›
›

Giáo trình Di truyền y học - TS.BS. Nguyễn Viết Nhân

doc 136 trang phuongnguyen 5210
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Giáo trình Di truyền y học - TS.BS. Nguyễn Viết Nhân", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • docgiao_trinh_di_truyen_y_hoc_ts_bs_nguyen_viet_nhan.doc

Nội dung text: Giáo trình Di truyền y học - TS.BS. Nguyễn Viết Nhân

  1. ĐẠI HỌC HUẾ GIÁO TRÌNH DI TRUYỀN Y HỌC Ts.Bs. Nguyễn Viết Nhân Ths.Bs. Hà Thị Minh Thi 2005 ĐẠI HỌC HUẾ 1
  2. GIÁO TRÌNH DI TRUYỀN Y HỌC Tất cả các hình vẽ trong cuốn sách này được lấy từ cuốn "Medical Genetics" của các tác giả Lynn B.J.; John C.C.; Michael J.B. và Raymond L.W. Nhà xuất bản Mosby, 2003 2005 2
  3. NỘI DUNG Chương 1, Ts. Nguyễn Viết Nhân VAI TRÒ CỦA DI TRUYỀN TRONG Y HỌC 1 Chương 2, Ths. Hà Thị Minh Thi CẤU TRÚC VÀ CHỨC NĂNG CỦA GENE 4 Chương 3, Ts. Nguyễn Viết Nhân ĐỘT BIẾN GENE 19 Chương 4, Ths. Hà Thị Minh Thi MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN CÁC BIẾN DỊ DI TRUYỀN Ở MỨC PHÂN TỬ 26 Chương 5, Ts. Nguyễn Viết Nhân ĐỘT BIẾN ĐƠN GENE TRÊN NHIỄM SẮC THỂ THƯỜNG 40 Chương 6, Ts. Nguyễn Viết Nhân ĐỘT BIẾN ĐƠN GENE DI TRUYỀN LIÊN KẾT VỚI GIỚI TÍNH VÀ DI TRUYỀN TY THỂ 49 Chương 7, Ts. Nguyễn Viết Nhân DI TRUYỀN HỌC HOÁ SINH: CÁC RỐI LOẠN CHUYỂN HOÁ 55 Chương 8, Ts. Nguyễn Viết Nhân BỘ NHIỄM SẮC THỂ NGƯỜI VÀ CÁC DẠNG ĐỘT BIẾN NHIẾM SẮC THỂ 63 Chương 9, Ts. Nguyễn Viết Nhân DI TRUYỀN TẾ BÀO HỌC LÂM SÀNG 74 Chương 10, Ts. Nguyễn Viết Nhân DI TRUYỀN ĐA YẾU TỐ 82 Chương 11, Ts. Nguyễn Viết Nhân DI TRUYỀN HỌC QUẦN THỂ 88 Chương 12, Ts. Nguyễn Viết Nhân LẬP BẢN ĐỒ GENE 94 Chương 13, Ths. Hà Thị Minh Thi DI TRUYỀN HỌC UNG THƯ 116 Chương 14, Ts. Nguyễn Viết Nhân PHÒNG VÀ CHẨN ĐOÁN BỆNH DI TRUYỀN VÀ DỊ TẬT BẨM SINH 127 3
  4. Chương 1 Vai trò của di truyền trong y học I. Di truyền y học là gì ? Di truyền y học là ngành học nhằm ứng dụng di truyền học vào y học, bao gồm: - Nghiên cứu sự di truyền của bệnh trong các gia đình. - Xác định vị trí đặc hiệu của các gen trên nhiễm sắc thể (NST). - Phân tích cơ chế phân tử trong quá trình sinh bệnh của gen đột biến. - Chẩn đoán và điều trị các bệnh di truyền. - Tư vấn di truyền. II. Vai trò của di truyền y học đối với công tác chăm sóc sức khoẻ Bệnh di truyền hiện nay chiếm một tỷ lệ không nhỏ trong các bệnh được gặp ở trẻ em và người lớn. Tỷ lệ này sẽ ngày mỗi tăng cùng với sự hiểu biết ngày càng nhiều của chúng ta về cơ sở di truyền của các bệnh. Di truyền học cung cấp những kiến thức cơ bản về nền tảng sinh học dẫn đến sự hình thành cơ thể do đó giúp chúng ta có thể hiểu tốt hơn và sâu hơn về quá trình sinh bệnh. Trong nhiều trường hợp những hiểu biết này có thể giúp ngăn ngừa bệnh hoặc giúp cho việc điều trị chúng trở nên hiệu quả hơn. III. Các loại bệnh di truyền Những thay đổi của vật chất di truyền hoặc sự kết hợp giữa chúng và các yếu tố khác có thể gây ra các bệnh di truyền. Những bệnh này được chia thành 4 nhóm chính như sau (bảng 1): - Các bất thường NST (chromosome disorders): xảy ra khi toàn bộ NST hoặc một phần của chúng bị mất đi, nhân lên v.v - Các bất thường đơn gen (single - gene disorder): xảy ra khi một gen bị đột biến. Trường hợp này thường được gọi là các bất thường kiểu Mendel. - Các bất thường di truyền đa yếu tố (multifactorial disorders): đây là nhóm bệnh gây ra ra bởi sự kết hợp giữa yếu tố di truyền và yếu tố môi trường. Rất nhiều dị tật bẩm sinh và 4
  5. nhiều tình trạng bệnh lý mãn tính ở người lớn thuộc về nhóm này. - Các bất thường di truyền của ti thể (mitochondrial disorders): chỉ chiếm một lượng nhỏ gây ra do bất thường của DNA trong các ti thể có trong bào tương của tế bào. Trong 4 nhóm trên nhóm các bất thường đơn gen, là nhóm được quan tâm nhiều nhất. Các bệnh thuộc nhóm này được phân loại dựa trên cách thức di truyền của gen bệnh trong gia đình (kiểu gen trội trên NST thường, kiểu lặn NST thường, kiểu di truyền liên kết với giới tính). Cho tới nay con số các bệnh gây ra bởi kiểu rối loạn này đã lên đến 14.000 và vẫn tiếp tục tăng trong thời gian tới. Bảng 1: Tỷ lệ tương đối của một số bệnh di truyền phổ biến Loại bệnh di truyền Tỷ lệ tương đối Bất thường NST Hội chứng Down 1/700 - 1/1000 Hội chứng Klinefelter 1/1000 nam Hội chứng Turner 1/2500 - 1/10000 nữ Di truyền đơn gen Bệnh teo cơ Duchene 1/3500 nam Hemophilia A 1/10000 nam Bệnh di truyền đa yếu tố Khe hở môi +/- hàm 1/500 - 1/1000 Tật chân khoèo 1/1000 Các khuyết tật tim bẩm sinh 1/200 - 1/500 Ung thư (mọi loại) 1/3 Đái đường (type I và II) 1/10 Bệnh tim / đột quỵ 1/3 - 1/5 Ngoài ra rất nhiều bệnh là kết quả của sự tương tác giữa các yếu tố di truyền và không di truyền (di truyền đa yếu tố) ở những mức độ rất khác nhau cho phép chúng ta nghĩ rằng bệnh di truyền có một phạm vi phân bố rất rộng, từ chỗ hoàn toàn do yếu tố di truyền quy định như bệnh xơ nang, bệnh teo cơ Duchenne (Duchenne muscular dystrophy) cho tới chỗ chủ yếu là do yếu tố môi trường như các bệnh nhiễm trùng. Rất nhiều 5
  6. loại bệnh có tỷ lệ mắc cao như các dị tật bẩm sinh, các bệnh tim mạch, cao huyết áp, đái tháo đường, ung thư nằm trong khoảng giữa của hai cực này. Chúng là kết quả của sự kết hợp ở các mức độ khác nhau của 2 yếu tố di truyền và môi trường. IV. Tình hình bệnh di truyền trên lâm sàng Trong thực tế chúng ta đang đối mặt với các bệnh có nguyên nhân môi trường như suy dinh dưỡng, điều kiện vệ sinh kém, nhiễm trùng và đây cũng chính là những nguyên nhân chính gây tử vong ở trẻ. Một nghiên cứu ở các bệnh viện Seatle (Mỹ) cho thấy 27% số trẻ em nhập viện vì bệnh di truyền, một nghiên cứu khác ở một bệnh viện nhi khoa của Mexico cho thấy 37,8% số trẻ nhập viện là do mắc bệnh di truyền hoặc có liên quan đến di truyền. Một câu hỏi được đặt ra là tỷ lệ người mắc bệnh di truyền trong quần thể là bao nhiêu ? Đây là một câu hỏi rất khó trả lời vì có rất nhiều yếu tố làm cho tỷ lệ này trở nên không chính xác như: (1) Một số bệnh phân bố theo chủng tộc như bệnh hồng cầu hình liềm được gặp rất phổ biến ở Châu Phi, bệnh xơ nang được gặp phổ biến ở Châu Âu. (2) Một số bệnh do đột biến gen trội được gặp phổ biến hơn ở người lớn tuổi như bệnh ung thư vú, ung thư đại tràng , do đó tỷ lệ mắc các bệnh này cao hơn ở những quần thể có độ tuổi lớn hơn. (3) Khả năng chẩn đoán của bác sỹ cũng là một yếu tố ảnh hưởng đến tỷ lệ của bệnh. Bảng 2: Tỷ lệ tương đối của các bệnh di truyền trong quần thể chung Loại bệnh di truyền Tỷ lệ mắc tính trên 1000 người Di truyền trội 3 - 9,5 Di truyền lặn 2 - 2,5 Di truyền liên kết với NST X 0,5 - 2 Bất thường NST Dị 6-9 tật bẩm sinh 20 - 50 Tổng 31,5 - 73 Bảng 2 giới thiệu tỷ lệ tương đối của các bệnh di truyền trong quần thể chung, cho thấy tỷ lệ mắc bệnh di truyền từ 3 - 7%, tuy nhiên tỷ lệ này không bao gồm các bệnh có liên quan đến di truyền được gặp phổ biến hơn ở người trưởng thành như bệnh tim, bệnh đái đường và bệnh ung thư. Nếu tính cả nhóm bệnh này thì tỷ lệ bệnh di truyền trong quần thể sẽ cao lên một cách đáng kể. 6
  7. Chương 2 Cấu trúc và chức năng của gene Nhiễm sắc thể chứa DNA (deoxyribonucleic acid) mang gene. Gen được truyền từ bố mẹ sang con cái và được xem là đơn vị cơ bản của sự di truyền, ảnh hưởng lên mọi cấu trúc và chức năng của cơ thể. Ở người có khoảng từ 30.000-40.000 gene cấu trúc (gene mã hóa cho RNA hoặc các protein). I. Cấu trúc của DNA 1. Thành phần hóa học và cấu trúc không gian của DNA Phân tử DNA được cấu tạo từ các đơn phân là nucleotide. Mỗi nucleotide có 3 thành phần cơ bản: (1) một đường pentose deoxyribose; (2) một nhóm phosphate và (3) một trong bốn loại base. Hai loại base cytosine (C) và thymine (T) có cấu trúc vòng đơn carbon nitrogen được gọi là các pyrimidine. Hai loại base adenine (A) và guanine (G) có cấu trúc vòng kép Hình 1. Cấu trúc của 4 loại base carbon - nitrogen được gọi là các purine (hình 1). Tên của các loại base được dùng để đặt tên cho các nucleotide. DNA có cấu trúc không gian như một thang xoắn với 2 tay thang là các phân tử đường và phosphat nối với nhau bằng các liên kết phosphodiester bền vững, bậc thang do các base ở hai bên nối với nhau qua các liên kết hydro yếu theo nguyên tắc bổ sung giữa base adenine với thymine và giữa base guanine và cytosine. Mỗi tay thang bắt đầu từ vị trí 5', kết thúc ở vị trí 3' của phân tử đường deoxyribose và hai tay thang đi ngược chiều nhau. Như vậy nếu một chuỗi đơn của DNA có trình tự các nucleotide 5' - ATGCAG - 3' thì chuỗi bổ sung sẽ có chiều và Hình 2. Cấu trúc xoắn trình tự của các nucleotide như sau: kép của DNA 1
  8. 3' - TACGTC - 5' (hình 2). Các trình tự khác nhau của các nucleotide sẽ quy định các loại protein khác nhau. Tính đặc hiệu của nhiều loại protein trong cơ thể đòi hỏi phải có một lượng lớn thông tin di truyền. Thực tế trong bộ NST đơn bội của các giao tử ở người chứa tới khoảng 3 tỷ cặp nucleotide, số lượng này nhiều hơn nhiều so với số nucleotide cần thiết cho việc mã hóa các protein của cơ thể. 2. Hiện tượng cuộn xoắn của DNA Tổng chiều dài của DNA trong một tế bào khoảng 2 mét do đó để có thể nằm gọn trong nhân tế bào DNA phải cuộn lại ở nhiều mức độ khác nhau (hình 3). Đầu tiên các đoan DNA với chiều dài tương ứng với khoảng từ 140 đến 150 cặp base (base pair: bp) cuộn quanh một lõi protein histon để tạo thành nucleosome. Các nucleosome nối với nhau bằng một đoạn DNA khoảng 20 - 60 bp. Khoảng 6 nucleosome cuộn lại thành một solenoid, các solenoid cuộn lại thành các quai chromatin (chromatin Hình 3. Mô hình cuộn xoắn của DNA loop), mỗi quai chromatin có khoảng 100.000 bp (100 kb). Các quai này được gắn với một khung protein. Bằng cách này DNA có thể giảm chiều dài xuống khoảng 1/10.000 lần so với chiều dài của nó trước khi cuộn xoắn. II. Cấu trúc của gene 1. Các intron và exon Cấu trúc intron và exon của gene là một đặc điểm để phân biệt giữa DNA của sinh vật eukaryote và prokaryote. Các intron chiếm phần lớn trong cấu trúc hầu hết các gene của cơ thể eukaryote. Các đoạn intron này 2
  9. sẽ được các enzyme cắt một cách chính xác ra khỏi các phân tử mRNA trước khi chúng đi ra khỏi nhân tế bào. Vị trí cắt của các enzyme được xác định bởi các đoạn DNA được gọi là các đoạn đồng nhất (consensus sequences) (đoạn này có tên như vậy vì được thấy phổ biến ở tất cả các cơ thể eukaryote) nằm cạnh mỗi đoạn exon (hình 4). Hình 4: Cấu trúc chi tiết của một gene Vì hầu hết các gene của cơ thể eukaryote gồm chủ yếu là các đoạn intron nên cho phép người ta nghĩ đến việc các đoạn này có thể có một chức năng nào đó. Hiện nay chức năng của các intron vẫn còn đang được nghiên cứu, người ta cho rằng có thể những đoạn intron do làm tăng thêm chiều dài của gene sẽ tạo thuận lợi cho sự tái sắp xếp của các gene trên cặp NST tương đồng qua quá trình trao đổi chéo giữa các NST này trong giảm phân hoặc ảnh hưởng đến thời gian nhân đôi và phiên mã của DNA. Một số intron lại mang trong nó các gene được phiên mã mà không liên quan gì tới chức năng gene mang chính các intron đó. Ví dụ như các intron trên gene gây bệnh u xơ thần kinh type 1 (NF1) chứa 3 gene được phiên mã theo hướng ngược với gene NF1 và không có mối liên hệ chức năng nào với gene NF1. 2. Các loại DNA Mặc dù DNA mang thông tin mã hóa cho các protein nhưng trong thực tế chỉ có ít hơn 5% trong số 3 tỷ cặp nucleotide trong genome của người thực sự làm chức năng này, còn lại phần lớn vật liệu di truyền chưa được biết chức năng. Người ta chia DNA thành các loại sau: 2.1. DNA độc bản (single - copy DNA): DNA độc bản chiếm khoảng 45% genome và gồm các gene mã hoá cho các protein. Các đoạn DNA loại này chỉ được thấy một lần duy nhất (hoặc vài lần) trong genome. Tuy nhiên phần mã hóa cho protein chỉ chiếm một phần nhỏ trên loại DNA này mà thôi, phần lớn còn lại là các intron hoặc là các đoạn DNA nằm xen giữa các gene. 2.2. DNA lặp (repetitive DNA): DNA lặp chiếm 55% còn lại của genome, đây là các đoạn DNA 3
  10. được lập đi lập lại có thể lên tới hàng ngàn lần trong genome, có 2 loại chính: 2.2.1. DNA vệ tinh (satellite DNA) Loại DNA này chiếm khoảng 10% genome và tập trung ở một số vùng nhất định trên NST, ở đó chúng sắp xếp nối đuôi nhau, cái này tiếp theo cái kia. DNA vệ tinh được chia thành 3 loại nhỏ: - DNA vệ tinh alpha: có kích thước 171 bp, lập đi lập lại nhiều lần với chiều dài hàng triệu bp hoặc hơn. Loại này được thấy cạnh tâm động của NST. - DNA tiểu vệ tinh (minisatellite DNA): có kích thước từ 14 - 500 bp, lập đi lập lại với chiều dài khoảng vài ngàn bp. - DNA vi vệ tinh (microsatellite DNA): có kích thước từ 1 - 13 bp, lập đi lập lại với tổng chiều dài không quá vài trăm bp. Hai loại DNA tiểu và vi vệ tinh có sự khác nhau rất lớn trong chiều dài giữa người này với người khác và điều này làm chúng trở nên rất hữu ích trong việc lập bản đồ gene. DNA tiểu vệ tinh và vi vệ tinh được gặp với tần số trung bình là 1 trên mỗi 2 kb trong genome và chúng chiếm khoảng 3% genome. 2.2.2. DNA lập lại rải rác: Loại DNA này chiếm khoảng 45% genome, gồm 2 loại: - Các yếu tố rải rác có kích thước ngắn (SINEs: short interspersed elements): kích thước từ 90 - 500bp. - Các yếu tố rải rác có kích thước dài (LINEs: long interspersed elements): kích thước 7.000 bp III. Chức năng của DNA 1. Sự nhân đôi Sự nhân đôi của DNA khi tế bào phân chia giúp tạo ra các bản sao chính xác của DNA cho các tế bào con, đảm bảo cho việc duy trì vật chất di truyền ổn định qua các thế hệ tế bào. Sự nhân đôi của DNA bắt đầu bằng việc phá vỡ các liên kết hydrogen yếu giữa các base, làm tách cấu trúc kép của DNA thành 2 sợi đơn với các base ở trạng thái tự do. Mỗi sợi đơn sẽ đóng vai trò như một khuôn (template) và các base này sẽ liên kết với các base của các nucleotide tự do theo nguyên tắc bổ sung giúp quá trình nhân đôi diễn ra chính xác. Bằng cách này sau khi hoàn tất quá trình nhân đôi mỗi DNA sẽ gồm có một chuỗi đơn cũ và một chuỗi mới được tổng hợp. Phân tử DNA 4
  11. mới này có cấu trúc giống hệt DNA ban đầu (hình 6). Hình 6. Sự nhân đôi của DNA Quá trình nhân đôi của DNA được xúc tác bởi nhiều loại enzyme khác nhau, một enzyme xúc tác cho việc tháo xoắn, một enzyme khác xúc tác cho việc tách DNA thành 2 chuỗi đơn, và một số enzyme khác thực hiện những chức năng khác nhau trong quá trình nhân đôi. DNA polymerase là một trong số các enzyme chính phục vụ cho quá trình nhân đôi, di chuyển dọc theo sợi đơn DNA từ đầu 3' đến đầu 5' và gắn các nucleotide tự do theo nguyên tắc bổ sung vào sợi đơn DNA bằng cách gắn chúng vào đầu 3' của chuỗi polynucleotide đang được tổng hợp. Do đó sợi DNA đơn mới luôn luôn được hình thành theo chiều từ 5' đến 3' và quá trình nhân đôi trên 2 mạch của phân tử DNA mẹ sẽ diễn ra theo hai chiều ngược nhau. Ngoài việc gắn các nucleotide, enzyme DNA polymerase còn thực hiện việc kiểm tra xem một nucleotide mới có bổ sung chính xác với nucleotide trên mạch khuôn không, nếu không thì nucleotide này sẽ bị loại bỏ và thay bằng một nucleotide khác. Quá trình này giúp đảm bảo cho sự nhân đôi của DNA diễn ra một cách chính xác. Nếu một sai sót trong quá trình nhân đôi không được sửa chữa thành công sẽ làm xuất hiện đột biến và các đột biến này có thể sẽ dẫn đến các bệnh di truyền. Tốc độ nhân đôi của DNA khoảng 40 - 50 nucleotide / giây. Tốc độ này chậm hơn nhiều so với tốc độ nhân đôi ở vi khuẩn với 500 - 1000 5
  12. nucleotide / giây. Để có thể thực hiện nhân đôi một cách nhanh chóng DNA (một vài NST có khoảng 250 triệu nucleotide), sự nhân đôi xảy ra tại nhiều điểm khác nhau trên DNA, những vị trí này được gọi là các điểm gốc nhân đôi (replication origins). Cách nhân đôi như vậy sẽ tạo ra nhiều chỗ tách trên chuỗi DNA, những chỗ đó được gọi là các vòng nhân đôi (replication bubble) và phía xảy ra hướng phát triển sự nhân đôi của vòng nhân đôi này được gọi là chạc nhân đôi (replication fork) (hình 7). Hình 7. Sự hình thành các vòng nhân đôi giúp quá trình nhân đôi diễn ra nhanh hơn 2. Quá trình phiên mã Quá trình phiên mã (transcription) giúp truyền thông tin di truyền cho việc tổng hợp protein từ gene ở trên DNA trong nhân đi vào bào tương để tham gia vào quá trình tổng hợp protein. Quá trình này được thực hiện thông qua phân tử RNA. 6
  13. RNA cũng là một loại acid nucleic có cấu trúc tương tự DNA với các phân tử đường, nhóm phosphate và nitrogenous base tuy nhiên thay cho đường deoxyribose là đường ribose, và thay cho thymine là uracyl. Uracyl có cấu trúc tương tự thymine nên có thể bắt cặp với adenine. Một điểm khác biệt quan trọng nữa là RNA thường chỉ có cấu trúc sợi đơn thay vì sợi kép như DNA. Quá trình phiên mã tổng hợp nên loại phân tử RNA thông tin (mRNA: messenger RNA) từ bản khuôn trên DNA (hình 8). 1. Bắt đầu cho quá trình phiên mã một trong số các enzyme RNA polymerase ( RNA polymerase II) sẽ gắn vào một đoạn DNA nằm phía trên gene gọi là vị trí khởi động (promotor site). Dưới sự xúc tác của enzyme này cấu trúc xoắn kép của một đoạn DNA sẽ được tách đôi và một trong hai mạch của DNA sẽ đóng vai trò của bản khuôn để tổng hợp mRNA. Hình 8. Quá trình phiên mã trên DNA Vị trí khởi động đóng vai trò quyết định mạch nào sẽ trở thành mạch khuôn trong việc tổng hợp mRNA thông qua việc định hướng cho enzyme RNA polymerase trên DNA. Trên mạch khuôn, RNA polymerase sẽ di chuyển theo chiều từ 3' đến 5' và cho phép các lắp ghép các ribonucleotide theo nguyên tắc bổ sung theo chiều từ 5' đến 3' với các base trên mạch khuôn theo cách thức tương tự như trong quá trình nhân đôi của DNA nhưng base thymine được thay bằng uracyl. 2. Sau khi quá trình tổng hợp RNA được bắt đầu, đầu 5' của phân tử RNA đang được tổng hợp sẽ được "bít" lại bằng cách thêm vào một 7
  14. nucleotide guanine đã được thay đổi về mặt hóa học đầu này được gọi là "5' cap". 5' cap giúp ngăn cản sự giáng hóa của RNA trong quá trình tổng hợp và giúp chỉ định vị trí bắt đầu quá trình giải mã của mRNA. 3. Quá trình phiên mã được tiếp tục cho tới khi RNA polymerase đọc tới một đoạn nucleotide gọi là đoạn kết thúc (termination sequence). Khi đến vị trí này một đoạn gồm từ 100 đến 200 adenine sẽ được gắn vào đầu 3' của mRNA, cấu trúc này được gọi là đuôi poly - A (poly A-tail). Đuôi poly-A được cho là có vai trò giữ cho phân tử này được hằng định và không bị giáng hóa khi vào trong bào tương. Khi đến vị trí kết thúc, RNA polymerase tiếp tục phiên mã trên chuỗi DNA thêm vài ngàn base tuy nhiên trên mRNA đoạn base thêm phía sau đuôi poly - A sẽ bị mất đi. 4. Cuối cùng RNA polymerase sẽ tách khỏi chuỗi DNA, giải phóng phân tử RNA với cấu trúc chuỗi đơn, phân tử này được gọi là phân tử mã sao nguyên thủy (primary transcript). Ở một số gene người, trên một gene có thể có nhiều vị trí khởi đầu khác nhau nằm ở các vị trí khác nhau do đó làm gene có thể được bắt đầu phiên mã ở các vị trí khác nhau dẫn đến việc tổng hợp các phân tử protein ít nhiều khác nhau từ cùng một gene. Điều này cho phép với cùng một gene có thể mã hóa cho các protein khác nhau ở các mô khác nhau 3. Điều hòa sự biểu hiện của gen (hình 9) Mặc dù tất cả tế bào của cơ thể đều mang trình tự DNA giống nhau, nhưng hoạt động phiên mã của các gene không giống nhau. Một số gene được phiên mã trong tất cả các tế bào của cơ thể, chúng được gọi là các "gene quản gia" (housekeeping gene) chịu trách nhiệm mã hóa cho các sản phẩm cần thiết cho sự tồn tại và chuyển hóa của tế bào. Số này chỉ chiếm một tỉ lệ rất nhỏ trên DNA. Trong khi đó đa số gene chỉ hoạt động ở các mô đặc hiệu và ở những thời điểm nhất định do đó tạo nên tính đặc thù cho từng loại tế bào, loại mô khác nhau và qua đó sản xuất ra các loại protein khác nhau. Nhiều loại protein khác nhau tham gia vào quá trình phiên mã. Một số cần thiết cho mọi quá trình phiên mã được gọi là các yếu tố phiên mã tổng quát (general transcription factors). Một số chỉ hoạt động ở một số gene nhất định vào những giai đoạn nhất định trong quá trình phát triển được gọi là các yếu tố phiên mã đặc hiệu (specific transcription factors). Enzyme RNA polymerase II mặc dù có vai trò quyết định trong việc bắt đầu quá trình phiên mã thông qua việc gắn với vị trí khởi động nhưng tự nó không thể gắn vào vị trí này và không thể quyết định số lượng mRNA được tổng hợp. 8
  15. Để thực hiện được quá trình phiên mã đòi hỏi một sự phối hợp phức tạp với khoảng trên dưới 50 loại protein khác nhau. Những yếu tố phiên mã tổng quát cho phép gắn RNA polymerase vào đoạn DNA đặc hiệu như đoạn TATA và những đoạn khác để bắt đầu quá trình phiên mã trên vùng khởi động. Hình 9. Các yếu tố tham gia vào cơ chế điều khiển hoạt động phiên mã Hoạt động phiên mã của các gene đặc hiệu có thể được gia tăng đáng kể bằng cách tương tác với các đoạn DNA được gọi là tác nhân thúc đẩy (enhancer), đây là những đoạn có chiều dài khoảng vài ngàn nucleotide nằm ở phía trước hoặc sau gene. Tuy nhiên những tác nhân này không tương tác trực tiếp với các gene mà thay vào đó chúng được gắn với các yếu tố phiên mã đặc hiệu được gọi là các tác nhân hoạt hóa (activator). Những tác nhân này đến phiên nó lại gắn với tác nhân phiên mã đặc hiệu thứ hai gọi là các tác nhân đồng hoạt hóa (co-activator), các tác nhân này mới thật sự gắn với phức hợp các yếu tố phiên mã tổng quát nói trên. Chuỗi tác động này bắt đầu từ tác nhân thúc đẩy đến tác nhân hoạt hóa đến tác nhân đồng hoạt hóa rồi đến phức hợp phiên mã tổng quát và cuối cùng là đến bản thân của gene làm gia tăng tốc độ phiên mã của các gene đặc hiệu ở những thời điểm nhất định. Trong khi các tác nhân thúc đẩy giúp gia tăng hoạt động phiên mã của các gene thì các đoạn DNA khác có tên là các tác nhân kìm hãm 9
  16. (silencer) lại ức chế hoạt động phiên mã của gene thông qua kiểu tác động tương tự. Đột biến xảy ra ở các đoạn làm nhiệm vụ của tác nhân thúc đẩy, tác nhân kìm hãm, vị trí khởi động cũng như đột biến ở các gene mã hóa cho các yếu tố phiên mã có thể dẫn đến các bệnh di truyền do gây ra những sai lầm Hình 10. Một kiểu motif gắn với đoạn DNA đặc trong biểu hiện của các hiệu theo kiểu helix - loop - helix (xoắn - vòng - xoắn). gene. Một lượng lớn và khá phức tạp của các yếu tố phiên mã đã góp phần vào việc điều hòa một cách hiệu quả hoạt động của gene. Vấn đề đặt ra là làm thế nào chúng có thể định vị một cách chính xác các đoạn DNA đặc hiệu? Việc định vị này được thực hiện thông qua các motif gắn DNA (DNA-binding motif). Trong mỗi motif, cấu hình của phân tử protein cho phép chúng gắn một cách chính xác và hằng định trên một đoạn đặc hiệu của chuỗi xoắn kép DNA. Trong môt số trường hợp chúng có thể uốn cong DNA để các tác nhân thúc đẩy có thể tác động lên trên các gene đích mặc dù chúng nằm xa nhau (hình 10). 4. Sự cắt nối gene (gene splicing) (hình 11) Phân tử mRNA nguyên thủy (primary mRNA) được sao ra từ mạch khuôn ở trên gene theo nguyên tắc bổ sung. Ở cơ thể eukaryote, trước khi phân tử mRNA này đi ra khỏi nhân các enzyme của nhân tế bào sẽ cắt các intron đi đồng thời nối các đoạn exon lại với nhau để biến mRNA nguyên thủy thành mRNA hoàn chỉnh (mature mRNA). Phân tử này sau đó sẽ được đưa vào bào tương. Một vài gene có các vị trí cắt thay đổi (alternative splice sites), điều này làm cho một phân tử mRNA nguyên thủy có thể bị cắt theo nhiều kiểu khác nhau dẫn đến việc tạo ra các sản phẩm protein khác nhau từ cùng một gene. Những sai sót trong quá trình nối gene, cũng giống như những sai sót xảy ra trong quá trình nhân đôi cũng là một dạng đột biến có thể gây ra các bệnh di truyền. 10
  17. Hình 11. Quá trình cắt nối mARN để tạo thành mRNA hoàn chỉnh IV. Mã di truyền Các protein được cấu tạo từ 1 hoặc nhiều chuỗi polypeptide. Mỗi chuỗi polypeptid được cấu tạo từ các đơn vị cấu trúc cơ bản là các acid amine. Cơ thể có 20 loại acid amine khác nhau, trình tự của các acid amine này trong chuỗi polypeptide được DNA quy định. Mỗi acid amine được mã hóa bởi ba nucleotide kế nhau trên DNA, ba nucleotide này được gọi là một codon. Với 4 loại nucleotide khác nhau sẽ có 64 codon khác nhau bởi thành phần và trật tự của các nucleotide, trong số này có 3 codon kết thúc (stop codon) UAA, UAG và UGA có nhiệm vụ báo hiệu chấm dứt việc tổng hợp chuỗi polypeptide. Trong số 61 mã còn lại có nhiều codon cùng mã hóa cho 1 acid amine, hiện tượng này được goi là hiện tượng thoái hóa mã (degeneration) (bảng 1). Mã di truyền là chung cho toàn bộ sinh giới trừ một số ngoại lệ đối với các codon ở ti thể. Ở DNA của ti thể có một số codon mã cho các acid amine khác với nghĩa của các codon này trên DNA trong nhân. 11
  18. - UGA mã cho tryptophan thay vì báo hiệu chấm dứt việc tổng hơp protein. - AGA và AGG không mã cho arginine mà báo hiệu chấm dứt tổng hợp protein. - AUA mã cho methionine thay vì mã cho isoleucine. Bảng 1. Bảng mã di truyền. VË TRÊ 1 VË TRÊ 2 VË TRÊ 3 (âáöu 5') UCAG (âáöu 3') U Phe Ser Tyr Cys U U Phe Ser Tyr Cys C U Leu Ser STOP STOP A U Leu Ser STOP Trp G C Leu Pro His Arg U C Leu Pro His Arg C C Leu Pro Gln Arg A C Leu Pro Gln Arg G A Ile Thr Asn Ser U A Ile Thr Asn Ser C A Ile Thr Lys Arg A A Met Thr Lys Arg G G Val Ala Asp Gly U G Val Ala Asp Gly C G Val Ala Glu Gly A G Val Ala Glu Gly G Ala: Alanine; Arg: arginine; Asn: asparagine; Asp: aspartic acid; Cys: cysteine; Gln: glutamine; Gla: glutamic acid; Gly: glycine; His: histidine; Ile: isoleucine; Leu: leucine; Lys: lysine; Met: methionine; Phe: phenylalanine; Pro: proline; Ser: serine; Thr: threonine; Trp: tryptophan; Tyr: tyrosine; Val: valine. V. Hoạt động giải mã (translation) Hoạt động giải mã là quá trình tổng hợp chuỗi polypeptide dựa trên khuôn mRNA. Phân tử mRNA không gắn trực tiếp với các amino acid mà phải thông qua vai trò của RNA vận chuyển (tRNA : transfer RNA). 12
  19. Phân tử này là một chuỗi RNA với khoảng 80 nucleotide có hình ba nhánh. Mỗi phân tử tRNA sẽ gắn 1 amino acid vào đầu 3' của nó qua một liên kết cộng hóa trị. Ở đầu kia của của phân tử tRNA là một đoạn 3 nucleo-tide được gọi là bộ ba đối mã (anticodon) (hình 12). Trình tự của các nucleotide trong bộ ba đối mã sẽ bắt cặp với một codon trên mRNA theo nguyên tắc bổ sung. Bằng cách này phân tử mRNA quy định trình tự của các amino acid một cách đặc hiệu thông qua vai trò của các tRNA. Nơi xảy ra quá trình tổng hợp protein trong bào tương là ribosome. Bào quan này được cấu tạo từ các protein có hoạt tính enzyme và các RNA ribosome (rRNA: ribosomal RNA) với tỷ lệ tương đương. Chức năng của rRNA là giúp gắn mRNA và tRNA vào ribosome. Trong quá trình giải mã, đầu tiên ribosome gắn vào vị trí khởi đầu trên mRNA. Tại Hình 12: Cấu trúc của phân tử RNA vận vị trí này có một cođon đặc chuyển hiệu là AUG mã hóa cho amino acid methionine, amino acid này thường được tách khỏi chuỗi polypeptide đang được tổng hợp (hình 13). Ribosome sẽ gắn tRNA vào bề mặt của nó để sự bắt cặp base có thể xảy ra giữa mRNA và tRNA. Ribosome di chuyển dọc theo phân tử mRNA từ codon này đến codon khác theo hướng từ 5' đến 3'. Khi qua được một codon thì một amino acid sẽ được giải mã thông qua sự tương tác giữa mRNA và tRNA. Trong quá trình này một enzyme của ribosome sẽ xúc tác cho việc hình thành các liên kết peptide giữa các amino acid kế nhau dẫn đến sự phát triển của chuỗi polypeptide. Khi ribosome đi đến codon kết thúc trên mRNA, sự giải mã và quá trình hình thành chuỗi polypeptide sẽ ngừng lại. 13
  20. Hình 13: Quá trình giải mã trên mRNA Đầu amino (-NH2) của chuỗi polypeptide tương ứng với đầu 5' của mRNA và nhóm carboxyl (-COOH) tương ứng với đầu 3'. Khi hoàn tất quá trình giải mã, mRNA, ribosome, chuỗi polypeptide sẽ được tách rời nhau và chuỗi polypeptide sẽ được giải phóng vào trong tế bào chất. Trước khi một chuỗi poly-peptide mới được tổng hợp có thể bắt đầu thực hiện hoạt động chức năng nó thường phải trãi qua một số biến đổi. 14
  21. Những biến đổi này được gọi là biến đổi sau giải mã (posttranslational modification). Sự biến đổi này có thể diễn ra theo các kiểu khác nhau. Chuỗi polypeptide có thể được cắt thành các đoạn nhỏ hơn hoặc các chuỗi polypeptide khác nhau được gắn lại với nhau để tạo thành một phân tử protein lớn hơn hoặc các chuỗi bên carbohydrate được gắn thêm vào chuỗi polypeptide v.v Những biến đổi này hết sức cần thiết để phân tử protein có được cấu trúc không gian chính xác, giúp chúng ổn định về cấu trúc và thực hiện các chức năng sinh học. 15
  22. Chương 3 Đột biến gene Đột biến gene (gene mutation) xảy ra khi có sự thay đổi trong trình tự của các nucleotide trên DNA. Chúng có thể xảy ra ở các tế bào dòng sinh dục (germline cell) hoặc các tế bào sinh dưỡng (somatic cell). Chương này tập trung vào các đột biến xảy ra trên các gene đơn (single gene), trong các tế bào dòng sinh dục và nằm trên các vùng DNA mang mã di truyền hoặc trên các đoạn tham gia vào quá trình điều hòa sự biểu hiện của gene vì các đột biến xảy ra trên các vùng khác của genome thường không gây ra các hậu quả về mặt lâm sàng. I. Các loại đột biến đơn gene (single - gene mutation) 1. Đột biến thay cặp nucleotide (base pair substitution) Một cặp nucleotide trong cấu trúc của gene bị thay bởi một cặp nucleotide khác. Tùy theo hậu quả của nó trên chuỗi polypeptide mà được chia làm ba loại: 1.1. Đột biến im lặng (silent substitution) Hình 1: Đột biến sai nghĩa và đột biến vô nghĩa 1
  23. Do tính chất thoái hóa của mã bộ ba nên đột biến làm thay đổi bộ ba mã hóa nhưng không làm đổi nghĩa do đó không làm thay đổi trình tự của các amino acid trong chuỗi polypeptide do đó không gây hậu quả trên kiểu hình. 1.2. Đột biến sai nghĩa (missense mutation)(hình 1) Đột biến chỉ làm thay đổi một amino acid trong chuỗi polypeptide. 1.3. Đột biến vô nghĩa (nonsense mutation) (hình 1) Đột biến làm cho một codon có nghĩa trở thành một codon kết thúc (UAA, UAG hoặc UGA trên mRNA). Những codon này báo hiệu chấm dứt quá trình giải mã nên dẫn đến việc ngừng tổng hợp protein sớm và tạo nên các chuỗi polypeptide ngắn hơn bình thường. Ngược lại nếu một codon kết thúc bị đột biến thành một codon có nghĩa thì chuỗi polypeptide sẽ bị kéo dài. 2. Đột biến thêm (insertion) và mất (deletion) một hoặc nhiều cặp nucleotide Những đột biến thuộc loại này thường gây ra các hậu quả nghiêm trọng. Nếu đột biến làm thừa hoặc mất ba nucleotide thuộc cùng một codon hoặc là một bội số của codon sẽ dẫn đến việc thừa hoặc thiếu 1 hoặc vài amino acide. Nếu số nucleotide thêm hoặc mất không phải là một bội số của codon sẽ làm thay đổi trình tự của các nucleotide từ vị trí đột biến về phía cuối gen, loại đột biến này được gọi là đột biến đổi khung (frameshift mu- tation) (hình 2) Hình 2: Đột biến đổi khung Ví dụ: Đột biến thêm 1 nucleotide Adenine vào vị trí thứ 6 của chuỗi nucleotide sau 5' - ACT - GAT - TGC - GTT - 3' sẽ làm thay đổi trình tự của nó thành: 5' - ACT - GAA - T TG - CGT - T 3' và do đó trình tự amino acid từ Thr - Asp - Cys - Val sẽ trở thành Thr - Glu - Leu - Arg. 2
  24. Đột biến đổi khung thường làm xuất hiện một codon vô nghĩa sau vị trí đột biến dẫn đến việc cắt ngắn chuỗi polypeptide. 3. Đột biến trên vị trí khởi động (promotor mutation) Đột biến xảy ra trên vị trí khởi động của gen có thể làm giảm ái lực của RNA polymerase tại vị trí này và dẫn đến kết quả là giảm sản xuất mRNA và qua đó làm giảm sản lượng protein. Đột biến xảy ra trên các gene mã hóa cho các yếu tố sao mã (transcription factor gene) hoặc trên các đoạn thúc đẩy (enhancer) của gene cũng gây ra hậu quả tương tự. 4. Đột biến ở vị trí cắt (splice site mutation) Đột biến xảy ra ở ranh giới của các đoạn exon và intron do đó làm thay đổi các vị trí báo hiệu cho việc cắt chính xác các đoạn intron. Những đột biến này có thể xảy ra trên đoạn GT có chức năng xác định vị trí cho 5' (5' donor site) hay ở vị trí nhận 3' (3' acceptor site), hoặc có thể xảy ra ở những vùng lân cận các vị trí này (hình 3). Khi đột biến này xảy ra, việc cắt có thể sẽ được thực hiện ở trong exon tiếp theo. Vị trí cắt mới này có trình tự nucletide hơi khác so với Hình 3. (A) vị trí cắt bình thường. (B) Đột biến ở vị trí bình thường, vị trí cắt xảy ra trên đoạn cho, GT bị thay bởi thường không được dùng AT. (C) Đột biến làm xuất hiện một vị trí cho đến và được "dấu" trong GT mới trong đoạn intron đầu tiên dẫn đến việc đoạn exon. Chúng được tạo nên các mRNA hoàn chỉnh bình thường và gọi là các vị trí cắt ẩn bất thường. (cryptic splice site). Việc cắt tại những vị trí cắt bí ẩn sẽ làm mất đoạn một phần exon hoặc đôi khi mất nguyên cả một exon. Đột biến này cũng có thể làm cho một phần hoặc 3
  25. toàn bộ một intron có mặt trong mRNA hoàn chỉnh. II. Transposon (các yếu tố cơ động: mobile element) Các transposon là các đoạn DNA có thể tự tạo ra bản sao của chính mình và cài vào các vị trí khác trên các nhiễm sắc thể và do đó có thể gây ra đột biến đổi cấu trúc. Đây là hiện tượng đã được chứng minh trên các súc vật thí nghiệm như ruồi giấm nhưng trước đây không rõ là có xảy ra ở người hay không. Hiện nay người ta đã phát hiện được ở một số bệnh như bệnh u xơ thần kinh (neurofibromatosis) type I, bệnh ung thư vú có tính gia đình, ung thư ruột kết (colon cancer) và bệnh máu khó đông A và B (hemophilia) ở người có liên quan đến hiện tượng này. III. Đột biến của các đoạn DNA lặp (tandem repeated DNA sequence) Đây là loại đột biến mới được khám phá gần đây. Đột biến ảnh hưởng lên các đoạn DNA lặp nằm ở trong hoặc ở cạnh các gene bệnh. Các đơn vị lặp có chiều dài ứng với ba cặp nucleotide như CAGCAGCAG chẳng hạn. Ở người bình thường có số lượng đoạn DNA lặp này tương đối nhỏ (ví dụ khoảng từ 20 đến 30 đoạn lặp) ở tại một vị trí đặc hiệu trên nhiễm sắc thể. Vì một lý do chưa rõ số đoạn này bị tăng lên một cách đáng kể trong giảm phân hoặc trong giai đoạn sớm của quá trình phát triển phôi làm cho trẻ có số lượng đoạn lặp lên tới hàng trăm hoặc thậm chí hàng ngàn lần. Khi hiện tượng này xảy ra tại một số vùng nhất định trên genome sẽ gây ra các bệnh di truyền. Giống như các đột biến khác chúng có thể được truyền cho thế hệ sau. Hiện nay người ta đã biết khoảng độ hơn mười bệnh liên quan đến loại đột biến này. IV. Hậu quả của đột biến gene ở mức phân tử Đột biến gene có thể làm tăng (gain of function) hoặc mất chức năng (loss of function) của phân tử protein do nó mã hóa. 1. Đột biến làm tăng chức năng của protein Đột biến làm xuất hiện một phân tử protein mới hoàn toàn hoặc làm biểu hiện quá mức bình thường chức năng của một phân tử protein hoặc làm phân tử protein biểu hiện không phù hợp (được tổng hợp ở không đúng loại mô hoặc không đúng giai đoạn). Đột biến làm tăng chức năng gây ra những bệnh di truyền trội (dominant disorder) (Vd: Bệnh Huntington). 2. Đột biến làm mất chức năng của protein Đột biến làm mất 50% sản phẩm protein của gene nhưng 50% 4
  26. protein bình thường còn lại vẫn đủ cho hoạt động chức năng bình thường do đó gây ra những bệnh di truyền lặn (recessive disorder). Người mang gene đột biến ở trạng thái dị hợp sẽ không có biểu hiện bệnh. Tuy nhiên trong một số trường hợp 50% sản phẩm protein bình thường vẫn không đủ cho chức năng bình thường khi đó sẽ làm xuất hiện bệnh ở trạng thái dị hợp (có biểu hiện trội), tình trạng này được gọi là haploinsufficency. Một loại đột biến làm mất chức năng của protein khác là đột biến âm tính trội (dominant negative mutation), loại đột biến này tạo ra sản phẩm protein không những không có chức năng mà còn ức chế chức năng của phân tử protein được tổng hợp bởi allele bình thường trong kiểu gene dị hợp. Hiện tượng này thường được thấy ở các gene mã hóa cho các phân tử protein được cấu tạo từ hai hoặc nhiều tiểu đơn vị. V. Nguyên nhân của đột biến Về mặt nguyên nhân đột biến được chia làm hai loại: (1) Đột biến cảm ứng (induced mutation) xảy ra do tác dộng của các tác nhân có trong môi trường sống Các tác nhân gây ra dạng đột biến này được gọi là tác nhân đột biến (mutagen). (2) Đột biến tự nhiên (spontaneous mutation) xảy ra trong quá trình nhân đôi của DNA. Các nghiên cứu trên súc vật thí nghiệm cho thấy phóng xạ (radiation) là một tác nhân đột biến quan trọng. Các tác nhân phóng xạ ion hoá (ionizing radiation) như tia X và bụi phóng xạ có thể làm tách các electron ra khỏi các nguyên tử do đó tạo nên các ion bị thay đổi điện tích. Khi các ion này nằm cạnh hoặc trong cấu trúc của DNA chúng có thể thúc đẩy các phản ứng hóa học làm thay đổi các base của DNA. Tác nhân phóng xạ ion hóa này cũng có thể làm phá vỡ cấu trúc xoắn kép của DNA. Dạng phóng xạ này có thể có thể tác động trên mọi loại tế bào của cơ thể bào gồm cả các tế bào mầm sinh dục. Các tác nhân phóng xạ không ion hóa (nonionizing radiation) không làm thay đổi điện tích của các nguyên tử nhưng làm cho các electron có thể nhảy từ quỹ đạo trong ra quỹ đạo ngoài của nguyên tử làm những nguyên tử này trở nên không hằng định về mặt hóa học. Tia cực tím (UV: ultraviolet) có mặt tự nhiên trong ánh sáng mặt trời là một ví dụ cho loại phóng xạ này. Tia cực tím tạo nên các liên kết cộng hóa trị giữa các base pyrimidine nằm cạnh nhau như thymine và cytosine sẽ tạo nên các pyrimidine dimers (dimers là các phân tử có 2 tiểu đơn vị), những dimers này không thể bắt cặp chính xác với các base purine trong quá trình nhân đôi của DNA, dẫn đến kết quả là gây ra thay thế một cặp base. Vì tia cực 5
  27. tím chỉ được hấp thu bởi lớp biểu bì nên chỉ có thể gây ra ung thư da mà không thể đến được các tế bào mầm sinh dục. Một số các hóa chất cũng có thể gây ra đột biến do có cấu trúc tương tự các base của DNA, chúng dược gọi là các base tương đồng (base analog) như 5 - bromouracyl. Loại base này có thể thay thế cho một base thật sự của DNA trong quá trình nhân đôi. Do cấu trúc của base tương đồng không giống một cách hoàn toàn như base mà nó thay thế do đó nó có thể gây ra sai sót trong quá trình bắt cặp ở những lần nhân đôi tiếp theo. Hàng trăm loại hóa chất đã được phát hiện là có khả năng gây đột biến ở súc vật thí nghiệm như nitrogen mustard, vynil chloride, các tác nhân alkyl hoá, formaldehyte, sodium nitrite và saccharin. Khả năng gây đột biến của chúng không giống nhau. Một số tác nhân đột biến được sản xuất bởi con người nhưng cũng có nhiều tác nhân xuất hiện tự nhiên trong môi trường như aflatoxin B1 có mặt phổ biến trong thực phẩm. VI. Tỷ lệ đột biến Ở mức độ nucleotide, tỷ lệ đột biến (mutation rate) được ước tính khoảng 10-9 cho mỗi cặp base trong mỗi lần phân chia tế bào ( những đột biến này đã tránh được quá trình sữa chữ-4 DNA). -7 mức độ gene, tỷ lệ đột aỞ biến rất thay đổi, tỷ lệ biến thiên từ 10 đến 10 đối với mỗi locus qua mỗi lần phân chia tế bào, sự biến động này là do: (1) Kích thước của các gene hết sức khác nhau; (2) Có một số đoạn nucleotide nhất định đặc biệt nhạy cảm với đột biến được gọi là các điểm nóng đột biến (mutation hot spots). Tỷ lệ đột biến cũng thay đổi đáng kể theo tuổi của bố mẹ. Một vài bất thường NST gia tăng đáng kể so với sự gia tăng của tuổi mẹ và các đột biến đơn gene có thể gia tăng theo tuổi bố. Sự gia tăng này được thấy trong nhiều bệnh do đột biến đơn gene như hội chứng Marfan và tật loạn sản sụn bẩm sinh (achondroplasia). Nguy cơ sinh một đứa con bị hội chứng Marfan cao khoảng 5 lần hơn ở người nam trên 40 tuổi so với các người nam trong độ tuổi 20 (hình 8). Nguyên nhân của hiện tượng này được cho là liên quan tới hoạt động của các tế bào mầm sinh dục ở người nam đã thực hiện phân chia trong suốt cuộc đời tạo điều kiện cho việc tích lũy các đột biến xảy ra do sai sót trong quá trình nhân đôi. VII. Sửa chữa DNA Trong mỗi lần phân chia tế bào sẽ có khoảng 3 tỷ cặp base thực hiện nhân đôi nghĩa là nguy cơ xảy ra sai sót trong quá trình này để dẫn đến đột biến là rất cao tuy nhiên trong thực tế sự nhân đôi của DNA đã diễn ra một cách chính xác đến ngạc nhiên. Nguyên nhân chính của sự chính xác này 6
  28. là hiện tượng sửa chữa DNA (DNA repair) xảy ra ở mọi tế bào bình thường trong cơ thể của các sinh vật bậc cao. Hàng chục loại enzyme khác nhau đã tham gia vào quá trình sửa chữa các DNA bị tổn thương. Chúng ghi nhận một cách chọn lọc một base bị thay đổi, loại bỏ nucleotide mang nó bằng cách cắt ra khỏi chuỗi DNA, sau đó thay bằng một nucleotide mang base chính xác theo nguyên tắc bổ sung và gắn DNA lại. Người ta cho rằng cơ chế này cho phép sửa chữa tới 99,9% các sai sót. 7
  29. Chương 4 Một số phương pháp phát hiện các biến dị di truyền ở mức phân tử Trong thế kỷ 20 người ta mới bắt đầu nghiên cứu về các biến dị của gene, hậu quả của các đột biến tích lũy theo thời gian. Sự đánh giá và đo lường các biến dị này trong quần thể và trong các gia đình có ý nghĩa rất quan trọng trong việc lập bản đồ gen nhằm xác định vị trí đặc hiệu của chúng trên các NST. Đây cũng là chìa khóa để xác định chức năng của gen và đặt cơ sở cho các chẩn đoán di truyền. Dưới đây sẽ mô tả các phương pháp đã được sử dụng để phát hiện các biến dị di truyền ở người. I. Điện di protein (protein electrophoresis) Kỹ thuật này phát triển đầu tiên vào thập niên 1930 và được áp dụng rộng rãi ở người vào các thập niên 1950 và 1960 cho phép phát hiện một cách đáng kể tính chất đa hình (polymorphism) ở người. Kỹ thuật này dựa trên nguyên tắc sự khác biệt của chỉ một amino acid trong phân tử protein xảy ra do đột biến trên DNA sẽ có thể gây ra một sự khác biệt nhẹ trong điện tích của protein. Ví dụ như trong bệnh hồng cầu hình liềm sự thay thế glutamic acid bằng valine trong chuỗi beta globin sẽ làm thay đổi điện tích của chuỗi globin vì glutamic acid có hai nhóm carboxyl trong khi đó valine chỉ có một nhóm carboxyl. Điện di có thể được sử dụng để xác định một người có Hb bình thường (HbA) hay mang Hb bị đột biến gây bệnh hồng cầu hình liềm (HbS). Hemoglobin được cho vào trong khay gel gồm (tinh bột, agarose và polyacrylamide) để chạy điện di. Do có sự khác biệt trong điện tích nên HbS và HbA sẽ di chuyển với các tốc dộ khác nhau trên gel. Sau khi cho chạy điện di trên gel trong nhiều giờ chúng được nhuộm bằng dịch hóa chất để có thể thấy được vị trí của chúng trên khay gel. Căn cứ sự phân bố của chúng trên khay gel để xác định người đó đồng hợp tử HbA, đồng hợp tử HbS hay dị hợp tử (HbA/HbS). (hình 1) Điện di protein đã được dùng để phát hiện các biến dị amino acid trên hàng trăm loại protein người. Tuy nhiên các đột biến thay base nhưng không làm đổi nghĩa của codon và các đột biến làm thay đổi amino acid nhưng không làm thay đổi điện tích của protein sẽ không thể phát hiện được bằng phương pháp này. Vì những lý do đó điện di protein chỉ cho phép phát hiện chỉ khoảng một phần ba các đột biến xảy ra trên các codon của DNA. Các đột biến xảy ra trên các đoạn DNA không mang mã cũng 1
  30. không phát hiện được bằng phương pháp này. II. Phát hiện đột biến ở mức DNA Biến dị trong DNA của ngừơi được ước tính thay đổi trong khoảng từ 1/300 đến 1/500 bp. Như vậy sẽ có khoảng 10 triệu vị trí đa hình (polymorphism sites) có mặt trong 3 tỷ cặp base có trong genome của người. Việc nghiên cứu các biến dị của DNA thông qua các nhóm máu và điện di protein chỉ cho phép phát hiện một tỷ lệ rất nhỏ trong số các biến dị này. Các kỹ thuật phân tử phát triển trong 20 năm qua đã giúp phát hiện thêm hàng ngàn biến dị mới ở mức DNA. Dưới đây trình bày một số phương pháp phổ biến. 1. Sự đa hình trong chiều dài các đoạn DNA giới hạn (Restriction Fragment Length Polymorphism: RFLPs) Nỗ lực đầu tiên trong việc phát hiện các biến dị di truyền ở mức độ DNA đựoc thực hiện thông qua vai trò của các enzyme của vi khuẩn được gọi là các enzyme giới hạn (restriction endonuclease/restriction enzyme). Các enzyme này được sản xuất bởi nhiều loại vi khuẩn khác nhau nhằm mục đích ngăn chặn sự xâm nhập của các DNA lạ bằng cách cắt nhỏ những DNA này. Các DNA lạ sẽ được cắt tại những vị trí Hình 1: Kỹ thuật điện di protein đặc hiệu trên DNA được gọi là những vị trí ghi nhận hay vị trí 2
  31. giới hạn (recognition sites/restriction sites). Ví dụ: Ở Escherichia coli (một loại vi khuẩn có trong ruột) có một enzyme giới hạn EcoRI ghi nhận một đoạn DNA có trình tự GAATTC. Mỗi khi bắt gặp đoạn này ở trên DNA thì EcoRI sẽ cắt giữa vị trí G và A dẫn đến việc tạo thành các đoạn DNA giới hạn. Hình 2: Cắt DNA bằng enzyme giới hạn EcoRI Giả sử có một đoạn DNA với chiều dài khoảng vài ngàn nucleotide và có 3 vị trí ghi nhận cho enzyme EcoRI. Nếu có 1 biến dị xảy ra ở vị trí nằm giữa làm đoạn GAATTC trở thành GAATTT, EcoRI sẽ không nhận diện được vị trí này và sẽ chỉ cắt tại 2 vị trí đầu và cuối. Do đó ở những người mang biến dị trên vị trí cắt ở giữa (A) sẽ có đoạn DNA giới hạn dài hơn so với người bình thường không mang biến dị (B). (hình 2) Để có thể quan sát được các đoạn DNA giới hạn có chiều dài khác nhau người ta đã thực hiện kỹ thuật gồm các bước sau (hình 3): (1) Xử lí bằng enzyme giới hạn (restriction digestion) Trước tiên DNA được chiết tách từ các mẫu mô, thường là từ máu. Sau đó DNA được cho tiếp xúc với một enzyme giới hạn như EcoRI. Quá trình này sẽ tạo ra trên một triệu đoạn DNA với các chiều dài khác nhau. (2) Điện di Những đoạn này được đem điện di ở trên gel theo một quy trình tương tự như điện di protein tuy nhiên các đoạn DNA di chuyển trên gel phụ thuộc vào kích thước chứ không phụ thuộc vào điện tích. Các đoạn DNA ngắn hơn sẽ di chuyển nhanh hơn trên gel. (3) Tách cấu trúc xoắn kép Sau đó các đoạn DNA được chuyển từ cấu trúc xoắn kép thành cấu trúc mạch đơn bằng cách cho tiếp xúc với dung dịch kiềm. 3
  32. (4) Cố định DNA Để cố định vị trí của các đoạn DNA này người ta thấm chuyển chúng từ gel qua một màng rắn như nitrocellulose (Southern transfer). Màng này bây giờ sẽ chứa hàng ngàn đoạn DNA phân bố theo trật tự tương tự như vị trí của chúng ở trên gel và được gọi là màng thấm Southern (Southern Blot). (5) Xác định đoạn DNA đặc hiệu Nếu người ta nhìn tất cả các đoạn này một lần trên màng lai sẽ khó phân biệt chúng với nhau do số lượng các đoạn DNA trên đó quá lớn. Vì vậy để có thể nhận định sự có mặt của các đoạn DNA đặc hiệu người ta dựa vào nguyên tắc bổ sung. Một mẫu dò (probe) đặc hiệu được tạo ra nhờ kỹ thuật DNA tái kết hợp (recombinant DNA) mang một đoạn mạch đơn DNA đặc hiệu có chiều dài khoảng vài ngàn bp và được đánh dấu bằng chất đồng vị phóng xạ. Màng thấm sẽ được cho tiếp xúc với hàng ngàn probe có hoạt tính phóng xạ. Trong những điều kiện nhất định quá trình bắt cặp theo nguyên tắc Hình 3: Kỹ thuật phát hiện tính đa hình trong bổ sung giữa các probe và các chiều dài của các đoạn DNA giới hạn đoạn DNA đặc hiệu tương ứng sẽ xảy ra. Do chỉ có một vài kb 4
  33. nên probe sẽ xác định được các đoạn DNA đặc hiệu (thường chỉ có một hoặc hai đoạn). Để có thể quan sát được vị trí đã xảy ra quá trình lai giữa các probe và các đoạn DNA đặc hiệu, màng lai sẽ được cho tiếp xúc với phim X quang, phóng xạ phát ra từ các đoạn dò sẽ tác động lên phim tạo ra các vệt sẫm màu, được gọi là các band. Phương pháp này được gọi là phương pháp phóng xạ tự chụp (autoradiogram).(hình 4) Như vậy sự biến dị Hình 4: Hình phóng xạ tự chụp cho thấy vị trí xảy ra trong trình tự của của 1 band 4,1kb và 1 band 3,3kb. Mỗi dãy đại DNA tại những vị trí diện cho một thành viên trong gia đình trong gia giới hạn đặc hiệu sẽ dẫn hệ trên hình phóng xạ tự chụp đến tính đa hình trong chiều dài của các đoạn DNA giới hạn (RFLPs) khi được cắt bởi cùng một loại enzyme giới hạn đặc hiệu. Hiện tượng này đã tạo ra sự đa dạng trong chiều dài của các đoạn DNA mà khi điện di chúng trên gel, chuyển lên trên màng lai và dùng các probe đặc hiệu có hoạt tính phóng xạ để phát hiện thì có thể đánh giá được các biến dị này. Quay trở lại với trường hợp bệnh hồng cầu hình liềm, ở người bình thường tại vị trí thứ 6 của chuỗi polypeptide globin bêta trong cấu trúc của phân tử Hb là glutamic acid. Amino acid được mã hóa trên gene bằng codon GAG. Trong bệnh hồng cầu hình liềm acid này được thay bằng valin, mã hóa trên gene bằng codon GTG. Enzym giói hạn Mst II ghi nhận đoạn DNA CCTNAGG (N nghĩa là enzyme này có thể ghi nhận bất cứ loại base nào của DNA tại vị trí đó). Như vậy nó sẽ cắt đoạn DNA bình thường tại vị trí này cũng như ở các vị trí giới hạn tương tự nằm ở hai bên vị trí này. Kết quả là Mst II sẽ tạo ra hai đoạn DNA, một đoạn có chiều dài 1100 bp và một đoạn có chiều dài 200 bp. Ở các DNA mang đột biến thay GAG bằng GTG làm Mst II không ghi nhận được đoạn giới hạn đó nữa 5
  34. nên đoạn DNA đột biến không được cắt ở vị trí giữa, do đó chỉ tạo ra một đoạn DNA có chiều dài 1300 bp. Trong điện di đoạn ngắn hơn sẽ di chuyển xa hơn ở trên gel nên hai đoạn DNA có kích thước khác nhau (1100 và 1300 bp) có thể phân biệt với nhau dễ dàng trên màng lai nhờ các probe mang DNA của gene beta - globin. Trong trường hợp này RFLPs đã cho phép phát hiện trực tiếp đột biến gây bệnh.(hình 5) Hình 5: Cắt gene beta - globin bằng enzym giới hạn Mst II Trong thực tế hiện nay đã có nhiều phương pháp hịêu quả hơn để đánh giá đột biến gây bệnh hồng cầu hình liềm. Tuy nhiên phương pháp này vẫn còn hữu ích trong việc xác định nhiều loại biến dị và các đột biến gây bệnh khác. Hiện nay người ta đã biết được hàng ngàn enzyme giói hạn, mỗi enzyme ghi nhận một đoạn DNA đặc hiệu. Thêm vào đó hàng ngàn loại probe khác nhau đã được tổng hợp, mỗi probe đại diện cho một đoạn ngắn DNA của người. Bằng cách kết hợp giữa các enzyme và các probe khác nhau, hàng ngàn vị trí đa hình đã được phát hiện trên genome của người. Sự đa hình này được sử dụng làm công cụ trong việc định vị nhiều gene bệnh quan trọng như gene gây bệnh u xơ thần kinh type I (neuro- fibromatosis type I), bệnh Huntington, bệnh xơ nang (cystic fibrosis) v.v 2. Sự đa hình trong số lượng của các đoạn lặp (Variable Number of Tandem Repeat Polymorphism: VNTR) Phương pháp xác định các RFLP chỉ cho phép phát hiện các biến dị có mặt hoặc không có mặt ở một vị trí hạn chế trên DNA. Các biến dị này được gọi là sự đa hình của các vị trí giới hạn ( restriction site polymorphism: RSPs). trong trường hợp này mỗi biến dị chỉ có thể có 2 allele do đó cũng dẫn đến sự hạn chế khi khảo sát các biến dị di truyền. Sự đa dạng sẽ tăng lên nếu như biến dị có thể tạo ra nhiều allele hơn, những biến dị như vậy được thấy ở các DNA tiểu vệ tinh (minisatellites). Biến dị di truyền ở đây được tính thông qua số lượng của các đoạn lặp trên 6
  35. một vùng nhất định. Một vùng DNA tiểu vệ tinh có thể lặp 2, 3 lần hoặc lên đến trên 20 lần lặp. Số lượng này thay đổi rất lớn từ người này qua người khác tạo ra nhiều biến dị di truyền trong quần thể vì vậy chúng được gọi là số lượng dao động của các đoạn lặp nối tiếp (variable number of tandem repeats: VNTRs). Các VNTR được phát hiện bằng kỹ thuật tương tự kỹ thuật dùng để phát hiện các RFLP. DNA sẽ được xử lý bằng một loại enzyme giới hạn, các đoạn DNA sau đó được điện di, tách xoắn và chuyển qua màng thấm. Tuy nhiên trong khi sự đa hình của các vị trí giới hạn chỉ cho phép phát hiện các biến dị dựa vào sự có mặt hoặc vắng mặt của các vị trí giói hạn (chỉ có 2 allele) thì các VNTR cho phép phát hiện các biến dị thông qua sự khác nhau về số lượng của các đoạn lặp giữa hai vị trí giới hạn (có thể có > 2 allele). (hình 6) Hình 6: Tính đa hình trong số lượng của các đoạn lặp (VNTRs) Giống như những vùng DNA tiểu vệ tinh, các DNA vi vệ tinh (microsatellite) cũng có những biến dị trong chiều dài do kết quả của sự khác nhau trong số lần lặp. Mỗi vi vệ tinh chỉ có từ 2, 3 hoặc 4 nucleotide và chúng được gọi là các đoạn lặp ngắn (short tandem repeat: STR). Mỗi đoạn lặp ngắn như vậy có thể lặp đi lặp lại hàng trăm lần. Số lần lặp của các DNA vi vệ tinh có sự khác biệt rất lớn giữa người này với người khác và giữa hai nhiễm sắc thể tương đồng. Tính chất đa hình của các đoạn lặp ngắn (short tandem repeat polymorphism: STRP) khác với các VNTR ở kích thước của đoạn lặp và chúng được phân lập không phải thông qua các vị trí giới hạn nằm cạnh các đoạn lặp mà thay vào đó là bằng kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction: phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ enzyme polymerase). Tính đa hình về số lượng của các VNTR và của các vi vệ tinh rất hữu ích trong việc lập bản đồ gene. Đặc biệt là các DNA vi vệ tinh vì trong genome chúng có mặt nhiều hơn, phân bố đều hơn và cũng dễ đánh giá hơn trong phòng thí nghiệm. Do các đặc tính này mà các DNA vi vệ tinh trở thành các đa hình được chọn lựa trong hầu hết các nghiên cứu để lập bản đồ gene. 7
  36. Ngoài ra sự đa hình của các VNTR và của vi vệ tinh cũng được sử dụng một cách hiệu quả trong lĩnh vực pháp lý như xác định người cha, xác định tội phạm. 3. Khuếch đại DNA bằng kỹ thuật PCR Việc sử dụng các RFLP và VNTR mặc dù có ích nhưng phụ thuộc nhiều vào kỹ thuật dòng hóa (cloning) và kỹ thuật chuyển và cố định DNA lên màng thấm. Những kỹ thuật này có một số hạn chế nhất định: (1) việc dòng hóa thường đòi hỏi nhiều thời gian (trung bình là 1 tuần hoặc hơn); (2) việc thực hiện kỹ thuật Southern blot đòi hỏi một lượng lớn DNA tinh khiết, thường là phải nhiều microgram (để có được số lượng này thường cần khoảng 1ml máu tươi). Kỹ thuật PCR cho phép nhân một đoạn DNA đặc hiệu ngắn (có chiều dài khoảng vài ngàn kb hoặc ngắn hơn) nhân lên một cách nhanh chóng thành hàng triệu bản sao Hình 7: Khuếch đại DNA bằng giống hệt nhau (hình 7) tạo kỹ thuật PCR điều kiện thuận lợi cho việc phát hiện các biến dị di truyền ở mức DNA hiệu quả hơn rất nhiều so với các phương pháp cổ điển. 8
  37. Quá trình thực hiện PCR đòi hỏi các thành phần sau: (1) Hai đoạn mồi (primer), mỗi đoạn mồi là một đoạn DNA có từ 15 đến 20 base được gọi là oligonucleotide (oligo có nghĩa là "một vài"). Các primer này tương ứng với trình tự của DNA nằm ngay ở các đoạn được quan tâm như đoạn chứa một đột biến gây bệnh hoặc chứa một đa hình của đoạn lặp DNA vi vệ tinh. Các primer này được tổng hợp nhân tạo trong phòng thí nghiệm. (2)DNA polymerase, đây là một loại enzyme hằng định với nhiệt độ được trích chiết từ vi khuẩn Thermus aquaticus. Xúc tác cho quá trình nhân đôi của DNA, trong kỹ thuật PCR quá trình này được gọi là quá trình kéo dài primer (primer extension). (3) Một lượng lớn các nucleotìde tự do (4) DNA từ một cơ thể sinh vật cần nghiên cứu, do kỹ thuật PCR rất nhạy nên lượng DNA cần thiết có thể rất nhỏ. Đầu tiên DNA của genome được đun nóng lên ở nhiệt độ tương đối cao (95oC hoặc hơn) để tách xoắn làm hình thành các chuỗi đơn. Sau đó các DNA này được cho tiếp xúc với một lượng lớn các primer, những primer này sẽ lai với các DNA của genome theo nguyên tắc bổ sung khi được làm lạnh tới nhiệt độ khoảng từ 35oC tới 65oC. DNA lại được đun nóng tới nhiệt độ trung gian 70 đến 75oC. Trong điều kiện có nhiều nucleotide tự do, một chuỗi đơn DNA mới sẽ được tổng hợp ở nhiệt độ này dưới sự xúc tác của DNA polymerase bắt đầu từ đoạn primer. Các DNA mới được tổng hợp sẽ có cấu trúc xoắn kép với đầu 5' mang primer được kéo dài bởi các nucleotide theo nguyên tắc bổ sung dưới sự xúc tác của enzyme DNA polymerase. Chuỗi xoắn kép DNA này lại được đun nóng ở nhiệt độ cao trở lại để tách xoắn. Chu kỳ nóng lạnh này được lập đi lập lại nhiều lần cho phép các DNA mới được tổng hợp đóng vai trò như các khuôn mới để tổng hợp thêm các DNA mới và số lượng của các bản sao tăng lên theo lũy thừa của 2. Khi chu kỳ này được lập đi lập lại từ 20 đến 30 lần sẽ tạo ra hàng triệu bản sao của DNA ban đầu. Tóm lại PCR là một quá trình bao gồm ba bước cơ bản: (1) Tách cấu trúc kép DNA bằng nhiệt độ cao (2) Lai với đoạn primer ở nhiệt độ thấp (2) Kéo dài đoạn primer ở nhiệt độ trung gian. Kết quả là tạo ra các đoạn DNA hoàn toàn giống nhau về trình tự . Mỗi chu kỳ chỉ đòi hỏi vài phút hoặc ít hơn cho nên từ 1 DNA ban đầu có thể khuyếch đại thành hàng triệu bản sao chỉ trong vòng vài giờ. 9
  38. Do tính đơn giản của kỹ thuật nên các máy PCR đã được chế tạo để thực hiện công việc này một cách tự động. Khi DNA được khuếch đại, chúng sẽ được phân tích theo những hướng khác nhau. Kỹ thuật PCR có nhiều thuận lợi hơn các kỹ thuật cổ điển do: (1) Có thể được sử dụng với 9một lượng DNA ban đầu hết sức nhỏ với đơn vị tính là nanogram (10- g) hoặc picogram (10-12g), số lượng DNA này có thể thu được từ các vết máu khô đã nhiều năm, trên một sợi tóc hoặc thậm chí từ mặt sau của một con tem được dán bằng nước bọt là đủ cho việc phân tích. (2) Không đòi hỏi quá trình dòng hóa (cloning), do đó PCR cho kết quả nhanh hơn so với các kỹ thuật cũ. (3) PCR cho phép tạo ra một lượng lớn DNA tinh khiết nên không cần phải sử dụng các probe có hoạt tính phóng xạ để phát hiện các đoạn DNA mang đột biến mà dùng các probe không có hoạt tính phóng xạ đánh dấu bằng phương pháp hóa học an toàn hơn. Tuy nhiên PCR cũng có những bất lợi nhất định: (1) Việc tổng hợp các primer đòi hỏi phải có sự hiểu biết về trình tự của đoạn DNA nằm cạnh đoạn DNA cần khảo sát. Khi không có những thông tin về trình tự của đoạn đó bắt buộc phải sử dụng các kỹ thuật khác. (2) Do kỹ thuật PCR hết sức nhạy nên rất dễ bị nhiễm DNA từ các nguồn khác trong phòng thí nghiệm. (3) PCR rất khó áp dụng với các đoạn DNA dài hơn 1 đến vài kb nên kỹ thuật này không thể được sử dụng để phát hiện các đột biến mất đoạn gene lớn hơn đoạn DNA trên. Trong trường hợp này phải sử dụng kỹ thuật Southern blotting để thay thế. Do những ưu việt của kỹ thuật PCR, nên hiện nay PCR được sử dụng phổ biến trong chẩn đoán các bệnh di truyền, trong pháp y và trong di truyền học tiến hóa. PCR đã thay thế cho kỹ thuật Southern blotting trong nhiều lãnh vực và hiện nay thường được dùng để phân tích các RFLP và VNTR. 4. Xác định trình tự của DNA (DNA sequencing) Trong nhiều nghiên cứu di truyền, một mục tiêu chính là xác định cho được trình tự của các base trên toàn bộ hoặc một phần của gene. Việc xác định trình tự của DNA cho phép tìm hiểu bản chất của đột biến gene, chức năng của gene, mức độ tương tự của gene với các gene khác đã biết. 10
  39. Hình 8: Kỹ thuật xác định trình tự nucleotide của DNA bằng cách sử dụng phương pháp dideoxy Một kỹ thuật được sử dụng rộng rãi để xác định trình tự của DNA là phương pháp dideoxy (dideoxy method) do Frederick Sanger đưa ra. Phương pháp này được thực hiện bằng cách sử dụng các dide- oxynucleotide chấm dứt chuỗi (chain-terminating dideoxynucleotide). Đây là các nucleotide có cấu trúc tương tự như các deoxyribonucleotide bình thường khác chỉ khác ở chỗ chúng thiếu mất một nhóm hydroxyl trong cấu trúc. Sự khác biệt này trong cấu trúc làm cho phân tử này không thể tạo 11
  40. thêm liên kết phosphodiester với các nucleotide tự do. Như vậy mặc dù các dideoxynucleotide có thể gắn vào một chuỗi DNA đang được tổng hợp nhưng sau nó không có thêm nucleotide nào gắn vào thêm được nữa và chấm dứt quá trình nhân đôi ngay tại vị trí đó. Người ta sử dụng 4 loại dideoxynucleotide khác nhau, mỗi loại sẽ bổ sung với các deoxyribonucleotide A, T, G, hoặc C. Trình tự của một chuỗi đơn DNA nào cần đọc trình tự sẽ đựơc trộn với các primer được đánh dấu bằng các chất hoạt tính phóng xạ, DNA polymerase, các nucleotide thông thường và một loại dideoxynucleotide. Primer sẽ lai với một vị trí tương ứng trên chuỗi đơn DNA theo nguyên tắc bổ sung và DNA polymerase sẽ giúp bổ sung tiếp các nucleotide như trong kỹ thuật PCR. Dideoxynucleotide sẽ gắn vào chuỗi DNA đang được tổng hợp khi có nucleotide tương ứng theo nguyên tắc bổ sung. Tuy nhiên khi điều này xảy ra thì quá trình tổng hợp chuỗi DNA cũng bị ngừng lại. Ở bất kỳ một vị trí nhất định nào, hoặc sẽ có một nucleotide bình thường hoặc một dideoxynucleotide có thể được thêm vào một cách ngẫu nhiên. Quá trình này cho phép cho phép tạo nên các đoạn DNA với chiều dài khác nhau, mỗi đoạn đều kết thúc bời cùng một loại dideoxynucleotide. Những đoạn DNA có thể phân lập theo chiều dài bằng điện di như trình bày ở phần trên. Bốn loại phản ứng khác nhau được thực hiện cho 4 loại nucleotide, các đoạn thu được từ mỗi loại phản ứng sẽ được chạy điện di bên cạnh nhau trên cùng một gel để vị trí của các đoạn có thể so sánh được với nhau. Vì mỗi band ứng với một chuỗi DNA tận cùng bởi 1 loại base duy nhất nên trình tự của DNA có thể được đọc bằng cách quan sát thự tự của các band trên gel sau khi sử dụng kỹ thuật phóng xạ tự chụp (các primer có hoạt tính phóng xạ sẽ chỉ vị trí của các đoạn DNA trên phim). Trong mỗi quá trình phản ứng như vậy có thể đọc được trình tự của vài trăm cặp base.(hình 8) Tuy nhiên cách đọc trình tự của DNA theo cách này tương đối chậm, khó khăn và dễ sai sót. Gần đây kỹ thuật đọc trình tự DNA tự động (automated DNA sequenced) sử dụng hệ thống phát hiện màu huỳnh quang (fluorescent), hóa chất phát sáng (chemiluminescent) hoặc hệ thống đo màu (colorimetric) đang được phát triển. Việc sử dụng các primer hoặc dideoxynucleotide được gắn huỳnh quang giúp cho phương pháp này trở nên phổ biến. Một mạch khuôn DNA được đọc trình tự bằng cách sử dụng phương pháp tương tự bước kéo dài primer trong kỹ thuật PCR. Mỗi một trong 4 dideoxynucleotide khác nhau được gắn với một loại màu huỳnh quang cho 12
  41. phép phát ra một phổ ánh sáng riêng. Các đoạn DNA đã được gắn huỳnh quang sau phản ứng tổng hợp sẽ được điện di trên gel polyacrylamide rất mỏng rồi sau đó được kích thích bằng một chùm tia laser . Ánh sáng phát ra được ghi nhận qua một camera kỹ thuật số (digital camera) để chuyển thành các tín hiệu điện tử và chuyển thành ảnh. Ảnh này được phân tích để chuyển thành dạng đồ thị trong đó mỗi một loại nucleotide khác nhau được mô tả bằng một đỉnh màu khác nhau, trình tự của các đỉnh màu này trên đồ thị cho phép đọc trình tự của đoạn DNA. Một đoạn khoảng 500 bp của 64 người khác nhau có thể được phân tích trên cùng một gel trong vòng từ 2 đến 4 giờ. Phương pháp đọc trình tự tự động cũng được thực hiện cho việc đánh giá tính chất đa hình của các đoạn lặp ngắn (STRP), tính đa hình của đơn nucleotide (single-nucleotide polymorphism: SNP) và các dạng đa hình khác. Một hướng đọc trình tự tự động khác là các mẫu DNA được điện di trong các ống thuỷ tinh rất nhỏ được gọi là các ống mao dẫn (capillary) chứ không phải trên gel polyacrylamide. Vì những ống này rất mỏng và lượng nhiệt tỏa ra trong quá trình điện di rất ít nên việc đọc trình tự diễn ra rất nhanh, kỹ thuật này cho phép đọc trình tự của 600 bp của 96 mẫu chỉ trong vòng 15 phút. Ngoài ra một kỹ thuật mới là sử dụng sắc ký khối phổ (mass spectroscopy), đây là một kỹ thuât có độ phân giải cao trước đây dùng để phân tích protein. Sự phát triển của kỹ thuật MALDI-TOF (matrixassisted laser desorption/ionization time-of-flight) cho phép phân tích hàng trăm mẫu DNA trong vài phút. Hiện nay đây là kỹ thuật thu hút nhiều sự quan tâm trong việc sử dụng để đọc trình tự DNA. Bằng cách sử dụng vi tính và các kỹ thuật tự động đã làm tăng khả năng đọc trình tự của DNA và đã cho phép đọc được trình tự của toàn bộ 3 tỷ bp trong genome của người. 5. Chip DNA (DNA chip) Chip DNA hoặc DNA microarray là một kỹ thuật mới để phát hiện các đột biến đặc hiệu với tốc độ rất nhanh, chính xác dựa trên cơ sở phân tích đột biến bằng vi tính. Để sản xuất các chip DNA, các oligonucleotide đóng vai trò của các đoạn dò (probe) được máy cài lên 2một phiến kính nhỏ. Mỗi phiến kính như vậy với diện tích khoảng 1cm có thể chứa từ hàng trăm đến hàng ngàn loại oligonucleotide khác nhau. Các oligonucleotide này gồm các DNA có trình tự bình thường và các DNA có trình tự mang các đột biến 13
  42. gây bệnh đã biết. DNA của một đối tượng nào đó được gắn huỳnh quang và cho lai với các oligonucleotide trên phiến kính để xác định xem chúng lai với oligonucleotide bình thường hay đột biến. Mẫu lai được phân tích trên máy vi tính để xác định DNA của đối tượng là bình thường hay mang loại đột biến cụ thể nào (hình 9). Hình 9: Sơ đồ minh hoạ một chip DNA. Các oligonucleotide được đặt trên con chip, sau đó cho tiếp xúc với DNA được gắn huỳnh quang của một đối tượng. Quá trình lai xảy ra nếu có một oligonucleotide có trình tự nucleotide bổ sung với trình tự DNA của đối tượng. Ví trí phát huỳnh quang trên chip sẽ đánh dấu vị trí của đoạn oligonucleotide trên chip Một ứng dụng khác của chip DNA là là xác định xem gene có biểu hiện (nghĩa là được phiên mã) ở trong một mẫu mô nào đó không (ví dụ như từ một khối u). Người ta chiết mRNA từ mô rồi dùng nó làm bản khuôn để tạo thành các đoạn DNA theo nguyên tắc bổ sung. Sau đó đoạn này được đem lai trên phiến kính với các oligonucleotide đại diện cho nhiều loại gene khác nhau. Tín hiệu lai dương tính ở tại vị trí nào đó trên phiến kính chứng tỏ gene đó được biểu hiện trên mẫu mô. 14
  43. Chương 5 Đột biến đơn gene trên nhiễm sắc thể thường I. Các khái niệm cơ bản 1. Xác suất Đánh giá nguy cơ là một phần hết sức quan trọng trong di truyền y học. Thầy thuốc hoặc nhà tư vấn di truyền thường phải thông tin cho các cặp vợ chồng về nguy cơ xuất hiện một bệnh lý di truyền nào đó trên con của họ. Để hiểu được làm thế nào có thể ước tính được các nguy cơ đó cần phải nhắc lại một số các khái niệm cơ bản về xác suất. Xác suất là tỷ lệ xuất hiện của một sự kiện nhất định trong một loạt các sự kiện. Trong giảm phân mỗi NST trong cặp tương đồng sẽ đi vào một tinh trùng hoặc trứng. Xác suất để 1 NST trong cặp được truyền cho tinh trùng hoặc trứng là 1/2 và xác suất cho NST kia của cặp cũng là 1/2. Xác suất này tương ứng với việc xác suất xuất hiện mặt sấp - ngữa của đồng tiền khi gieo nên chúng ta sẽ dùng việc gieo đồng tiền như một ví dụ minh họa. Khi một đồng tiền được gieo lập đi lập lại nhiều lần, kết quả của mỗi lần gieo sẽ độc lập với nhau và xác suất xuất hiện mặt sấp hoặc mặt ngữa sẽ là 1/2 (khi tính trên một lượng lớn lần gieo). Tương tự như vậy, xác suất để bố hoặc mẹ sẽ truyền một trong số hai allele ở 1 locus nhất định cho con sẽ độc lập với nhau trong các lần sinh. Nguyên lý độc lập cho phép chúng ta suy ra 2 quy luật căn bản của xác suất là quy luật nhân (multiplication rule) và quy luật cộng (addition rule). 1.1. Quy luật nhân Nếu 2 (hay nhiều) thử nghiệm xảy ra độc lập với nhau thì xác suất để có được 1 kết quả nào đó cho cả hai (hay nhiều) thử nghiệm sẽ là phép nhân xác suất của kết quả đó trong mỗi thử nghiệm. Ví dụ: Một cặp vợ chồng muốn biết khả năng sinh được cả ba đứa con đều là trai sẽ là:1/2 x 1/2 x 1/2 = 1/8 (1/2 là xác suất sinh con trai hoặc gái trong mỗi lần sinh). 1.2. Quy luật cộng Nếu chúng ta muốn biết xác suất xuất hiện của sự kiện này hoặc của sự kiện kia thì chỉ cần cộng xác suất xuất hiện của các sự kiện đó lại với nhau. 1
  44. Ví dụ: Giả sử có một cặp vợ chồng muốn có 3 đứa con, và họ muốn cả ba đứa trẻ này có chung một giới, xác suất để họ có cả ba đứa con đều là gái là 1/8, xác suất để họ có ba đứa đều là trai là 1/8 do đó xác suất để họ có được 2 đứa con như ý muốn là 1/8 + 1/8 = 1/4 và như vậy khả năng để họ có 3 đứa con với các kiểu kết hợp khác về giới tính sẽ là 3/4. 2. Khái niệm về kiểu gen và kiểu hình - Kiểu gen (genotype): là cấu trúc di truyền của một cá thể tại một locus. - Kiểu hình (phenotype): là những cái chúng ta có thể quan sát được trên cơ thể hoặc trên lâm sàng. Kiểu gene không nhất thiết phải tương ứng với kiểu hình. Hai kiểu gen khác nhau, một đồng hợp trội và một dị hợp, có thể có cùng một kiểu hình như ở bệnh xơ nang (cystic fibrosis). Ngược lai cùng một kiểu gen nhưng có thể cho kiểu hình khác nhau trong những điều kiện ngoại cảnh khác nhau. Kiểu hình là kết quả của sự tương tác giữa kiểu gen và các yếu tố ngoại cảnh. Cũng cần nhấn mạnh chữ "ngoại cảnh" ở đây có thể bao gồm luôn cả yếu tố di truyền (Ví dụ: như gene ở một locus khác có thể tương tác với một gene đặc hiệu hoặc sản phẩm của nó). 3. Tần số kiểu gen và tần số gene 3.1. Tần số kiểu gen Tần số kiểu gen được tính một cách đơn giản bằng cách chia số kiểu gen đó cho tổng toàn bộ số kiểu gen. Tổng tần số của các kiểu gen phải bằng 1. Ví dụ: Chúng ta đánh giá về nhóm máu MN trên 200 người trong một quần thể. Nhóm máu này được mã hóa trên một locus của chromosome thứ 2 bởi 2 allele được ký hiệu là M và N. Trong hệ nhóm máu MN, hiệu quả của cả 2 allele đều có thể quan sát ở cơ thể dị hợp tử (heterozygote) MN vì vậy chúng được gọi là đồng trội (codominant) và tình trạng dị hợp này có thể phân biệt với hai dạng đồng hợp tử MM và NN. Bất cứ một cá thể nào trong quần thể đều thuộc về một trong ba kiểu gen MM, NN hoặc MN. Trong 120 người được nghiên cứu chúng ta có phân bố kiểu gen như sau: MM (64); MN (120); NN (16). Tần số của kiểu gen MM là 64 / 200 (= 0,32); tần số của kiểu gen MN là 120 / 200(= 0,60) và tần số kiểu gen NN là 16 / 200 ( = 0, 08). Lẽ dĩ nhiên tổng của toàn bộ kiểu gene phải bằng 1. 2
  45. 3.2. Tần số gen Tần số gen của mỗi allele được tính bằng cách đếm số gene đó và chia cho tổng số gene. Tổng tần số của các gene allele phải bằng 1. Tần số của allele M ở người có kiểu gen MM là : 64 x 2 = 128 gene M; tần số của allele N ở người có kiểu gen NN là : 16 x 2 = 32 gene N; tần số của gene M hoặc N ở người có kiểu gene MN là : 120, nên tổng số từng gene M và N là: Gene M : 120 + 128 = 248 Gene N: 120 + 32 = 152 Tổng số gene M và N : 248 + 152 = 400 gene tại locus mang gene quy định nhóm máu MN (gấp đôi số cá thể khảo sát), nên tần số gene M là 248 / 400 (= 0,62) và tần số gene N là 152 /400 ( = 0,38). 4. Nguy cơ tái phát (recurrence risk) Các bố mẹ có nguy cơ sinh con mắc bệnh di truyền luôn luôn đặt cho nhà tư vấn di truyền câu hỏi về khả năng mắc bênh của con họ trong tương lai. Khi họ đã có một hoặc hai đứa con mắc một bệnh di truyền bố mẹ sẽ được nhà tư vấn dự báo một nguy cơ tái phát (recurrence risk), đây là khả năng mà họ có thể sinh đứa con tiếp theo mắc bệnh di truyền đó. Nếu họ chưa có con, họ cũng có nhu cầu được biết về nguy cơ sinh ra một đứa con mắc bệnh di truyền, nguy cơ này gọi là nguy cơ xảy ra (occurence risk). 5. Phả hệ (pedigree) Hình 1: Các ký hiệu phả hệ cơ bản Phả hệ là một công cụ phổ biến trong di truyền y học. Sử dụng các ký hiệu đơn giản để minh họa mối liên quan giữa các thành viên trong gia 3
  46. đình (hình 1) và cho thấy những thành viên nào trong gia đinh bị mắc bệnh hoặc không mắc một bệnh di truyền nào đó. Trong một phả hệ điển hình, một mũi tên được sử dụng để chỉ đối tượng đầu tiên trong phả hệ được khảo sát (proband). 6. Khái niệm " trội " và " lặn" Thuật ngữ " trội" và " lặn" được dùng để ám chỉ cách biểu hiện của gene ở cá thể. Mặc dù sự biểu hiện của gene rất phức tạp nhưng việc dùng thuật ngữ "trội" và "lặn" cho gene được dùng phổ biến và thuận lợi trong thực tế. Cách phân biệt đơn giản và hiệu quả bệnh di truyền gene trội và gene lặn là dựa trên sự biểu hiện hay không biểu hiện trên lâm sàng ở người dị hợp tử. Bệnh di truyền trội hầu như luôn luôn biểu hiện trên lâm sàng trong khi đó bệnh di truyền lặn luôn luôn bình thường trên lâm sàng ở cơ thể dị hợp. II. Sự di truyền của gene đột biến nằm trên nhiễm sắc thể thường 1. Di truyền gene trội (autosomal dominant inheritance) 1.1. Đặc điểm Hình 2: Khung Punnett minh Hình 3: Một phả hệ minh họa sự di họa hôn nhân giữa người bình truyền tật thừa ngón sau trục thường (aa) và người mắc bệnh dị hợp (Aa). Bệnh di truyền phổ biến nhất thuộc kiểu này được gặp với tần số 1/1000. 4
  47. Trẻ mắc bệnh thường được sinh ra từ hôn nhân của một người hoàn toàn bình thường và một người mắc bệnh dị hợp tử (Aa x aa). (hình 2). Một phả hệ của tật thừa ngón sau trục (postaxial polydactyly) với biểu hiện thừa ngón cạnh ngón út (hình 3) di truyền kiểu trội trên NST thường, với gene A quy định tật thừa ngón, a quy định ngón bình thường được minh họa dưới đây cho thấy nhiều đặc điểm quan trọng của các Hình 4: Tật thừa ngón sau bệnh di truyền do gene trội trên NST trục thường (hình 4): -Cả hai giới đều có tỷ lệ mắc xấp xỉ. - Không có sự gián đoạn giữa các thế hệ. -Nếu bố mẹ không mắc bệnh thì con của họ sẽ không có ai mắc bệnh trừ khi xuất hiện đột biến mới. 1.2. Nguy cơ tái phát và nguy cơ xảy ra Khi một trong hai bố mẹ bị ảnh hưởng bởi một bệnh di truyền gene trội trên NST thường ở trạng thái dị hợp, người kia hoàn toàn bình thường. Nguy cơ xảy ra và nguy cơ tái phát đều là 1/2. 2. Di truyền gene lặn trên NST thường (autosomal recessive inheritance) 2.1. Đặc điểm Hình 5: Khung Punnett minh họa hôn nhân giữa hai người Hình 6: Một phả hệ minh họa sự di truyền dị hợp tử về gene lặn đột biến bệnh bạch tạng. 5
  48. Các bệnh di truyền gene lặn trên NST thường khá hiếm trong quần thể. Những người mang gene bệnh ở trạng thái dị hợp tử (Aa) phổ biến hơn nhiều so với người đồng hợp tử (aa) về gene bệnh. Bố mẹ của người mắc bệnh di truyền gene lặn trên NST thường đều phải dị hợp tử về gene bệnh (Aa x Aa). Ví dụ: Bệnh bạch tạng là một bệnh di truyền gene lặn gây ra do đột biến gene mã hóa cho enzyme tyrosinase chuyển hóa tyrosine. Trên phả hệ của bệnh này (hình 6) cho thấy các đặc điểm chính của các bệnh di truyền do gene lặn trên NST thường: - Bệnh thường được thấy ở một hoặc một số anh chị em ruột nhưng không xảy ra ở các thế hệ đầu. - Nam và nữ đều có khả năng mắc bệnh như nhau. - Trung bình một phần tư con của cặp vợ chồng mang gene bệnh ở trạng thái dị hợp sẽ biểu hiện bệnh. (hình 5) - Tình trạng hôn nhân đồng huyết (consanguinity), được gặp nhiều trong phả hệ của loại bệnh di truyền này hơn so với các loại bệnh di truyền khác. 2.2. Nguy cơ tái phát Nguy cơ tái phát trong con cái của các bố mẹ mang gene bệnh (carrier) trung bình là 25%. Tỷ lệ này thay đổi trong từng gia đình nhưng khi tính trên một số lượng lớn gia đình sẽ đạt được tỷ lệ trên. III. Các yếu tố làm ảnh hưởng đến kiểu di truyền 1. Đột biến mới Nếu một đứa trẻ được sinh ra với một bệnh di truyền và trong gia đình của trẻ chưa hề có tiền sử về bệnh này thì có thể trẻ này là kết quả của một đột biến mới (new mutation), điều này đặc biệt đúng đối với bệnh di truyền do gene trội trên NST thường. Trong trường hợp này nguy cơ tái phát ở lần sinh tiếp theo của cặp bố mẹ này không cao hơn mức chung của quần thể. Các nghiên cứu cho thấy một tỷ lệ lớn của các bệnh di truyền gene trội trên NST thường là kết quả của một đột biến mới. Đặc điểm này cho thấy bệnh có xu hướng giới hạn tiềm năng sinh sản của cá thể mắc bệnh. 2. Tình trạng khảm ở các tế bào dòng sinh dục (germline mosaicism) Đôi khi trong một gia đình người ta có thể thấy trong số con của cùng một bố mẹ có tới 2 con hoặc nhìều hơn mắc cùng một loại bệnh di truyền trội NST thường trong khi tiền sử của gia đinh chưa hề có ai mắc 6
  49. bệnh này. Vì đột biến là một sự kiện hiếm gặp nên việc xảy ra nhiều lần một loại đột biến trong cùng một gia đình rất khó có thể xảy ra. Cơ chế giải thích cho hiện tượng này là hiện tượng khảm của các tế bào dòng sinh dục (germline mosaicism. Trong quá trình phát triển phôi của một trong hai bố mẹ, một đột biến có thể đã xảy ra và ảnh hưởng lên tất cả hoặc một phần của của các tế bào dòng tinh nhưng không ảnh hưởng hoặc chỉ ảnh hưởng đến một vài tề bào soma của phôi. Như vậy bố hoặc mẹ đã mang đột biến trong các tế bào dòng sinh dục của họ nhưng họ hoàn toàn không có biểu hiện bệnh trên kiểu hình. Kết quả là họ có thể truyền gene đột biến cho nhiều người con. Hiện tượng này mặc dù tương đối hiếm gặp nhưng ảnh hưởng rất lớn đến nguy cơ tái phát của bệnh. 3. Khởi bệnh muộn (delayed age of onset) Trong khi một số bệnh di truyền biểu hiện ngay từ khi sinh hoặc chỉ một thời gian ngắn sau đó thì nhiều bệnh di truyền phải đợi cơ thể tới giai đoạn trưởng thành mới biểu hiện. Hiện tượng này được gọi là hiện tượng khởi bệnh muộn (delayed age of onset). Tình trạng biểu hiện muộn dẫn đến hậu quả là người bệnh thường có con trước khi họ nhận thức được tình trạng mang gene bệnh của mình. (a) (b) Hình 7: Bệnh u xơ thần kinh type I. (a) Bệnh nhân có các chấm cà phê - sữa trên bụng và các u xơ thần kinh bì. (b) Bệnh nhân có một u xơ thần kinh lớn phía sau lưng 4. Tính thấm giảm (reduced penetrance) Một đặc điểm quan trọng của nhiều bệnh di truyền là tính thấm giảm. Tính thấm giảm là hiện tượng người mang kiểu gene của bệnh 7
  50. nhưng hoàn toàn không có biểu hiện trên kiểu hình, mặc dù vậy họ vẫn truyền gene bệnh cho thế hệ sau. 5. Biểu hiện đa dạng (variable expression) Một tình trạng phức tạp khác là sự biểu hiện đa dạng của bệnh. Bệnh có thể có tính thấm hoàn toàn nhưng mức độ nghiêm trọng của bệnh có sự thay đổi rất lớn. Ví dụ trong bệnh u xơ thần kinh (neurofibromatosis) type I (còn được gọi là bệnh Von Recklinghausen). Bố hoặc mẹ có thể có bệnh rất nhẹ, nhẹ đến nỗi họ không nghĩ là mình mắc bệnh, nhưng họ có thể truyền gene bệnh cho con và đôi khi chúng có biểu hiện bệnh rất nặng (hình 7) Giống như tình trạng khởi bệnh muộn và tính thấm giảm, biểu hiện đa dạng của bệnh cũng là một cơ chế tạo điều kiện cho gene bệnh không bị đào thải và có mặt với tần số cao trong quần thể. 6. Tính đa hìệu (pleiotropy) Một gene có thể gây ra các hiệu quả khác nhau trên cơ thể được gọi là gene đa hiệu (pleiotropy). Ví dụ trong hội chứng Marfan. Đây là một bệnh di truyền gene trội trên NST thường với các biểu hiện ở mắt, xương, và hệ tim mạch. Tất cả những biểu hiện này đều xuất phát từ tình trạng tổ chức liên kết bị kéo dãn không bình thường. Gene gây ra hội chứng Marfan được định vị trên nhánh dài của NST 15 mã hóa cho fibrilin, một thành phần của mô liên kết. Đột biến gene này dẫn đến nhiều hậu quả khác nhau trên cơ thể. (hình 8) 7. Tính dị nguyên (heterogeneity) Khi một bệnh nhưng có thể gây Hình 8: Một thiếu niên mắc hội ra bởi các đột biến trên các locus chứng Marfan với tay chân dài, khác nhau ở các gia đình khác nhau, khuôn mắt hẹp. Hình ảnh bàn tay tình trạng này được gọi là tính dị vượn (arachrinodac-tyly) ở một trẻ nguyên của locus (locus hetero- nữ 8 tuổi mắc hội chứng Marfan. geneity). Tình trạng bệnh gây ra bởi đột biến ở các gene khác nhau có thể 8
  51. không phân biệt được trên lâm sàng. 8. Sự khởi bệnh sớm và sự gia tăng mức biểu hiện ở thế hệ sau Từ trong giai đoạn đầu của thế kỷ XX người ta đã quan sát thấy một vài bệnh di truyền dường như cho thấy có tuổi khởi bệnh sớm hơn hoặc có mức độ biểu hiện bệnh nặng hơn hoặc có thể thể hiện cả hai hiện tượng này trong các thế hệ sau của mỗi gia tộc. Kiểu biểu hiện này gọi là hiện tượng khởi bệnh sớm (anticipation). 9
  52. Chương 6 Đột biến đơn gene di truyền liên kết với giới tính & di truyền ty thể Nhiễm sắc thể (NST) giới tính X của người là một NST lớn chứa khoảng 5% DNA của genome (khoảng 160 triệu bp). Có trên 700 gene đã được định vị trên NST giới tính X. Trái với NST X, NST Y rất nhỏ (khoảng 70 triệu bp) và chỉ chứa rất ít gene. I. Hiện tượng bất hoạt NST X ( X inactivity) Trong những năm đầu của thập niên 60, Lyon đã đưa ra giả thuyết 1 trong 2 NST X trong các tế bào sinh dưỡng ở người nữ đã bị bất hoạt. Sự bất hoạt 1 trong 2 NST X đã xảy ra rất sớm trong thời kỳ phát triển phôi của người nữ và NST X bị bất hoạt mang tính chất ngẫu nhiên, ở một số tế bào thì NST X bị bất hoạt có Hình 1: Giả thuyết Lyon về sự bất hoạt nguồn gốc từ bố và ở các tế bào khác thì của NST X NST X có nguồn gốc từ mẹ bị bất hoạt. Khi hiện tượng này xảy ra thì NST có nguồn gốc từ bố (hoặc mẹ) đó sẽ bị bất hoạt trong tất cả các thế hệ tế bào sau. Như vậy hiện tượng này vừa có tính ngẫu nhiên vừa có tính cố định (hình 1). Giả thuyết Lyon được cũng cố bằng các bằng chứng tế bào học qua hình ảnh của vật thể Barr (Bar body) trong nhân tế bào ở gian kỳ (hình 2). Vật thể này là một NST X bị bất hoạt và chỉ được thấy ở các tế bào có từ 2 NST X trở lên. Số lượng vật thể Barr trong nhân tế bào luôn luôn 1
  53. bằng số lượng NST giới tính X trừ đi 1. Các nghiên cứu cho thấy quá trình bất hoạt xảy ra khoảng 2 tuần sau khi thụ tinh, khi phôi có khoảng vài trăm tế bào. Tuy nhiên hiện tượng bất hoạt xảy ra trên NST X là không hoàn toàn, một số vùng NST X vẫn duy trì trạng thái hoạt động trên tất cả các bản sao của nó, đặc biệt là những vùng đầu tận cùng của các nhánh dài và nhánh ngắn của NST. Vùng tận cùng của nhánh ngắn trên NST X có độ tương đồng rất cao đối với phần xa trên nhánh ngắn của Hình 2: Vật thể Barr NST Y. Một số vùng khác trên NST X cũng không bị bất hoạt. Những nghiên cứu gần đây cho thấy gần 20% số gene trên NST X bất hoạt có thể vẫn hoạt động. Rất nhiều gene trên NST X thoát khỏi sự bất hoạt có allele tương đồng trên NST Y dẫn đến hiện tượng là tạo ra kiểu gene tương tự ở người nam và người nữ. II. Di truyền gene lặn liên kết NST X Nhiều bệnh đã được biết rõ di truyền theo kiểu gene lặn liên kết với NST giới tính X. Những bệnh phổ biến gồm bệnh ưa chảy máu A (hemophilia A), bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne (Duchenne muscular dystrophy), bệnh mù màu lục - đỏ (red - green color blindness). Hình 3: Phả hệ cho thấy sự di truyền của một bệnh di truyền lặn liên kết NST giới tính X, các ký hiệu được tô đậm minh họa những người mắc bệnh, các ký hiệu có dấu chấm minh họa những người bình thường mang gene bệnh. 2
  54. Đặc điểm - Biểu hiện của bệnh được thấy phổ biến ở người nam hơn người nữ (hình 3) - Gene bệnh được truyền dưới dạng dị hợp tử qua một loạt các người nữ dẫn đến sự ngắt quãng trong biểu hiện qua một số thế hệ. - Bố mắc bệnh sẽ truyền gene cho 100% con gái của ông ta và những người con gái này sẽ truyền gene bệnh cho 50% số con trai của họ và làm biểu hiện bệnh. - Kiểu hôn nhân phổ biến là hôn nhân giữa một người nữ mang gene bệnh (carrier) và môt người nam bình thường. (hình 4a). - Một kiểu hôn nhân phổ biến khác là bố mắc bệnh và mẹ bình thường, trong trường hợp này toàn bộ con trai của họ hoàn toàn bình thường và toàn bộ con gái của họ đều là carrier với kiểu gene dị hợp tử do nhận gene bệnh từ bố (hình 4b). - Kiểu hôn nhân giữa môt người nam mắc bệnh và một người nữ mang gene bệnh rất ít gặp. Con gái của họ sẽ có một nửa mang gene bệnh ở trạng thái dị hợp tử (carrier) và nửa kia mang gene bệnh ở trạng thái đồng hợp và có biểu hiện bệnh. Ở con trai cũng có một nửa hoàn toàn bình thường và một nửa mắc bệnh. (a) (b) Hình 4: (a) Hôn nhân giữa một người nam bình thường và một người nữ mang gene bệnh; (b) Hôn nhân giữa một người nữ bình thường và một người nam mắc bệnh. Đôi khi cũng có thể gặp người nữ chỉ mang một gene lặn đột biến trên NST X nhưng vẫn có biểu hiện bệnh do hiện tượng bất hoạt của NST X như trong bệnh hemophilia A có khoảng độ 5% người nữ dị hợp tử 3
  55. có nồng độ yếu tố VIII thấp đủ để được coi như là mắc bệnh hemophilia thể nhẹ. III. Di truyền gene trội liên kết NST X Ngoại trừ trường hợp hội chứng NST X dễ gãy (fragile X syndrome), các bệnh di truyền gene trội liên kết NST X có số lượng ít hơn và có ý nghĩa về mặt lâm sàng không bằng trường hợp di truyền gene lặn liên kết NST X. Ví dụ trong bệnh còi xương do giảm phosphate máu (hypo- phosphatemia ricket), đây là một bệnh mà thận bị suy giảm khả năng trong việc tái hấp thu phosphate dẫn đến việc cốt hóa bất thường làm xương bị cong và biến dạng. Hình 5: Phả hệ minh họa sự di truyền của một gene trội liên kết NST X, X1 là allele bình thường; X2 là Giống như trường allele bệnh. hợp di truyền gene trội trên NST thường, người nữ dị hợp tử về gene bệnh trên NST X sẽ có biểu hiện nhẹ hơn so với người nữ đồng hợp tử. Đặc điểm Mỗi cá thể chỉ cần nhận một gene bệnh liên kết NST X là đủ để mắc bệnh. Vì người nữ có 2 NST X, một trong 2 NST này đều có khả năng mang gene bệnh nên người nữ có khả năng mắc bệnh cao gấp đôi người nam (trừ khi gene bệnh đó gây chết ở người nam) (hình 5). Người bố mắc bệnh không thể truyền bệnh cho con trai nhưng con gái của họ đều mắc bệnh do nhận gene này. Người mẹ mắc bệnh thường ở trạng thái dị hợp. Những người này thường truyền bệnh cho con gái hoặc con trai với xác suất khoảng 50% như nhau ở cả 2 giới. 4
  56. IV. Di truyền liên kết với NST Y Hình 6: Phả hệ minh họa sự di truyền của bệnh liên kết NST Y Hiện nay đã có khoảng 24 gene liên kết với NST Y đã được xác định. Những gene này gồm có gene bắt đầu cho sự biệt hóa của phôi thành người nam, nhiều gene mã hóa cho các yếu tố sinh tinh đặc hiệu của tinh hoàn (testis - specific spermatogenesis factors) và một kháng nguyên tương hợp tổ chức phụ (minor histocompatibility antigen) được gọi là HY. Rất nhiều gene quản gia (housekeeping gene) định vị trên NST Y và tất cả những gene này đều có allele tương đồng không bị bất hoạt trên NST X. Các tính trạng liên kết với NST Y luôn luôn có kiểu di truyền bố - con trai (hình 6). V. Các tính trạng có sự biểu hiện giới hạn bởi giới tính (sex limited trait) hoặc chịu ảnh hưởng của giới tính (sex influenced trait) Đôi khi có sự nhầm lẫn giữa sự biểu hiện của tính trạng di truyền liên kết với giới tính với sự biểu hiện của tính trạng giới hạn bởi giới tính hoặc chịu ảnh hưởng của giới tính. Một tính trạng có biểu hiện giới hạn bởi giới tính là tính trạng xảy ra ở chỉ một trong hai giới dẫn đến sự khác biệt về mặt giải phẫu giữa hai giới. Các khuyết tật của tử cung và tinh hoàn cũng là một ví dụ cho hiện tượng này. Một ví dụ rất hay cho trường hợp tính trạng có sự biểu hiện chịu ảnh hưởng của giới tính là tính trạng sói đầu (baldness). Tính trạng này biểu hiện ở cả nam và nữ nhưng xảy ra ở nam phổ biến hơn. Tính trạng này không di truyền liên kết với giới tính mà di truyền theo kiểu gene trội trên NST thường ở người nam nhưng lại di truyền theo kiểu gene lặn trên NST thường ở người nữ. Người nữ dị hợp tử có thể truyền gene này cho con cháu của họ nhưng không biểu hiện, người nữ chỉ bị sói đầu khi mang 5
  57. gene ở trạng thái đồng hợp, tuy nhiên ngay với kiểu gene này người nữ cũng chỉ có biểu hiện tóc bị thưa một cách đáng kể hơn là sói hoàn toàn. VI. Di truyền ty thể Đa số các bệnh di truyền gây ra do các khuyết tật xảy ra trên genome trong nhân tế bào, tuy nhiên cũng có một số bệnh di truyền chiếm tỷ lệ không lớn gây ra do các đột biến của DNA ty thể (mtDNA, mt: mitochondria). Mỗi tế bào người chứa hàng trăm ty thể trong bào tương. Quá trình sao mã của mtDNA xảy ra ở trong ty thể và độc lập với nhân. Khác với DNA của nhân, mtDNA không có các đoạn intron. Tỷ lệ đột biến ở DNA trong ty thể cao hơn khoảng 10 lần so với DNA trong nhân, tình trạng này xảy ra do ty thể thiếu hệ thống enzyme sửa chữa DNA và cũng có lẽ do bởi các các gốc oxy tự do (free oxygen radical) được giải phóng trong quá trình oxy phosphoryl hóa. Đặc điểm Do ở trong bào tương nên mtDNA được truyền theo dòng mẹ. Người nam nhận mtDNA từ mẹ và không truyền cho con (hình 7) vì tinh trùng chỉ chứa một lượng mtDNA rất ít và mtDNA không đi vào trứng qua quá trình thụ tinh để tham gia vào quá trình phát triển phôi Hình 7: Phả hệ minh họa sự di truyền của bệnh di truyền ty thể Vì mỗi tế bào chứa một quần thể phân tử DNA ty thể, nên mỗi tế bào có thể mang một vài phân tử có đột biến của DNA ty thể và một số phân tử khác thì không. Hiện tượng này của DNA được gọi là hiện tượng heteroplasmy, đây là nguyên nhân quan trọng giải thích tính đa dạng trong biểu hiện của các bệnh lý di truyền ty thể. Tỷ lệ phân tử DNA ty thể đột biến càng lớn thì mức độ nặng nề trong biểu hiện càng cao. Cho tới nay đã xác định được trên 50 đột biến điểm và trên 100 đột biến mất đoạn hoặc nhân đoạn trên DNA của ty thể gây ra những hậu quả bệnh lý. 6
  58. Chương 7 Di truyền học hóa sinh: Các rối loạn chuyển hóa Mỗi quá trình chuyển hóa trong tế bào bao gồm một chuỗi các phản ứng nối tiếp nhau mà các bước trong chuỗi phản ứng đó được xúc tác bởi các enzyme do gene mã hóa. Bình thường các gene này được tái sinh với độ chính xác rất cao và các hệ thống ezyme do các gene này mã hóa sẽ luôn luôn hoạt động một cách hiệu quả từ thế hệ này sang thế hệ khác. Các biến dị xảy ra khá phổ biến trên các gene mã hóa cho các enzyme tuy nhiên một số ít biến dị có thể làm cho enzyme không thể thực hiện được chức năng bình thường dẫn đến các hậu quả bệnh lí. Hiện nay đã có trên 350 loại bệnh chuyển hóa khác nhau và hầu hết đều hiếm gặp. Tuy nhiên các bất thường chuyển hóa giải thích cho một tỷ lệ đáng kể trong các bệnh di truyền gây bệnh hoặc gây tử vong. Một nghiên cứu gần đây cho thấy rằng tỷ lệ mắc các rối loạn chuyển hóa chiếm khoảng chừng 1/2.500 lần sinh hoặc 10% trường hợp bệnh lí đơn gene ở trẻ em. Việc chẩn đoán các bệnh chuyển hóa cũng rất khó khăn do đó tỷ lệ thật sự của các bệnh lí di truyền do bất thường chuyển hóa có lẽ cao hơn nhiều so với thực tế. Hầu hết các rối loạn chuyển hóa đều được di truyền theo kiểu gene lặn NST thường, nên chỉ những người mang hai allele đột biến mới biểu hiện bệnh. Mặc dù một allele đột biến sẽ làm giảm hoặc mất hoạt tính của enzyme nhưng người mang gene đột biến ở trạng thái dị hợp thường không bị ảnh hưởng đến sức khoẻ. I. Các khuyết tật của các quá trình chuyển hóa Các phân tử sinh học được phân thành 4 nhóm chính: các nucleic acid, các protein, các carbohydrat và các lipid. Các con đường chuyển hóa chính để chuyển hóa các phân tử này gồm có: quá trình glycolysis (chuyển đường D-glucose thành lactic acid), chu trình citric acid, chu trình pentose phosphate, quá trình gluconeogenesis (tạo glycogen từ các phân tử không phải carbonhydrate như protein, chất béo), tổng hợp và dự trữ glycogen và acid béo, các quá trình giáng hóa, tạo năng lượng và các hệ thống vận chuyển. Chúng ta sẽ xét xem bằng cách nào mà các khuyết tật trong mỗi quá trình chuyển hóa lại có thể gây bệnh cho con người. 1
  59. 1. Chuyển hóa carbohydrate Do đảm nhiệm nhiều chức nhiệm vụ khác nhau trong tất cả mọi loại sinh vật nên cacbohydrate là loại chất hữu cơ nỗi trội nhất trên Trái Đất. Các carbohydrate đóng vai trò cơ chất cho việc sản xuất và dự trữ năng lượng, can thiệp vào các quá trình chuyển hóa và tham gia vào cấu trúc của DNA và RNA. Do đó các carbonhydrate chiếm một tỷ lệ lớn trong khẩu phần ăn của con người và được chuyển hóa thành ba loại monosaccharide chính là glucose, galactose và fructose. Galactose và fructose được chuyển thành glucose trước khi đi vào quá trình glycolysis. Sự thất bại trong việc sử dụng các loại đường này một cách hiệu quả giải thích cho đại đa số các các khuyết tật chuyển hóa carbohydrate bẩm sinh ở người. Tăng galactose máu (galactosemia) Hình 1: Vai trò của enzyme galactose 1 - phosphate uridyl transferase (GAL-1-P uridyl transferase) Đây là rối loạn đơn gene phổ biến nhất của quá trình chuyển hóa carbohydrate. Bệnh tăng glactose máu do thiếu enzyme transferase (tăng galactose máu loại cổ điển) chiếm tỷ lệ 1/55.000 trẻ sơ sinh. Bệnh này xảy ra do các đột biến trên gene mã hóa cho enzyme galactose 1 - phosphate uridyl transferase (GAL-1-P uridyl transferase) (hình 1). Do thiếu hoạt tính của enzyme này nên những người mắc bệnh không thể chuyển thành công galactose thành glucose, hậu quả là galactose sẽ được chuyển hóa theo một con đường khác để thành galactitol và galactonate. Các dấu hiệu lâm sàng phổ biến của bệnh này gồm có suy gan, đục thủy tinh thể và 2
  60. chậm phát triển. Về lâu dài, khuyết tật này sẽ dẫn đến chậm phát triển trí tuệ, phát triển kém và suy giảm buồng trứng ở người nữ. Chương trình sàng lọc sơ sinh của bệnh này được thực hiện phổ biến và rộng rãi thông qua việc đo hoạt tính của enzyme GAL-1-P uridyl transferase huyết tương trên giọt máu khô. Việc xác định sớm giúp cho việc điều trị được thực hiện sớm, chủ yếu là loại galactose ra khỏi khẩu phần ăn và do đó giảm được nguy cơ bệnh lí xảy ra do bất thường trong quá trình chuyển hóa galactose. 2. Chuyển hóa amino acid Các protein đóng những vai trò hết sức khác nhau trong cơ thể. Đơn vị cấu trúc cơ bản của protein là các amino acid. Một số amino acid có thể được cơ thể tổng hợp, đây là những amino acid không thiết yếu và một số amino acid cơ thể không tổng hợp được mà phải do môi trường cung cấp, đây là những amino acid thiết yếu. Rất nhiều khuyết tật của quá trình chuyển hóa amino acid đã được phát hiện. Tăng phenylalanine máu Hình 2: Vai trò của enzyme phenylalanine hydroxylase (PAH) Khuyết tật trong chuyển hóa phenylalanine (một amino acid thiết yếu) gây ra chứng tăng phenylalanine máu (hyperphenylalaninemias). Khuyết tật này gây ra bởi các đột biến trên các gene mã cho các thành 3
  61. phần tham gia vào con đường hydroxy hóa phenylalanine. Sự gia tăng nồng độ của phenylalanine trong huyết tương sẽ làm tổn hại đến các quá trình hoạt động bình thường của tế bào trong não như myelin hóa (myelinaton), tổng hợp protein, gây ra tình trạng chậm trí nặng. Hầu hết các trường hợp tăng phenylalalanine máu gây ra bởi các đột biến của enzyme phenylalanine hydroxylase (PAH) (hình 2) và gây ra bệnh phenylketonuria cổ điển (classical phenylketonuria, PKU). Đã có trên 400 đột biến đã được xác định trên gene PAH gồm các dạng thay thế, mất và thêm nucleotide. Tỷ lệ mắc bệnh tăng phenylalanine máu thay đổi khá lớn giữa các nhóm chủng tộc, với tỷ lệ bệnh PKU thay đổi từ 1/10.000 ở người da trắng đến 1/90.000 ở người Châu Phi. Việc điều trị tất cả các trường hợp tăng phenylalanine máu đều nhằm tới mục đích là duy trì nồng độ phenylalanine bình thường thông qua việc hạn chế ăn các thức ăn có chứa phenylalanine. Tuy nhiên do amino acid này là một amino acid thiết yếu và việc cung cấp đầy đủ amino acid này là hết sức cần thiết cho sự phát triển của cơ thể. Thiếu phenylalanine hoàn toàn sẽ gây chết do đó vần phải duy trì một cách hiệu quả ở mức cân bằng giữa việc cung cấp protein và phenylalanine cho sự phát triển và việc ngăn ngừa sự gia tăng quá cao phenylalanine máu. Hầu hết các trẻ mắc PKU đều phải theo một chế độ ăn hạn chế phenylalanine cho đến khi chúng bước vào tuổi thanh thiếu niên (khoảng từ 13 - 19 tuổi), tuy nhiên một số nghiên cứu cho thấy việc điều trị suốt cả cuộc đời đem lại nhiều lợi ích hơn cho các bệnh nhân PKU. 3. Chuyển hóa lipid Lipid là một nhóm phân tử sinh học phân tử phức tạp không tan trong nước và tan dễ dàng trong các dung môi hữu cơ (như chloroform). Chúng là thành phần cấu trúc cơ bản của các phân tử phospholipid và sphingolipid có trong cấu trúc của các màng sinh học. Lipid cũng tạo nên các hormone, đóng vai trò như các thông tin nội bào và cũng là nguồn cung cấp năng lượng. Sự gia tăng nồng độ lipid trong huyết tương (hyperlipidemia) khá phổ biến, tình trạng này xảy ra do các khiếm khuyết trong các cơ chế vận chuyển lipid. Các sai sót trong chuyển hóa acid béo (các chuỗi hydro- carbon với một nhóm tận cùng carboxylate) thường ít gặp hơn. Tuy nhiên các sai sót điển hình của quá trình chuyển hóa acid béo giúp hiểu biết một cách hiệu quả hơn cơ sở sinh hóa của quá trình dị hóa (catabolism) lipid. 4
  62. Khiếm khuyết MCAD Khuyết tật bẩm sinh phổ biến nhất của quá trình chuyển hóa acid béo là trường hợp thiếu enzyme acyl CoA dehydrogenase chuỗi trung bình (medium chain acyl CoA dehydrogenase: MCAD) (hình 3). Khiếm khuyết enzyme MCAD được đặc trưng bởi các cơn giảm glucose máu, tình trạng này dễ xảy ra hơn khi ăn kiêng. Thông thường, trẻ mắc khiếm khuyết enzyme MCAD có biểu hiện nôn mữa và hôn mê sau một thời gian ăn uống kém do mắc một bệnh thông thường nào đó như viêm đường hô hấp trên, viêm dạ dày ruột. Hình 3: Vai trò của enzyme acyl CoA dehydrogenase chuỗi trung bình (medium- chain acyl CoA dehydrogenase: MCAD) (bước 4) Nhịn ăn sẽ dẫn đến tình trạng tích lũy các chất trung gian của acid béo, không sản xuất đủ các keton cho nhu cầu của tổ chức và thiếu hụt nguồn cung cấp glucose. Phù não (cerebral edema) và bệnh não (encephalopathy) do các hậu quả trực tiếp hoặc gián tiếp của các chất trung gian của các acid béo trên hệ thần kinh trung ương. Tử vong thường xảy ra trừ khi có một nguồn năng lượng khác như glucose được bổ sung kịp thời. Giữa các cơn cấp tính, các trẻ mắc khiếm khuyết của MCAD 5
  63. thường có các kết quả xét nghiệm bình thường. Việc điều trị bao gồm việc chăm sóc y tế trong các cơn cấp, cung cấp đầy đủ năng lượng và tránh ăn kiêng. Hiện nay hầu hết các bệnh nhân mắc MCAD đã được báo cáo đều có nguồn gốc Tây Bắc Châu Âu và 90% số này có các allele mang một đột biến sai nghĩa do thay nucleotide A bằng G dẫn đến việc thay thế glutamate bằng lysine. Các dạng đột biến dạng thay cặp khác, mất cặp hoặc thêm cặp nucleotide đã được xác định nhưng không phổ biến. Tính đặc hiệu trong cấu trúc phân tử của MCAD giúp chẩn đoán dễ dàng bằng test DNA trực tiếp. Phương pháp này được sử dụng làm công cụ chẩn đoán cũng như sàng lọc (screening) đáng tin cậy và rẻ tiền. II. Bất thường của các con đường giáng hóa (degradative pathway) Hầu hết các phân tử sinh học đều liên tục được hoàn hồi trong quá trình chuyển hóa bình thường của một tế bào. Các phân tử bị giáng hóa để tạo ra các cơ chất dùng cho việc kiến tạo nên các phân tử mới. Hơn nữa các phó phẩm (by-product) của các quá trình sản sinh năng lượng, chuyển đổi của các cơ chất và đồng hóa cần phải được xử lí và loại thải. Những sai sót trong các con đường giáng hóa này có thể dẫn đến tích lũy các chất chuyển hóa mà lẽ ra đã được loại thải hoặc hoàn hồi và gây ra các hậu quả bệnh lý. Rối loạn tồn trữ ở lysosome Các rối loạn tồn trữ ở lysosome là những khuyết tật chuyển hóa bẩm sinh điển hình. Bệnh xảy ra do kết quả của sự tích lũy các cơ chất. Các enzyme trong các lysosome xúc tác cho quá trình giáng hoá bậc thang của các sphingolipid, glycosaminoglycan (mucopolysaccharide), glycoprotein và glycolipid. Sự tích lũy các phân tử không bị giáng hóa sẽ làm rối loạn chức năng của tế bào, mô và cơ quan. Hầu hết các rối loạn của lysosome gây ra do khiếm khuyết của các enzyme. Mặc dù một số trường hợp xảy ra do sự bất hoạt khả năng hoạt hóa một enzyme hoặc vận chuyển một enzyme tới một cấu phần ở dưới mức tế bào (sub-cellular compartment) mà ở đó nó có thể thực hiện chức năng một cách chính xác. Các rối loạn chuyển hóa mucopolysaccharidose (muco-polysaccha- ridoses : MPS disorders) là một nhóm các rối loạn gây ra do giảm khả năng giáng hóa của một hoặc vài glycosaminoglycan (như dermatan sulfate, heparan sulfate, keratan sulfate and chondroitin sulfate). Các glycosaminoglycan này là các sản phẩm thoái hoá của các proteoglycan được thấy trong dịch ngoại bào. Tất cả các rối loạn MPS được đặc trưng 6
  64. bởi sự hư hỏng tiến triển và mãn tính của nhiều hệ thống gây ra những rối loạn chức năng nghe, nhìn, khớp, và hệ tim mạch. III. Bất thường trong các quá trình sản xuất năng lượng Năng lượng cần cho hoạt động sống của tế bào được sản xuất từ nhiều cơ chất khác nhau như glucose, các ketone, các amino acid và các acid béo. Quá trình chuyển hóa các cơ chất này đòi hỏi cắt dần chúng thành những phân tử nhỏ hơn (qua các quá trình như chu trình citric acid hay beta oxy hóa) cùng với việc chuyển các ion hydrogen qua hệ thống phosphoryl oxy hóa (oxidative phosphorilation: OXPHOS). Một vài cơ chất được chuyển hóa theo con đường kỵ khí. Trên 20 loại rối loạn khác nhau liên quan tới các khuyết tật của hệ thống OXPHOS gây ra do các đột biến thay, thêm hoặc mất nucleotide trong genome của ty thể và được di truyển theo dòng mẹ (maternal inheritance). Tuy nhiên các gene trong nhân có thể gây mất đoạn mtDNA đã được phân lập và chúng được di truyền theo kiểu gene lặn trên NST thường. Đột biến của các gene ảnh hưởng đến hệ OXPHOS gây ra những biểu hiện kiểu hình phức tạp như là kết quả của sự khác biệt trong như cầu chuyển hóa ở các tổ chức khác nhau và các hệ thống khác nhau ở các giai đoạn phát triển khác nhau. IV. Bất thường của của các hệ thống vận chuyển Sự vận chuyển hiệu quả của các phân tử giữa các bào quan trong tế bào và giữa tế bào với môi trường chung quanh thông qua các màng ngăn thường đòi hỏi sự có mặt của các đại phân tử đóng vai trò nối kết giữa các thành phần liên quan lại với nhau và đóng vai trò trung gian trong việc vận chuyển qua các màng đó. Những bất thường trong các hệ thống vận chuyển này sẽ gây ra vô số hậu quả khác nhau, tùy thuộc vào việc chúng đã làm các màng ngăn này đã bị thay đổi như thế nào hoặc sự tích lũy của các cơ chất đã ảnh hưởng như thế nào đến các hoạt động sinh lý bình thường của màng. Sự vận chuyển bất thường của cystine: bệnh cystine niệu (cystinuria) Cystine là một dẫn suất disulfide của amino acid cysteine. Sự vận chuyển bất thường của cysteine có thể gây ra hai bệnh cystinuria (cystine niệu) và bệnh cystinosis (nhiễm cystine), cả hai loại bệnh này đều di truyền theo kiểu gen lặn NST thường. Sự vận chuyển bất thường của cystine giữa tế bào và dịch ngoại bào gậy ra bệnh cystinuria, một trong những bệnh chuyển hóa di truyền phổ biến nhất. Mặc dù đây là một bệnh gây chết nhưng thường không gây chết sớm. Bệnh cystinuria là một bệnh di truyền dị nguyên (heterogeneous) 7