, những thông tin trên rất hữu ích để tìm ra nguyên hay xuất hiện bệnh trong trại nuôi cá. II.1.1.3.2. Thông tin về sản xuất, môi trường và quản lý ao Chất lượng nước và những điều kiện môi trường biến động cũng có những ảnh hưởng đáng kể đến sức khỏe của cá có thể là ảnh hưởng trực tiếp (trong giới hạn chịu đựng về 22
22. mặt sinh lý) hay gián tiếp (làm tăng sự mẫn cảm của cá với mầm bệnh). Nhiệt độ, độ mặn, độ đục, vi khuẩn gây bẩn và sự phát triển của tảo đều là những yếu tố môi trường quan trọng. Mật độ nuôi cao trong các hệ thống nuôi thâm canh làm cho các bị sốc và gây nên những thay đổi về môi trường tạo điều kiện cho bệnh bộc phát. Sự tích tụ chất thải từ thức ăn thừa do cho ăn quá mức hay do cá giảm ăn đều sinh ra độc tố khi phân hủy làm ảnh hưởng trực tiếp đến cá và tạo điều kiện môi trường thuận lợi cho vi sinh vật phát triển. Các mầm bệnh này thường là các tác nhân gây bệnh thứ cấp. Ngoài ra các chất gây ô nhiễm khác cũng có thể ảnh hưởng đáng kể đến sức khỏe của cá. Thông tin vế môi trường nuôi đặc biệt là ở những hệ thống nuôi hở, ao, bè hay lồng rất quan trọng khi xác định nguyên nhân gây bệnh. Các thông tin cần phải ghi nhận càng thường xuyên càng tốt là: những thay đổi về thời tiết, nhiệt độ nước, hàm lượng oxy, pH, độ mặn, độ trong và sự phát triển của tảo và hoạt động của con người. II.1.1.3.3.Quan sát bề mặt cơ thể cá Những quan sát bề mặt cơ thể cá nói chung không cung cấp nhiều thông tin liên quan đến một sự cố về bệnh riêng lẻ nhưng những quan sát về dấu hiệu lâm sàng ở bề mặt cơ thể cùng với những biện pháp hợp lý như loại bỏ hoặc cách ly cá bệnh với cá khỏe, thu mẫu xét nghiệm có thể giảm đáng kể thất thoát do bệnh. II.1.1.3.4.Quan sát trên da và vây cá Những tổn thương trên da và vây thường là do bệnh truyền nhiễm, ví dụ như bệnh đỏ da ở cá chép. Tuy nhiên, những vết thương trước đó do những nguyên nhân cơ học (cá cọ vào thành bể hay do những sinh vật khác như cá dữ, chim) hay tổn thương hóa học tấn công sẽ tạo điều kiện cho các mầm bệnh sơ cấp hay thứ cấp (ví dụ như trường hợp nhiễm vi khuẩn Aeromonas) tấn công làm xấu thêm tình trạng sức khỏe của cá. Những thay đổi ở da liên quan đến bệnh, ví dụ như bệnh đốm đỏ dù là nhỏ hay to thường đòi hỏi phải có những động tác tích cực để xử lý. Những dấu hiệu bệnh thường xuất hiện xung quanh các tia vi, nắp mang, hậu môn và vùng đuôi, cũng có khi dấu hiệu bệnh lan khắp toàn thân. Những dấu hiệu như xuất huyết hoặc mất cân bằng thẩm thấu sẽ làm cho da cá sậm màu đi. Những vết thương bị xuất huyết trên da dễ dẫn đến tình trạng lở loét làm ảnh hưởng đến việc điều hòa áp suất thẩm thấu và khả năng đề kháng của cơ thể với các mầm bệnh thứ cấp. Hiện tượng lở loét thường gặp ở phần da vùng lưng và đầu và có thể do bệnh gây nên. Ở một số loài cá, những chỗ da bị sưng lên là dấu hiệu của sự mất vẩy hoặc sự tích tụ chất nhày. Ngoại ký sinh trùng hay giun dẹp cũng cần phải được lưu ý. Khi những loài ký sinh trùng này xuất hiện trên da cá nhiều hơn mức bình thường sẽ làm cho cá bị nhiễm những mầm bệnh thứ cấp, là dấu hiệu của sự phát bệnh hay bị sốc. Ký sinh trùng có thể bám trên bề mặt da cá hoặc ở giai đoạn ấu trùng sống trong bào nang/bào xác dưới da hay vi cá. Những dạng bào xác ấu trùng như ấu trùng sán lá song chủ metacercariae có thể phát hiện nhờ những đốm trắng hay đen dưới da (hoặc sâu trong mô). Mắt của cá cũng là nơi cần được quan sát cẩn thận để phát hiện bệnh. Hình dạng, màu sắc, tình trạng đục vẩn, bọt khí và những đốm đỏ nhỏ lấm tấm do xuất huyết đều là những dấu hiệu cho thấy cá sắp bị bệnh hoặc đang ở trong tình trạng nhiễm bệnh. Ví dụ 23
23. như trường hợp mắt cá bị to và trương phồng lên còn được gọi là cá bị lồi mắt thường liên quan đến nhiều trường hợp bệnh ở cá. II.1.1.3.5. Quan sát mang Mang cá là một trong số các mô dễ quan sát những thay đổi khi cá bị bệnh như mang nhợt nhạt hay bị lở loét. Những thay đổi ở mang cá thường là có liên quan đến bệnh và cần phải lưu tâm đặc biệt khi thấy những biểu hiện bất thường xuất hiện ở mang. Những đốm đỏ trên mang là dấu hiệu của sự xuất huyết đã làm giảm di khả năng thực hiện các chức năng của mang. Mang bị sinh vật gây bẩn bám, tích tụ nhiều chất nhày hay ký sinh trùng (tiêm mao trùng, sán lá đơn chủ, giáp xác chân chèo, nấm, v.v.) đều có thể làm hạn chế bề mặt tiếp xúc của mang và là dấu hiệu ảnh hưởng xấu đến sức khỏe của cá. Những ảnh hưởng xấu ở mang có thể làm ảnh hưởng trực tiếp đến cá hoặc làm cho cá dễ mẫn cảm với các mầm bệnh thứ cấp khác. II.1.1.3.6. Quan sát trên cơ thể Bất kỳ một thay đổi khác thường nào về mặt hình dạng của cá đều là dấu hiệu không tốt về mặt sức khỏe. Những thay đổi về hình dạng thường gặp là “đầu nhọn” hay xảy ra ở cá con là dấu hiệu của sự phát triển không bình thường; hiện tượng ưỡn hay vẹo cột sống là dấu hiệu không tốt về dinh dưỡng hay môi trường. Phù cơ thể là một hiện tượng xuất hiện khá phổ biến và dễ nhận thấy nhất về mặt thay đổi hình dạng cơ thể của cá. Phù cơ thể là sự căng phồng phần bụng làm cho bụng cá trương to. Đây là dấu hiệu bệnh cho thấy có sự sưng lên của các nội quan cá như gan, tụy hay thận, sự tích tụ dịch cơ thể do ký sinh trùng hoặc do những nguyên nhân khác chưa rõ. Phù cơ thể là một trong những nhân tố của khá nhiều bệnh nguy hiểm ở cá liên quan đến sự ngưng trệ hệ thống điều hòa thẩm thấu do có nhiều tế bào máu của thận bị phá hủy. II.1.1.3.7. Quan sát bên trong cơ thể cá Quan sát bên trong cơ thể cá là bước tiếp sau việc quan sát những thay đổi về hoạt động/tập tính sống của cá. Mẫu cá bệnh phải được giải phẫu dọc theo phần bụng từ họng đến hậu môn để quan sát các nội quan và xoang cơ thể. Nên giải phẫu mẫu cá khỏe để so sánh những sai khác của nội quan cá khoẻ và cá bệnh. Nếu như cá khỏe mạnh và các mô cơ thể bình thường thì sẽ không thấy dịch cơ thể trong khoang bụng cá, cơ rắn chắc, có thể thấy những lớp mỡ có màu trắng kem xung quanh ruột và dạ dày. Thận có màu đỏ sẫm nằm sát phần tận cùng phía trên của khoang cơ thể giữa tuỷ sống và bóng hơi, gan có màu đỏ, tụy và lách cũng có màu đỏ. II.1.1.3.8. Quan sát khoang bụng và các mô Những dấu hiệu bệnh thường thấy nhất trong khoang cơ thể là sự xuất huyết và sự tích tụ dịch cơ thể. Những đốm máu có thể xuất hiện trong cơ vách của khoang cơ thể.Vách của khoang cơ thể mềm nhũn, rã ra khi giải phẫu là dấu hiệu cho biết cá đã chết lâu và sẽ không còn thích hợp cho việc chẩn đoán chính xác do sự xâm nhập rất nhanh của các vi sinh vật hoại sinh là mầm bệnh cơ hội khi sau khi cá chết. Hiện tượng hoại cơ còn có thể do cơ bị nhiễm trùng ví dụ như ký sinh trùng nhóm thích bào tử trùng (myxosporean). Có thể quan sát sự nhiễm trùng này bằng cách ép một mảnh 24
24. nhỏ mẫu mô bị nhiễm lên lam kính và quan sát bằng kính hiển vi giải phẫu để quan sát những thể vùi dạng bào tử. Một số loài ký sinh trùng nhóm vi bào tử trùng (microsporidian) và thích bào tử trùng có thể hình thành bào xác trong cơ của cá, mô liên kết các nội quan và khoảng cơ thể, và những cơ quan khác. Những dạng bào xác này tập trung thành từng cụm có hình cầu trắng và đòi hỏi thao tác định danh để xác định ký sinh trùng thuộc nhóm nào. Giun sán cũng có thể xuất hiện trong khoang bụng, nhóm này thường nằm cuộn lại xung quanh các nội quan và các mô màng bụng. Sự hiện của chúng thường không gây nguy hiểm cho cá tuy nhiên nếu chúng có quá nhiều trong khoang bụng sẽ gây chèn ép hay chiếm chỗ các nội quan của cá. II.1.1.3.9. Quan sát các nội quan Bất cứ những đốm trắng xám nào xuất hiện trên một trong những cơ nội quan của cá như gan, thận, tụy hay lách đều do bệnh vì những đốm trắng xám này là dấu hiệu của sự hoại tử hoặc tổn thương ở mô. Ở thận hoặc lách thì đây là dấu hiệu của sự ngưng sản xuất tế bào máu. Những vết loét trên thận còn có thể là do ảnh hưởng trực tiếp của sự điều hoà áp suất thẩm thấu. Những vết loét trên gan thì có thể do ảnh hưởng của cơ chế kháng khuẩn và kháng độc tố. Bất kỳ một nội quan nào của cá bị sưng lên đều là dấu hiệu của bệnh cần được chẩn đoán càng sớm càng tốt. Khi ruột cá bị sưng thì phải kiểm tra xem là do thức ăn hay do sự tích tụ dịch nhày. Sự tích tụ dịch nhày là dấu hiệu của ngưng tiêu hóa thức ăn, loại bỏ chất thải cũng như sự kích động ruột thường có liên quan đến những bệnh nguy hiểm. Đây cũng có thể do sự xâm nhập cơ hội của những đoạn ruột đã bị kích động do sự thay đổi quá nhanh về thức ăn ví dụ như do trùng roi Hexamita salmonis. Ruột có đầy dịch nhày có thể nhận ra qua phân kết cụm, phân kéo dài hay có dịch nhày. Thông tin về phương pháp quan sát dấu hiệu bệnh trên cơ thể cá cũng được trình bày trong phần bệnh cá, giáo trình bệnh học thủy sản (Khoa Thủy sản, 2005). Các dấu hiệu bệnh thường gặp ở cá được trình bày ở phụ lục 3. II.1.2. Phương pháp quan sát mẫu giải phẫu tươi Quan sát mẫu giải phẫu tươi có thể được thực hiện ngay tại trại nuôi hay chỉ cần có kính hiển vi và các dụng cụ tiểu phẫu đơn giản là có thể thực hiện được nhằm giúp đánh giá tình trạng sức khỏe tôm/cá nuôi và phán đoán những nguyên nhân có thể gây bùng phát bệnh. Những phương pháp trình bày dưới đây thường được sử dụng trong chẩn đoán bệnh tôm. Ở cá, các kỹ thuật này cũng được áp dụng khá tương tự. Thông tin chi tiết về các phương pháp cơ bản trong chẩn đoán bệnh cá có thể tham khão thêm trong tài liệu hướng dẫn chẩn đoán bệnh thủy sản (Asia Diagnostic guide for aquatic animal disease, FAO fisheries technical paper 402/2) hoặc trong giáo trình bệnh học thủy sản (Khoa Thủy sản, 2005). Kính phết huyết tương Để kiểm tra hình thái của hồng cầu và sự hiện diện của vi trùng và ký sinh trùng trong máu. Những biến đổi như nhân bị co lại thường có liên quan đến bệnh Vibrio hoặc bệnh đầu vàng. Nhân bị vỡ và có nhiều thể vùi trong tế bào chất là biểu hiện đặc trưng của sự 25
25. nhiễm vi-rút gây bệnh đầu vàng (YHV). Vi khuẩn Vibrio thường phổ biến trong các trường hợp nhiễm khuẩn. Vi bào tử trùng (Microsporidium) cũng thường được tìm thấy trong máu. Có thể nhuộm mẫu huyết tương bằng phương pháp nhuộm Gram hay nhuộm Heamatocyline & Eosin (H&E) (xem phụ lục 4). Kính phết mẫu gan tụy, cơ và cơ quan sinh dục đặt lên lam cho vào một giọt dung dịch cố định Davidson, phết đều, để khô và nhuộm bằng thuốc nhuộm H&E. Phương pháp này có thể phát hiện các thể ẩn của vi-rút trong trường hợp tôm bị nhiễm nặng. Ngoài ra cũng có thể phát hiện nhóm Vibrio và vi bào tử trùng. Cố định mang tôm bằng dung dịch HCl Davidson và nhuộm bằng thuốc nhuộm H&E có thể phát hiện vi-rút gây bệnh đốm trắng (WSSV), YHV và vi-rút gây hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan lập biểu mô (IHHNV). Vi khuẩn gây bệnh đóng rong, nguyên sinh động vật, nấm mycosis và hiện tượng tiết hắc tố cũng được phát hiện bằng cách này (xem phụ lục 5). Quan sát tiêu bản tươi bằng cách lấy mẫu của mang, phụ bộ, cơ quan gan tụy, cơ, cơ quan sinh dục và ruột giữa cho vào một giọt dung dịch 2.8 % NaCl hoặc nước biển vô trùng, đậy bằng lam và quan sát dưới kính hiển vi để phát hiện vi khuẩn dạng sợi, nguyên sinh động vật, vi khuẩn hình que có khả năng di động (thường là nhóm Vibrio), nấm mycosis, tảo khuê, tảo lục và cả mùn bã hữu cơ. Ở những chỗ bị đen dưới vỏ hoặc trong cơ có thể dùng dao tiểu phẫu để cắt mẫu và đặt mẫu lên phiến kính với một giọt dung dịch 2.8 % NaCl và quan sát dưới kính hiển vi để phát hiện vi khuẩn gây bẩn, nguyên sinh động vật và nấm Furasium. Một số phương pháp nhuộm nhanh hiện đang được sử dụng để phát hiện vi-rút baculo ở tôm sú (Monodon baculovirus-MBV), YHV và WSSV (xem phụ lục 6). II.1.3. Phương pháp mô học Mô bệnh học là phương pháp xác định các tổn thương ở các mô tế bào dựa trên các thủ thuật nhuộm tế bào và quan sát bằng kính hiển vi. Phương pháp này cho phép người phân tích kết luận tính chất của các vùng tổn thương. So sánh và đối chiếu với các kết quả quan sát bên ngoài là công việc rất cần thiết để có được một chẩn đoán đúng. Nếu chỉ dựa vào những hình thái tổn thương bên ngoài mà không có các dữ kiện khác có liên quan đến cá tôm bệnh thì thường có những kết luận sai lầm vì những hình thái tổn thương của vài bệnh có thể giống nhau và gây nhầm lẫn trong chẩn đoán. Phương pháp mô học nghiên cứu cấu trúc mô ở mức độ hiển vi và mô bệnh học là một chuyên môn hẹp của phương thức mô học đề cập tới quá trình phát triển bệnh. Mô bệnh học là một kỹ thuật rất quan trọng trong nghiên cứu bệnh tôm và nhiều trường hợp bệnh chỉ có thể chẩn đoán được bằng phương pháp này. Tuy nhiên, nó có những hạn chế nhất định, chẳng hạn, thao tác tương đối chậm và trong nhiều trường hợp bệnh tôm phải được xử lý ngay trước khi có được kết quả xét nghiệm mô học. Phương pháp mô học chỉ nên sử dụng kết hợp với tất cả các dữ liệu về môi trường và sức khỏe tôm để xác định tác nhân gây bệnh 26
26. Trước khi quan sát dưới kính hiển vi, mẫu phải được cố định để tránh bị hư thối, loại bỏ thức ăn và đúc khối sáp. Cắt mẫu thành từng lát mỏng khoảng 5 micromet, rồi đặt lên lam, nhuộm màu và đậy bằng lam kính. Thịt tôm bị phân hủy cực kỳ nhanh sau khi tôm chết, vì thế cần phải cố định chúng. Tôm chết dù được giữ trong nước đá hay đông lạnh cũng đều vô ích đối với phương pháp mô học do những biến đổi xảy ra trong cơ. Dung dịch cố định tôm tốt nhất là dung dịch Davidson’s và formaline đệm trung tính (phụ lục 5). II.1.3.1. Mục tiêu - Nghiên cứu các tổn thương ở các mô và tế bào (vi thể) - So sánh đối chiếu các tổn thương với những biểu hiện lâm sàng của vật chủ để tìm hiểu mối quan hệ mật thiết giữa biến đổi hình thái và các rối loạn chức năng làm cơ sở cho việc chẩn đoán. II.1.3.2. Những điều cần lưu ý khi sử dụng phương pháp mô bệnh học: 1. Kết quả phân tích mô học có ý nghĩa quan trọng trong chẩn đoán bệnh hiển thị quan hệ trực tiếp giữa tác nhân gây bệnh và vật chủ 2. Khi thực hiện các phân tích mô học cần phải ghi nhận và phân loại những biến đổi về hình thái và cấu tạo ở mức tế bào. Mỗi loại mô, tế bào có những biểu hiện khác nhau với tác nhân gây bệnh. II.1.3.3. Phương pháp mô học bao gồm các bước: 1. Các giai đoạn tạo lát cắt tế bào (tiêu bản mô học) - Thu mẫu (theo phương pháp của Lightner, 1996) - Cố định mẫu (dung dịch Davidson’s). Sau đó trữ trong dung dịch 50-70 % alcohol. - Cắt mẫu - Tách nước - Đúc parafin - Cắt mẫu bằng microtom - Dùng xylen để loại parafin ra khỏi lát cắt. 2. Nhuộm lát cắt bằng phương pháp nhuộm H&E 3. Quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi và nhận định kết quả 27
27. II.2. KỸ THUẬT HÓA MÔ MIỄN DỊCH II.2.1. Nguyên tắc Kỹ thuật hoá mô miễn dịch (Immunohistochemistry-IHC) cho phép phát hiện kháng nguyên trên tiêu bản mô bằng cách sử dụng kháng thể có tính đặc hiệu với kháng nguyên qua phản ứng kháng nguyên-kháng thể. Kháng thể dùng cho phản ứng có thể được đánh dấu bằng thuốc nhuộm phát huỳnh quang (kỹ thuật IFC), enzym, chất phóng xạ để có thể nhận biết khi quan sát dưới kính hiển vi điện, kính hiển vi huỳnh quang hay những loại kính hiển vi khác (hình 2.1). II.2.2. Ứng dụng - Xác định tác nhân gây bệnh một cách chuyên biệt dựa trên tính nhạy và tính chuyên biệt của phản ứng kết hợp kháng nguyên-kháng thể. - Do khả năng phát hiện kháng nguyên trong tiêu bản mô hay tế bào nên phương pháp này cho phép tìm hiểu khả năng gây bệnh của tác nhân gây bệnh . - Quan sát bằng kính hiển vi điện hay kính hiển vi huỳnh quang, một vài phương pháp đặc biệt được sử dụng để quan sát dưới kính hiển vi điện tử. Hình 2.1. Nguyên lý kỹ thuật IHC (KT: kháng thể; KN: kháng nguyên) 28
28. II.2.3. Mẫu phân tích Mẫu sử dụng là mô hay dịch cơ thể còn tươi: thời gian chuẩn bị mẫu thường là khoảng 24 giờ. Sau đó mẫu được xử lý bằng một trong các phương pháp sau: Vết bôi/kính phết: vết bôi dùng cho xét nghiệm IHC phải được gởi đến phòng thí nghiệm trong vòng 48 giờ sau khi chuẩn bị tiêu bản. Trường hợp lâu hơn 48 giờ thì mẫu phải được giữ trong tủ lạnh và tránh ánh sáng để kháng nguyên không bị hư. Thông tin chi tiết về việc chuẩn bị tiêu bản phải được sự hướng dẫn của phòng thí nghiêm nhận mẫu. Formalin: cố định mẫu (dày khoảng <1 cm) trong dung dịch đệm trung tính (10% formalin) và đúc khối bằng paraffin trong vòng < 1 tuần. Hoặc cố định 48 giờ trong formalin, sau đó bảo quản trong ethanol để có thể bảo quản mẫu cho việc phát hiện bằng phương pháp mô học hoặc phương pháp miễn dịch. Đông lạnh: ưu điểm của mẫu đông lạnh là tách được trường hợp liên kết chéo của một số kháng nguyên với formalin làm ảnh hưởng đến sự liên kết kháng nguyên-kháng thể. Tuy nhiên phương pháp đông lạnh làm giảm đi chi tiết về hình thái của mô và tế bào, đòi hỏi phải có phương pháp trữ đông đặc biệt cho IHC, giới hạn việc xác định tình trạng bệnh trước khi mô được trữ đông và thao tác thực hiện tiêu bản khó hơn so với tiêu bản bằng cách đúc khuôn parafin như trong phương pháp mô bệnh học. Phương thức trữ đông tốt nhất là sử dụng môi trường trữ mô chuyên biệt, để trong isopentane và đông lạnh bằng nitơ lỏng hay ở –70°C. II.2.4. Thao tác Có nhiều phương pháp IHC được sử dụng tuỳ theo mục đích phát hiện kháng nguyên chủ yếu dựa trên loại mẫu (vết bôi, đúc parafin hay đông lạnh), dạng mẫu vật để phát hiện bệnh và độ nhạy cần đạt được. Những thông tin cần có khi thực hiện IHC là: (i) cách cố định mẫu; (ii) thời gian cố định; (iii) những miêu tả đặc trưng về mẫu và (vi) loài. II.2.5. Ưu và nhược điểm của phương pháp II.2.5.1. Ưu điểm: - Nhận dạng những mầm bệnh khó có thể phát hiện bằng phương pháp mô học hay nhuộm truyền thống. - Xác định chính xác tác nhân gây bệnh dựa vào tính chuyên biệt của kháng thể đối với kháng nguyên. - Có thể giúp xác định một cách trực tiếp khả năng gây bệnh của mầm bệnh qua sự tương tác ở mức tế bào về mặt hình thái hoặc cấu tạo. 29
29. II.2.5.2. Nhược điểm: - Thời gian giữ mẫu trong formalin càng lâu sẽ càng dễ gây ra hiện tượng liên kết giữa các kháng nguyên tạo kết quả dương tính giả. - Đòi hỏi quá trình tạo ra kháng thể chuyên biệt, kiểm tra tính ổn định của phản ứng giữa kháng thể và kháng nguyên. - Một số kháng thể chỉ có thể cho phản ứng có hiệu quả với mẫu đông lạnh. - Kết quả âm tính hay dương tính giả phụ thuộc rất nhiều vào chất lượng của mô được sử dụng, phương pháp và thời gian cố định, kinh nghiệm làm việc với kháng thể của người phân tích. II.3. KỸ THUẬT NUÔI VI SINH VẬT Những kỹ thuật nuôi vi sinh vật giúp cho việc chẩn đoán sơ bộ mầm bệnh vi sinh vật ở mức họ hoặc có khi đến mức giống. Trong trường hợp đòi hỏi phải có chẩn đoán xác định thì phải sử dụng những phương pháp định danh chuyên biệt tùy theo loài hoặc týp. Tuy nhiên hạn chế của phương pháp nuôi vi sinh vật trong chẩn đoán bệnh là thường dễ gặp trường hợp âm tính giả đối với một số mầm bệnh vi sinh đòi hỏi điều kiện nuôi cấy đặc biệt. Mặt khác vấn đề tạp nhiễm trong quá trình nuôi cấy rất dễ gây nên hiện tượng dương tính giả trong chẩn đoán. II.2.1. Nuôi vi khuẩn II.2.1.1. Ứng dụng Đánh giá tình trạng nhiễm khuẩn của loài vi khuẩn phân lập được trên mẫu bệnh phẩm II.2.1.2. Phương pháp Phân lập và nuôi vi khuẩn bằng môi trường chọn lọc tùy theo dạng vi khuẩn được nuôi. Vi khuẩn thường được nuôi trong môi trường có chứa kháng sinh mà chúng kháng. Cách làm này vừa có thể giúp kiểm soát sự phát triển của chúng, theo dõi sự thay đổi khả năng kháng thuốc trong cùng một quần thể cũng như giúp xác định loại kháng sinh có hiệu lực với loài vi khuẩn đó. Một số môi trường chọn lọc thường được sử dụng nuôi mầm bệnh vi khuẩn ở thủy sản như: - Vibrio sp: TCBS - Aeromonas sp: aeromonas agar + ampicillin, rimler short agar, ampicillin-dextrin agar - Flexibacter sp: Cytophaga - Edwardsiella ictaluri: Edwardsiella ictaluri agar 30
30. II.2.1.3. Mẫu phân tích Cơ, gan, thận hay máu của sinh vật bị bệnh. Trong một số trường hợp bệnh phẩm thủy sản lở loét mẫu có thể được thu bằng cách dùnh gạc bông gòn lấy mẫu tại vết thương. Mẫu cũng có thể được thu từ dịch cơ thể của bệnh phẩm. II.2.1.4. Ưu và nhược điểm của phương pháp Ưu điểm: phát hiện được sự hiện diện của mầm bệnh. Nhược điểm: thao tác phân lập và nuôi cấy rất tốn thời gian và dễ bị tạp nhiễm với các mầm bệnh cơ hội II.2.2. Nuôi nguyên sinh động vật II.2.2.1. Ứng dụng Giúp đánh giá tình trạng nhiễm nguyên sinh động vật trên mẫu bệnh phẩm II.2.2.2. Phương pháp Nguyên sinh động vật được nuôi trên các dòng tế bào đặc biệt có bổ sung fetal bovine serum và kháng sinh như penicillin, streptomycin để tránh nhiễm khuẩn. II.2.2.3. Mẫu phân tích Mẫu ruột, phân, máu hay các mô cơ thể. Cách tốt nhất là rửa mẫu bằng dung dịch nước muối sinh lý có chứa kháng sinh để tránh nhiễm khuẩn, sau đó giữ trong tủ lạnh trước khi chuyển mẫu đến phòng thí nghiệm trong vòng 24 giờ. II.2.2.4. Ưu và nhược điểm của phương pháp Ưu điểm: phát hiện được sự hiện diện của mầm bệnh. Nhược điểm: thao tác phân lập và nuôi cấy rất tốn thời gian và sau khi thu mẫu phải được xử lý trong vòng 24 giờ II.2.3. Nuôi vi-rút II.2.3.1. Ứng dụng Việc nuôi vi-rút thường được sử dụng nhằm hỗ trợ cho các phép chẩn đoán nhiễm vi-rút. Việc phân lập vi-rút thường gắn với các xét nghiệm phân tử như PCR nên phương pháp thu mẫu cũng phải được thực hiện tùy theo vi-rút là DNA hay RNA vi-rút. 31
31. II.2.3.2. Phương pháp Vi-rút là sinh vật sống ký sinh bắt buộc nên việc nuôi vi-rút thường được thực hiện trên tế bào sống hoặc trong cơ thể sinh vật sống. Tế bào sống thường được nuôi trong đĩa petri hoặc trong lọ tiệt trùng. Mẫu được nghiền và sau đó cho vào môi trường nuôi cấy và nhiệt độ thích hợp để vi-rút phát triển. II.2.3.3. Mẫu phân tích Mẫu phải được thu vào thời điểm có bệnh bộc phát vì vi-rút có thể không còn hiện diện trên cơ thể vật chủ khoảng 2 ngày sau khi có thấy dấu hiệu bệnh lý. Tùy theo điều kiện thực tế mà mẫu có thể được vận chuyển sống, ướp nước đá, nước đá khô hoặc nitơ lỏng để chuyển về phòng thí nghiệm. Mẫu gởi đến phòng thí nghiệm phải kèm theo các thông tin về loại mẫu, loại vi-rút tình nghi bị nhiễm và thời gian quan sát thấy dấu hiệu bệnh lý liên quan đến vi-rút đó. Mẫu được thu có thể là mẫu mô hoặc dung dịch trích từ mô trong điều kiện vô trùng, mẫu máu được thu với dung dịch chống đông. Điều kiện vận chuyển và lưu trữ mẫu tùy theo loại vi-rút và sẽ tùy theo phòng thí nghiệm phân tích hướng dẫn. Một số phòng thí nghiệm đòi hỏi mẫu phải được giữ trong môi trường có bổ sung protein và kháng sinh khi vận chuyển, mẫu phải được vận chuyển trong nước đá trong vòng 24 giờ, hoặc phải giữ lạnh ở 4°C nếu vận chuyển trong vòng 5 ngày. Trường hợp lâu hơn 5 ngày phải giữ mẫu ở -70°C, v.v . II.2.3.4. Đọc kết quả Nhìn chung, việc phân lập vi-rút từ mô hay máu của vật chủ bị bệnh là đầy đủ làm chứng cứ cho sự nhiễm vi-rút. Tuy nhiên, vi-rút có thể tham gia như là mầm bệnh thứ cấp chứ không phải là tác nhân gây bệnh chủ yếu. Điều cần thiết trong quá trình chẩn đoán là phải có cơ sở cho thấy vi-rút có liên quan đến sự tổn thương của cơ thể vật chủ hoặc vi-rút là tác nhân gây bệnh chủ yếu. Việc này đòi hỏi những kỹ thuật có thể xác định vai trò gây bệnh của vi-rút như tế bào học hoặc mô bệnh học đi kèm theo bằng những phương pháp như IHC hay hiển vi điện tử. Cần phải ghi nhận rằng hiện tại qui trình PCR đã được phát triển đối với hầu hết vi-rút gây bệnh ở thủy sản giúp cho việc sàng lọc và xác định vi-rút mới khá hiệu quả. Tuy nhiên việc sử dụng PCR thuần túy để chẩn đoán bệnh cần phải được thận trọng khi xác nhận quan hệ giữa vi-rút và dấu hiệu bệnh lý. 32
32. II.3. TÀI LIỆU THAM KHẢO CHƯƠNG II 1. Alday de Graindorge, V. and Flegel, T.W. (1999). Diagnosis of shrimp diseases with emphasis on black tiger prawn, Penaeus monodon. 2. Austin, B., and Austin, D. A. (999). Bacterial fish Pathogens: Disease of farmed and wild fish 3rd Edition 3. FAO Asia Diagnostic guide for aquatic animal disease. Fisheries technical paper 402/2. 4. Forbes, B. A., Sahm, D. F., and Weissfeld, A. S. (2002). Laboratory methods in basic virology In: Diagnostic Microbiology. 11th edition. 5. Hirsh, D. C., MacLachlan, N. J., and Walker, R. L. (2004). Laboratory Diagnosis. In: Veterinary Microbiology 2nd edition. 6. Lightner, D. V. (1996). A Handbook of shrimp Pathology and Diagnostic Procedures for Deseases of Culutred Penaeid Shrimp. 7. Noga, E. J. (1999). Fish Disease: Diagnosis and Treatment. 8. OIE (2006). Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals. 9. Nguyễn Anh Tuấn, Nguyễn Thanh Phương, Đặng Thị Hoàng Oanh và Trần Ngọc Hải. (2002). Quản lý sức khỏe tôm trong ao nuôi. 10. Tonguthai, K., Chinabut, S., Somsiri,T., Chanratchakool, P., and Kanchanakhan, S. (1999). Diagnostic Procedures for Finfish Diseases 11. Từ Thanh Dung, Đặng Thị Hoàng Oanh và Trần Thị Tuyết Hoa. (2005). Giáo trình bệnh học thủy sản. 33
33. CHƯƠNG III: CÁC KỸ THUẬT HUYẾT THANH Các kỹ thuật huyết thanh là kỹ thuật sử dụng kháng thể để phát hiện protein kháng nguyên của vi-rút, vi khuẩn hoặc những đáp ứng của vật chủ với vi-rút, vi khuẩn hay ký sinh trùng trong mẫu huyết thanh. Trọng tâm của các kỹ thuật huyết thanh là xác định sự tiếp xúc của vật chủ với mầm bệnh, tuy nhiên, các kỹ thuật này cung cấp ít thông tin về tình trạng nhiễm bệnh của vật chủ hoặc của cả đàn thủy sản nuôi. III.1. PHƯƠNG PHÁP KẾT TỦA MIỄN DỊCH III.1.1. Nguyên lý Khi cho kháng thể đặc hiệu phản ứng với kháng nguyên hòa tan ở liều lượng chuẩn sẽ xuất hiện được kết tủa nhìn thấy được bằng mắt thường. Phản ứng này được dùng phổ biến để phát hiện kháng nguyên khi đã có sẵn kháng thể đặc hiệu hoặc để phát hiện kháng thể khi có kháng nguyên hòa tan đặc hiệu. Phản ứng kết tủa bị ức chế khi có quá thừa kháng nguyên hoặc kháng thể. Sự kết tủa tối ưu khi có nồng độ kháng nguyên phù hợp với kháng thể. Nguyên lý chung: kết tủa miễn dịch chỉ có thể sử dụng được khi cho kháng nguyên hòa tan phản ứng với kháng thể cũng hòa tan. Hiện tượng kết tủa miễn dịch xảy ra in vitro. Hiện tượng tủa những phức hợp phân tử do liên kết kháng nguyên-kháng thể là do hình thành một mạng lưới ba chiều các phân tử kháng nguyên nối lại với nhau bởi các kháng thể (Marrack, 1934) (hình 3.1). 34
34. Hình 3.1. Hiện tượng tủa với sự hình thành mạng lưới cân bằng Việc hình thành mạng lưới kết tủa phải có nhiều điều kiện như sau: - Kháng thể phải có ít nhất hai hóa trị. - Kháng nguyên đa hóa trị - Kháng nguyên phải hòa tan và thành phần của môi trường như lực ion hay pH có vai trò nhất định trong việc làm xảy ra hiện tượng kết tủa. - Các kháng thể IgG chỉ có chứa 3% glucid là những chất gây tủa tốt nhất, còn kháng thể IgM chứa tới 10% nên dễ hòa tan và ít kết tủa hơn. - Các phức hợp kháng nguyên-kháng thể càng to thì càng dễ kết tủa III.1.2. Ứng dụng Kỹ thuật miễn dịch khuếch tán là kỹ thuật đơn giản giúp phát hiện kháng nguyên trong mẫu huyết thanh hay huyết tương bằng cách định tính hay định lượng. III.1.3. Mẫu phân tích Mẫu huyết thanh hay huyết tương. III.1.4. Các dạng khuếch tán miễn dịch III.1.4.1. Kết tủa trong môi trường lỏng Phương pháp Heideiberger và Kendall Phương pháp này cho phép định lượng một phản ứng miễn dịch, đến nay vẫn còn được dùng để giải thích hiện tượng tủa tại sao khi xuất hiện khi không, đó là do thay đổi tỷ lệ nồng độ tương đối giữa kháng thể và kháng nguyên. Trong một loạt ống thí nghiệm, cho đều cùng một lượng kháng thể không thay đổi. Sau đó cho vào kháng nguyên với nồng độ tăng dần. Kết quả là hiện tượng kết tủa sẽ tăng dần từ ống đầu và sau đó giảm đi (hình 3.2). Nếu đem ly tâm thì có thể lấy tủa và định lượng nitrogen của tủa trong từng ống. Nếu kháng nguyên không phải là protein thì lượng nitrogen tủa tỷ lệ với lượng kháng thể bị tủa. Nếu lấy ống có tủa nhiều nhất thì có thể xác định được lượng kháng thể có trong huyết thanh bởi vì trong ống ấy hơn 95% kháng thể đã bị tủa. Hơn nữa, nếu biết được lượng kháng nguyên đã cho vào mỗi ống và trọng lượng phân tử riêng của kháng nguyên và kháng thể thì người ta có thể tính ra công thức của phức hợp Sau khi ly tâm tách tủa, có thể lấy nước mặt rồi nếu cho thêm kháng nguyên vào những ống đầu và kháng thể vào những ống cuối thì vẫn có được tủa thêm. Điều này cho phép xác định được 3 khu vực: 35
35. - Trong những ống đầu là khu vực thừa kháng thể, nơi mà do thiếu kháng nguyên nên đã ngăn không cho kết tủa hết kháng thể. - Trong những ống cuối là khu vực thừa kháng nguyên nên cũng không cho phép hình thành mạng lưới 3 chiều. - Những ống gần nơi tủa tối đa tương ứng với khu vực tương đương ở đó kháng nguyên và kháng thể có tỉ lệ nồng độ tối ưu cho phép tủa gần hết các phân tử kháng thể và kháng nguyên. Hình 3.2. Hiện tượng tủa trong môi trường lỏng Định lượng bằng đo độ đục Dùng một tia sáng mạnh đơn sắc cho đi qua ống nghiệm trong đó đã có trộn kháng nguyên với kháng huyết thanh tương ứng. Tia sáng sẽ càng bị khuếch xạ mạnh nếu tủa càng nhiều. Việc định lượng được tiến hành tại vùng có thừa kháng thể và nhờ việc đọc độ cản quang rồi so sánh với đường chuẩn. Việc sử dụng tia laser cho phép việc định lượng có giá trị cao. Kỹ thuật này có rất nhiều ứng dụng trong việc định lượng các kháng nguyên khác nhau mà nồng độ trong một môi trường sinh học trong khoảng mg/l như IgG, IgA, IgM và trong việc tìm các kháng kháng thể. 36
36. III.1.4.2. Tủa trong môi trường gel Nguyên lý Kháng thể cũng như kháng nguyên có thể khuếch tán trong thạch (gel) và khi gặp nhau thì gây tủa, tủa ấy không di chuyển và hiện lên trông thấy bằng mắt thường hoặc nhuộm. Miễn dịch khuếch tán kép (kỹ thuật Ouchterlony) Trong một lớp thạch không dày, đục thủng suốt những lỗ cách đều nhau, khoảng cách này phụ thuộc vào hệ số khuếch tán của từng chất phản ứng. Rồi nhỏ vào trong mỗi lỗ đối diện với nhau một dung dịch kháng nguyên và kháng thể. Thời gian xuất hiện các đường cung tủa có thể là hai ngày đến một tuần. Hình 3.3. Khuếch tán kép (kỹ thuật Ouchterlony) Kỹ thuật này dù ít nhạy nhưng cho phép phân tích các hệ thống kháng nguyên- kháng thể. Muốn so sánh giữa hai kháng nguyên hay để phát hiện sự có mặt của nhiều kháng thể trong một huyết thanh thì có thể bố trí hai lô kháng nguyên trước một lỗ có chứa huyết thanh. Kết quả có thể: (i) Phản ứng giống hệt khi hai kháng nguyên y hệt nhau hay có epitop tương tự thì các đường kết tủa với kháng thể sẽ nối liền nhau; (ii) Phản ứng không y hệt nếu hai kháng nguyên khác nhau thì sẽ kết hợp riêng với hai kháng thể và hai đường kết tủa sẽ cắt chéo nhau hoặc (iii) Phản ứng giống một phần khi hai kháng nguyên có cùng một epitop và một epitop riêng khác nhau thì các kháng thể tương ứng sẽ cho một đường tủa chung liền với nhau và một đường tủa phụ gắn với đường tủa trước đối với kháng nguyên thứ hai (hình 3.3). Ngược lại, có thể dùng kỹ thuật này để so sánh với nhau hai kháng huyết thanh gây tủa để xem chúng có nhận biết cùng một kháng nguyên hay không. Kỹ thuật này rất hay được dùng để phát hiện các kháng thể chống nhân của một người so với một huyết thanh chuẩn. 37
37. Miễn dịch khuếch tán vòng (kỹ thuật Mancini) Kỹ thuật này dùng để định lượng kháng nguyên. Kháng thể đặc hiệu được hòa đều vào trong thạch trước khi đổ dãy thạch lên trên kính hay hộp petri. Sau đó, đục các lỗ và cho vào đó dung dịch kháng nguyên có độ pha loãng khác nhau. Kháng nguyên sẽ khuếch tán và gặp kháng thể ngay trong thạch và tạo nên những vòng kết tủa mà bề mặt của nó sẽ tỉ lệ thuận với nồng độ kháng nguyên. Việc định lượng được suy ra từ một đường biểu diễn chuẩn lập ra từ những nồng độ đã biết của kháng nguyên. III.1.4.3. Miễn dịch khuếch tán điện Miễn dịch khuếch tán điện đơn (kỹ thuật Laurell) Xuất phát từ nguyên lý của kỹ thuật khuếch tán vòng, kỹ thuật này chỉ khác ở chỗ là sự di chuyển của các kháng nguyên định lượng được thực hiện trong điện trường. Do đó vùng kết tủa có hình tên lửa (còn gọi là điện di tên lửa) (hình 3.4). Chiều dài của hình tên lửa tỷ lệ với nồng độ kháng nguyên. Kỹ thuật này nhạy hơn kỹ thuật Mancini nhưng dùng nhiều chất phản ứng hơn. Hình 3.4. Khuếch tán điện: 1,2,3 mẫu chuẩn; x: mẫu Miễn dịch điện di (kỹ thuật Grabar và Williams) Khi dung dịch định phân tích có chứa nhiều kháng nguyên thì khuếch tán kép không đủ để xác định mọi đường kết tủa. Miễn dịch điện di bổ sung thiếu sót ấy bằng cách tách trước các kháng nguyên theo tốc độ di chuyển của chúng trong điện trường rồi mới gây tủa bằng kháng huyết thanh đặc hiệu rải trong một rãnh đào sẵn dọc theo chiều điện di. Các đường tủa xuất hiện theo hình thức những cung ở hai bên rãnh. Kỹ thuật này chủ yếu được dùng để định tính, cho phép đánh giá có hiện tượng tủa hay không so với một đối chứng. Đây là một kỹ thuật tốt để xác định một Ig đơn dòng do tạo ra một cung tủa dày hơn, cong và gần rãnh hơn đồng thời nối liền với cung tủa của Ig huyết thanh cùng lớp. III.1.4.4. Miễn dịch khuếch tán: Điện di với miễn dịch khuếch tán in situ Trong kỹ thuật này dịch sinh học định nghiên cứu được cho chạy điện di trước, sau đó cho tác dụng của kháng thể đặc hiệu ngay trên lớp thạch để hình thành kết tủa kháng nguyên- kháng thể. Như vậy, các thành phần của hỗn hơp phức tạp như huyết thanh được tách ra bằn điện di trong thạch. Sau đó, các phân tử khác nhau định nghiên cứu sẽ được tủa một cách chọn lọc bằng các kháng huyết thanh đặc hiệu với các ptotein đã di chuyển 38
38. ngay trên bề mặt của thạch. Kháng thể này nhanh chóng thấm vào bên trong gel của thạch và kết tủa tại chỗ kháng nguyên tương ứng. Những phân tử không bị kết tủa thì sẽ được rửa cho đến hết. Từ đó, dễ dàng nhuộm các phức hợp kháng nguyên- kháng thể và sẽ cho ra một hình ảnh chính xác của tình trạng phân bố kháng nguyên sau điện di. Kỹ thuật này rất nhanh và nhạy hơn kỹ thuật điện di để chuẩn đoán những bất thường đơn dòng của Ig. Nó có lợi hơn là kháng nguyên không có thời gian để khuếch tán trước khi bị kết tủa bởi kháng thể. Tính thuần nhất của một thành phần đơn dòng nào đó nếu có ở một lượng rất thấp thì cũng được bảo tồn trong kỹ thuật này. Sau cùng việc giải thích những hình ảnh thu được cũng dễ dàng hơn trong kỹ thuật miễn dịch điện di. III.1.5. Ưu và nhược điểm của phương pháp III.1.5.1. Ư u đi ểm: Kỹ thuật đơn giản III.1.5.2. Nhược điểm: Kháng nguyên muốn phát hiện phải ở dạng hòa tan thì mới có thể khuếch tán được. Mặt khác phương pháp này có tính nhạy không cao. III.2. PHƯƠNG PHÁP NGƯNG KẾT MIỄN DỊCH III.2.1. Nguyên lý Hiện tượng ngưng kết là do cơ chế hình thành một mạng lưới giữa kháng nguyên và kháng thể cho phép một lượng các hạt ấy sáp lại với nhau để hình thành đám ngưng kết đủ to để mắt thường có thể nhìn thấy được. Mạng lưới chỉ có thể xuất hiện với các kháng thể có ít nhất là hai hóa trị. IgM với đến 10 vị trí kết hợp nên có khả năng ngưng kết mạnh hơn IgG. Nói chung các kháng nguyên hữu hình bao giờ cũng đa hóa trị cho nên không bị hạn chế. Ở phản ứng ngưng kết miễn dịch đòi hỏi kháng nguyên hữu hình. Đó là kháng nguyên có kích thước lớn như hồng cầu và tế bào vi sinh vật. Kháng nguyên hữu hình có epitop bề mặt có thể liên kết chéo với các kháng thể tạo thành từng cụm có thể nhìn thấy được bằng mắt thường. Kháng thể trong phản ứng này gọi là kháng thể gây ngưng kết. Phản ứng ngưng kết nhạy hơn phản ứng kết tủa nên được dùng để định tính và bán định lượng kháng thể trong huyết thanh. Cơ sở lí hóa của phản ứng ngưng kết: một hỗn hợp bao gồm những tiểu phần lơ lửng trong một dung môi. Các tiểu phần giữ được trạng thái. 39
39. III.2.2. Xếp loại các phản ứng ngưng kết Người ta phân biệt thành ngưng kết chủ động hay trực tiếp trong đó hạt hữu hình đã có mang sẵn những nhóm quyết định kháng nguyên đặc hiệu như hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, tinh trùng, vi khuẩn và ngưng kết thụ động khi các hạt chỉ là chất trơ làm giá đỡ cho các quyết định kháng nguyên hòa tan đã được gắn một cách nhân tạo lên bề mặt của nó, trong đó thường dùng là hồng cầu đã xử lý bằng formol. III.2.2.1. Ngưng kết trực tiếp: Cho các hạt hữu hình có mang sẵn các nhóm quyết định kháng nguyên tiếp xúc với kháng thể ở các nồng độ pha loãng khác nhau. Các kháng thể kết hợp với kháng nguyên gắn trên các hạt sẽ dẫn đến hình thành mạng lưới và ngưng kết. III.2.2.2. Ngưng kết gián tiếp: Kháng nguyên hòa tan được cố định trên những hạt khác nhau tùy theo typ phản ứng, sau đó hỗn hợp hạt sẽ được cho tiếp xúc với huyết thanh trong những điều kiện như ngưng kết trực tiếp. III.2.2.3. Ngưng kết nhân tạo: Khi kháng thể không phát huy được tác dụng trên hai vị trí trên, nghĩa là hiện tượng kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể có xảy ra mà vẫn có hiện tượng ngưng kết. Coombs đã cho thêm kháng thể anti-globulin tạo một cầu nối giữa globulin miễn dịch đã có sẵn trên hạt theo hai hình thức sau: test coombs trực tiếp thử trên hồng cầu đã có gắn sẵn một cách tự nhiên các kháng thể không gây ngưng kết, khi cho thêm kháng thể anti-globulin vào thì sẽ gây ngưng kết; Test Coombs gián tiếp là một test huyết thanh cho phép tìm xem trong một huyết thanh có hay không có kháng thể chống hồng cầu nhưng không gây ngưng kết. Đầu tiên, ủ huyết thanh với một loại hồng cầu đã biết rõ nhóm. Sau đó, rửa sạch thì trên hồng cầu chỉ còn bám kháng thể trong huyết thanh cho nên khi thêm kháng thể anti- glubolin và nếu có ngưng kết thì có nghĩa là trong ấy có kháng thể định tìm (hình 3.5). Hình 3.5. Phương pháp test coombs trực tiếp vá gián tiếp 40
40. III.2.3. Ứng dụng Phát hiện kháng nguyên và đánh giá sự tương tác giữa kháng thể với một kháng nguyên dạng hạt. Có 3 dạng thường gặp: - Ức chế sự ngưng kết hồng cầu (Hemagglutination inhibition-HI): đánh giá sự tương tác giữa kháng thể với vi-rút có chứa protein ngưng kết hồng cầu. - Ngưng kết vi khuẩn (Bacterial agglutination): xác định kháng thể huyết thanh được tạo ra để chống lại sự nhiễm khuẩn. - Ức chế ngưng kết (Agglutination inhibition): phát hiện một lượng nhỏ kháng thể chống lại một tác nhân gây bệnh nào đó . III.2.4. Mẫu phân tích Mẫu huyết tương hay huyết thanh III.2.5. Ưu và nhược điểm của phương pháp III.2.5.1. Ư u đi ểm: Kỹ thuật khá đơn giản III.2.5.2. Nhược điểm: Kháng nguyên của mầm bệnh muốn phát hiện phải ở dạng hạt. Mặt khác phương pháp này có tính nhạy không cao. III.3. KỸ THUẬT MIỄN DỊCH HUỲNH QUANG III.3.1. Nguyên lý Trong kỹ thuật này kháng thể được đánh dấu bằng thuốc nhuộm huỳnh quang. Kỹ thuật dựa trên tính chất của thuốc nhuộm khi được kích thích bởi bức xạ có bước sóng đặc hiệu sẽ phát sáng. Chẳng hạn fluorescein phát huỳnh quang màu vàng lục, còn rodamin phát quang màu đỏ da cam. Kháng thể gắn thuốc nhuộm huỳnh quang gọi là kháng thể đánh dấu hoặc kháng thể huỳnh quang. 41
41. III.3.2. Phương pháp III.3.2.1. Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang trực tiếp Kỹ thuật chỉ có hai thành phần: Kháng nguyên và kháng thể, tạo ra hai lớp của phản ứng. Một trong hai thành phần được gắn trực tiếp với thuốc nhuộm huỳnh quang. Đầu tiên người ta cố định vi khuẩn trên lam kính sau đó phủ kháng thể huỳnh quang lên để kháng thể gắn với tế bào vi khuẩn. Rửa loại bỏ kháng thể thừa rồi quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang. Chỉ có các vi khuẩn đặc hiệu với kháng thể huỳnh quang mới được quan sát (hình 3.6). Hình 3.6. Kháng thể huỳnh quang và kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang trực tiếp III.3.2.2. Kỹ thuật miễn dịch huỳng quang gián tiếp Kỹ thuật này ngoài hai thành phần chính là kháng nguyên và kháng thể đặc hiệu tạo ra hai lớp của phản ứng còn có một thành phần nữa được gắn với thuốc nhuộm huỳnh quang, tạo lớp thứ ba là kháng- kháng thể (hình 3.7). 42
42. III.3.3. Ứng dụng Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang được sử dụng để phát hiện kháng nguyên của một mầm bệnh chuyên biệt trong mô hay tế bào bị nhiễm bệnh. Phương pháp khá tương tự như kỹ thuật IHC, cho phép việc phát hiện kháng nguyên qua sự kết hợp đặc hiệu với kháng thể có đánh dấu huỳnh quang. III.3.4. Mẫu phân tích Mẫu phân tích có thể là mẫu mô, mẫu tế bào, huyết thanh. Các mẫu này có thể được lưu trữ bằng cách đông lạnh, làm khô hay cố định trong dung dịch cố định thích hợp. III.3.5. Ưu và nhược điểm của phương pháp III.3.5.1. Ưu điểm: Có tính nhạy cao và thao tác nhanh để phát hiện và định dạng mầm bệnh trong mẫu kính phết, mô hay tế bào. III.3.5.2. Nhược điểm: Đòi hỏi phải sử dụng kháng thể huỳnh quang hoặc kháng huyết thanh. Việc đọc kết quả đòi hỏi kỹ năng và kinh nghiệm của người thực hiện việc chẩn đoán để phân biệt những trường hợp dương tính giả và âm tính giả. Phản ứng chéo của kháng thể với kháng nguyên khá có thể xảy cho nên kháng thể sử dụng phải có tính chuyên biệt cao. 43
43. Hình 3.7. Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang gián tiếp III.4. KỸ THUẬT MIỄN DỊCH LIÊN KẾT ENZYM III.4.1. Nguyên lý Kỹ thuật miễn dịch liên kết enzym (ELISA-Enzyme- Linked Immunosorbent Assay) là kỹ thuật khá nhạy và đơn giản, cho phép xác định kháng nguyên hoặc kháng thể ở nồng độ rất thấp (khoảng 0,1 ng/ml). So với kỹ thuật phóng xạ thì kỹ thuật này rất rẻ tiền và an toàn hơn mà vẫn chính xác như nhau. Nguyên tắc của kỹ thuật ELISA giống như kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang, nhưng thay vì kháng thể gắn với thuốc nhuộm huỳnh quang thì người ta gắn kháng thể với một enzym. Khi cho thêm cơ chất thích hợp vào phản ứng, enzym sẽ thủy phân cơ chất này thành một chất có màu. Sự xuất hiện màu chứng tỏ xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng nguyên với kháng thể, thông qua cường độ màu người ta biết được nồng độ của kháng nguyên cần phát hiện. Kỹ thuật ELISA được chia làm hai dạng là ELISA trực tiếp và ELISA gián tiếp. Các enzym thường dùng trong kỹ thuật ELISA là β-galactoxidaza, glucooxidaza, peroxidazza 44
44. và phophadaza kiềm. ELISA dùng để xác định nhiều tác nhân gây bệnh như vi-rút, vi khuẩn, nấm, kí sinh trùng. III.4.2. Ứng dụng ELISA được sử dụng để đánh giá sự tiếp xúc của mẫu bệnh phẩm với những tác nhân gây bệnh khác nhau như vi khuẩn, vi-rút, ký sinh trùng. Kháng nguyên được làm tinh sạch và hàm lượng kháng thể sử dụng cũng như hàm lượng kháng nguyên có thể xác định được. III.4.3. Mẫu phân tích Huyết thanh hay huyết tương III.4.4. Phương pháp Hàm lượng kháng thể sử dụng để kết hợp với kháng nguyên của mầm bệnh được xác định bằng biểu đồ hàm lượng kháng thể chuẩn. Kết quả được đọc bằng hàm lượng kháng thể. III.4.4.1. Kỹ thuật ELISA gián tiếp Thường được dùng để định tính hoặc định lượng kháng nguyên. - Nhỏ huyết thanh có kháng thể (ví dụ antitoxin) vào giếng ở bảng nhựa để cho kháng thể bám vào thành giếng. - Nhỏ tiếp dịch kháng nguyên cần xét nghiệm (ví dụ toxin). Nếu là kháng nguyên đặc hiệu với kháng thể thì sẽ gắn với kháng thể. - Thêm cộng hợp gắn enzym vào giếng để cho kháng thể của cộng gắn với kháng nguyên mà trước đó đã gắn với kháng thể đầu tiên, tạo nên một “bánh mì kẹp chả” là kháng thể- kháng nguyên- kháng thể gắn enzym (hình 3.8a). - Bổ sung cơ chất của enzym. Enzym sẽ thủy phân cơ chất này làm thay đổi màu của dung dịch. Tốc độ thủy phân của enzym sẽ tỉ lệ thuận với lượng kháng thể đã gắn enzim, cũng có nghĩa là tỉ lệ thuận với kháng nguyên cần xét nghiệm. Sự thay đổi màu dung dịch có thể nhìn thấy được bằng mắt thường hoặc đo được bằng quang phổ kế. 45
45. Hình 3.8. Kỹ thuật ELISA: (a) ELISA gián tiếp; (b) ELISA trực tiếp (KT: kháng thể; KN: kháng nguyên; S: cơ chất) III.4.4.2. Kỹ thuật ELISA trực tiếp Thường được dùng để định tính hoặc định lượng kháng thể. - Nhỏ dịch kháng nguyên cho hấp thụ lên thành giếng. - Nhỏ tiếp kháng huyết thanh (chứa kháng thể) cần xét nghiệm rồi ủ. Nếu trong huyết thanh có chứa kháng thể đặc hiệu thì sẽ gắn với nó. - Thêm cộng hợp kháng- kháng thể đã gắn enzym. Kháng thể này được tạo thành để khống chế kháng thể người. - Thêm cơ chất của enzym. Tốc độ thủy phân cơ chất gắn liền với sự thay đổi màu của dung dịch và tỉ lệ thuận với lượng kháng thể cần xác định trong mẫu. Sự thay đổi màu có thể quan sát bằng mắt thường hay quang phổ kế (hình 3.8b). 46
46. III.4.5. Ưu và nhược điểm của phương pháp III.4.5.1. Ưu điểm: Phương pháp ELISA là phương pháp khá nhạy và dễ thực hiện. Có thể xét nghiệm cùng một lúc nhiều mẫu bệnh phẩm, thời gian thực hiện ngắn nên được xem như là phương pháp vàng trong sàng lọc/phát hiện bệnh. III.4.5.2. Nhược điểm: Cần phải có kháng thể đơn dòng hay đa dòng phù hợp với kháng nguyên của mầm bệnh cần xét nghiệm. III.5. TÀI LIỆU THAM KHẢO CHƯƠNG III 1. Kuby, J. (1997). Antigen-Antibody Interactions. In: Immunology. 3rd edition. 2. Vũ Triệu An và Jean, C.H. (2001). Miễn dịch học. 3. Nguyễn Lân Dũng. (2000). Vi sinh vật học. 4. Nguyễn Ngọc Lành. (1997). Miễn dịch học. 5. Madigan, M.T., Martinko, J.M. and Parker, J. (2002). Biology of Microorganisms. 10th edition. 6. Đỗ Ngọc Liên. (1999). Miễn dịch học cơ sở. 47
47. CHƯƠNG 4: CÁC KỸ THUẬT PHÂN TỬ IV.1. KỸ THUẬT PHẢN ỨNG CHUỖI TRÙNG HỢP Kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase Chain Reaction-PCR) do Karl Mullis và cộng sự phát minh năm 1985. Thực chất đây là một phương pháp tạo dòng DNA in vitro không cần có sự hiện diện của tế bào. IV.1.1. Nguyên tắc Tất cả các DNA polymeraza khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn đều cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt. Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn, và DNA polymeraza sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới. Nếu hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự DNA thì chỉ đoạn DNA nằm giữa hai mồi được tổng hợp. Hai mồi này gồm một mồi xuôi và một mồi ngược so với chiều phiên mã của gen. Phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn sau (hình 4.1): IV.1.1.1. Giai đoạn biến tính (denaturation): Trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của chúng, thường là ở 94-95 ºC trong vòng 30 giây đến 1 phút. Đây là giai đoạn mạch đôi tách thành 2 mạch đơn. IV.1.1.2. Giai đoạn lai (hybridization): Nhiệt độ dược hạ thấp hơn Tm của các mồi cho phép các mồi bắt cặp với khuôn. Trong thực nghiệm, nhiệt độ này dao động trong khoảng 40-70 ºC tùy thuộc Tm của các mồi sử dụng mà thời gian bắt cặp khác nhau và kéo dài từ 30 giây đến 1phút. Đây là giai đoạn quyết định tính đặc hiệu của phản ứng. IV.1.1.3. Giai đoạn tổng hợp (hay kéo dài) (extension): Nhiệt độ được tăng lên đến 72 ºC. Đó là điều kiện tốt nhất để cho Taq polymeraza hoạt động tổng hợp kéo dài mạch theo nguyên tắc bổ sung từ 2 đầu sợi khuôn ban đầu giúp cho DNA polymeraza hoạt động. Thời gian tùy thuộc độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút. Theo Geifand và White (1990), tốc độ tổng hợp của Taq là 150 nucleotit/giây ở nhiệt độ 75oC - 80oC; 60 nucleotit/giây ở 70oC; 24 nucleotit/giây ở 55oC; 1,5 nucleotit/giây ở 37oC và ở nhiệt độ 22oC chỉ còn 0,25 nucleotit/giây. Sau một chu kỳ gồm ba giai đoạn như trên, một phân tử DNA khuôn được nhân lên thành hai, các đoạn DNA vừa được nhân trong chu kỳ lại làm khuôn cho chu kỳ nhân bản tiếp theo vì hai đầu tận cùng của sản phẩm bổ sung với mồi. Do đó sau mỗi chu kỳ số lượng đoạn DNA được tổng hợp sẽ tăng lên gấp đôi và như vậy sau n chu kỳ nhân bản 48
48. sẽ tạo ra 2n bản DNA từ một khuôn ban đầu. Sau 30 chu kỳ sự khuếch đại sẽ là 106 so với lượng bản mẫu ban đầu. Hình 4.1. Nguyên lý kỹ thuật PCR IV.1.2. Ứng dụng PCR có nhiều ứng dụng vào các mục đích khác nhau, như phân tích hệ gen của động vật và thực vật vì nó cho phép tạo ra một lượng lớn các đoạn trình tự đặc hiệu, xác định trình tự của DNA được nhân bản, nhân bản quần thể mRNA để làm mẫu lai, xác định trình tự đặc hiệu từ cDNA để làm mẫu lai, xác định sinh vật chuyển gen. PCR cũng được dùng để phân tích tiến hoá, phân tích sự đa dạng di truyền ở mức độ DNA trong và giữa các quần thể. 49
49. PCR là một công cụ hữu hiệu cho việc phát hiện mầm bệnh vi khuẩn, vi-rút, ký sinh trùng (protozoa hay metazoa) và nấm. Một số mầm bệnh thủy sản quan trọng ở cá và tôm nuôi hiện nay được chẩn đoán bằng PCR gồm có: (i) ở cá có vi-rút gây bệnh ở cá nheo mỹ (channel catfish virus-CCV), vi-rút gây nhiễm trùng và hoại tử cơ quan tạo máu (infectious hematopoietic necrosis virus-IHNV), vi-rút gây nhiễm trùng và hoại tử tuyến tụy (infectious pancreatic necrosis virus-IPNV), vi-rút gây xuất huyết và nhiễm trùng máu (viral hemorrhagic septicemia virus-VHSV), vi-rút gây hoại tử hệ thần kinh (viral nervous necrosis virus-VNNV) và Renibacterium salmoninarum; (ii) ở tôm có vi-rút đốm trắng (WSSV), vi-rút đầu vàng (YHV), vi-rút gây hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan lập biểu mô (infectious hypodermal and haematopoeitic necrosis virus-IHHNV), vi-rút gây hộI chứng taura (Taura syndrome virus-TSV), nội ký sinh trùng và vi khuẩn đặc biệt là nhóm Vibrio. IV.1.3. Phương pháp IV.1.3.1. Ly trích DNA hay RNA từ vật chủ để sử dụng làm mạch khuôn Trong phòng thí nghiệm DNA hoặc RNA được ly trích từ mẫu bệnh phẩm. Mô cơ thể được ly trích tùy thuộc vào nơi mà mầm bệnh muốn chẩn đoán thường tấn công. IV.1.3.2. Chuẩn bị Thành phần của một phản ứng PCR (reaction mix) bao gồm DNA khuôn tức là đoạn trình tự DNA cần được nhân lên; 2 đoạn mồi, mỗi mồi dài khoảng 18-24 nucleotid; DNA polymeraza (thường hiện nay sử dụng là Taq polymeraza - là một loại enzym chịu nhiệt); bốn loại deoxyribonucleotit triphosphat (dATP, dGTP, dTTP, dCTP) và dung dịch đệm và ion Mg2+. Phản ứng PCR tối ưu khi DNA khuôn tinh sạch, nhưng một ưu điểm lớn của phương pháp PCR là cho phép nhân cả những mẫu DNA không được bảo quản tốt, đã bị phá hủy từng phần như những vết máu để lâu ngày, tinh dịch đã khô, hoá thạch, tóc, móng tay của người đã chết Mồi là chỉ tiêu quan trọng nhất để đạt được một sự khuyếch đại một đoạn DNA đặc trưng. Mồi luôn gắn với DNA khuôn ở đầu 3’ và DNA polymeraza kéo dài chuỗi tổng hợp theo chiều 5’ → 3’. Trình tự mồi, nhiệt độ gắn mồi và nồng độ trong phản ứng PCR là những nhân tố quyết định sự thành công của phản ứng PCR. Việc chọn mồi cũng phải tuân thủ một số nguyên tắc như: - Trình tự của mồi được chọn sao cho không có sự bắt cặp bổ sung giữa mồi “xuôi” và mồi “ngược”, và cũng không có những cấu trúc “kẹp tóc” do sự bắt cặp bổ sung giữa các phần khác nhau của một mồi. - Tm của mồi xuôi và mồi ngược không cách biệt nhau quá xa. - Các mồi chọn phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuyếch đại không trùng với các trình tự lặp lại trên gen. 50
50. - Trình tự nằm giữa 2 mồi không quá lớn. Phản ứng PCR sẽ tối ưu nếu đoạn trình tự nhỏ hơn 1kb. Trước đây trong phản ứng PCR người ta thường dùng DNA polymeraza I tách chiết từ DNA polymeraza thông dụng nhất là Taq polymerse được tách ra từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermus aquaticus sống ở suối nước nóng 94-100 °C. Enzym này có hoạt tính cao nhất ở nhiệt độ 70-80 °C, có trọng lượng phân tử là 94kD, gồm 832 axit amin do gen có 2499 cặp bazơ tổng hợp nên. Saiki (1988) đã chỉ ra rằng hoạt tính của Taq polymeraza giảm 50% sau 130 phút ở nhiệt độ 92,5 °C, sau 40 phút ở 95 °C và sau 5-6 phút ở 97 °C. Mặt khác, nồng độ ion Mg2+ và dNTP trong hỗn hợp phản ứng cũng ảnh hưởng rất nhiều đến hoạt tính của Taq polymeraza. Bốn loại nucleotit thường được sử dụng ở nồng độ là 20 – 200 µM/mỗi loại nucleotit, nếu sự mất cân bằng trong thành phần các nucleotit xãy ra sẽ dẫn tới các lỗi sao chép của DNA polymeraza. Nồng độ ion Mg2+ cũng là nhân tố ảnh hưởng mạnh đến phản ứng PCR. Tuy nhiên không có một quy luật chung cho vấn đề này. Nồng độ tối ưu phải được xác định cho từng phản ứng qua thử nghiệm. Trong thực tế số chu kỳ của phản ứng PCR không vượt quá 40 chu kỳ. Sở dĩ như vậy là vì phản ứng PCR diễn ra qua 2 giai đoạn. Trong giai đoạn đầu số lượng bản sao tăng theo cấp số nhân tỷ lệ với lượng mẫu ban đầu. Sau đó hiệu quả khuyếch đại giảm do các nguyên nhân sau: - Hoạt tính của polymeraza giảm theo thời gian ở nhiệt độ cao - Sự cạn kiệt các thành phần của phản ứng. - Các bản sao vừa được tổng hợp không kết hợp với mồi mà kết hợp với nhau - Sự xuất hiện của các sản phẩm phụ ức chế phản ứng. PCR được thực hiện trong máy chu kỳ nhiệt và sau đó các đoạn DNA được phân biệt bằng kỹ thuật điện di bản thạch và nhuộm bằng ethidium bromide và chụp ảnh dưới tia UV. IV.1.3.3. Đối chứng Một xét nghiệm PCR tiêu chuẩn cần phải có những đối chứng sau: 1. Không có DNA/RNA: phản ứng PCR không có mạch khuôn DNA để kiểm soát trường hợp bị tạp nhiễm 2. DNA/mRNA của vật chủ: để chắc chắn axit nucleic mẫu cũng được khuếch đại và mồi không đặc hiệu với hệ gen của vật chủ 3. Đối chứng dương: phản ứng PCR có mạch khuôn DNA đặc hiệu với mồi 51
51. IV.1.4. Các hạn chế của phương pháp PCR 1. Phương pháp PCR thông thường không hoạt động được với những đoạn DNA lớn hơn 3 kb. 2. Sự ngoại nhiễm do sản phẩm khuếch đại của những lần thao tác trước 3. Các sai sót gây ra do taq polymerase (khoảng 10.000 nucleotic thì enzym gắn sai 1 nucleotic) IV.1.5. Các dạng PCR IV.1.5.1. PCR truyền thống Ứng dụng: PCR truyền thống (conventional PCR) hiện đang là một trong những phương pháp có tính nhạy cao được sử dụng rất phổ biến để phát hiện và xác định trình tự DNA của vi-rút, vi khuẩn, nấm và ký sinh trùng. Mẫu sử dụng: - Mẫu mô bệnh, huyết tương hay dung dịch thu từ vết lở loét - Lưu trữ mẫu: -20°C hay -70°C. - PCR có thể được thực hiện từ mẫu đúc parafin. Nhưng sản phẩm PCR không phù hợp cho việc giải trình tự về sau. - DNA khi đã tiếp xúc với formalin hơn 48 giờ sẽ không còn sử dụng cho PCR được nữa. Ưu điểm: - Phương pháp PCR truyền thống rất nhạy chỉ cần một số lượng DNA nhỏ là có thể khuếch đại và phát hiện. Phương pháp được sử dụng để phát hiện mầm bệnh ở mức rất thấp. - DNA là phân tử sinh học khá bền nên PCR có thể áp dụng với những mẫu chết không thể áp dụng các kỹ thuật nuôi cấy. - Thao tác thực hiện nhanh. - PCR được thực hiện với số lượng mẫu rất nhỏ (tối đa là 25 mg mẫu/phản ứng). Nhược điểm: - Dễ bị tạp nhiễm: do tính nhạy cao, lỗi thao tác - Đòi hỏi thêm phương pháp chẩn đoán khác để xác định tác nhân gây bệnh 52
52. IV.1.5.2. PCR phiên mã ngược Nguyên lý: PCR phiên mã ngược (reverse transcriptase PCR) là phương pháp PCR được sử dụng để khuếch đại, phân lập hay xác định thư viện RNA của mô hay tế bào. Để thực hiện RT-PCR trước hết RNA sau khi ly trích phải được phiên mã bằng men phiên mã ngược (Reverse transcriptase) để chuyển RNA thành cDNA (complementary DNA) rồi thực hiện PCR truyền thống với cDNA (xem hình 4.2). Hình 4.2. Nguyên lý RT-PCR Ứng dụng: là một trong những phương pháp có tính nhạy cao được sử dụng rất phổ biến để phát hiện và xác định trình tự RNA của vi-rút và vi khuẩn. Mẫu sử dụng: mẫu mô bệnh, huyết tương hay dung dịch thu từ vết lở loét, mẫu là mẫu tươi hay được lưu trữ ở -70 °C. Ưu điểm: là phương pháp nhạy và chuyên biệt để phát hiện RNA của vi-rút hay vi khuẫn trong mẫu bệnh phẩm dựa trên trình tự của gen 16s hay 18s. Nhược điểm: RNA bị phân hủy nhanh nên mẫu phải được thu và lưu trữ đúng qui cách. Thao tác ly trích RNA phức tạp và khó thực hiện hơn nhiều so với DNA. 53
53. IV.1.5.3. PCR thời gian thật Ứng dụng: PCR thời gian thật (real-time PCR) là dạng biến hoá của PCR được sử dụng để phát hiện trình tự và số lượng DNA hoặc RNA của mầm bệnh. Phương pháp: căn cứ trên sự phân cắt DNA theo chiều 5'-3' của DNA polymerase cắt mẫu dò được đánh dấu bằng thuốc nhuộm huỳnh quang trong phản ứng PCR giúp xác định cường độ của chất đánh dấu và từ hệ số tương quan tính được hàm lượng DNA trong mẫu phân tích. Mẫu sử dụng: mẫu mô bệnh, huyết tương hay dung dịch thu từ vết lở loét, mẫu là mẫu tươi hay được lưu trữ ở -70 °C. Ưu điểm: phương pháp PCR thời gian thật rất nhạy và chuyên biệt. Cho phép xác định số lượng vi-rút nhiễm trong mô của bệnh phẩm. Qui trình thực hiện trong vòng (24 – 48 giờ). Nhược điểm: tốn kém, đòi hỏi thời gian và trình độ chuyên môn để thiết kế qui trình. IV.2. KỸ THUẬT PHÂN TÍCH TÍNH ĐA DẠNG VỀ CHIỀU DÀI ĐOẠN GIỚI HẠN IV.2.1. Nguyên lý Kỹ thuật phân tích tính đa dạng về chiều dài đoạn giới hạn (restriction fragment length polymorphism-RFLP) dựa trên sự tách biệt từng đoạn DNA bằng các enzym giới hạn (restriction enzyme-RE). Sự di chuyển của DNA từ thạch đến màng thấm và sử dụng mẫu dò DNA qua phương pháp lai phân tử để phát hiện các đoạn DNA với trình tự đặc hiệu. Kỹ thuật lai phân tử (molecular hybridization) dựa trên nguyên lý là lai phân tử giữa mẫu dò DNA với các phân tử DNA được lưu giữ trên giá thể để dò tìm các phân tử sinh học đặc trưng. Kỹ thuật này có hiệu quả cao trong nghiên cứu phát hiện các đại phân tử sinh học có cấu trúc phân tử phức tạp. Nó có thể áp dụng cho mọi loại đại phân tử sinh học có khả năng gắn kết vào giá thể lưu giữ như màng nitrocellulose, màng nylon, màng giấy cellulose, nhưng vẫn duy trì được khả năng gắn kết với các nhóm chất hiển thị khác. IV.2.2. Phương pháp Phương pháp Southern được Giáo sư Edwin M. Southern xây dựng và thử nghiệm thành công vào năm 1975. Ở đây, quá trình lai phân tử xảy ra khi hai đoạn mạch đơn DNA bắt cặp và gắn kết với nhau trên nguyên tắc bổ xung cho nhau. Các bước tiến hành trong kỹ thuật này có thể được tóm tắt như sau: - DNA bộ gen được cắt thành những đoạn có kích thước khác nhau bằng một hay nhiều enzym giới hạn (RE) và được phân tách bằng điện di trên bản gel. - DNA được biến tính ngay trên gel rồi được thấm truyền lên màng lai. Trong quá trình thấm truyền vị trí các đoạn DNA trên màng lai được giữ nguyên như trên bản gel. 54
54. - DNA cố định trên màng được đem lai với mẫu dò DNA có đánh dấu bằng phóng xạ hoặc hoá học. Sau quá trình lai người ta rửa màng lai để loại bỏ các mẫu dò không bắt cặp. - Cuối cùng người ta dùng kỹ thuật phóng xạ hoặc hoá học tự ghi để định vị các phân tử lai và hiển thị trên phim thành từng băng dạng vạch ngang. Việc phát hiện các phân tử trên màng được tiến hành thông qua kỹ thuật đánh dấu. Phổ biến nhất là gắn các nucleotide với các đồng vị phóng xạ 32P dạng 32P-dNTP. Ưu điểm lớn của phương pháp phóng xạ này là có độ nhạy rất cao, có thể phát hiện được vết DNA ở mức ng (10-9 g) và thấp hơn. Tuy nhiên phương pháp đánh dấu phóng xạ đòi hỏi phòng thí nghiệm có những thiết bị kiểm tra và bảo đảm an toàn phóng xạ đồng bộ. Những năm gần đây kỹ thuật phi phóng xạ (non-radioactive) hay kỹ thuật đánh dấu lạnh (cold labelling) đang từng bước thay thế kỹ thuật phóng xạ. Trong đó nổi bật là kỹ thuật phát quang hoá học kích hoạt (Enhancing Chemical Luminecsence, ECL) và kỹ thuật sử dụng đánh dấu với digoxigenin (DIG). IV.2.3. Hệ thống phi phóng xạ DIG Hệ thống phi phóng xạ DIG là phương pháp đánh dấu và phát hiện axít nucleic rất nhạy bén và hữu hiệu. Hệ thống này mang nhiều tính ưu việt như an toàn, mẫu dò đánh dấu có độ bền cao và dung dịch lai có thể dùng lại vài lần. So với phương pháp đánh dấu bằng chất phóng xạ, phương pháp này cũng có thuận lợi như độ nhạy cao và phông nền sạch. Nhưng lại tránh được những bất lợi như sự rủi ro trong khi sử dụng chất phóng xạ, chất thải độc hại, thời gian hiện phim lâu, tính không bền của mẫu dò đã đánh dấu. Trong hệ thống DIG, mẫu dò là DNA, RNA hay các oligo được đánh dấu bằng cách gắn với digoxigenin (DIG). Đối với mẫu dò là DNA, yếu tố DIG-11-dUTP được dùng để đánh dấu và được gắn kết với phân tử DNA thông qua phản ứng PCR hay lai với các mồi ngẫu nhiên mang yếu tố đó (hình 4.3). Hình 4.3: Cấu trúc của Alkali-labile Digoxigenin (DIG) - dUTP Ở phương pháp thứ nhất (hình 4.4a), với DIG-dUTP có trong hỗn hợp phản ứng PCR, sản phẩm mẫu dò được tạo ra rất đặc hiệu và có độ nhạy cao. Chỉ cần 10 pg đối với DNA plasmit hoặc 10 ng đối với DNA genom là đủ để tạo ra mẫu dò lai Southern. Phương pháp đánh dấu DNA bằng PCR đặc biệt thuận lợi trong dò tìm bản gen đơn lẻ trên màng thấm hệ gen. 55
55. Trong phương pháp thứ hai (hình 4.4b), enzym Klenow sao chép khuôn mẫu DNA với sự có mặt của các đoạn 6 nucleotit ngẫu nhiên và DIG-dUTP. Trung bình cứ 20-25 nucleotit trên mạch DNA mới tổng hợp có một phân tử DIG gắn vào. Như vậy, mẫu dò tạo ra được đánh dấu đồng đều, rất nhạy, có thể dò tìm đích trong 0.10-0.03 pg DNA. Sản phẩm mẫu dò là tổ hợp của các đoạn có độ dài khác nhau. Không giống như đáng dấu bằng PCR, phương pháp này đỏi hỏi phải có khuôn mẫu DNA rất sạch. Tín hiệu từ mẫu dò sau khi đã lai với axit nucleic trên màng được phát hiện nhờ kỹ thuật hoá miễn dịch. Đó là phản ứng liên kết giữa kháng thể của Digoxigenin và Digoxigenin gắn trong mẫu dò. Tiếp theo, các phân tử liên kết này được nhìn thấy nhờ vào phản ứng với hợp chất tạo sắc hoặc phát quang. Các hợp chất tạo sắc tạo ra ra tín hiệu màu trực tiếp trên màng. Còn các hợp chất phát quang có độ nhạy cao thì sản sinh ra ánh sáng có thể ghi nhận lại trên phim X-quang giống như ở phương pháp đánh dấu bằng chất phóng xạ 32P hay 35S. IV.2.4. Ứng dụng của kỹ thuật lai Southern Kỹ thuật lai Southern là một trong những kỹ thuật sinh học phân tử quan trọng được sử dụng nhiều trong các phân tích phân tử như: lập bản đồ giới hạn của một gen, phát hiện các đa hình độ dài của cùng một gen ở các chủng hay giữa các cá thể khác nhau qua sự so sánh bản đồ giới hạn, phát hiện các đột biến mất đoạn/đột biến điểm hay tái tổ hợp trên một gen vì chúng làm thay đổi bản đồ giới hạn, phát hiện sinh vật chuyển gen và đánh giá số lượng bản gen và điểm gắn của gen chuyển. (a) (b) Hình 4.4: Các phương pháp đánh dấu của DIG. (a) đánh dấu bằng PCR; (b) đánh dấu bằng các đoạn 6 nucletit ngẫu nhiên. 56
56. IV.2.5. Mẫu phân tích Mẫu có thể sử dụng là mẫu mô, máu hoặc mẫu ký sinh trùng, vi khuẩn, nấm từ những vết thương của mẫu bệnh phẩm. IV.2.6. Ưu và nhược điểm IV.2.6.1. Ưu điểm: Rất chuyên biệt và có độ tin cậy cao IV.2.6.2. Nhược điểm: Mất thời gian để thực hiện (10 - 14 ngày). IV.3. KỸ THUẬT LAI IN SITU IV.3.1. Nguyên lý Kỹ thuật lai In situ (In-situ hybridization) được phát triển từ phép lai Southern blot, kỹ thuật này sử dụng các mồi đánh dấu (đoạn DNA hoặc kháng thể) để lai với DNA, RNA hay protein ngay ở trong tế bào mà không cần tách chiết chúng. Người ta thường sử dụng mẫu mô được cố định bằng formalin như trong trường hợp cố định mẫu phân tích mô bệnh học. Mẫu dò trong lai In situ thường được đánh dấu bằng phương pháp hóa học (chất phát huỳnh quang). Các mẫu dò này được tổng hợp từ những nucleotide mang những liên kết hóa học đặc biệt. Các mẫu dò này sau khi lai sẽ được phát hiện nhờ kháng thể hoặc các protein khác nhận biết các liên kết hóa học của chúng. IV.3.2. Ứng dụng Phương pháp lai In-situ phát hiện được sự có mặt và vị trí axit nucleic của mầm bệnh trên mô giúp thiết lập sự liên quan giữa mầm bệnh và vật chủ. IV.3.3. Mẫu phân tích Mẫu mô cố định trong paraffin 57