›
›

Giáo trình Cơ sở di truyền chọn giống động vật (Tiếp theo)

pdf 112 trang phuongnguyen 30
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Giáo trình Cơ sở di truyền chọn giống động vật (Tiếp theo)", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfgiao_trinh_co_so_di_truyen_chon_giong_dong_vat_tiep_theo.pdf

Nội dung text: Giáo trình Cơ sở di truyền chọn giống động vật (Tiếp theo)

  1. Giáo trình cơ sở di truyền chọn giống động vật
  2. Giáo trình cơ sở di truyền chọn giống động vật - Chương 3 DI TRUYỀN PHÂN TỬ VÀ KỸ THUẬT DI TRUYỀN ỨNG DỤNG TRONG NHÂN GIỐNG ĐỘNG VẬT Đến những năm 1940, di truyền học cổ điển được gọi là “di truyền học hình thức” vì chỉ căn cứ vào kết quả lai hay quan sát tế bào học mà suy đoán về gen. Gen có bản chất như thế nào? Nó thực hiện chức năng sinh hóa ra sao? Đó là những vấn đề con bỏ ngõ. Năm 1941, G. Beadle và E. Tatum nghiên cứu các đột biến sinh hóa ở nấm mốc Neurospora crassa và nêu lên giả thuyết 1 gen - 1 men - tính trạng, cho thấy, gen xác định tính trạng thông qua việc điều khiển tổng hợp các enzym, chất xúc tác các phản ứng sinh hóa. Tiếp theo, các đối tượng vi sinh vật bắt đầu được sử dụng rộng rãi đã tạo một buớc phát triển mới trong nghiên cứu di truyền Vào những năm 40, J. Lederberg, với các công trình của mình dã góp phần đưa một vi khuẩn trở thành đối tượng được sử dụng nhiều nhất trong sinh học phân tử, đó là vi khuẩn E. coli. Nhiều nhà vật lý, hóa học chuyển sang nghiên cứu di truyền học đã ứng dụng các
  3. phương pháp mới trong nghiên cứu sinh học. Việc xác định DNA chính là vật chất di truyền đã mở màn cho các nghiên cứu phân tử về cấu tạo và chức năng của gen. Năm 1944, Oswald Avery, Colin Mc Leod và Maclyn McCarty nghiên cứu Streptococcus pneumonie, một vi khuẩn gây viêm phổi, dựa vào các quan sát trước của Fred Griffiths đã phát hiện ra hiện tượng biến nạp và đã chứng minh DNA là nhân tố gây biến nạp, làm thay đổi kiểu di truyền ở phế cầu khuẩn D. pneumonie. Alfred Hershey và Martha Chase (1952) củng cố thêm kết luận trên bằng các thực nghiệm trên thực khuẩn thể (bacteriophage), đó là các virus có khả năng xâm nhiễm vi khuẩn E. coli. Sự phát hiện cấu trúc chuỗi xoắn kép DNA của James D. Watson và Francis H.C. Crick (1953) chính thức khởi đầu cho thời kỳ nghiên cứu di truyền phân tử. Cấu trúc đơn giản và trình tự bổ sung của phân tử DNA 82 là cơ sở cho cơ chế tự sao chép của phân tử DNA ở mỗi thế hệ tế bào cũng như cơ chế tổng hợp RNA từ khuôn DNA. Học thuyết trung tâm của sinh học phân tử ra đời.
  4. DNA mRNA protein Sao chép phiên mã dịch mã. Vào cuối những năm 70, sự xuất hiện một loạt kỹ thuật mới đã tạo ra cuộc cách mạng trong sinh học phân tử. Với các enzym cắt hạn chế, người ta có thể cắt phân tử DNA ở những vị trí xác định thành những đoạn có kích thước mong muốn, gắn chúng vào các vector, rồi chuyển vào tế bào vi khuẩn. Việc nuôi cấy các tế bào vi khuẩn này cho phép thu hồi lại một lượng lớn DNA cần. Đó là phương pháp tạo dòng. Sau đó, người ta đã hoàn thiện các phương pháp xác định nhanh trình tự DNA. Như vậy các nhà sinh học bây giờ không chỉ ngồi đếm nhiễm sắc thể hay thiết lập bản đồ gen dựa vào đột biến và lai, họ nắm đến từng nucleotit của đoạn DNA. Hơn thế nữa, họ còn có thể tùy ý tạo các đột biến trên đoạn DNA rồi chuyển chúng trở vào tế bào để nghiên cứu chức năng của một gen trên một loại tế bào xác định, xác định trình tự toàn bộ gen người, giải quyết vấn đề bệnh ung thư, sự phát triển phôi, biệt hóa mô 1. DNA và vai trò của nó trong di truyền. Vào năm 1868, Miescher, nhà sinh hóa học người Thụy Điển, phát hiện trong nhân tế bào bạch cấu một chất không phải protein và ông gọi là nuclein (chất nhân). Về sau thấy chất này có tính axit nên gọi là nucleic
  5. axit. Có hai loại là desoxyribonucleic axit (viết tắt là DNA) và ribonucleic axit (viết tắt là RNA). Chất mà Miesher tìm ra là DNA. Năm 1914, nhà bác học Đức R. Fulgen đã tìm ra phương pháp nhuộm màu DNA. Năm 1944, vai trò mang thông tin di truyền của DNA mới được chứng minh và đến năm 1952 mới được công nhận. 1.1. Chứng minh gián tiếp. Nhiều số liệu cho thấy có sự liên quan chặt chẽ giữa DNA và vật chất di truyền. Thứ nhất, DNA có trong tế bào của tất cả các sinh vật, chỉ giới hạn trong nhân và là thành phần chủ yếu của nhiễm sắc thể (một cấu trúc của tế bào, có chứa nhiều gen). 83 Thứ hai, Tất cả các tế bào sinh dưỡng của bất kỳ một loại sinh vật nào đều chứa một lượng DNA rất ổn định, không phụ thuộc vào sự phân hóa chức năng hay trạng thái trao đổi chất. Thứ ba, số lượng DNA tăng theo bội số nhiễm sắc thể trong tế bào. Ở tế bào sinh dục, đơn bội (n) có số lượng DNA là 1 thì ở tế bào sinh dưỡng, lưỡng bội (2n) có số lượng DNA tăng lên gấp đôi. Thứ tư, tia tử ngoại (uv) có hiệu quả gây đột biến cao nhất ở bước sóng 260 nm, đây
  6. chính là bước sóng mà DNA hấp thụ tia tử ngoại nhiều nhất. 1.2 Bằng chứng trực tiếp chứng minh axit nucleic là vật liệu di truyền. 1.2.1 Hiện tượng biến nạp. Thí nghiệm của Griffiths, 1928 trên phế cầu khuẩn Diplococcus pneumonie gây bệnh viêm phổi cho động vật có vú. Hình 36. Thí nghiệm biến nạp ở chuột a/ Tiêm vi khuẩn S sống gây bệnh cho chuột chuột chết b/ Tiêm vi khuẩn R sống không gây bệnh chuột sống c/ Tiêm vi khuẩn S đã nung nóng cho chuột chuột sống d/ Hỗn hợp vi khuẩn S bị đun chết trộn với vi khuẩn R sống đem tiêm cho chuột chuột chết. Trong xác chuột có vi khuẩn S và R. D. pneumonie có 2 nòi: nòi S có vỏ bọc và 1 phân tử DNA, khi nuôi cấy cho khuẩn lạc trơn, bóng, có khả năng gây bệnh. 84 Nòi R: không có vỏ bọc, có 1 phân tử DNA, khi nuôi cấy cho khuẩn lạc không trơn, bóng, không có khả năng gây bệnh. Tiêm nòi S cho chuột, chuột sẽ chết. Tiêm nòi R cho
  7. chuột, chuột vẫn sống. Nung nóng nòi S và tiêm cho chuột, chuột vẫn sống. Trộn lẫn nòi S đã nung nóng với nòi R, tiêm cho chuột, chuột chết. Ở đây đã có yếu tố nào đó từ nòi S đã bị giết chết chuyển sang nòi R (không gây bệnh) làm thay đổi đặc điểm của nòi R. Khi chuyển sang nòi R, làm cho nòi R từ chổ không gây bệnh trở nên gây bệnh. Năm 1944, T. Avery, Mc Leod và McCarty đã tách chiết DNA của nòi S đem cho vào các tế bào nuôi cấy chủng R. Kết quả là một số khuẩn lạc biến thành dạng trơn, bóng: chúng đã được biến nạp. Đặc biệt khi phân hủy DNA bằng DNAse thì hiện tượng biến nạp không xẩy ra. Các tác giả đã chứng minh được rằng DNA chính là nhân tố biến nạp làm thay đổi các kiểu di truyền ở phế cầu khuẩn. Ngày nay có thể thực hiện được biến nạp ở sinh vật Eucaryotae như nấm men, tế bào thực vật, tế bào chuột và cả ở tế bào người, thậm chí có thể thực hiện biến nạp ở các loài khác nhau. Do đó, biến nạp có thể được coi là phương tiện chung để chuyển gen giữa các sinh vật. 1.2.2 Sự xâm nhập của DNA virus vào vi khuẩn. Năm 1952, A. Hershey và M. Chase đã tiến hành thí nghiệm với bacteriophage T2 (thực khuẩn thể) cho xâm nhập vi khuẩn Escherichia coli (E.
  8. coli). Phage T2 có cấu tạo đơn giản gồm vỏ protein và phân tử DNA bên trong. Khi cho phage T2 vào vi khuẩn, chúng gắn lên bề mặt bên ngoài, một phần chất nào đó đã xâm nhập vào trong vi khuẩn và sau 20 phút làm tan tế bào vi khuẩn, phong thích nhiều phage mới. Thí nghiệm của A. Hershey và M. Chase nhằm xác định, chất nào của phage đã vào bên trong tế bào vi khuẩn: DNA, protein hay cả hai chất trên. Vì DNA chứa nhiều photpho (P) nhưng không có lưu huỳnh (S) còn protein chứa nhiều lưu huỳnh nhưng không có photpho, nên có thể phân biệt DNA và protein nhờ các đồng vị phóng xạ P và S. Phage được nuôi trên vi khuẩn đã nhiễm đồng vị phóng xạ P32 và S35. Các phage nhiễm trong khoảng thời gian đủ để bám vào vách tế bào và bơm chất nào đó vào trong tế bào. Sau đó đem phân tích nhận thấy, 85 phần ngoài vi khuẩn có chứa nhiều S35, nhưng rất ít P32, chứng tỏ phần lớn protein vỏ phage nằm ngoài tế bào vi khuẩn. Phân tích phần bên trong tế bào vi khuẩn thấy chúng chứa nhiều P32 nhưng rất ít S35. Hình 37. Vật chất di
  9. truyền của phage là DNA Điều này chứng tỏ DNA của phage đã đựơc bơm vào trong tế bào vi khuẩn, ở đó thông tin di truyền chứa trong DNA sẽ được dùng để tổng hợp những virus mới. 2 Thành phần hóa học và cấu trúc phân tử DNA 2.1. Thành phần hóa học. Phân tử DNA là một chất trùng hợp (polymer), polynucleotit. Nó được tạo nên do sự nối liền các đơn phân (monomer). Mỗi monomer gồm 3 thành phần: - Đường pentose (5 carbon) - desoxyribose - Base nitơ gồm 2 nhóm purine: Adenine (A) và Guanine (G) và pyrimidine : Thymine (T) và Cytosine (C). - Nhóm phosphate. 86 Đường pentose gắn với base nitơ ở vị trí C1 sẽ tạo nên nucleoside. Nucleoside được gắn thêm nhóm phosphate vào C5 của đường pentose thành nucleotid. Hình 38. Cấu tạo các base nitơ 2.2. Mô hình xoắn kép DNA của J. Watson và F. Crick. Năm 1953, J. Watson và F. Crick đã đưa ra mô hình cấu trúc phân tử DNA. Theo mô hình này, phân tử DNA là một
  10. chuỗi xoắn kép mà hai mạch gồm khung đường pentose xen kẽ với các nhóm phosphate, được gắn với nhau nhờ các cầu nối hydro (liên kết hydro) theo nguyên tắc bổ 87 sung. Có nghĩa là adenine của mạch này sẽ liên kết với thymine của mạch kia, guanine của mạch này liên kết với cytosine của mạch kia và ngược lại. Giữa adenine với thymine liên kết với nhau bằng 2 cầu nối hydro, còn giữa guanine với cytosine liên kết với nhau bằng 3 cầu nối hydro. Hình 39. Chuỗi xoắn kép DNA của Watson - Crick 88 Hình 40. Sơ đồ cấu trúc 2 mạch của phân tử DNA theo Watson-Crick Điều này đã được các thực nghiệm của Chargaff xác định. Khi thủy phân DNA nhận thấy, tổng số các loại base purine bằng tổng số các loại pyrimidine. Đặc điểm này được gọi là định luật Chargaff. Theo định 89
  11. luật này thì A = T; G = C, tức là , nhưng tỷ số , ở các loài sinh vật khác nhau, tỷ số này đặc trưng cho loài, dựa vào đó có thể phân biệt các loài với nhau. Sinh vật bậc cao, tỷ số , sinh vật bậc thấp, tỷ số . Từ năm 1953 trở lại nay, mô hình phân tử DNA của J. Watson và F. Crick là trung tâm của các nghiên cứu di truyền học và sinh học phân tử, Watson và Crick đã nhận giải thưởng Nobel vào năm 1962. Mỗi vòng xoắn của phân tử DNA gồm có 10 cặp nucleotid, chiều dài là 34 Ao; đường kính của phân tử DNA là 20Ao. Sự sắp xếp của 2 mạch theo kiểu đối song song, đầu 5’P (nhóm P tự do gắn với C5 của đường) đối diện với 3’OH (nhóm OH gắn với C3 của đường) và ngược lại. 1;1CTGACGTA1CGTA1CGTA1CGTA 5’P 3’OH 3’OH 5’P. 3. Sao chép DNA Watson và Crick đã cho rằng, nếu hai mạch của phân tử DNA được tách ra do các liên kết hydro giữa các cặp base bị đứt, mỗi mạch sẽ làm khuôn cho việc tổng hợp mạch mới, tương tự với mạch cặp trước đó. Kết quả một phân tử DNA ban đầu (mẹ) qua quá trình sao chép sẽ cho ra hai phân tử DNA (con) giống hệt nhau. Mỗi
  12. phân tử con đều mang một mạch cũ và một mạch mới. Kiểu sao chép này gọi là sao chép bán bảo tồn. Những nghiên cứu tiếp theo đã tìm ra các cơ chế phân tử của quá trình sao chép DNA. Đó là quá trình rất phức tạp, phải trải qua các cơ chế chung như sau: - Các liên kết hydro gắn hai mạch với nhau phải bị phá vỡ và hai mạch phải tách nhau ra, từ mạch kép trở thành hai mạch đơn. - Phải có đoạn mồi, tức là đoạn DNA hoặc RNA ngắn, bắt cặp bổ sung với 1 đầu của mạch khuôn. 90 - Có đủ 4 loại nucleosid triphosphate (ATP, TTP, GTP, CTP) bắt cặp với mạch đơn khuôn. - Mạch mới tổng hợp theo hướng 5’P - 3’OH, các nucleotid mới được nối lại với nhau bằng liên kết phosphodieste. Mỗi bước được điều khiển bởi enzym đặc hiệu và được thực hiện một cách nhanh chóng, chính xác. 3.1 Các enzym, protein tham gia vào quá trình tái bản DNA - DNA polymerase I là loại enzym được phát hiện đầu tiên, lúc đầu người ta cho rằng đây là loại enzym có vai trò chủ yếu trong tái bản DNA. Về sau người ta còn phát hiện được các enzym DNA
  13. polymerase II và DNA polymerase III. - DNA polymerase II có chức năng xác định sự bắt đầu tổng hợp một phân đoạn mới DNA và kết thúc sự tổng hợp DNA. - DNA polymerase III là enzym tham gia chủ yếu vào tái bản DNA kéo dài dần chuỗi mới tổng hợp. Loại enzym này có khoảng 10 phân tử trong một tế bào, chúng có tốc độ tổng hợp DNA nhanh hơn nhiều lần so với DNA polymerase I và DNA polymerase II. -Trên mỗi phân tử DNA dạng vòng ở vi khuẩn E. coli có khoảng 400.000 vòng xoắn, nên sự tháo xoắn phải xẩy ra theo một cơ chế tối ưu nào đó để khi tháo xoắn không làm rối loạn cấu trúc của nó. Sự tháo xoắn được tạo ra do đứt tại một điểm nhất định trên một mạch đơn trong quá trình tái bản, các chổ đứt này sẽ nhanh chóng được sửa chữa sau khi tháo xoắn. Enzyn tham gia vào sửa chữa này là DNA gyrase (hay topoisomerase). - Ngoài ra còn có các enzym khác như: Enzym “rep” mở xoắn chuỗi xoắn kép, RNA primerase tổng hợp đoạn mồi RNA ngắn để tạo nhóm 3’OH, enzym DNA ligase nối các đoạn DNA ngắn (đoạn Okazaki) thành phân tử DNA dài. Bên cạnh đó, trong quá trình tổng hợp DNA còn thấy có vai trò protein DNA-B nhận ra và đánh dấu điểm khởi đầu tái bản, protein
  14. SSB bám vào hai mạch đơn ổn định để thực hiện quá trình tái bản DNA. 3.2 Các giai đoạn sao chép. 3.2.1 Khởi sự. Ở E. coli, quá trình sao chép bắt đầu khi một protein đặc hiệu (B) nhận biết điểm bắt đầu sao chép và gắn vào trình tự base đó. Tiếp theo 91 enzym gyrase nới lỏng vòng xoắn DNA ở 2 phía của protein B và tách xa vị trí ban đầu tạo ra 2 phểu tái bản, trên mỗi phểu tái bản có 3 chạc, gọi là dạng chữ Y. Hai phân tử enzym “rep” tháo xoắn chuỗi xoắn kép DNA để bẻ gãy dần các liên kết hydro trên mạch kép DNA. Vì vậy hai mạch đơn lần lượt tách nhau ra. Quá trình này cần dùng năng lượng ATP. Các protein làm căng mạch (SSB-Single Strand Binding), gắn với mạch đơn DNA làm chúng tách nhau, ngăn cho hai mạch không chập lại với nhau để tạo thuận lợi cho sao chép. 3.2.2 Nối dài phân tử DNA. Sự khởi đầu tái bản DNA đòi hỏi có một yếu tố mồi (primer). Yếu tố này giữ chức năng khởi động. Enzym DNA polymerase III chỉ có khả năng xúc tác việc hình thành mạch đơn mới DNA theo hướng 5’-3’, vì vậy việc lắp ráp
  15. các nucleotit vào sợi khuôn bao giờ cũng bắt đầu từ chiều 3’ của sợi khuôn. Hình 41. Sao chép DNA ở vi khuẩn E. coli 92 Nghĩa là sự kéo dài (elongation) được thực hiện do gắn thêm nucleotit vào đầu có OH của cacbon 3’ tự do. Để tạo ra nhóm 3’OH, enzym primase bám vào đầu 3’ của mạch gốc tổng hợp nên đoạn mồi ngắn khoảng 8-10 ribonucleotit. Như vậy, enzym primase làm nhiệm vụ khởi động để sau đó enzym DNA polymerase III xúc tác tạo thành liên kết photphodieste giữa nhóm 3’OH tự do của đoạn mồi và nguyên tử photpho phía trong cùng của nucleotit triphotphat đang gắn vào đoạn mồi. Sự nhận biết của nucleotit triphotphat được gắn vào đoạn mồi phụ thuộc vào sự kiên kết đôi base bổ sung của môi trường nội bào với nucleotit đối diện trong mạch khuôn. DNA polymerase III xúc tác phản ứng trùng hợp hóa, liên kết nucleotit mới vào đầu đoạn mồi. Mạch khuôn có chiều 3’OH - 5’P được DNA-polymerase gắn vào và tổng hợp ngay mạch bổ sung theo chiều 5’P -
  16. 3’OH. Mạch này được gọi là mạch trước (mạch sớm), quá trình sao chéo được thực hiện liên tục, từ ngoài vào trong, hướng vào chẻ ba sao chép. Trong khi đó mạch khuôn theo hướng 5’P-3’OH, việc tổng hợp có phức tạp hơn và thực hiện từ chẻ ba sao chép ra ngoài, mạch này được hoàn thiện muộn hơn được gọi là mạch sau hay mạch muộn. Việc tổng hợp mạch đơn DNA mới trên mạch gốc 5’-3’ theo chiều ngược và tạo ra những đoạn ngắn, gọi là đoạn Okazaki. Theo Okazaki mỗi đoạn có từ 1000 đến 2000 nucleotit. Trước khi tổng hợp, mỗi phân đoạn Okazaki cũng tổng hợp đoạn mồi RNA để tạo nhóm 3’OH để sau đó nhờ tác dụng của enzym DNA polymerase III kéo dài tiếp chuỗi polydezoxyribonucleotid. Các nucleotid được gắn vào đầu 3’OH của đoạn mồi để kéo dài ra theo chiều 5’-3’ tạo ra đoạn Okazaki. Sau khi đoạn Okazaki tiếp theo được hình thành thì enzym DNA polymerase I vào thay thế vị trí DNA polymerase III, phân hủy đoạn mồi RNA và tổng hợp đoạn DNA bổ sung theo hướng 5’-3’. Giữa hai đoạn Okazaki lúc này có một khoảng trống, khoảng này sẽ được lấp đầy do enzym DNA ligase hình thành thêm liên kết photphodieste, cứ như vậy các đoạn Okazaki lần lượt được
  17. nối lại với nhau, kéo dài dần sợi DNA tổng hợp. 3.2 Sao chép ở tế bào eucaryotae. Sự sao chép ở tế bào nhân chuẩn eucaryotae còn chưa được hiểu tường tận nhưng các dữ liệu thu được cho thấy hệ thống này khá gần với hệ thống sao chép ở procaryotae. Khác biệt chủ yếu là ở các loại DNA-polymerase tham gia vào quá trinh. Ngoài các DNA-polymerase, hệ thống sao chép ở eucaryotae còn có sự tham gia của nhiều protein chuyên biệt 93 như: PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen-kháng nguyên trong nhân tế bào đang phân chia) có chức năng hoạt hóa các polymerase và , các nhân tố sao chép A và C (Replication Factor, RF-A, RF-C) cần cho hoạt động của các polymerase và . Mô hình sao chép ở eucaryotae được đề xuất như sau: - Đầu tiên, DNA được tháo xoắn nhờ một loại enzym tham gia vào tháo xoắn phân tử DNA và nhân tố sao chép A (RF-A). - Trên mạch chậm, polymerase /primase tương tác với RF-A tổng hợp mồi RNA (dài độ 10 nucleotid). Mồi này được nối dài thêm độ 20 nucleotid nhờ
  18. polymerase kết hợp với nhân tố sao chép RF-C. Lúc đó, sự phối hợp PCNA-ATP chận polymerase lại, giúp cho polymerase gắn vào và tổng hợp đoạn Okazaki. - Polymerase được giải phóng và được chuyển lên mạch đối diện, tổng hợp liên tục mạch mới. Nhiều nghiên cứu sử dụng phân tử đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ cho thấy các phân tử DNA ngay sau khi được sao chép sẽ được tổ chức lại thành nucleosome. Các nucleosome mới hình thành chỉ chứa các histon mới tổng hợp. Tuy nhiên điều chưa rõ là các nucleosome mới hình thành nằm hoàn toàn trên một mạch và các nucleosome cũ trên mạch kia hay có sự phân bố ngẫu nhiên trên cả hai mạch. 4. RNA và sự phiên mã (sinh tổng hợp RNA) 4.1. Thành phần hóa học của phân tử RNA. Phân tử RNA (Ribonucleic acid) được cấu tạo từ 3 thành phần: - Đường pentose (đường 5C), ở đây là đường ribose. - Base nitơ, gồm 2 nhóm: purine (adenine (A) và Guanine (G) và pyrimidine cytosine (C) và uracyl (U). - Nhóm phosphate (P). Các thành phần trên liên kết với nhau (base nitơ liên kết với đường ở C1 và nhóm phosphate liên kết với đường ở C5) tạo thành ribonucleic. Các
  19. monoribonucleic liên kết với nhau bằng liên kết phosphodieste thành chuỗi polyribonucleic. 94 Phân tử RNA là một chuỗi (1 mạch) polyribonucleotid. 4.2 Sự phiên mã (sinh tổng hợp RNA) Mặc dù bản chất hóa học của hai loại quá trình: sinh tổng hợp DNA và RNA rất giống nhau nhưng chúng lại mang những ý nghĩa sinh học chuyên biệt. Quá trình sinh tống hợp DNA (sự sao chép) có tính ổn định cao, đảm bảo sự truyền đạt nguyên vẹn bộ gen; trong khi đó sự sinh tổng hợp RNA (sự phiên mã) lại liên quan đến tính đa dạng và biến động trong sự biểu hiện các tính trạng di truyền. Phần lớn sự biểu hiện của gen được kiểm tra và điều hòa ở mức độ phiên mã và mọi giai đoạn của quá trình phiên mã đều có thể chịu sự biến đổi. Các nguyên tắc cơ bản của quá trình này đã được thiết lập dựa vào nghiên cứu trên procaryotae (E. coli) nhưng dường như các nguyên tắc này có tính phổ biến cho cả eucaryotae. Tuy nhiên, do những khác biệt về cấu trúc (bộ gen ở eucaryotae được bao bọc trong nhân, trong khi ở procaryotae bộ gen nằm tự do trong tế bào chất) và do những khác biệt về hệ
  20. enzyme nên sự phiên mã ở procaryotae và eucaryotae cũng có những sai khác nhất định. 4.2.1 Các giai đoạn của quá trình phiên mã. 4.2.1.1 Vai trò của RNA polymerase. Enzym RNA polymerase được nghiên cứu chứa hai hợp phần chình đó là yếu tố sigma () và lõi enzym chứa hai chuỗi anfa() và bêta (). Yếu tố sigma có vai trò quan trọng giúp cho enzym lõi nhận biết và bám vào vùng gen khởi động để bắt đầu phiên mã tại vị trí chính xác. Sau đó chúng rời enzym lõi để tham gia vào một quá trình phiên mã khác. Enzym lõi đóng vai trò chủ chốt trong việc trùng hợp và kéo dài sợi RNA. 4.2.1.2 Vai trò của các tín hiệu khởi đầu và kết thúc phiên mã. - Tín hiệu khởi đầu phiên mã đó là vùng khởi động (promotor) có chứa hai vị trí đặc hiệu, tạo điều kiện cho RNA polymerase nhận biết và bám vào để chuẩn bị khởi đầu quá trình phiên mã. Đoạn nhận biết nằm cách điểm khởi đầu phiên mã khoảng 35 nucleotit về phía trước, thường có trình tự 5’ TTGACA (3’). Đoạn thứ hai có trình tự 5’ TATATT (3’) gọi là hộp TATA hay là hộp pribnow nằm cách điểm bắt đầu phiên mã 10 cặp nucleotit. - Tín hiệu kết thúc bao gồm:
  21. + Nhân tố : đây là một loại protein gồm có 6 tiểu đơn vị. Cơ chế hoạt động của nhân tố này hiện nay chưa được rõ, nhưng người ta đã chứng 95 minh được rằng, một đoạn dài khoảng 70-80 nucleotid của phân tử RNA mới tổng hợp quấn quanh . Có lẽ có chức năng tách enzyme và sợi RNA ra khỏi khuôn DNA. Hình 42. Tín hiệu khởi đầu và kết thúc phiên mã + Một cấu trúc đặc hiệu trên sợi khuôn: Bao gồm hai trình tự đối xứng bổ sung tiếp theo là một loạt 6 adenine (chúng sẽ được phiên mã thành 6 uracyl). Ngay sau khi hai trình tự đối xứng bổ sung được hình thành trên RNA, chúng có thể bắt cặp với nhau tạo thành cấu trúc “kẹp tóc” ngăn không cho RNA-polymerase tiếp tục tổng hợp. Phần sợi khuôn nằm sau 96 RNA- polymerase sẽ trở lại cấu trúc ban đầu, tách rời khỏi enzyme và sợi RNA mới tổng hợp. Hình 43. Phiên mã ở Eucaryote 4.2.2. Giai đoạn khởi động. Enzyme RNA polymerase nhận biết quá trình tự khởi động trên sợi DNA
  22. (promotor), nhờ tiểu đơn vị . Nhân tố nhận biết được promotor là nhờ cấu trúc đặc trưng của nó. RNA- polymerase gắn vào promotor theo hai bước: Trước hết enzyme nhận biết và gắn một cách lỏng lẻo vào trình tự -35 (cách vị trí bắt đầu sinh tổng hợp 35 cặp base). Sau đó, phức hợp này chuyển thành phức hợp “mở”, trong giai đoạn này một vùng DNA bắt đầu từ trình tự -10 sẽ được tháo xoắn và một sợi DNA lộ ra dưới dạng tự do, làm khuôn cho sự sinh tổng hợp RNA. 4.2.3. Giai đoạn kéo dài. Khi phân tử RNA đạt chiều dài khoảng 8 nucleotid thì nhân tố tách khỏi phức hợp enzyme. Lúc bấy giờ lại có thể gắn vào một promotor khác để khởi động một quá trình phiên mã mới. Sự tách rời nhân tố cần thiết cho giai đoạn kéo dài vì sự có mặt tiếp tục của nó sẽ gắn chặt phức hợp enzyme vào promotor khiến cho enzyme không thể trượt dài theo sợi khuôn DNA để tiến hành quá trình sinh tổng hợp. Nhân tố 97 được thay thế bằng các nhân tố kéo dài (elongation factors). RNA- polymerase tháo xoắn liên tục phân tử DNA trên một
  23. chiều dài khoảng 17 nucleotid theo tiến triển của quá trình sinh tổng hợp. Sợi RNA mới sẽ tách khỏi mạch khuôn DNA, trừ một đoạn khoảng 12 nucleotid bắt đầu từ điểm tăng trưởng vẫn liên kết với DNA. Phần DNA được tháo xoắn sẽ được xoắn trở lại sau đó. 4.3.3. Giai đoạn kết thúc. Trên DNA vi khuẩn tồn tại dấu hiệu “kết thúc”. Khi RNA polymerase gặp dấu hiệu này nó sẽ ngừng quá trình sinh tổng hợp, nhả sợi DNA khuôn ra và có thể bắt đầu hoạt động ở nơi khác. 4.4 Quá trình phiên mã ở eucaryotae. 4.4.1 Một số điểm khác hơn so với ở procaryotae. - Tất cả các gen ở procaryotae đều được phiên mã bởi 1 polymerase duy nhất, trong khi ở eucaryotae có 3 loại polymerase chịu trách nhiệm phiên mã các loại gen khác nhau: loại I cho các RNA của ribosome, loại II phiên mã các RNA thông tin và loại III cho các RNA kích thước nhỏ, như các RNA vận chuyển. - Các RNA thông tin vừa được phiên mã từ DNA hầu như không bao giờ được dịch mã ngay thành protein như ở procaryotae. Đầu tiên các tiền-RNA thông tin được hình thành trong nhân sẽ phải chịu một số biến đổi hóa học trước khi xuất hiện trong tế bào chất dưới dạng hoạt động. - Do cấu trúc có nhân của eucaryotae, quá trình phiên mã tạo
  24. RNA thông tin xẩy ra trong nhân, còn quá trình dịch mã tổng hợp protein xẩy ra trong tế bào chất nên hai quá trình này không đồng thời như ở procaryotae. - Sự khởi động phiên mã ở các cơ thể đa bào eucaryotae không đáp ứng tức thời với điều kiện ngoại cảnh như ở procaryotae. Một đặc điểm của các mRNA ở eucaryotae là mỗi mRNA mã hóa cho 1 chuỗi polypeptid trong khi ở procaryotae mỗi mRNA thông tin mã hóa cho nhiều chuỗi polypeptid. 4.4.2 Các giai đoạn phiên mã ở tế bào eucaryotae. 4.4.2.1. Giai đoạn khởi động. 98 Chịu sự kiểm tra của 1 trình tự đặc biệt - hộp TATA- nằm trước vị trí bắt đầu phiên mã khoảng 25-35 nucleotide. Ở một số gen, trình tự TATA được thay bằng một trình tự giàu GC. RNA-polymerase II bắt đầu hoạt động phiên mã nhờ nhiều nhân tố phiên mã (TF- Transcription Factor) có bản chất protein. Trước tiên, nhân tố TFIID nhận biết và gắn vào trình tự TATA. Tiếp theo là việc gắn thêm nhân tố TFIIA. Lúc đó RNA- polymerase liên kết với TFIIB sẽ gắn vào phức hợp TFIID-TFIIA. Một phân tử ATP được phân
  25. giải, năng lượng dùng để tách hai mạch DNA, phức hợp được “mở”. Cuối cùng, nhân tố TFIIE cho phép khởi động sự phiên mã. - Giai đoạn kéo dài: Phân tử RNA được tổng hợp từ mạch khuôn DNA. Quá trình này được tiến hành nhờ nhân tố TFIIS. - Giai đoạn kết thúc: Sự phiên mã kết thúc trước điểm gắn đuôi polyA rất xa. Sự kết thúc phiên mã có liên quan đến những cấu trúc dạng “kẹp tóc” tiếp ngay sau là quá trình tự giàu GC. 4.4.2.2 Quá trình trưởng thành của các tiền mRNA. Trước khi sự phiên mã kết thúc, các tiền mRNA bắt đầu trải qua một quá trình biến đổi ngay trong nhân để trở thành các mRNA trưởng thành, quá trình này gồm các bước sau: - Gắn chóp: ngày sau khi bắt đầu phiên mã, một guanine có gắn nhóm methyl ở N7 (7- methyl guanine), được gắn vào đầu 5’P của mRNA nhờ liên kết 5’-5’ triphosphate. - Thêm đuôi: Ngay sau khi được phiên mã, các mRNA sẽ bị cắt bỏ khoảng 20 nucleotide nằm trước một trình tự AAUAAA, đây chính là trình tự nhận biết cho phản ứng cắt. Sau đó 1 enzyme có trong nhân-polyA-polymerase sẽ gắn một số lượng adenine nhất định (khoảng 250 ở động vật có vú, 100 ở eucaryotae bậc thấp) vào đầu 3’ của mRNA. Một protein, PABP (PolyA
  26. Binding Protein-Protein liên kết với polyA) sẽ gắn vào đuôi polyA. Protein này cần thiết cho sự sống còn và sinh trưởng của tế bào. Đuôi polyA kết hợp với PABP có vai trò trong sự ổn định các mRNA và việc khởi sự dịch mã. Đến giai đoạn này, tiền mRNA đã được hình thành, nhưng để chuyển thành dạng hoạt động, phân tử này còn phải trải qua một bước biến đổi: quá trình ghép nối. 99 - Quá trình ghép nối (splicing): Đây là quá trình loại bỏ các intron và nối các exon lại với nhau hình thành nên mRNA trưởng thành (hoạt động). mRNA trưởng thành sẽ đi ra tế bào chất qua các lỗ trên màng nhân để tham gia vào quá trình dịch mã (sinh tổng hợp protein). Hình 44. Phiên mã gián đoạn ở Eucaryote Hình 45. Cấu trúc m RNA của Eucaryote 100 5. Mã di truyền và dịch mã RNA thông tin chỉ là giai đoạn trung gian giữa DNA và protein. Ở eucaryotae, RNA thông tin giúp chuyển thông tin mã hóa trên DNA nằm trong nhân ra đến bộ máy dịch mã tạo protein ngoài tế bào
  27. chất. Quá trình sinh tổng hợp protein cũng như quá trình sinh tổng hợp DNA, RNA tuân theo một số nguyên tắc chung. Tuy nhiên, quá trình dịch mã phức tạp hơn nhiều so với sự sao chép và phiên mã. Điều đó là do cơ chế của sự sao chép hay phiên mã chủ yếu dựa vào ái lực giữa các base thành phần cấu tạo phân tử mới với các base của khuôn, biểu hiện qua các liên kết hydro giữa chúng. Còn trong quá trình dịch mã các amino acid tuy được nối kết với nhau theo khuôn RNA nhưng chúng là hoàn toàn không có ái lực với phân tử RNA. Do đó trong quá trình sinh tổng hợp protein, ngoài khuôn mRNA và các đơn vị thành phần cấu tạo nên phân tử mới (các amino acid), còn cần sự hiện diện của các nhân tố tiếp hợp (adaptor). Các nhân tố tiếp hợp này làm vật trung gian giúp cho các amino acid không phải tiếp xúc với khuôn RNA. Dó chính là các RNA vận chuyển (tRNA). Quá trình dịch mã tiến hành theo một cơ chế chung cho tất cả mọi tế bào. 5.1 Các loại RNA và vai trò của chúng trong quá trình sinh tổng hợp protein. 5.1.1 RNA thông tin và mã di truyền. RNA thông tin (ký hiệu là mRNA) còn được gọi là RNA trung gian, được tổng hợp trên khuôn mẫu của gen cấu trúc, trên mạch gốc có chiều
  28. 3’OH - 5’P của phân tử DNA. mRNA làm nhiệm vụ truyền thông tin di truyền từ gen cấu trúc (DNA) sang sản phẩm protein nhờ nguyên tắc mã bộ ba và đối mã di truyền. Trong tế bào hàm lượng mRN chiếm tỷ lệ nhỏ (khoảng vài phần trăm) trong tổng số các loại RNA. Thời gian tồn tại của mRNA tùy thuộc vào loài, đối với procaryotae là khoảng 2 phút còn đối với eucaryotae có thể từ 30 phút đến 24 giờ. Trên cơ sở mối quan hệ thông tin DNA - mRNA - protein mà người ta nêu lên lý thuyết về mã di truyền. Trình tự phân bố các nucleotide trong phân tử DNA qui định trình tự phân bố các ribonucleotide trong phân tử mRNA và trình tự sắp xếp các ribonucleotide trong mRNA qui định trình tự sẵp xếp các axit amin trong phân tử protein được tổng hợp. Về mặt số lượng thì trong phân tử mRNA có 4 loại nucleotide và trong phân tử protein có ít nhất 20 loại axit amin. Vậy, nếu cứ 1 nucleotide qui định 1 axit amin thì chỉ có 41 loại axit amin được tổng hợp, nếu cứ 2 nucleotide qui định 1 axit amin thì chỉ có 42 = 16 axit amin được tổng hợp.
  29. 101 Như vậy sẽ thiếu, có một số axit amin không được tổng hợp. Còn nếu cứ 3 nucleotid qui định 1 axit amin thì sẽ có 43 = 64 loại axit amin được tổng hợp, không những đủ các loại axit amin mà còn thừa. Do đó, giả thuyết này tạm thời được công nhận. Vấn đề tiếp theo là xác định chính xác các bộ ba (codon) nào mã hóa cho axit amin nào. M. W Niremberg và H. Matthaei đã dùng enzyme theo phương pháp của Ọchoa tổng hợp mRNA nhân tạo. Sau đó đưa men này vào trong môi trường chỉ có 1 loại uracyl thì nhận được RNA toàn bộ là uracyl (polyU), nếu chỉ có adenine thì nhận được polyA Năm 1961, các tác giả trên đã dùng polyU thay cho mRNA để tổng hợp protein trong hệ thống vô bào (có axit amin, enzyme tổng hợp protein, nhưng không có DNA), sản phẩm nhận được là mạch polypeptide polyphenylalanine, chỉ chứa 1 loại axit amin là phenylalanine và tỷ lệ uracyl / phenylalanine là 3/1. Điều đó chứng tỏ, codon UUU mã hóa cho phenylalanine. Sau đó, người ta cũng đã xác định AAA mã hóa cho lysine, GGG cho glycine, CCC cho proline Vào năm 1964, H.G Khorana tìm ra phương pháp tạo mRNA tổng hợp nhân tạo
  30. với trình tự lặp lại (như AAG AAG AAG ) nhờ đó đã giải quyết các vấn đề còn chưa rõ. Các đặc điểm của mã di truyền. - Mã di truyền là mã bộ ba, nghĩa là cứ 3 nucleotide kế tiếp mã hóa cho 1 axit amin. - Mã di truyền không gối lên nhau. Thông tin trong phân tử mRNA được đọc theo chiều 5’P - 3’OH kể từ codon khởi đầu. - Mã di truyền có tính chất đặc hiệu, nghĩa là mỗi bộ ba chỉ mã hóa cho 1 axit amin nhất định. - Mã di truyền có tính chất “thoái hóa”, nghĩa là phần lớn nhiều bộ ba cùng mã hóa cho 1 axit amin. - Mã di truyền có codon khởi đầu AUG mã hóa cho methyonine và các codon kết thúc không mã hóa (UAG, UAA, UGA), nhưng là tín hiệu kết thúc chuổi protein được tổng hợp. - Mã di truyền có tính chất phổ biến, nghĩa là toàn bộ sinh giới đều sử dụng thống nhất mã di truyền. 102 Bảng 5. Bảng mã di truyền Nucleotid Nucleotid 2 U C A G Nucleotid 1 3
  31. U Phe Ser Tyr Cys Phe Ser Tyr Cys U C A G Lue Ser vô nghĩa vô nghĩa Lue Ser vô nghĩa Trip C Leu Pro His Arg Leu Pro His Arg U C A G Leu Pro Glutamin Arg Leu Pro Glutamin Arg A Ileu Thr Asp Ser Ileu Thr Asp Ser U C A G Ileu Thr Lys Arg Met Thr Lys Arg G Val Ala Asp Gly Val Ala Asp Gly U C A G Val Ala Glu Gly Val Ala Glu Gly 5.1.2 RNA vận chuyển (t.RNA hoặc s.RNA). RNA vận chuyển chính là nhân tố tiếp hợp (adaptor) trong quá trình dịch mã. Ngoài chức năng làm nhiệm vụ trung gian giữa axit amin và khuôn mRNA, t.RNA còn giúp giải quyết trở ngại về không gian trong quá trình dịch mã (vận chuyển). Số lượng các loại tRNA biến động theo loài, 30-40 ở vi khuẩn (procaryotae), 50 ở tế bào thực vật, động vật (eucaryotae) nhưng cấu trúc của chúng rất giống nhau. Một
  32. đặc điểm đáng chú ý là một t.RNA có thể kết hợp với hai codon khác nhau cùng mã hóa cho 1 axit amin. 103 Chức năng trung gian của t.RNA đươc thực hiện nhờ những enzyme đặc hiệu là các aminoacyl-t.RNA synthetase. Có 20 aminoacyl-t.RNA synthetase tương ứng với 20 loại axit amin. Các enzyme này có khả năng nhận biết axit amin đặc hiệu và cả t.RNA tương ứng. Quá trình gắn axit amin vào t.RNA với sự tham gia của enzyme này là một quá trình tiêu tốn năng lượng. Hình 46. Cấu trúc của tRNA t.RNA chiếm khoảng 10-20% tổng số các loại RNA. Cấu tạo giống như chiếc lá 3 thùy: - Thùy tác dụng với ribosome. - Thùy mang bộ ba đối mã. - Thùy có chức năng nhận biết enzyme, gắn amino acid tương ứng vào t.RNA. Trên phân tử t.RNA có chổ xoắn lại , tại các điểm này ribonucleotide có thể liên kết với nhau theo nguyên tắc bổ sung. 5.1.3 RNA ribosome (r.RNA) 104 Ribosome được cấu tạo từ các r.RNA và hơn 50 loại protein. Chúng được phân thành hai tiểu đơn vị- một tiểu
  33. đơn vị lớn và một tiểu đơn vị nhỏ. Ở tế bào procaryotae, tiểu đơn vị lớn gồm 2 phân tử r.RNA và khoảng 35 protein, còn tiểu đơn vị nhỏ gồm 1 phân tử r. RNA và khoảng 20 protein. Trừ một vài sai khác về kích thước và thành phần, ribosome cũng như r.RNA ở procaryotae và eucaryotae có cấu trúc cơ bản giống nhau. 5.2 Các giai đoạn của quá trình dịch mã. 5.2.1 Hoạt hóa axit amin. Mỗi axit amin có mặt ở bào tương được đính vào từng t.RNA thích hợp nhờ hoạt động xúc tác của enzyme aminoacyl-t.RNA synthetase đặc thù. Đầu tiên enzym này xúc tác cho phản ứng ATP hoạt hóa axit amin thành phức hợp aminoacyl-AMP liên kết với enzyme. Enzyme + axit amin + ATP Enzyme-aminoacyl-AMP +P-P Sau đó phức hợp này kết hợp với t.RNA tương ứng bằng liên kết đồng hóa trị tạo nên aminoacyl-t.RNA Enzyme-aminoacyl-AMP + t.RNA tRNA-aminoacyl + AMP + enzyme. 5.2.2 Khởi đầu. Là một giai đoạn cực kỳ phức tạp với sự tham gia của hàng loạt nhân tố protein: các nhân tố khởi động (IF -initiation Factor). Dấu hiệu bắt đầu khởi động là codon AUG. Bước quan trọng nhất là hình
  34. thành tiểu đơn vị nhỏ của ribosome-Met-t.RNA-mRNA với sự tham gia của các nhân tố khởi động. Met-t.RNA cùng với 1 phân tử GTP (có chức năng cung cấp năng lượng) và tiểu đơn vị nhỏ của ribosome được gắn vào vị trí chuyên biệt của mRNA, vị trí này nằm rất gần codon AUG khởi động. Một trong các nhân tố khởi động có vai trò đặc biệt quan trọng trong việc phát hiện codon khởi động để phức hợp gắn vào. Ngay sau khi codon khởi động được phát hiện thì tiểu đơn vị lớn của ribosome sẽ đến kết hợp với phức hợp và sự dịch mã bắt đầu. 5 2.3 Kéo dài chuỗi polypeptide. Là giai đoạn tương đối đơn giản, mang tính lặp lại. Sau khi amino acid đầu tiên (Met) đã được đặt vào vị trí, chuỗi polypeptide bắt đầu được tổng hợp (kéo dài). Aminoacyl- t.RNA kế tiếp sẽ đến xếp đúng vào vị trí 105 trên ribosome nhờ một trong các nhân tố kéo dài (EF- elongation Factor). Có 2 vị trí chuyên biệt trên ribosome: Hình 47. Dòng thông tin trong quá trình dịch mã Vị trí A tiếp nhận aminoacyl - t.RNA kế tiếp và vị trí P giữ phức
  35. hợp peptidyl-t.RNA, tức là chuỗi polypeptide đang hình thành. Sự tiếp xúc giữa peptidyl-t.RNA và aminoacyl- t.RNA sẽ dẫn đến sự hình thành liên kết peptide gắn amino acid mới vào chuỗi polypeptide đang hình thành. Quá trình được lặp lại cho đến khi xuất hiện dấu hiệu kết thúc dịch mã. 5.2.4 Kết thúc sinh tổng hợp protein. Khi dấu hiệu kết thúc dịch mã (một trong các codon UAG, UAA, UGA) được nhận biết bởi nhân tố kết thúc (Termination Factor-TF). Sự có mặt của TF với enzyme peptidyltransferase gây sự chuyển dịch của ribosome và phức hợp peptidyl-t.RNA lập tức tách làm đôi: phân tử 106 t.RNA tự do và chuỗi polypeptide hoàn chỉnh. Lúc đó, ribosome cũng tách khỏi mRNA, hai tiểu phần lớn nhỏ cũng tách nhau ra ở dạng tự do. Có thể một lúc trên phân tử mRNA có nhiều ribosome (polysome) trượt qua để tổng hợp protein. Nghĩa là trên một phân tử m.RNA có thể tổng hợp nhiều phân tử protein. Điều này phụ thuộc vào nhu cầu sinh lý của tế bào. Hình 48. Mô hình dịch mã ở ribosome
  36. 5.3 Điều hòa sự biểu hiện của gen. Trong bất kỳ tế bào nào, tất cả các gen đều không hoạt động đồng thời với cường độ như nhau, do đó không phải lúc nào sự sinh tổng hợp protein cũng xẩy ra hoặc loại protein nào cũng được tổng hợp với số lượng như nhau. Như vậy, tế bào phải có cơ chế điều hòa để tổng hợp protein tiết kiệm và hợp lý nhất. Một số gen hoạt động thường xuyên cung cấp sản phẩm liên tục, số khác có biểu hiện ở những giai đoạn nhất định trong chu kỳ sống. Một 107 số protein cần được tổng hợp với số lượng lớn, một số khác chỉ cần ít phân tử. Do vậy, hoạt tính của mỗi gen điều hòa bởi nhiều cơ chế khác nhau để có hiệu quả tốt nhất trong việc sử dụng nguồn năng lượng của tế bào. Năm 1962, F. Jacob và J. Monod đã nếu ra quan niệm operon để giải thích sự điều hòa ở vi khuẩn E. coli. Cơ chế điều hòa hoạt động của gen được biết nhiều nhất là trên đối tượng vi khuẩn và phage. Trong hệ thống này, hoạt động điều hòa đóng-mở xuất hiện khi tổng hợp một m.RNA để tạo một sản phẩm cần thiết. Ở sinh vật nhân chuẩn sự đóng hoàn
  37. toàn của 1 gen là phổ biến. Ở vi khuẩn, khi 1 enzyme tác động theo trình tự trong 1 chu kỳ chuyển hóa đơn thì có thể các enzyme này được sản sinh ra hoặc không. Hiện tượng này được gọi là sự điều hòa đồng hàng, là do sự kiểm soát tổng hợp của một phân tử m.RNA đa cistron mã hóa tất cả các sản phẩm của gen. Kiểu điều hòa này không xẩy ra ở sinh vật nhân chuẩn, vì m.RNA của nó là đơn cistron. Gồm có 2 cơ chế điều hòa: âm tính và dương tính. Điều hòa âm tính : Một chất ức chế có mặt trong tế bào và cản trở sự phiên mã. Một chất độc lập với chất ức chế, gọi là chất cảm ứng (trao đổi) lại cho phép mở đầu sự phiên mã. Điều hòa dương tính: Một phân tử chất tác động, có thể là protein hoạt hóa một điểm mở đầu. 5.3.1 Cơ chế điều hòa biểu hiện của gen ở tế bào procaryotae. 5.3.1.1. Operon và thành phần của nó. Phần lớn các gen trong hệ gen procaryotae được tổ chức thành đơn vị hoạt động chức năng gọi là operon. Năm 1961, Jacob và Monod đã đề xuất mô hình operon lactose. Mô hình này là một tổ hợp gồm các gen sau: - Gen điều hòa (Regulator-R) sản sinh ra 1 loại protein điều hòa gọi là chát ức chế (repressor). Chất ức chế này có tác dụng điều chỉnh hoạt động của nhóm gen cấu trúc thông
  38. qua sự tương tác với gen chỉ huy. - Gen chỉ huy (Operator- O) nằm kề trước nhóm gen cấu trúc và là vị trí tương tác với chất ức chế. - Gen khởi động (Promotor-P) là đoạn DNA nằm trước gen chỉ huy có thể trùm lên toàn bộ hoặc một phần gen chỉ huy. Đây là vị trí m.RNA bám vào để khởi đầu phiên mã. 108 - Nhóm gen cấu trúc (cistron) là một số gen liên quan về mặt chức năng, xếp cạnh nhau (đa cistron). Hình 49. Các vùng điều hòa của operon lacto 5.3.1.2 Điều hòa âm tính. Hình 50. Mô hình cảm ứng điều hòa âm tính operon lac. 109 Khi trong môi trường nuôi cấy E.coli không có lactose (chất cảm ứng) thì operon không hoạt động, nghĩa là các enzyme tham gia chuyển hóa đường lactose không được sinh ra, vì chất ức chế bám vào gen chỉ huy, làm ức chế sự phiên mã của gen cấu trúc. Khi bổ sung lactose vào môi
  39. trường thì một thời gian sau vi khuẩn sẽ bắt đầu hấp thụ và phân giải nó, nghĩa là enzyme liên quan đã được sinh ra. Lúc này chất cảm ứng (lactose) tương tác với chất ức chế làm biến đổi cấu hình của chát này, vì vậy nó không thể nhận biết và bám vào gen chỉ huy, gen này cho phép các gen cấu trúc được phiên mã để tổng hợp các enzyme tương ứng, phân giải lactose. 5.3.1.3 Điều hòa dương tính. Hình 51. Sơ đồ điều hòa dương tính operon lacto. 110 Ngoài ra CAP chỉ hoạt động khi trong môi trường tế bào có hàm lượng cAMP cao; cAMP kết hợp với protein CAP tạo ra phức hợp CAP-cAMP hoạt động, có khả năng nhận biết và bám vào đoạn trình tự đối xứng ở vị trí CAP ở vùng gen khởi động, nhờ vậy RNA-polymerase được kích hoạt để bám vào vị trí tương ứng của nó, bắt đầu quá trình phiên mã. Khác với cơ chế điều hòa âm tính, là do sự tương tác giữa chất ức chế và gen chỉ huy, còn điều hòa dương tính là do sự tương tác giữa protein điều hòa thuộc phức hợp
  40. cAMP-CAP với vùng khởi động dẫn đến sự tăng cường phiên mã mà chủ yếu điều chỉnh tốc độ khởi đầu phiên mã. 5.3.1.4 Hoạt động của operon triptophan. Operon triptophan của E. coli có 5 gene cấu trúc được ký hiệu A, B, C, D, E tham gia vào quá trình sinh tổng hợp amino acid triptophan. Khi tế bào E. coli dư thừa triptophan thì operon ngừng hoạt động, do đó các enzyme tương ứng không được sinh ra. Điều này có thể được giải thích như sau: Chất ức chế bình thường ở trạng thái bất hoạt, nhưng khi có tryptophan dư thừa, nó sẽ bám vào và tạo thành phức hợp có hoạt tính (triptophan còn gọi là chất đồng ức chế) có khả năng bám vào gen chỉ huy để ức chế quá trình phiên mã. Ngược lại, khi trong tế bào không có triptophan, chất ức chế ở trạng thái bất hoạt nên không bám vào gen chỉ huy được, vì vậy các gen cấu trúc lại hoạt động phiên mã. Kết quả các enzyme tham gia tổng hợp triptophan được sinh ra. Hình 52. Mô hình ức chế điều hòa âm tính operon –trip ở E.coli Khi hàm lượng triptophan được tổng hợp thừa sẽ ức chế trở lại, kìm hãm hoạt động của operon.
  41. 111 5.3.2 Điều hòa phiên mã ở eucaryotae. Sự điều hòa ở eucaryotae có những khác biệt lớn so với ở procaryotae cả về tín hiệu cũng như cơ chế điều hòa. Tín hiệu điều hòa ở cơ thể đa bào là những phân tử do các tế bào chuyên biệt sản sinh, theo thể dịch lưu chuyển khắp cơ thể. Các phân tử này tác động lên những nhóm tế bào “đích” điều chỉnh biểu hiện của gen ở các tế bào này theo đúng chương trình đã định sẵn cho phù hợp với sự phát triển của toàn cơ thể. Có hai nhóm phân tử điều hòa chính: các hormone và các nhân tố tăng cường (Growth Factor- GF). Bộ gen eucaryotae có các điểm đặc thù: - Kích thước bộ gene rất lớn. - Phân tử DNA được nén chặt trong nhân Do vậy mà hệ thống điều hòa đơn giản của procaryotae dựa vào sự nhận biết một trình tự DNA ngắn bởi một protein duy nhất trong giai đoạn phiên mã không còn phù hợp. Sự điều hòa biểu hiện gen ở eucaryotae thể hiện trong mọi giai đoạn, từ trước lúc sao chép đến sau khi dịch mã. Cơ chế điều hòa cũng thay đổi theo từng giai đoạn. 5.3.2.1 Điều hòa bằng cách biến đổi cấu trúc nhiễm sắc chất (chromatin) hay cấu trúc của phân tử DNA. Nhiễm sắc thể là cấu trúc liên kết của DNA
  42. và protein histon trong thời kỳ hai lần phân bào. Khi sự phân chia nhân bắt đầu (kỳ trước của phân bào), nhiễm sắc thể xoắn chặt lại, có dạng hình que đặc trưng. Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy có sự tồn tại của những vùng “nhạy cảm” trong nhiễm sắc thể. Các vùng này tương ứng với các gen hoạt động của tế bào. Chúng có cấu trúc đặc trưng khiến chúng trở nên dễ tiếp cận đối với nhiều nhân tố như các enzyme thủy phân hay các enzyme sao chép và phiên mã. Như vậy mức độ điều hòa đầu tiên là sự sắp xếp các gen cần biểu hiện vào một cấu trúc nhiễm sắc thể, thuận lợi cho quá trình sao chép và phiên mã. 5.3.2.2 Điều hòa ở mức độ phiên mã. Kiểu điều hòa này cơ bản giống sự điều hòa ở procaryotae, cũng dựa trên sự tương tác giữa các protein điều hòa với các trình tự DNA chuyên biệt, nhưng phức tạp hơn rất nhiều. Các trình tự DNA chuyên biệt là CIS và các protein điều hòa tương tác với chúng, các nhân tố TRANS. 112 - Trình tự CIS. Cũng giống như ở procaryotae, vùng 5’ không phiên mã của gen được gọi là promotor chịu trách
  43. nhiệm điều khiển sự phiên mã của gen. Tuy nhiên, các trình tự điều hòa sự phiên mã lại nằm trước đó rất xa. Chính các trình tự này quyết định sự biểu hiện đặc trưng của một gen, nghĩa là gen được biểu hiện trong loại tế bào nào, vào thời điểm nào, dưới sự tác động của các nhân tố điều hòa nào. Một đặc điểm chung của các trình tự này là chúng thường có cấu trúc gồm hai phần đối xứng nhau, ví dụ, trình tự đáp ứng với hormone tuyến giáp dưới đây: AGGTCATGACCT TCCAGTACTGGA Các trình tự này được gọi chung là trình tự CIS. Bên cạnh đó, còn một nhóm trình tự khác cũng tham gia vào điều hòa hoạt động của gen, đó là nhóm các trình tự khuyếch đại (enhancer). Các enhancer này có tác dụng làm tăng biểu hiện của gen tương ứng. Khác với trình tự CIS, hoạt động khuyếch đại phụ thuộc vào: - Vị trí, chúng không nhất thiết phải nằm ở đầu 5’ của các gen mà có thể hiện diện ở đầu 5’, 3’ hay ngay trong intron của gen. - Hướng, sự đảo ngược hướng của chúng (từ 5’-3’ sang 3’- 5’) không làm mất hoạt tính khuyếch đại. Với cùng các đặc tính đó, nhưng có tác dụng ngược lại là nhóm các trình tự
  44. dập tắt (silencer). Cơ chế hoạt động của hai nhóm này còn chưa được biết rõ. - Các protein là nhân tố có tác động TRANS. Một vài protein nhận biết hộp CCAAT, đã được xác định ở tế bào động vật có vú. Các nhân tố này có thể được phân biệt giữa các đơn vị của các phần tử CCAAT. Các hộp GC được nhận biết bởi các nhân tố phụ Đặc điểm chung của các nhân tố này là chúng bao gồm ít nhất hai vùng cấu trúc-chức năng chính: + Vùng chịu trách nhiệm gắn nhân tố TRANS vào DNA. + Vùng tác đông lên sự phiên mã. Các vùng cấu trúc-chức năng này độc lập với nhau. Ngoài hai vùng trên, nhiều nhân tố Trans còn mang một số vùng phụ khác như vùng gắn 113 các hormone, các ion Như vậy, các gen của eucaryotae được hoạt hóa bởi hai trình tự DNA có tác dụng CIS là promotor và enhancer, chúng được nhận biết các nhân tố protein có tác dụng Trans. Các nhân tố Trans này cho phép DNA-polymerase khởi sự phiên mã và đạt tốc độ phiên mã tối đa. 5.3.2.3 Hormone. Ví dụ rõ nhất về các chất điều hòa
  45. nội tại của hoạt tính gen là các hormone. Đó là những chất được tạo ra do một loại tế bào mà có hiệu quả đến các tế bào khác. Các hormone thường được vận chuyển đến các phần của cơ thể nhưng chỉ có tác động đến các tế bào có các thụ thể (receptor) tương ứng. Sự tương tác giữa hormone với thụ thể gây nên tín hiệu tác động đến các vùng đặc hiệu của DNA, làm hoạt hóa gen hoặc nhóm gen tương ứng. 5.3.2.4 Điều hòa ở mức độ sau phiên mã. - Hiện tượng “ghép nối” khác biệt. Hệ thống loại bỏ intron và ghép nối exon của mRNA sơ cấp để hình thành mRNA trưởng thành, khác nhau tùy từng loại tế bào, mô. Việc ghép nối khác biệt các exon sẽ dẫn đến sự hình thành các mRNA khác nhau. Thông thường các mRNA mã hóa cho các protein có chức năng tương tự nhưng đôi khi chúng lại có chức năng hoàn toàn khác nhau. Một ví dụ là kiểu điều hòa ở gen calcitonine. Hai loại protein được dịch mã từ gen này là calcitonine và CGRP là một chất trung gian thần kinh được tìm thấy trong não. Hai protein trên là sản phẩm của hai mRNA hình thành do sự ghép nối tạo hai tổ hợp exon khác nhau. - Điều hòa biểu hiện gen bằng cách tăng giảm thời gian sống của các mRNA. Kiểu điều hòa này mang
  46. tính số lượng, mRNA càng tồn tại lâu trong tế bào thì càng được dịch mã thành nhiều protein. Hiện tượng này thấy rõ trong tế bào ung thư. Quá trình tổng hợp protein từ một số mRNA bền vững tạo ra một số lượng rất lớn các protein tương ứng. - Nguồn dự trữ của các mRNA trong tế bào. Rất nhiều gen được phiên mã nhưng không bao giờ được dịch mã ngay. Khi có một tín hiệu xuất hiện (hormone chẳng hạn), bộ máy dịch mã lập tức hoạt động, tổng hợp protein từ các mRNA đã trữ sẵn. 5.3.2.5 Điều hòa trong giai đoạn dịch mã. 114 Sự điều hòa biểu hiện của gen trong giai đoạn này còn chưa được biết rõ. Tuy nhiên kiểu điều hòa này có liên quan đến các mRNA dự trữ trong tế bào. 5.3.2.6 Điều hòa trong giai đoạn sau dịch mã. Các protein sau dịch mã có thể trải qua nhiều biến đổi hóa học như glycosyl hóa, phosphoryl hóa, acetyl hóa Sự điều hòa trong giai đoạn này là một vấn đề rất lớn và phức tạp. 6. Đột biến gen 6.1 Khái niệm về đột biến gen. Trong lịch sử nghiên cứu đột biến, các phương pháp nghiên cứu ngày càng hoàn thiện, người ta có những
  47. quan niệm khác nhau về đột biến gen. Muller, 1941; Rieger, Michaelis, 1958 quan niệm đột biến gen là những biến đổi chỉ xẩy ra trong giới hạn 1 gen, làm xuất hiện allel mới, không liên quan tới sai hình nhiễm sắc thể. Theo các tác giả thì khái niệm đột biến gen đồng nghĩa với khái niệm đột biến trong gen. Charlote, Aurebach, 1976 lại quan niệm, đột biến gen là những biến đổi không chỉ xẩy ra trong 1 gen, mà có thể xẩy ra những biến đổi đụng chạm tới nhiều gen, gọi là đột biến cụm gen. Guliaev, Malchenco, 1975 cho rằng những đột biến di truyền theo Mendel bình thường có thể là đột biến gen hoặc sai hình nhiễm sắc thể, không thể phát hiện được về phương diện tế bào, không làm giảm khả năng sống của các loại giao tử. Theo các tác giả thì thuật ngữ đột biến gen thường được dùng để chỉ các đột biến phát hiện được theo kiểu hình. Sự phân biệt đột biến gen và đột biến cấu trúc nhiễm sắc thể hoàn toàn có tính qui ước, phụ thuộc vào tính khách quan của các phân tích về tế bào học. Trên cơ sở những phân tích về đột biến gen, có thể định nghĩa khái quát đột biến gen là những biến đổi đột ngột xẩy ra trong cấu trúc phân tử của gen, làm thay đổi số lượng, thành phần, trình tự phân bố các nucleotide
  48. tạo nên những alen mới, thay đổi khả năng biểu hiện của tính trạng. Đột biến gen khác với đột biến nhiễm sắc thể ở các điểm sau: - Đột biến gen xẩy ra ở cấp độ phân tử, có khả năng xẩy ra theo hướng ngược lại. 115 - Đa số là đột biến nhỏ nên khó phát hiện bằng những quan sát tế bào học, còn sai hình nhiễm sắc thể có thể phát hiện bằng phương pháp phân tích tế bào và nhiều đột biến có thể phát hiện qua kiểu hình. 6.2 Phân loại và cơ chế đột biến gen. Đột biến gen là hình thức biến đổi vật chất di truyền ở cấp độ phân tử thường gây ra các dạng: đảo vị trí các nucleotide, thêm nucleotide, mất cặp nucleotide. Xét về mặt nguồn gốc có thể chia đột biến gen thành 2 loại: các đột biến tự phát và đột biến nhân tạo hay còn gọi là đột biến cảm ứng. Loại thứ nhất xẩy ra trong tế bào do sai sót trong quá trình tái bản, như hiện tượng hỗ biến dẫn tới kết cặp sai hoặc do các gen đột biến hoặc do các vùng dẽ bị đột biến trong phân tử DNA, người ta gọi các vùng dễ bị đột biến là các “điểm nóng”, tại các điểm này thường chứa nhiều AT, cũng có thể do bị tổn thương dưới ảnh hưởng
  49. của điều kiện môi trường. Nếu dựa vào các biến đổi trong cấu trúc của gen ở từng nucleotide riêng rẽ thì có thể chia ra đột biến thay thế và đột biến dịch khung. 6.2.1. Các đột biến thay thế cặp base nitơ. Có 2 kiểu thay thế, đó là đồng hoán và dị hoán. - Đồng hoán: là dạng đột biến, trong đó 1 base purine này được thay bằng 1 base purine khác (AT được thay bằng GC; GC được thay bằng AT) hoặc 1 base pyrimidine này được thay bằng 1 base pyrimidine khác (TA được thay bằng CG; CG được thay bằng TA). - Dị hoán: là dạng đột biến trong đó 1 base purine được thay bằng 1 base pyrimidine hoặc ngược lại (AT được thay bằng CG; AT được thay bằng TA) A = T T = A Dị hoán Đồng hoán C = G G = C Các hiện tượng đồng hoán tự phát có thể xẩy ra trong khi tái bản DNA do hiện tượng hổ biến, do sự thay đổi vị trí của 1 nguyên tử hydro của 1 base kéo theo sự thay đổi đặc tính hình thành liên kết hydro bình thường giữa A và T, giữa G và C. Hậu quả của sự biến đổi dẫn tới sự kết
  50. 116 cặp nhầm giữa các base, do đó trong những lần tái sinh tiếp theo sẽ tạo ra các thể đột biến đồng hoán tương ứng. 6.2.2 Các dạng đột biến dịch khung. Là dạng mất hoặc thêm một cặp base nitơ trên phân tử DNA khi kết thúc tái bản ở 1 DNA con nào đó. Điều này sẽ dẫn đến dịch khung dọc, dẫn tới hậu quả sản phẩm protein tạo ra thay đổi về kích thước, cấu trúc nên không thực hiện được chức năng sinh học. 6.3 Một số ví dụ về đột biến gen. 6.3.1 Đột biến nhầm nghĩa. Đây là dạng đột biến do thay thế 1 base nitơ nào đó trong gen dẫn tới hình thành 1 codon mới, thay đổi thành phần, trình tự phân bố các nucleotide trong codon, dẫn tới codon đó mã hóa 1 axit amin khác. Hậu quả của đột biến này phụ thuộc vào vị trí và tính chất của axit amin bị biến đổi trên mạch polypeptide. Ví dụ, các đột biến thay thế nhầm nghĩa thường gặp ở chuỗi của hemoglobin ở người. Đột biến này là do thay đổi codon trong RNA tổng hợp hemoglobin từ GAA biến thành GUA dẫn tới axit amin vị trí thứ 6 là glutamic được thay bằng valine (HbA trở thành HbS). Đột biến HbC do cấu trúc codon GAA đổi thành AAA và glutamic được thay bằng lysine. Tương tự đột biến HbE là
  51. do codon GAA mã hóa glutamic ở vị trí 26 được đổi thành AAA mã hóa cho lysine. 6.3.2 Đột biến vô nghĩa. Do thay thế 1 base nitơ này bằng 1 base nitơ khác trong gen cấu trúc, hình thành một codon kết thúc thay cho codon có nghĩa trước đây, dẫn tới mạch polypeptide được tổng hợp bị ngắn lại, làm mất hoạt tính sinh học. Trường hợp đột biến làm thay đổi codon kết thúc thành codon có nghĩa dẫn tới chuỗi polypeptide được tổng hợp sẽ dài ra. 6.3.3 Đột biến dịch khung. Là dạng đột biến do mất hoặc thêm 1 base nitơ trong cấu trúc của gen dẫn tới khung dọc các mã di truyền thay đổi. Hậu quả dẫn tới biến đổi thành phần, trình tự axit amin trong phân tử protein được tổng hợp. 6.4 Các kiểu hình của đột biến gen. 6.4.1 Tính chất biểu hiện kiểu hình của đột biến gen. 117 Kiểu hình của đột biến gen rất đa dạng, vì mối gen có thể đột biến ở nhiều mức độ khác nhau tạo nhiều kiểu hình khác nhau. Nếu đột biến xẩy ra trong giảm phân, thường xẩy ra ở tế bào sinh dục, qua thụ tinh sẽ tồn tại ở hợp tử. Các đột biến trội sẽ xuất hiện ngay trên kiểu hình các cá thể
  52. mang đột biến đó. Các đột biến lặn đi vào hợp tử, tồn tại ở trạng thái dị hợp, rồi qua giao phối lan truyền chậm chạp trong quần thể, trải qua một số thế hệ được nhân lên và có điều kiện gặp gỡ nhau trong giao phối, lúc đó kiểu hình đột biến lặn xuất hiện. Đột biến xuất hiện với tần số rất thấp, nếu tính trên từng gen riêng rẽ chỉ vào khoảng 10-6 - 10-4. Ở một loài dễ đột biến, tần số đột biến có thể lên tới 10-2. Đại bộ phận các gen đột biến thường có hại, làm phá vỡ tình hài hòa của kiểu gen, tuy nhiên xét cho cùng tính lợi hại của đột biến gen chỉ là tương đối, trong điều kiện này có hại nhưng chuyển sang điều kiện khác lại là kiểu hình có lợi. Nếu đột biến chỉ xẩy ra ở những lần nguyên phân đầu tiên của hợp tử trong giai đoạn 2-8 phôi bào sẽ tạo nên đột biến tiền phôi, có khả năng đi vào các giao tử, di truyền và biểu hiện kiểu hình đột biến ở thế hệ sau qua sinh sản hữu tính. Nếu xẩy ra trong nguyên phân sẽ tồn tại ở tế bào sinh dưỡng (soma) tạo nên đột biến soma, rồi nhân lên trong một mô. Nếu là đột biến trội sẽ biểu hiện ở một phần cơ thể tạo nên thể khảm. Đột biến soma có thể được nhân lên bằng sinh sản sinh dưỡng, không di truyền qua sinh sản hữu tính. 6.4.2 Một số kiểu hình của đột biến gen. - Đột biến hình
  53. thái. Đó là các đột biến có sự thay đổi hình dạng, màu sắc, kích thước cơ thể. Ví dụ, đột biến thân thấp, hạt thóc râu dài, bẹ lá tím ở một số giống lúa được xử lý bằng tia gama, hóa chất ở hạt nẩy mầm. Đột biến bạch tạng ở người và động vật do đột biến lặn của gen qui định tạo thành sắc tố trong da (melanine), người bạch tạng có da, tóc trắng. - Đột biến gây chết. Loại đột biến này thường xẩy ra ở những gen thiết yếu. Các cơ thể đơn bội mang gen gây chết thì chết tức thì. Các đột biến gây chết thường là đột biến lặn., chỉ có tác dụng gây chết ở những cá thể đồng hợp lặn, cá thể dị hợp mang gen gây chết thì cơ thể vẫn sống. Khi các cá thể dị hợp giao phối với nhau, xuất hiện 1 số cá thể đời con đồng hợp lặn, mới biểu hiện gây chết. 118 - Đột biến dinh dưỡng. Là loại đột biến mà cơ thể chỉ phát triển trong môi trường có chất dinh dưỡng bổ sung mà ở kiểu hình hoang dại (không đột biến) không cần chất đó. Các đột biến dinh dưỡng chủ yếu được phát hiện ở các vi sinh vật như E. coli, sacharomyces cerevisae, nấm neurosphora Các thể hoang dại mọc được trên môi trường
  54. tối thiểu được gọi là cơ thể nguyên dưỡng. Các thể này có khả năng sử dụng các chất đơn giản trong môi trường tối thiểu để chuyển hóa thành các chất cần thiết cho tế bào như amino acid, nucleic Các cơ thể mang đột biến dinh dưỡng hay còn gọi là đột biến khuyết dưỡng không mọc được trên môi trường tối thiểu, chỉ mọc được trên môi trường có đủ các chất cần thiết. - Đột biến có điều kiện. Dạng đột biến này chỉ tác động lên cơ thể mang nó trong điều kiện nhất định. Loại đột biến này thường là đột biến cảm ứng với nhiệt độ. Kiểu hoang dại sinh trưởng tốt trong điều kiện nhiệt độ cao hoặc thấp. Các thể đột biến hoàn toàn không mọc được trong điều kiện nhiệt độ khác nhau. 7. Di truyền học Hemoglobin với công tác giống gia súc. 7.1 Cấu trúc, chức năng di truyền của Hemoglobin. Hemoglobin ở người và động vật có chức năng chủ yếu là vận chuyển oxy. Chức năng của hemoglobin đã được phát triển qua sự tiến hóa, chủ yếu qua các bước phát triển cao của sắc tố hô hấp để hình thành hemoglobin, sau đó là bước định khu hemoglobin trong các tế bào biệt hóa, đó là hồng cầu. Hemoglobin có trọng lượng phân tử khoảng 66.700 (người), bao gồm 4 nhóm hem, chứa sắt, gắn với 4 chuỗi
  55. globin là phần protein của phân tử hemoglobin. Bốn chuỗi globin gồm 2 nhị hợp, tức là các protein dưới dạng 2 cặp chuỗi và 2 cặp chuỗi (ở người trưởng thành). Chuỗi polypeptit gồm 141 axit amin, chuỗi gồm 146 axit amin và đều có trọng lượng phân tử khoảng 1700. Mỗi chuỗi polypeptit liên kết với 1 nhóm hem tạo thành monomer (đơn phân), cả đại phân tử gồm 4 monomer, tạo thành tetramer. Hem là vòng pocfirin có nguyên tử sắt ở giữa. Cấu trúc của hem không biến đổi, giống nhau ở mọi phân tử hemoglobin. 119 Vì vậy, trong nghiên cứu di truyền học hemoglobin, người ta chỉ đề cập tới các hiện tượng liên quan đến phần protein của đại phân tử hemoglobin, tức là globin. Bằng phương pháp sắc ký kết hợp các phân tích khác, người ta đã phát hiện bản chất di truyền các rối loạn trong chức năng hoạt động bình thường của hemoglobin ở người. Một loại bệnh di truyền do đột biến gen được phát hiện về hemoglobin dị dạng, bệnh hồng cầu hình lưỡi liềm (HbS). Loại hồng cầu này không hoàn chỉnh, dễ bị phân hủy dẫn đến bệnh thiếu
  56. máu. Trong thực tế, những người đồng hợp về gen đột biến thường bị chết khi sinh ra hoặc từ 3 tháng đến 2 tuổi. 7.2 Đa hình di truyền hemoglobin và ứng dụng trong công tác giống gia súc. Cấu trúc phân tử các dạng hemoglobin khác nhau, với thành phần các chuỗi polypeptit đa dạng, khác nhau là cơ sở khách quan của hiện tượng đa hình di truyền hemoglobin. Hiện tượng đa hình di truyền hemoglobin phát sinh trước hết là do đột biến, chọn lọc tự nhiên trong quần thể, còn do chọn lọc nhân tạo trong đó có vai trò của dịch gen, tức là sự phân bố đột biến trong quần thể dưới ảnh hưởng của các quá trình di truyền tự động, hình thành các động thái tần số gen khác nhau. Trên đối tượng bò, phân tích đa hình di truyền hemoglobin đã cho phép xác định các sai khác giữa các giống bò. Người ta đã xác định rằng, kiểu hemoglobin và tần số gen hemoglobin là đặc trưng cho các giống gia súc, có thể sử dụng để tìm hiểu nguồn gốc gia súc, mối quan hệ di truyền giữa các giống, mối quan hệ với các tính trạng năng suất Các số liệu thực nghiệm ở nhiều nước trên thế giới và ở Việt Nam đều thừa nhận, kiểu hemoglobin ở gia súc (bò, lợn ) là tính trạng di truyền ổn định. Tính trạng này có bản chất di truyền, không phụ
  57. thuộc vào thức ăn, điều kiện chăm sóc, nuôi dưỡng, khí hậu được di truyền theo qui luật Mendel, từ đó có thể qua genotype, qua biểu hiện của tính trạng này, mà đánh giá, xác định phẩm giống vật nuôi. 8. Di truyền miễn kháng. 8.1 Khái niệm. 120 Miễn dịch học (Immunology), khoa học nghiên cứu các phản ứng miễn nhiễm. Các kỹ thuật miễn dịch học được ứng dụng có hiệu quả trong nhiều lĩnh vực sinh học và y dược học. Phản ứng miễn dịch ở các động vật bậc cao đựơc thực hiện do hệ thống phức tạp trong đó có sự tương tác của các tế bào và phân tử đặc hiệu (specific) và không đặc hiệu (non-specific) bảo vệ cơ thể, chống lại các tác nhân gây nhiễm. Sự miễn dịch cơ thể thu được ngay trong giai đoạn phát triển phôi thai bằng con đường truyền kháng nguyên (miễn dịch chủ động) từ cơ thể mẹ qua nhau thai vào cơ thể con. Ngoài ra động vật sơ sinh còn có thể nhận kháng thể từ sữa đầu của mẹ, những miễn dịch này không được di truyền. Nếu mầm bệnh bắt đầu nhiễm từ mẹ sang con, sau đó con thu được miễn dịch chủ động, miễn dịch
  58. này sẽ thay cho miễn dịch chủ động tạm thời của gia súc non và có thể giữ lại trong thời gian dài. Khác nhau cơ bản giữa miễn dịch tập nhiễm và sức đề kháng bẩm sinh là miễn dịch tập nhiễm sẽ bị mất đi còn sức đề kháng bẩm sinh thì được di truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác. 8.2 Kháng nguyên (antigen). Hiện tượng miễn dịch liên quan đến phản ứng giữa kháng nguyên và kháng thể. Kháng nguyên là vật chất mang thông tin di truyền lạ với cơ thể động vật và có khả năng gây ra phản ứng miễn dịch. Kháng nguyên là các chất polymer như: protein, polynucleotide. Kháng nguyên có hai tính chất quan trọng là tính lạ và tính đặc trưng. - Tính lạ là thể hiện sự khác nhau về cấu trúc phân tử và những tính chất hóa học giữa kháng nguyên và protein cơ thể. - Tính đặc trưng là thể hiện ở việc kháng nguyên không chỉ làm xuất hiện kháng thể mà còn có khả năng liên hệ với kháng thể tạo thành phức hệ kháng nguyên – kháng thể, ví dụ: kháng nguyên albumin xâm nhập vào cơ thể thì làm xuất hiện kháng thể anti-albumin. Tính chất của kháng nguyên phụ thuộc vào các yếu tố như thành phần, trình tự các axit amin trong trong phân tử
  59. protein kháng nguyên, cấu trúc bậc I, bậc II, bậc III, bậc IV trong phân tử và cấu trúc qui định thể kháng 121 nguyên. Qui định thể kháng nguyên là các nhóm hóa học nằm trên kháng nguyên. Qua nghiên cứu người ta nhận thấy rằng khi ở bào thai bắt đầu có quá trình tạo máu thì bắt đầu có kháng nguyên. Kháng nguyên không biến đổi không theo thời gian, tuổi tác, giới tính, môi trường và trạng thái sinh lý của cơ thể. Tính di truyền của kháng nguyên được đảm bảo một cách chắc chắn rằng, kháng nguyên có ở cơ thể con thì nhất thiết có ở cơ thể bố hoặc mẹ. Ví dụ: Bố IAIA x mẹ ii Con IAi (nhóm máu O) 8.3 Kháng thể (antibody). Kháng thể là globulin miễn dịch xuất hiện trong máu động vật khi có sự xâm nhập của kháng nguyên, kích thích cơ thể sinh ra và có phản ứng đặc trưng với kháng nguyên. Tính miễn dịch đặc trưng là tính chất đặc trưng của kháng thể, có nghĩa là kháng thể nào sẽ chỉ có phản ứng miễn dịch với kháng nguyên tương ứng. Ví dụ: kháng thể anti-tetanos sẽ chỉ có phản ứng miễn dịch với vi trùng Tetanos. Sự hình kháng thể chịu sự kiểm tra của kiểu di
  60. truyền cơ thể. Các cơ chế miễn dịch không đặc hiệu hình thành hàng rào bảo vệ đầu tiên chống lại các vi sinh vật gây bệnh. Nhờ đó sự miễn nhiễm đặc hiệu có đủ thời gian để hình thành. Các sản phẩm của hệ thống miễn nhiễm đặc hiệu của động vật có vú tác động chủ yếu bằng sự kích thích các tế bào hành động không đặc hiệu. Các tương tác phức tạp có thể tổng kết như sau: Macrophage tác động với tư cách các tế bào trình diện kháng nguyên (antigen- presenting cell) đối với các lymphocyte T hổ trợ đặc hiệu. Các macrophage này tạo ra IL-1 (interkeuline-1) kích thích sự hoạt hóa của tế bào TH. Các tế bào T được kích thích bởi kháng nguyên sản sinh ra IFN(interferon ), mà IFNlại làm tăng hoạt tính của macrophage và tế bào sát thủ tự nhiên NK (natural killer cell). Thêm vào đó, các tế bào TH sản sinh ra IL-2 làm tăng hoạt tính của các tế bào NK và IL-3, mà nó lại làm tăng số lượng của các thực bào (phagocytic cells) trong máu và làm tăng số lượng cũng như hoạt tính của 122
  61. các tế bào mỡ trong mô. Tế bào helper T cũng sản sinh ra IL-4 và IL-5 để tăng số lượng và hoạt tính của các tế bào mỡ và eosinophil tương ứng. Các hoạt tính nêu trên có vai trò quan trọng trong sự miễn nhiễm chống lại các dạng ký sinh đa bào. Các immunoglobin IgC và IgM được hoạt hóa bổ sung nhau và kích thích thực bào (phagocytosis). Hình 53. Sơ đồ cấu trúc của phân tử IgG H- Mạch nặng; L- Mạch nhẹ; C- Cố định (constant); Fab- Vùng kháng thể đặc hiệu; V- Biến đổi (variable) Các kháng thể (antibody), hay immunoglobulin (Ig), là các glucoprotein dược tìm thấy trong huyết thanh, trong các chất được tiết ra như nước bọt, nước mắt và dịch tiêu hóa. Phần lớn các phân tử kháng thể được tìm thấy ở phần globulin của huyết thanh (serum). Các nhóm immunoglobulin gồm: IgM, IgG, IgA, IgE, IgD, chúng khác nhau về cấu trúc, sự phân bố và đặc tính sinh học. IgA quan trọng hơn vì là kháng thể được tiết ra bảo vệ bề mặt bên ngoài của cơ thể. IgG và IgM có nhiều trong máu, thực hiện chức năng bảo vệ thể dịch chống vi khuẩn. Các kháng thể được tiết ra từ các tế bào bắt nguồn từ lymphocyte B, hình thành qua chọn lọc dòng dưới tác động
  62. đặc hiệu của xác định thể kháng nguyên (antigenic determinant). Tất cả các phân tử kháng thể đặc hiệu được sản sinh ra do một loại tế bào plasma đặc hiệu. Sự đặc hiệu của kháng thể do trình tự các gốc axit amin của vùng Fab độc nhất cho mỗi kháng thể. Mặt khác, tất cả các phân tử IgG gây nên sự loại bỏ các immunogen bằng một số cách hạn chế sau khi gắn vào chúng. Như vậy, 123 phân tử kháng thể có 2 phần: phần giống và phần khác với các phân tử kháng thể tạo ở tế bào khác. Tất cả các loại kháng thể cũng có cấu trúc cơ bản theo mô hình 4 mạch như IgG mặc dầu có nhiều điểm khác nhau ở mạch nặng, mạch nhẹ và mức độ glycosil hóa. 8.4 Cơ sở di truyền của sinh tổng hợp kháng thể. - Thuyết khuôn: các tác giả Sauder, Pauling và Bernet cho rằng, kháng nguyên tham gia trực tiếp vào sự hình thành polypeptid kháng thể. Có nghĩa là việc tổng hợp mạch polypeptid phải dựa trên khuôn kháng nguyên và dựa vào cấu trúc bậc I, bậc II của kháng nguyên. Tác giả cho rằng, cấu trúc bậc I của kháng thể dựa vào khuôn kháng nguyên nên khi khuôn thay đổi
  63. thì sự sắp xếp các axit amin của kháng thể thay đổi. Như vậy là mỗi một kháng nguyên sẽ là một khuôn cho một kháng thể tương ứng. Các tác giả còn giải thích rằng, kháng nguyên liên kết mRNA và ribosome để tạo thành phức hệ Kháng nguyên-mRNA-Ribosome, tạo thành qui định thể kháng nguyên. Bằng chứng cho giả thuyết này là kháng nguyên tồn tại trong suốt thời gian tổng hợp kháng thể và người ta tìm thấy phức hệ trên. - Thuyết tiền định di truyền: tác giả Erphlis cho rằng, các thông tin di truyền về trung tâm hoạt tính của kháng thể đã có sẵn trước khi kháng nguyên xâm nhập vào và có thể có hai khả năng xẩy ra: + Khả năng thứ nhất là có thể tồn tại một nhóm tế bào có khả năng tổng hợp kháng thể, còn thông tin của kháng nguyên được thu nhận từ một dòng tế bào khác. + Khả năng thứ hai là tế bào của cơ thể là đa tiềm năng về di truyền, tức là có đủ tất cả thông tin di truyền để tổng hợp mọi loại kháng thể, còn kháng nguyên chỉ có tác dụng là tác nhân kích thích cảm ứng ở gen tổng hợp kháng thể hoạt động. - Quan điểm di truyền học hiện đại: tế bào cơ thể động vật là đa tiềm năng về di truyền và có đủ thông tin để tổng hợp tất cả mọi loại kháng thể. Khi có kháng nguyên xâm nhập vào,
  64. thông tin kháng nguyên sẽ kích thích hoạt động của gen điều chỉnh. Các gen điều chỉnh nhận được tín hiệu kích thích sẽ tổng hợp nên các protein-enzym và các protein- enzym này sẽ tác động vào các gen cấu trúc tương ứng, chuyển các gen này sang trạng thái hoạt động để tổng hợp nên các kháng thể có khả năng gây phản ứng miễn dịch với kháng nguyên tương ứng. 124 8.2 Di truyền sức kháng bệnh ở vật nuôi. 8.2.1 Định nghĩa. Sức đề kháng bệnh là khả năng không cảm nhiễm bệnh và khả năng không mắc bệnh của cơ thể. Sức đề kháng bệnh có thể do bẩm sinh hoặc tập nhiễm. Sức đề kháng phụ thuộc vào các loài động vật. Một số loài động vật không bị cảm nhiễm đối với một số bệnh, trong khi một số loài khác lại rất dễ mắc bệnh đó. Động vật máu lạnh không bị lây nhiễm những bệnh truyền nhiễm của động vật máu nóng. Trâu, bò không cảm nhiễm những bệnh chảy nước mũi, thiếu máu truyền nhiễm ở ngựa, nhưng tất cả động vật thuộc bộ móng guốc, ngón chẵn đều cảm nhiễm đối với bệnh lở mồm, long móng. Tính cảm nhiễm của động vật
  65. còn phụ thuộc vào cơ thể động vật. Trong cùng một đàn gia súc xẩy ra dịch bệnh vẫn có những con không bị bệnh. Sức đề kháng còn liên quan đến khả năng thích nghi với điều kiện sống của động vật. Ví dụ, gia súc vùng nhiệt đới không có sức đề kháng cao đối với những bệnh do nguyên sinh động vật và những bệnh truyền nhiễm địa phương so với các gia súc vùng ôn đới. Gia súc vùng ôn đới thì khả năng đề kháng đối với các bệnh ngoài da, vi sinh vật đường máu, cầu trùng kém hơn so với gia súc vùng nhiệt đới. Di truyền sức kháng bệnh ở vật nuôi là một vấn đề rất phức tạp mà cho đến nay vẫn chưa được sáng tỏ. Có nhiều trường hợp khả năng kháng một bệnh cụ thể được xác định là đơn gen, song nhiều trường hợp lại do nhiều gen kiểm soát. Sức đề kháng với bệnh được hiểu theo nghĩa rộng là tính không cảm nhiễm với bệnh của gia súc cũng như khả năng chống chịu với các yếu tố bất lợi của môi trường. Khi theo dõi một đàn gà bị bệnh New castle, bị bệnh bạch cầu hay một bệnh nào khác đều có thể thấy rằng trong lúc đối với những con này bệnh có tác động gây chết thì những con khác bệnh lại hoàn toàn vô hại (vẫn sinh trưởng, phát triển bình thường). Con bò này bị bệnh viêm vú nhưng con khác
  66. vẫn bình thường. Nhiều biến dị di truyền đối với sức kháng bệnh và các vật ký sinh ở vật nuôi, có thể kết luận rằng biến dị di truyền này là có ở hầu hết các vật nuôi. 8.2.1 Sức đề kháng bệnh ở đại gia súc. 125 Người ta đã phát hiện trường hợp có sức đề kháng cao đối với bệnh viêm vú ở dòng gia súc cho sữa. Các nghiên cứu của Legate, Grinells (1952) đã xác nhận rằng, bò cái có sức đề kháng cho ra những bê cái mẫn cảm với bệnh viêm vú ít hơn 33% so với bò cái không có sức đề kháng. Những sai khác này xuất hiện do kết quả chọn lọc hàng loạt, chỉ tiến hành một thế hệ và chỉ theo con mẹ mà không tính đến các ảnh hưởng di truyền của bố đối với bê cái về tính mẫn cảm đối với bệnh này. Những kết quả trên đã dẫn đến lần đầu tiên chọn giống theo sức đề kháng với viêm vú. Mặt khác còn chứng minh rằng, chọn lọc cũng đã làm giảm được tính mẫn cảm với bệnh viêm vú hơn bất kỳ một tổ hợp nào của các biện pháp thú y, phòng bệnh. Sức đề kháng bệnh viêm vú cũng có liên quan đến việc chọn lọc đực giống. Reid (1954) đã phát hiện ra trong số bê Jersey là con gái của một
  67. số đực giống trong đàn bò của Trường Đại học Tổng hợp Penxinvania, bệnh viêm vú được phát hiện trên 14% trường hợp và trong số con gái của một đực giống là 55% các trường hợp. Tác giả cũng nhấn mạnh rằng, bên cạnh các đặc điểm mang tính chất di truyền thì các biện pháp phòng bệnh để nâng cao phẩm chất sữa cũng cần thiết. Các yếu tố như: chuồng bẩn, thiếu đệm lót, thời tiết ẩm và các điều kiện không thuận lợi khác cũng làm tăng tính mẫn cảm đối với bệnh viêm vú ở gia súc cho sữa. Bảng 6. Mối quan hệ giữa sức đề kháng bệnh viêm vú ở mẹ và con Tác giả và Số đàn Mẹ mẫn Mẹ có sức Mức giảm địa điểm nghiên cảm với đề kháng tỷ lệ mẫn nghiên cứu cứu bệnh với bệnh cảm ở thế viêm vú viêm vú S hệ con của Số con ố Con gái bò cái có gái lượng lượng mẫn sức đề mẫn cảm cảm kháng (%) Ward 20 86 54,4 109 56,0 38 (Kentecbe)
  68. Ward 15 128 81,3 171 54,4 33 (Manavat) Legate & 11 114 53,0 82 35,0 34 Grinell (Bắc crolina) 8.2.2 Sức đề kháng di truyền đối với lợn 126 Tính mẫn cảm của lợn đối với các bệnh có sự khác nhau về bản chất. Khi xẩy ra dịch lợn, ta thấy có nhiều con không mắc bệnh, mặc dù chúng có tiếp xúc với con bệnh và mức độ mắc bệnh ở từng con có khác nhau. Có thể quan sát thấy hiện tượng tương tự ở các bệnh không truyền nhiễm (chứng cảm lạnh, bệnh đường tiêu hóa, bệnh ký sinh trùng ). Người ta đã bỏ nhiều công sức để nghiên cứu chọn lọc các dòng đề kháng bệnh và thu được một số kết quả. Kết quả nghiên cứu của các tác giả Mỹ và Canada cho thấy, lợn bị viêm mũi thường giảm tăng trọng so với những con khỏe. Trong quá trình chọn lọc theo hướng nâng cao sức đề
  69. kháng đối với bệnh viêm mũi người ta đã tạo được giống lợn Lakomb. Người ta cũng đã có thông báo về việc tạo các dòng lợn có sức đề kháng đối với bệnh viêm phế quản (Bronchoppneumonia), tạo ra các dòng lợn có khả năng kháng bệnh viêm vú, bệnh bạch cầu tăng . Người ta đã biết rằng, nguyên nhân chủ yếu của bệnh ỉa chảy ở lợn con là do các chủng E. coli có kháng nguyên bề mặt tế bào được gọi là K.88. Nhưng không phải tất cả lợn con đều dễ nhiễm E. coli K.88. Đặc biệt chỉ những con có thụ quan (receptor) K.88 ở trên thành ruột là mẫn, còn những con không có thụ quan là kháng. Người ta cũng đã xác định được rằng, sự có mặt hay vắng mặt của thụ quan K.88 được xác định bởi 2 alen thuộc cùng 1 locus trên nhiễm sắc thể thường. Alen xác định sự có mặt của thụ quan là trội hoàn toàn so với alen xác định sự vắng mặt của thụ quan này (Gibbons et al 1977). 8 2.3 Sức đề kháng di truyền đối với các bệnh ở gia cầm. Gà mái bị bệnh ỉa phân trắng do Salmonella pullorum thường truyền vi khuẩn này cho gà con qua lòng đỏ trứng. Những gà con bị bệnh bằng con đường này có thể chết hoặc sống sót được tùy thuộc vào việc chúng có gen mẫn hay kháng và phụ thuộc vào điều
  70. kiện môi trường. Mặt khác gà con bị bệnh cũng còn được truyền qua phân của những gà khác. Các giống gà khác nhau có sức kháng tự nhiên với bệnh này ở các mức khác nhau. Ở các giống gà như Rode Island đỏ hay Plymouth, tính mẫn cảm với bệnh cao hơn ở gà Leghorn trắng từ 3-5 lần. Kết quả lai giữa dòng kháng và mẫn đã chứng minh rằng, sức kháng bệnh ỉa phân trắng ở gà không phải là kết quả của hiện tượng miễn dịch thụ động mà do gen qui định. 127 Robert và Card (1935) đã chứng được rằng, có thể nâng cao sức đề kháng tự nhiên của gà Leghorn trắng đối với bệnh ỉa phân trắng do vi khuẩn bằng cách chọn giống thích hợp. Tác giả đã truyền qua miệng tất cả những gà con thí nghiệm bằng tác nhân gây bệnh ỉa phân trắng. Bằng cách ấy thì phần lớn gà con đều bị nhiễm tự nhiên bệnh này. Trong hai đàn gà Leghorn trắng được chọn giống thưeo sức đề kháng bệnh ỉa phân trắng trong 4 năm liền, thu được tỷ lệ gà sống sót sau tiêm truyền là 61-70%. Trong khi đó, nhóm gà đối chứng không được tiến hành chọn giống như trên thì tỷ lệ gà con sống sót sau nhiễm bệnh (cũng bằng
  71. một liều như trên) chỉ còn 28%. Một dòng thứ ba được chọn giống trong thời gian suốt 9 năm liền, thu được tỷ lệ gà sống sót sau khi tiêm trưyền cùng liều là 74%. Kết quả khác nhau giữa các dòng có sức đề kháng cao và không có sức đề kháng đã chứng minh được sức đề kháng cao của dòng thứ nhất không phải là kết quả của một hiện tượng miễn dịch thụ động nào cả (truyền từ mẹ sang gà con thông qua trứng). Sức đề kháng cao đối với bệnh ỉa phân trắng được truyền lại cho đời sau là do gà mái và gà trống thuộc dòng có sức đề kháng. Từ đó có thể tin chắc rằng, sức đề kháng cao với bệnh ỉa phân trắng do vi khuẩn ở gà là do gen qui định. Kết quả nghiên cứu của các tác giả còn cho thấy, ảnh hưởng của môi trường đối với sự di truyền sức kháng bệnh. Gà con mới nở yêu cầu nhiệt độ chuồng nuôi là 35oC. Một số gà có sức đề kháng với Salmonella pullorum sẽ chết, nếu nuôi ở nhiệt độ 30oC. Mặt khác, nhiều gà con mẫn cảm với bệnh ỉa phân trắng do vi khuẩn ở nhiệt độ 35oC lại trở nên có sức đề kháng, nếu tăng nhiệt độ chuồng nuôi lên 40oC. 8.2.3 Sức đề kháng đối với nội ký sinh.
  72. Steward và cộng sự thuộc Trường Đại học Caliphonia đã tiến hành nghiên cứu sức đề kháng đối với sự nhiễm giun Ostertagia circumcinta ở cừu non thuộc giống Romni-Mac và cừu non thuộc giống khác, bao gồm từng nhóim 4 con một. Tất cả đều được nuôi trong cùng một đàn. Người ta đã xác định được mức độ nhiễm giun ở một số cừu non. Qua theo dõi, các tác giả nhận thấy, cừu Romni-Mac về chỉ tiêu này thấp hơn so với cừu thuộc giống khác. Điều này chứng tỏ, giống Romni-Mac có sức đề kháng cao với giun. Warick và cộng tác viên đã tiến hành chọn giống dê theo sức đề kháng chống lại giun tròn (Haemonchus contortus). Khi cho lai hai kiểu khác nhau giữa những dê đực có sức đề kháng đối với giun ký sinh với những dê cái không được chọn lọc, các tác giả đã thu được kết quả sau. 128 Bảng 7. Kết quả thí nghiệm về sức đề kháng đối với giun ký sinh ở dê. Thí nghiệm Đối chứng
  73. Dê đực có sức đề kháng x Dê cái không được chọn 71 33 lọc Dê đực có khả năng đề kháng x Những con gái 83 31 chưa được kiểm tra của mẹ có sức đề kháng Tác giả Rozenbe đã tạo được dòng gà có sức đề kháng cao đối với cầu trùng Coccidium bằng cách chọn giống qua nhiều thế hệ. Kết quả lai giữa các dòng có sức đề kháng cao với các dòng chưa chọn lọc cho thấy, sức đề kháng của gà đối với Coccidium, cũng như sức đề kháng đối với các bệnh khác có sự di truyền trung gian. 8.2.4 Sức đề kháng đối với ngoại ký sinh trùng. Giữa các động vật tồn tại những sai khác di truyền về sức kháng bệnh không chỉ đối với ký sinh trùng bên trong mà cả đối với ngoại ký sinh trùng. Sức đề kháng đối với các ký sinh trùng hút máu có ý nghĩa quan trọng đối với nhiều nước trên thế giới, mà sâu bọ, ve bét là vật môi giới truyền các loại sinh vật gây bệnh. Trong các bệnh bị lây nhiễm
  74. qua vật chủ trung gian, đặc thù là bệnh sốt vàng da fevrisflava, bệnh sốt rét cơn ở người. Các nghiên cứu ở những nước thuộc các vùng khác nhau trên thế giới, người ta đã xác định được rằng, bò Zebu có sức đề kháng cao đối với bọ bét và do đó cũng có sức đề kháng cao đối với bệnh do bọ bét truyền cao hơn các giống gia súc có sừng thuộc nguồn gốc Châu Âu. Bonsma nghiên cứu bệnh tràn dịch tim, gây nên do Richeketsia và được truyền qua bọ bét Ambliomma hebracium. Kết quả cho thấy, có sự sai khác giữa bò Zebu và bò Châu Âu về sức đề kháng với bệnh tràn dịch tim và đồng thời có sự sai khác thời gian sống của những bò bị bệnh. Các nghiên cứu cũng cho thấy, bò lai F1 do giao phối giữa bò Châu Âu với các giống bò Zebu khác cũng thể hiện tính trội thuộc về bố, mẹ có sức đề kháng cao. Người ta đã thừa nhận rằng, ưu thế lai này của giống bò Zebu là do khả năng bẩm sinh. Bonsma đã tính được số lượng ve bét trên ba vùng khác nhau trên cơ thể giống bò Châu Âu cao hơn bò Zebu là 2,2; 2,9 và 7,5 lần. Từ lâu, người ta biết rằng bò Bos indicus kháng ve tốt hơn bò Bos taurus được nuôi trong những điều kiện giống nhau. Các con lai giữa bò Brahman với bò Anh và giữa bò
  75. Africander với bò Anh chỉ nhiễm khoảng 40% số ve mà các giống bò Anh bị nhiễm (Seifert, 1971). 129 Cùng với biến dị giữa các giống, còn có biến dị di truyền về sức kháng ve ở trong cả hai giống Bos indicus và Bos taurus cũng như các con lai giữa chúng, hệ số di truyền này rất cao (80%). Điều này chỉ ra rằng, chọn lọc trong quần thể sẽ rất có hiệu quả. Bảng 8. Tỷ lệ mắc bệnh tràn dịch tim ở bê trước 30 tháng tuổi trong thí nghiệm của Bonsma (1944) tại trại Transvaal. Giống Số bê Tỷ lệ loại Tuổi trung được sinh thải (%) bình của bê bị ra bệnh Bò Zebu thuần 246 5,3 11 chủng Bò ¾ máu Zebu 86 7,0 8 và ¼ máu Châu Âu
  76. Bò ½ máu Zebu 397 10,2 6 và ½ máu Châu Âu Bò thuần chủng 28 60,7 5 Châu Âu 9. Kỹ thuật di truyền. Kỹ thuật tái tổ hợp DNA thường được gọi là kỹ thuật di truyền, bao gồm một tập hợp gồm nhiều kỹ thuật, trong đó vai trò hàng đầu thuộc về các tư duy và phương pháp của di truyền vi sinh vật, sinh học phân tử, hóa học của axit nucleic. Về hình thức, kỹ thuật di truyền được ra đời vào năm 1972-1973, khi nhóm nghiên cứu của Berg, Boyer và Cohen ở Mỹ đã tạo nên phân tử DNA tái tổ hợp invitro từ ba nguồn nguyên liệu khác nhau: nguyên bộ gen của virus SV40 gây ung thư ở khỉ, một phần bộ gen của phage trung hòa và các gen của operon lactose của vi khuẩn E. coli. Vào năm 1973-1974 nhóm Cohen, Helinski, Boyer lần đầu tiên đã nhận được các sản phẩm có hoạt tính từ DNA tái tổ hợp. Nhóm này đã giải quyết vấn đề lắp ghép và tạo dòng DNA. Sau đó nhiều nhà khoa học
  77. đã lao vào các thí nghiệm lắp ghép gen và nhanh chóng thu được các kết quả có ứng dụng thực tiễn. Kỹ thuật di truyền được thực hiện qua nhiều công đoạn phức tạp và tinh vi, có thể nói là một công nghệ. Từ đó thuật ngữ công nghệ sinh học (biotechnology) ra đời. 9.1 Các enzyme hạn chế. Vào năm 1962, V. Arber lần đầu tiên chứng minh rằng có những enzyme đặc biệt hoạt động trong tế bào vi khuẩn, chúng có khả năng phân biệt DNA “của mình” với DNA “lạ” của phage. Các enzyme này “hạn 130 chế” khả năng sinh sản của phage trong tế bào vi khuẩn bằng cách phân hủy chúng một cách đặc hiệu, do đó được gọi là enzyme hạn chế. Các enzyme phân cắt DNA được gọi là nuclease, gồm 2 loại: exonuclease và endonuclease. Exonuclease cắt DNA từ hai đầu mút còn endonuclease cắt DNA ở giữa phân tử. Các enzyme hạn chế cắt phân tử DNA ở giữa một cách đặc hiệu nên được gọi là endonuclease hạn chế (restriction). Vào năm 1970, H. Smith và các cộng sự đã tách được restriction endonuclease đầu tiên từ vi khuẩn Haemophilus influenzae được gọi là
  78. HinII. Ngay sau đó không lâu đã xác định được rằng, phần lớn các loài vi khuẩn có hệ thống chuyên biệt hạn chế biến đổi (restriction-modification system) để bảo vệ tế bào khỏi sự xâm nhập của DNA lạ. Các restriction được chia làm 3 nhóm: các enzyme nhóm II thường được sử dụng trong kỹ thuật di truyền. Các enzyme nhóm II này nhận biết DNA mạch kép ở những trình tự nhận biết và cắt DNA ở ngay trong trình tự này. Các trình tự nhận biết này thường có 4-6 cặp nucleotide đối xứng đảo ngược nhau, được gọi là các palindrom. Mỗi restriction endonuclease có trình tự nhận biết đặc trưng. - Restriction endonuclease E.co RI (từ E.coli)có trình tự nhận biết: E.Coli cắt G A A T T C G A A T T C C T T A A G C T T A A G - Enzyme BamHI (ở vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens) BamHI G G A T C C G G A T C C
  79. C C .T A G G C C T A G G - Enzyme HaeIII (từ vi khuẩn Haemophilus aegyptius) có trình tự: Hac III G G C C G G C C C C G G C C G .G 131 Các enzyme Eco RI và BamHI khi cắt DNA mạch kép tạo ra các đầu lệch “cố kết” hay “dính” vì các base bổ sung dễ bắt cặp để gắn lại với nhau như lúc chưa bị cắt rời. Nếu có 1 đoạn DNA lạ khác cùng bị cắt bởi 1 loại enzyme hạn chế, ví dụ enzyme Eco RI thì nhờ các đầu “cố kết” đoạn DNA lạ, có thể xen vào giữa như sau: Đoạn ADN I Đoạn ADN lạ II G A A T T C. G A A T T C G A A T T C C T T A A G. C T T A A G C T T A A G Eco RI G A A T T C A A T T C G C T T A A G G C T T A A
  80. “Đầu cố kết” “Đầu cố kết” G A A T T C G A A T T C C T T A A G C- T T A A G Đoạn ADN “lạ” xen giữa. Tính chất quan trọng này được dùng để cắt -ghép các gen. Ngày nay có hơn 1200 loại restriction endonuclease đã được phát hiện, chúng có khả năng cắt DNA tổng cộng với hơn 120 trình tự nhận bíết khác nhau. 9.2 Thu nhận gen. Vào năm 1969, Becwitt, Shapiro đã thông báo về công trình tách gen từ operon lactose của E. coli dựa trên cơ sở kết hợp các phương pháp di truyền vi sinh cổ điển với các phương pháp vật lý để tách và lai các phân tử DNA. Có thể thu nhận gen để thực hiện kỹ thuật tái tổ hợp DNA bằng ba phương pháp khác nhau. 9.2.1. Tách các đoạn DNA từ bộ gen. Đây là phương pháp được sử dụng rộng rãi ngay từ buổi đầu của sự phát triển kỹ thuật tái tổ hợp DNA. Toàn bộ DNA của một sinh vật 132 được cắt đoạn nhỏ dài khoảng 15.000 đến 20.000 cặp base bằng lắc cơ học hay bởi các enzyme endonuclease rồi gắn
  81. vào các vector mang gen, tạo plasmid tái tổ hợp. Phương pháp này mang tinh chất mò mẫm, vì nguyên bộ gen hoặc toàn bộ phân tử DNA của các sinh vật khác nhau chứa rất nhiều gen. Tuy nhiên, phương pháp này hiện nay vẫn đang được sử dụng có hiệu quả trong việc lập ngân hàng hay thư viện gen của các sinh vật, được gọi là ngân hàng DNA bộ gen (genomic DNA libraries). 9.2.2 Tổng hợp gen bằng phương pháp hóa học. Năm 1969, Khorana đã thực hiện việc tổng hợp nhân tạo gen. Đó là gen mã hóa việc tổng hợp t.RNA, vận chuyển aminoacid alanine ở nấm men, không có hoạt tính. Về sau cũng chính nhóm trên đã tổng hợp được gen đầu tiên có hoạt tính, đó là gen mã hóa cho chất ức chế t.RNA vận chuyển của thyrosine ở E. coli, có chiều dài khoảng 200 cặp nucleotid. Muốn tổng hợp gen bằng phương pháp hóa học phải biết trình tự nucleotid của gen. Kỹ thuật di truyền đã nhanh chóng đưa các gen được tổng hợp hóa học vào sản xuất. Lần đầu tiên vào năm 1977, K. Itakura và Boyer đã thành công trong việc tổng hợp nhân tạo gen, mã hóa cho việc tổng hợp hormone somatostatin của động vật có vú biểu hiện trong tế bào E. coli. Sau đó các nòi E. coli mang gen tổng hợp hóa học
  82. được tạo ra, chúng sản sinh hormone tăng trưởng ở người và các hormone peptid như: bradikinie, anginotensine, neuropeptid leuencephalin Các tế bào E. coli mang plasmid tái tổ hợp đã tạo ra khoảng 1 triệu phân tử hormone trong tế bào. Polypeptid này đã được thử nghiệm kiểm định ở chuột bị lấy mất tuyến yên, hoàn toàn tương tự hormone tăng trưởng ở người. Phương pháp tổng hợp hóa học gen cũng đựoc sử dụng để tạo nòi vi khuẩn sản sinh ra insulin, hormone quan trọng để chữa bệnh tiểu đường. Gen insulin được tổng hợp ở dạng gồm từ 40 đoạn oligonucleotid, mỗi đoạn căn bản có 6 nucleotid. Các đoạn này được ligase nối lại thành một cấu trúc thống nhất. Các mạch kép polynucleotid có chiều dài 271-286 cặp base được gắn vào plasmid. Plasmid được gắn thêm đoạn gen điều hòa. Tế bào chứa plasmid mang gen insulin tổng hợp ra proinsulin, sau đó được xử lý hóa học để biến thành insulin có hoạt tính. Phân tử insulin cấu tạo gồm 2 mạch A (21 amino acid) và mạch B (30 amino acid). Hai mạch được nối lại với nhau nhờ cầu nối disulfit. 9.2.3 Sự tổng hợp gen từ m.RNA của gen tương ứng.
  83. Phương pháp thu nhận gen bằng cách cắt toàn bộ DNA của một sinh vật có nhiều bất lợi. Thứ nhất, số đoạn DNA được tạo ra có thể rất 133 lớn, như ở động vật có vú có thể lên đến hàng triệu đoạn và phải cần có hàng triệu dòng vi khuẩn mang các đoạn DNA này, trong số đó có những dòng chứa các đoạn DNA tương tự nhau, trùng lặp. Thứ hai, phần lớn DNA của eucaryotae bậc cao dư thừa, tức không mã hóa cho việc tổng hợp protein, những đoạn này làm tốn công vô ích khi tạo dòng. Trong thực tiễn của kỹ thuật di truyền, người ta sử dụng rộng rãi phương pháp thứ ba, đó là tạo gen từ các mRNA thông tin của chúng. Phương pháp này dựa vào quá trình phiên mã ngược nhờ sử dụng enzyme phiên mã ngược (reverse transcriptase, có tên là DNA-polymerase phụ thuộc RNA. Enzyme này lần đầu tiên được phát hiện khi nghiên cứu sao chép RNA của restovirus gây ung thư. Nó có khả năng tổng hợp nên DNA một mạch, được gọi là c-DNA từ khuôn mRNA hoặc từ một đoạn polyribonucleotid tổng hợp hóa học. Nhờ enzyme reverse transcriptase này có thể
  84. tổng hợp hầu như tất cả các gen, miễm có mặt mRNA của gen đó. Các c-DNA mạch đơn có thể được biến thành mạch kép nhờ DNA-polymerase và được gọi là c-DNA kép. Đoạn c-DNA kép này được gắn vào plasmid và biến nạp vào vi khuẩn để tạo dòng c-DNA. Các dòng DNA của bộ gen là những đoạn ngẫu nhiên của trình tự nucleotid dọc theo DNA của sinh vật và hầu như không phụ thuộc vào loại tế bào nào dùng để lấy DNA. Ngược lại các dòng c- DNA chỉ chứa những đoạn gen đã được phiên mã ra m.RNA, vì tế bào của các mô đã được biệt hóa sẽ có các loại mRNA khác nên ngân hàng c-DNA nhận đựoc sẽ phụ thuộc vào kiểu tế bào được sử dụng. Sử dụng ngân hàng c- DNA sẽ có nhiều ưu thế: - Thứ nhất, các dòng c-DNA chứa trình tự mã hóa liên tục của một gen. - Thứ hai, nhiều protein được tổng hợp với số lượng lớn do những tế bào chuyên hóa và như vậy trong các tế bào này mRNA của protein giàu đó sẽ có tỷ lệ cao và ngân hàng c-DNA được tạo ra từ tế bào này sẽ có nhiều c-DNA mã hóa cho các protein tương ứng. Sự dồi dào c-DNA một vài loại nào đó làm giảm nhẹ đáng kể việc xác định đúng dòng mong muốn từ ngân hàng gen. Bằng con đường này đã nhận được và
  85. tạo dòng các gen mã hóa cho globuline ở người, động vật và chim, cho globuline thủy tinh thể mắt bò, cho ovalbumine (protein lòng trắng trứng), cho fibroin tơ tằm. Phương pháp này cũng được sử dụng để thu nhận, tạo dòng và biểu hiện các gen interferon của người trong các vi khuẩn. 134 Hiện nay số lượng ngân hàng gen của DNA nhiễm sắc thể và c-DNA không ngừng tăng, chúng là nguồn cho các nhà nghiên cứu, đồng thời một số đáng kể trở thành hàng hóa. Năm 1972 các nhà khoa học Mĩ đã tạo được các dòng c- DNA của 2375 gen bộ não người. 9.3 Các vector chuyển gen. 9.3.1 Thế nào là vector chuyển gen. Để thu nhận gen dưới dạng tinh sạch với hàm lượng lớn, người ta phải tạo dòng (clon) gen đó. Tạo dòng cơ bản là nhằm gắn trình tự DNA cần thu nhận vào một vector. Vector là những phân tử DNA thường có dạng vòng, mang nhiều đặc tính, trong đó có khả năng tự tái sinh, tồn tại độc lập, mượn bộ máy tế bào vi khuẩn để tạo ra nhiều bản sao khác giống hệt vector ban đầu và mang được gen cần chuyển. Các vector chuyển
  86. gen cần thỏa mãn các điều kiện sau: - Có các trình tự khởi sự sao chép để có thể tự sao chép, tồn tại độc lập. - Có các trình tự nhận biết, nơi mà các enzyme hạn chế nhận biết để cắt hở làm chổ ráp các gen lạ vào. Các trình tự này thường nằm xa điểm xuất phát sao chép để tránh bị cắt nhầm. - Các trình tự điều hòa tạo điều kiện thuận lợi cho sự phiên mã gen lạ. - Đảm bảo cho sự di truyền bền vững của DNA tái tổ hợp ở dạng độc lập hay gắn vào nhiễm sắc thể của tế bào chủ. - Có các gen đánh dấu để dễ dàng phát hiện ra chúng hoặc các gen lạ gắn vào. - Vector phải có kích thước càng nhỏ càng tốt để có thể thu nhận một lượng DNA tối đa. Hơn nữa kích thước DNA càng nhỏ thì càng dễ xâm nhập vào tế bào vi khuẩn và càng được sao chép nhanh và hiệu quả. Ngoài ra chúng còn phải có những đặc tính bổ sung khác để cho việc tạo dòng thuận lợi. - Chứa các gen làm vô hiệu hóa đoạn DNA không mong muốn bị gắn vào. - Có nhiều bản sao để tách được ra khỏi tế bào với số lượng lớn và đảm bảo sự khuyếch đại của gen gắn vào. - Có các trình tự nucleotid cần thiết cho sự biểu hiện của gen như promotor, trình tự gắn với ribosome để dịch mã. 135
  87. Không có vector toàn năng cho chuyển gen, mà cần có sự chọn lựa tùy đối tượng, tùy kích thước đoạn gen được tạo dòng. Các vector chuyển gen có 5 ứng dụng: - Tạo dòng và khuyếch đại trình tự của DNA (nhiều bản sao giống nhau). - Nghiên cứu sự biểu hiện của một đoạn trình tự DNA. - Đưa gen vào các tế bào vi sinh vật (vi khuẩn, nấm men) hay các động vật, thực vật. - Sản xuất RNA. - Sản xuất protein từ gen được tạo dòng. Do có tầm quan trọng nên các vector chuyển gen được hoàn thiện không ngừng, từ những vector plasmid tự nhiên ở vi khuẩn vào đầu những năm 70, tiến tới nhiều loại vector phức tạp, đến nhiễm sắc thể nhân tạo. 9.3.2 Các vector chuyển gen là plasmid. Plasmid là những đoạn DNA ngắn (2-5), dạng vòng, nằm ngoài nhiễm sắc thể, được tìm thấy lần đầu tiên ở vi khuẩn. Sự sao chép plasmid không phụ thuộc vào sự sao chép nhiễm sắc thể vi khuẩn. Mỗi vi khuẩn có thể chứa hàng trăm plasmid. Ở các sinh vật procaryotae, các vector chuyển gen thường được sử dụng là các plasmid của các vi khuẩn và các bacteriophage. Chúng được cải tiến để ngày càng thuận tiện hơn cho kỹ thuật tái tổ hợp DNA, qua 3 thế hệ. - Thế hệ thứ nhất là các plasmid tự nhiên, đến nay hầu
  88. như không còn sử dụng nữa. - Thế hệ thứ hai. Là các plasmid được cấu tạo phức tạp hơn Một trong những plasmid được sử dụng rộng rãi nhất là BR 322. Plasmid này có khả năng sao chép độc lập với tế bào E. coli và tồn tại với số lượng trung bình 20-30 bản sao cho mỗi tế bào. Trong các điều kiện nuôi cấy nhất định có thể khuyếch đại có chọn lọc làm tăng số plasmid đến hơn 1000 bản sao cho một tế bào. - Thế hệ thứ ba Là các plasmid đa năng và chuyên dụng. Các plasmid vi khuẩn có thể chứa đoạn DNA lạ có chiều dài khoảng 3-10 kb. 136 9.3.3 Các vector chuyển gen là phage . Phage (thực khuẩn thể) là virus xâm nhiễm và làm phân giải vi khuẩn. Các phage, virus của vi khuẩn cũng được dùng làm vector chuyển gen vì nhiều phage có khả năng thực hiện tải nạp mang gen từ tế bào vi khuẩn cho sang tế bào vi khuẩn nhận. Vector phage . được sử dụng rộng rãi để lập ngân hàng gen, vì nó mang được đoạn DNA lớn hơn, dễ bảo quản, dễ tách ra để phân tích. Ưu điểm nổi bật của phage là chúng có hệ thống tự động xâm nhập và sinh sản trong tế bào vi khuẩn
  89. với hiệu quả cao hơn nhiều so với việc đưa plasmid vào tế bào vi khuẩn bằng biến nạp. Tuy nhiên các thao tác ban đầu có phức tạp hơn. 9.4 Tạo plasmid tái tổ hợp (tạo dòng). Bước tiếp theo của kỹ thuật di truyền là gắn các đoạn DNA hay các c-DNA vào vector chuyển gen để tạo nên plasmid có mang DNA lạ được gọi là plasmid tái tổ hợp hay khảm. 9.4.1. Các bước tạo dòng. - Chọn và xử lý vector: Việc chọn và xử lý vector phụ thuộc vào nhiều yếu tố: kích thước các đoạn DNA muốn tạo dòng, mục đích tạo dòng Trước hết, vector được cắt ở vị trí xác định bằng 1 enzyme giới hạn. Sau đó 2 đầu chổ nối cắt được xử lý để chúng không thể nối trở lại; vecto chỉ có thể trở lại dạng vòng ban đầu khi hai đầu chổ mối cắt được nối với một trình tự DNA lạ. - Xử DNA cần tạo dòng (insert): Trước hết cần chọn lọc sơ khởi các DNA có kích thước gần nhau và tương ứng với loại vector đã chọn. Sau dó hai đầu của các đoạn DNA này cần được xử lý cho phù hợp với hai đầu chổ mối cắt của vector (bằng cách cắt bằng cùng một enzyme giới hạn để tạo các đầu so le tương hợp). - Tạo vecto tái tổ hợp: Vecto và DNA cần tạo dòng đã được xử lý sẽ được trộn chung theo một tỷ lệ nhất định với sự tham gia
  90. của ligase. Ligase xúc tác phản ứng nối vector với insert tạo thành vector tái tổ hợp (recombinant). Vector tái tổ hợp sau đó sẽ được tinh sạch qua tách chiết và tủa. - Chuyển vector tái tổ hợp vào tế bào chủ: Nhằm mục đích sử dụng bộ máy của tế bào chủ để sao chép vector tái tổ hợp thành một số lượng lớn bản sao. Tùy thuộc loại tế bào chủ, người ta sử dụng kỹ thuật chuyển thích hợp. 137 - Phát hiện dòng cần tìm trong thư viện gen: Sự phát hiện dòng cần tìm, người ta sử dụng một mẫu dò, mẫu dò có thể là một kháng thể đặc trưng cho protein mã hóa bởi gen cần tìm hoặc một trình tự DNA bổ sung cho gen cần tìm. Do bản chất của DNA cần tạo dòng (được gọi là insert) người ta phân biệt hai loại thư viện gen: thư viện bộ gen (genomic library) và thư viện c-DNA (cDNA library). 9.4.2. Thư viện bộ gen (genomic library). Thư viện bộ gen của một sinh vật là tập hợp tất cả các trình tự DNA cấu thành bộ gen đã được gắn vào vector. Về nguyên tắc, thư viện bộ gen có thể được thiết lập từ bất kỳ loại tế bào nào của sinh vật nghiên cứu. Để thiết lập thư viện bộ gen, trước hết người ta tách
  91. chiết DNA bộ gen của sinh vật đó, cắt DNA thành những đoạn có kích thước xác định bằng các enzyme giới hạn; rồi gắn các đoạn này vào vector tạo vector tái tổ hợp. Các vector tái tổ hợp sau đó được đưa vào tế bào chủ. Các tế bào chủ sẽ được nuôi cấy trên môi trường đặc và hình thành nên những dòng (clone). Ứng dụng của thư viện bộ gen là khi cần:. - Giải mã thông tin di truyền chứa trong bộ gen, đặc biệt là cấu trúc intron-exon của một gen xác định. - Tạo dòng các trình tự DNA không mã hóa nằm cạnh các gen và đòng vai trò quyết định trong sự điều hòa biểu hiện của gen. 9.4.3. Thư viên cDNA. Thư viện cDNA là tập hợp các bản sao cDNA từ tất cả các mRNA của một tế bào. Như vậy, không giống với thư viện bộ gen, thư viện cDN được thiết lập từ một loại tế bào xác định trong đó gen nghiên cứu phải được biểu hiện thành mRNA. Thư viện cDNA mang tính đặc trưng tế bào rất cao vì ở mỗi loại tế bào của cơ thể đã biệt hóa chỉ có một số gen được phiên mã thành mRNA. Việc thiết lập thư viện cDNA có một số điểm đặc trưng: Trước hết mRN của tế bào được tách chiết rồi được chuyển thành cDNA nhờ enzyme phiên mã ngược (Reverse transcriptase). Thư viện cDNA được thiết lập chủ
  92. yếu nhằm mục đích nghiên cứu sự biểu hiện của 1 gen xác định cùng với những vấn đề liên quan như sự điều hòa biểu hiện của gen, mối tương tác giữa các gen trong quá trình sống 138 Thư viện cDNA cũng được hình thành theo những bước sau: - Việc chọn vector tương đối dễ dàng do kích thước của các cDNA ít khi lớn hơn 9 kb. Ngày nay người ta thường sử dụng các plasmid thế hệ thứ ba. Plasmid được cắt bởi enzyme giới hạn và hai đầu mối cắt được loại phosphate để tránh hiện tượng tự nối trở lại. - Bên cạnh đó, mRNA được tách chiết từ tế bào và được chuyển thành cDNA nhờ enzyme phiên mã ngược. Vector tái tổ hợp được hình thành do sự kết hợp giữa plasmid và cDNA. - Sau đó, vector tái tổ hợp được đưa vào tế bào vi khuẩn bằng phương pháp biến nạp (transformation). Sau khi tế bào vi khuẩn đã nhận các vector tái tổ hợp, người ta lại nuôi chúng trong môi trường lỏng một thời gian ngắn trước khi đem trải chúng trên môi trường đặc. Các dòng vi khuẩn sẽ hình thành nên những khuẩn lạc trên mặt thạch. 9.5 Biến
  93. nạp DNA tái tổ hợp vào tế bào. Sau khi được DNA tái tổ hợp, việc tiếp theo là biến nạp, đưa nó vào lại tế bào. Có thể đưa vào bằng nhiều cách. 9.5.1 Hóa biến nạp. DNA tái tổ hợp (plasmid mang đoạn gen lạ) được ủ với số lượng lớn tế bào vi khuẩn chưa có plasmid. Đối với vi khuẩn có thể xử lý CaCL2 lạnh, kèm sốc nhiệt độ (42oC trong 2 phút) thì DNA tái tổ hợp xâm nhập vào tế bào nhiều hơn. Đối với tế bào động vật có vú, để thực hiện biến nạp có thể dùng phương pháp hấp thụ DNA qua trung gian phosphate calcium. Phương pháp này cho hiệu quả thấp. 9.5.2 Điện biến nạp. Sử dụng dòng điện cao thế cục bộ theo xung có thể làm tế bào hấp thụ DNA nên được gọi là điện biến nạp. Lúc đầu phương pháp này được sử dụng ở động vật có vú, về sau cho cả tế bào thực vật. Hiệu quả biến nạp cao, có thể gấp 10-20 lần so với xử lý hóa chất, đoạn DNA biến nạp có kích thước lớn. Tuy nhiên tỷ lệ tế bào chết cũng đáng kể (50-70%). Khó khăn khác là phải chế dụng cụ chuyên biệt tạo dòng điện có điện thế cao cho một khối lượng xử lý nhỏ. 9.5.3 Vi tiêm. 139
  94. Đối với các tế bào động vật có vú (thường là các hợp tử) có thể tiêm thẳng DNA tái tổ hợp vào tế bào. Đây là phương pháp thông dụng có hiệu quả trong chuyển gen ở tế bào động vật có vú, tạo các động vật nhiễm gen. 9.5.4 Bắn DNA vào tế bào. Đối với các tế bào thực vật, muốn thực hiện biến nạp phải tạo tế bào trần (mất vách tế bào) thì DNA mới ngấm được vào trong. Việc tạo tế bào trần không đơn giản, tốn công sức và thường sức sống tế bào giảm, khó phân chia để tự tái sinh. Để khỏi phải làm các công việc trên, phương pháp bắn DNA tái tổ hợp trực tiếp vào tế bào thực vật đã được sử dụng. Các hạt kim loại (đường kính khoảng 4 micromet) mang DNA hoặc RNA được bắn với tốc độ nhanh xuyên thủng vách tế bào đưa vào trong. Phương pháp này có nhiều ưu thế và được dùng nhiều trong các thực vật nhiễm gen. Ngoài ra còn nhiều phương pháp khác đưa DNA tái tổ hợp vào trong tế bào: - Sử dụng màng lipid bao DNA để đưa vào tế bào. - Dùng tinh trùng mang DNA tái tổ hợp xâm nhập vào tế bào trứng. - Các vector virus tự động thực hiện tải nạp đưa DNA tái tổ hợp vào tế bào với hiệu suất cao hơn nhiều nên cũng được sử dụng rộng rãi ở cả tế bào người, động vật và thực vật. 9.6
  95. Phương pháp PCR. Vào năm 1985, K. Mullis đã phát hiện ra phương pháp đơn giản khuyếch đại nhanh nhiều bản sao của các đoạn DNA mà không cần sử dụng tế bào. Kỹ thuật này được gọi là polymerase chain reaction (PCR), được hiểu là phản ứng polymer dây chuyền. Sự khuyếch đại bằng PCR được thực hiện invitro trong một ống nghiệm plastic nhỏ, khác hẵn với sự tạo dòng các đoạn DNA invitro được gắn vào plasmid của tế bào vi khuẩn hay nấm men. Kỹ thuật này được ứng dụng nhanh và có ý nghĩa cách mạng đối với sự phát triển của sinh học phân tử và kỹ thuật di truyền. Thực chất đây là phương pháp tạo dòng invitro không cần có sự hiện diện của tế bào. 9.6.1. Nguyên tắc thực hiện. PCR là quá trình khuyếch đại của một trình tự DNA đặc hiệu invitro được xúc tác bởi enzyme DNA polymerase. Sự khuyếch đại này nói chung được thực hiện nhờ các chu trình nhiệt lặp lại (có thể đến 35 140 lần) gồm: đun nóng (95oC) trong vòng 30 giây đến 1 phút. Đây là giai đoạn biến tính; Làm nguội (37 - 65oC), trong
  96. vòng 30 giây đến 1 phút, cho phép các mồi bắt cặp với khuôn, đây là giai đoạn lai; Ủ lâu ở 72oC giúp cho DNA polymerase hoạt động tổng hợp. Thời gian tùy thuộc vào độ dài trình tự DNA cần khuyếch đại, thường kéo dài 30 giây đến nhiều phút, đây là giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (elongation). Trong dung dịch có các primer (đoạn mồi) P1 và P2, mỗi loại sẽ bắt cặp bổ sung với đầu mạch đơn tương ứng. Như vậy, một mạch kép DNA, sau phản ứng do DNA polymerase thực hiện thành 2 mạch DNA kép và có thể thực hiện chu trình khuyếch đại mới 2 thành 4, 4 thành 8 theo cấp số nhân. 3’ 5’ A 5’ 3’ Lặp 3’ 5’ lại n lần 5’ 3’ B 3’ 5’ C 5’ 3’ Hình 54. Sơ đồ nguyên tắc của phương pháp PCR Một chu kỳ gồm 3 bước: A. Biến tính (denaturation): tách rời hai mạch của phân tử DNA. B. Lai (hybridization): cặp mồi chuyên biệt cho một trình tự DNA xác định được cho bắt cặp với khuôn. C. Kéo dài (elongation): DNA-