Giáo trình Cơ sở di truyền

179 trang phuongnguyen 5050

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Giáo trình Cơ sở di truyền", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

giao_trinh_co_so_di_truyen.pdf

Nội dung text: Giáo trình Cơ sở di truyền

PHẦN I CƠ SỞ DI TRUYỀN
MỞ ĐẦU LƯỢC SỬ PHÁT TRIỂN CỦA DI TRUYỀN HỌC VÀ KỸ THUẬT DI TRUYỀN 1.1- LĨNH VỰC NGHIÊN CỨU CỦA DI TRUYỀN VÀ CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN Thuật ngữ “di truyền” (geneties) xuất phát từ gốc latinh là gentikos (nguồn gốc). Di truyền học là một bộ môn của sinh học, chuyên đi sâu nghiên cứu hai đặc tính cơ bản của sự sống là tính di truyền và tính biến dị. Tính di truyền biểu hiện ở sự giống nhau của các tính trạng giữa thế hệ này và thế hệ khác. Đặc tính di truyền cho phép thế giới sinh vật bảo toàn nòi giống. Trải qua nhiều thế hệ nối tiếp nhau nhưng những đặc tính di truyền không bị mất đi, thế hệ con cháu luôn có những đặc điểm giống bố mẹ, ông bà. Các sinh giới sống trong điều kiện môi trường luôn có những biến động như sự thay đổi thời tiết, nhiệt độ môi trường, lượng nước, lượng thức ăn và sự đấu tranh sinh tồn giữa các loài. Để thích nghi với điều kiện sống, các cơ thể sống cũng có những thay đổi, làm xuất hiện những tính trạng khác nhau giữa các thế hệ, đó là sự biến dị. Biến dị biểu hiện sự sai khác của thế hệ con cháu so với thế hệ bố mẹ đồng thời sự sai khác của một cá thể nào đó so với các cá thể khác cùng đàn. Di truyền học thực sự trở thành một bộ môn khoa học độc lập kể từ những năm 1900 - 35 năm sau ngày Mendel công bố công trình “Các thí nghiệm lai ở thực vật”. Từ đó đến nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của các nghành khoa học khác như vật lý, toán học, hóa học, di truyền học đã và đang khám phá rất nhiều quy luật về sự tồn tại và lưu truyền sự sống và trở thành một mũi nhọn trong nghiên cứu sinh học. Những thành tựu rực rỡ của di truyền học đã đem lại những nhận thức mới về cấu tạo và sự vận hành bộ máy di truyền của cơ thể sống. Cùng với sự phát triển mạnh mẽ của di truyền học, một lĩnh vực nghiên cứu mới của di truyền học ra đời, đó là kỹ thuật di truyền hay còn gọi là công nghệ gen hoặc công nghệ di truyền (genetic engineering). - 2 -
Có thể nói, kỹ thuật di truyền là một tập hợp của nhiều kỹ thuật như hóa học, sinh học phân tử, vi sinh vật học, mà trong đó, vai trò hàng đầu thuộc về các tư duy và phương pháp của di truyền. Công nghệ di truyền sử dụng các phương pháp sinh học phân tử để tách DNA từ một cơ thể sống và sau đó cắt, nối các gen trên DNA. Bằng cách như vậy, người ta có thể loại bỏ các gen không mong muốn và đưa vào các gen mới đặc hiệu theo chủ ý lựa chọn. Các thao tác cắt, nối trên DNA được thực hiện bên ngoài cơ thể sống trong các ống nghiệm (in vitro). Phân tử DNA mới được tạo dựng sau các thao tác cắt, nối có một số đặc điểm khác với phân tử DNA ban đầu được tách ra từ tế bào sống, được gọi là DNA tái tổ hợp và kỹ thuật này được gọi là kỹ thuật tái tổ hợp DNA. Sự tái tổ hợp DNA được đánh giá là thành công chỉ sau khi đưa được phân tử DNA tái tổ hợp vào trong tế bào sống và chúng biểu hiện các hoạt tính di truyền và ở thế hệ con cháu sẽ mang phân tử DNA tái tổ hợp. Có thể nói: Kỹ thuật di truyền là sự thao tác bộ máy di truyền của một cơ thể sống bằng cách thêm vào hay loại bớt gen đặc hiệu. 1.2- GIAI ĐOẠN DI TRUYỀN SAU MENDEL Phát minh của Mendel đã đặt nền móng cho di truyền học. Tuy nhiên, ở thời điểm mà Mendel công bố công trình nghiên cứu của mình, một phần do chưa hiểu rõ được cơ chế phân bào, các nhà khoa học chưa thể hiểu và đánh giá đúng mức tầm quan trọng của phát minh này. Cuối thế kỷ XIX, 5 năm sau ngày công bố công trình của Mendel (1870), các giai đoạn của quá trình phân bào nguyên phân và sau đó, phân bào giảm nhiễm (1890) đã được mô tả một cách chi tiết. Dưới kính hiển vi, các nhà nghiên cứu đã quan sát thấy các nhiễm sắc thể và sự phân chia các nhiễm sắc thể trong quá trình phân bào. Năm 1902-1903, W.S Sutton, Th. Bovery và một số nhà khoa học khác đã tiến hành các nghiên cứu độc lập, cũng đã phát hiện có sự tương quan đồng điệu giữa sự biểu hiện của nhiễm sắc thể trong phân bào với sự biểu hiện của các tính trạng theo Mendel. Thuật ngữ “gen” do nhà khoa học Đan Mạch W. Johansen nêu ra năm 1909. Học thuyết di truyền nhiễm sắc thể ra đời: Các gen được chứng minh là nằm trên nhiễm sắc thể, chiếm một vị trí xác định, xếp theo đường thẳng và chúng chịu sự phân li như nhiễm sắc thể. - 3 -
Học thuyết di truyền nhiễm sắc thể đã đưa di truyền học lên một bước phát triển mới. Sự phát triển của di truyền nhiễm sắc thể gắn liền với nhóm nghiên cứu do Morgan lãnh đạo với các nhà di truyền học nổi tiếng như C. Bridges, A.H Sturtevant và G. Muller: - Việc phát hiện ra sự khác nhau giữa các cá thể đực và cái ở 1 cặp nhiễm sắc thể gọi là nhiễm sắc thể giới tính, là một dữ kiện quan trọng để xây dựng nên học thuyết di truyền nhiễm sắc thể. Các gen nằm trên nhiễm sắc thể giới tính sẽ có sự di truyền khác hơn so với các gen nằm trên nhiễm sắc thể thường. Quy luật di truyền của các gen liên kết với nhiễm sắc thể giới tính đã được xác định. - Hiện tượng trao đổi chéo giữa các đoạn nhiễm sắc thể tương đồng trong phân bào giảm nhiễm dẫn tới sự sắp xếp lại các gen, từ đó xuất hiện các giao tử dạng mới không giống của cha mẹ, gọi là dạng tái tổ hợp (recombinant). Dựa vào tần số tái tổ hợp ổn định giữa các gen, người ta xây dựng các bản đồ di truyền nhiễm sắc thể. Học thuyết di truyền nhiễm sắc thể đã củng cố thêm cho học thuyết về gen của Mendel, nhưng nó cụ thể hơn, đồng thời, nó chỉ rõ giới hạn của quy luật phân li độc lập trong học thuyết của Mendel. Sau chiến tranh thế giới lần thứ hai, di truyền học phân tử đã phát triển rất mạnh mẽ. Năm 1944, O. Avery, Mc. Leod và Mc. Carty đã chứng minh rằng: DNA chính là chất di truyền. Năm 1953, mô hình cấu trúc DNA của Wattson-Crick ra đời, đã tạo một bước ngoặt lớn cho sự phát triển của di truyền học và sinh học. Năm 1961, M. Nirenberg và J. Matthei đã xác định được bộ mã di truyền đầu tiên và sau đó, toàn bộ các bộ mã di truyền cũng đã được tìm ra. 1.3- SỰ RA ĐỜI CỦA CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN Kỹ thuật di truyền ra đời vào những năm đầu của thập niên 70 trong thế kỷ 20. Phân tử DNA tái tổ hợp đầu tiên được nhóm các nhà nghiên cứu Mỹ là Berg, Boyer và Cohen tạo ra năm 1972-1973 từ nguồn vật liệu di truyền ban đầu là DNA của virus SV40 gây ung thư ở khỉ được cắt, ghép với DNA của vi khuẩn E. Coli. Phân tử DNA mới được tạo ra trong ống nghiệm này đã không được đưa vào vi khuẩn E. Coli như đã dự định vì lý do an toàn cho người và - 4 -
động vật, sợ rằng loài vi khuẩn mới mang gen của virus gây nên ung thư, nếu thoát ra ngoài sẽ gây dịch bệnh mà con người thì chưa có cách điều trị, tai hại là khó lường. Năm 1973-1974, nhóm các nhà khoa học người Mỹ do Cohen đứng đầu với Helinski, Boyer đã sử dụng plasmid làm nguồn vật liệu cho các nghiên cứu của họ. Plasmid là những phân tử DNA mạch vòng, xoắn kép, ngoài nhân. Plasmid xuất hiện khá phổ biến ở vi khuẩn, mã hóa các gen biểu hiện tính kháng thuốc, kháng kháng sinh ở vi sinh vật - plasmid pSR100 được phân lập và làm sạch. Plasmid này mang gen kháng tetracycline được cắt tại một vị trí bằng enzyme cắt hạn chế EcoRI, vị trí cắt này không nằm trong vùng có chứa các gen cơ bản và nối một đoạn DNA của plasmid R6-5d có chứa gen kháng kanamixin tạo thành một phân tử lai gọi là DNA tái tổ hợp. Như vậy, phân tử DNA tái tổ hợp có chứa hai gen biểu hiện tính kháng tetracycline và kanamixin. Phân tử DNA được tạo dựng trong ống nghiệm này được đưa trở lại vào tế bào E. Coli. Kết quả là vi khuẩn E. Coli mang plasmid có chứa hai gen kháng thuốc đã có khả năng kháng cả tetracycline và kanamixin, nghĩa là, loài vi khuẩn này có thể phát triển được trên môi trường chọn lọc có chứa cả tetracycline và kanamixin. Một thí nghiệm kiểm tra được bố trí đã khẳng định rằng, loài vi khuẩn mới này mang phân tử DNA tái tổ hợp. Sau thành công rực rỡ của nghiên cứu trên, nhiều nhà khoa học đã tiến hành các thí nghiệm lắp ghép gen và đã thu được nhiều kết quả ứng dụng được trong thực tiễn. Từ những năm 1990, sự kết hợp giữa sinh học, công nghệ di truyền và tin học đã cho phép rút ngắn thời gian nghiên cứu và đã thu được nhiều kết quả hoàn hảo hơn. 1.4- Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN Công nghệ di truyền hiện đang đóng vai trò cơ sở cho những nghiên cứu và ứng dụng của công nghệ sinh học, là mũi nhọn của nghành công nghệ sinh học. Về ý nghĩa khoa học, có thể nói rằng, sự ra đời của công nghệ di truyền và những thành tựu đạt được đã tạo nên một cuộc cách mạng về nhận thức của con người đối với thế giới sinh học. Ngày nay, con người hiểu rõ hơn về - 5 -
các cơ chế di truyền và đang từng bước điều khiển chúng để tạo ra các chủng loại sinh vật có lợi cho con người. Về ý nghiã thực tiễn, công nghệ di truyền được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu và sản xuất liên quan đến nông nghiệp, công nghệ thực phẩm, y dược, bảo vệ môi trường, Khó có thể liệt kê hết tất cả những kết quả nghiên cứu dựa trên cơ sở của công nghệ di truyền đã được ứng dụng vì tốc độ phát triển nhanh chóng của lĩnh vực công nghệ này, xin giới thiệu một số ví dụ cụ thể như sau: 1.4.1- Trong y dược Vận dụng kỹ thuật di truyền, các nhà khoa học đã có thể chẩn đoán các bệnh do rối loạn di truyền và tiến tới điều trị bằng cách thay gen bệnh bằng gen lành hay đưa gen lành vào cơ thể để bù đắp cho gen bệnh - đây là một hướng ứng dụng khó thực hiện nhất. Trong những năm qua, lĩnh vực ứng dụng công nghệ di truyền mạnh nhất trong y tế là nghành sản xuất thuốc kháng sinh, vác xin, kháng thể đơn dòng và các protein có hoạt tính sinh học. Hiện nay, các nghiên cứu nhằm tìm kiếm các chất kháng sinh mới tăng mạnh do hiện tượng vi sinh vật kháng lại tác dụng của kháng sinh ngày càng nhiều hơn. Phạm vi ứng dụng của kháng thể đơn dòng trong ngành y tế ngày càng tăng như phân tích miễn dịch, định vị các khối u, phát hiện một số protein có liên quan đến sự hình thành khối u, xác định sự có mặt của các loại vi khuẩn khác nhau, giúp cho các bác sĩ xác định bệnh một cách nhanh chóng và chính xác. Kháng thể đơn dòng là tập hợp các phân tử kháng thể đồng nhất về mặt cấu trúc và tính chất. Kháng thể đơn dòng được tạo ra bằng cách cho lai tế bào lympho trong hệ miễn dịch của động vật hoặc của người với tế bào ung thư. Một số thể lai có khả năng tạo ra kháng thể đặc hiệu đối với kháng nguyên. Chọn các thể lai đó nhân lên và sản xuất kháng thể đơn dòng. Các tế bào lai có khả năng tăng sinh vĩnh viễn trong môi trường nuôi cấy - tính chất này nhận được từ tế bào ung thư. Nhờ công nghệ sử dụng DNA tái tổ hợp mà người ta có thể sản xuất một số protein có hoạt tính sinh học dùng để chữa bệnh như insulin chữa bệnh - 6 -
tiểu đường, interferon chữa bệnh ung thư, các hormon tăng trưởng cho con người. Bản chất của công nghệ này là làm thay đổi bộ máy di truyền của tế bào bằng cách đưa gen mã hóa cho một protein đặc hiệu và bắt nó hoạt động để tạo ra một lượng lớn loại protein mà con người cần. 1.4.2- Trong nông nghiệp Vấn đề chọn giống có vai trò rất quan trọng trong sản xuất nông nghiệp, nhằm nâng cao sản lượng và chống các loại sâu, bệnh cũng như các điều kiện tự nhiên bất lợi đối với cây trồng và vật nuôi. Kỹ thuật di truyền được sử dụng để xác định vị trí của các gen mã hóa cho các tính trạng mong muốn, giúp cho việc lai tạo, chọn giống cũng như tạo ra các sinh vật chuyển gen nhanh và hiệu quả cao. Hiện nay, nhiều động vật và thực vật chuyển gen đã ra đời, đáp ứng nhu cầu cho con người. Cây chuyển gen là cây có mang những gen đặc hiệu mà trước đó nó không có, do con người đã đưa vào nó bằng kỹ thuật di truyền. Các gen được chuyển thường liên quan đến các tính trạng như chịu hạn, chịu mặn, chống được sâu bệnh, 1.4.3- Trong công nghệ thực phẩm Công nghệ lên men là một lĩnh vực quan trọng trong sản xuất thực phẩm. Việc tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng lên men tốt, đem lại hiệu quả cao là rất cần thiết. Các nghiên cứu sử dụng công nghệ di truyền phục vụ cho công nghệ lên men chủ yếu đi vào hai hướng chính là: - Phân tích di truyền các loại vi sinh vật sử dụng trong quá trình lên men, xác định các gen mã hóa cho các tính trạng mong muốn nhằm tạo ra năng suất và chất lượng sản phẩm lên men. - Tạo ra các vi sinh vật chuyển gen phục vụ cho các qui trình lên men. Ví dụ trong sản xuất rượu, ngày nay người ta đã dùng các chủng vi sinh vật có khả năng tạo rượu cao và cho hương vị tốt. Phần lớn các chủng đó được nghiên cứu, tuyển chọn, lai tạo bằng công nghệ di truyền. Để sản xuất rượu vang, trước đây, người ta phải dùng hai loại vi sinh vật là S. Cerevisiae để tạo ra hàm lượng rượu trong dịch lên men và sau đó, sử - 7 -
dụng Leuconostos trong lên men phụ ở quá trình tàng trữ, nhằm nâng cao chất lượng của rượu. Ngày nay, người ta tiến tới dùng một chủng vi sinh vật chuyển gen để thực hiện cả hai quá trình. Công nghệ di truyền đóng vai trò quan trọng trong việc tuyển chọn và tạo ra các vi sinh vật có hoạt tính enzyme cao, sử dụng trong công nghệ thực phẩm. Đối với các sản phẩm lên men sữa như phomat và sữa chua, trước kia, người ta thường sử dụng những vi sinh vật tự nhiên có mặt trong sữa để lên men, do vậy, người ta khó lòng kiểm soát quá trình lên men và hiệu quả không cao. Ngày nay, với công nghệ di truyền, người ta đã tạo được các chủng mới với các tính chất xác định và đã điều khiển được quá trình lên men theo định hướng mong muốn. Trong những năm gần đây, bằng cách sử dụng công nghệ di truyền, người ta đã tuyển chọn và tạo ra những chủng vi sinh vật có khả năng tổng hợp các enzyme chịu nhiệt, chịu axit, chịu kiềm tốt để sản xuất enzyme. Enzyme λ-amylase chịu nhiệt đã và đang được sử dụng nhiều để sản xuất nha, đường glucose từ tinh bột. Ở thời gian đầu, những nghiên cứu của công nghệ di truyền chủ yếu hướng vào những vấn đề sinh học cơ bản thuần tuý và cho đến những năm gần đây, nhành công nghệ này đã chuyển thành một nghành công nghiệp trị giá nhiều tỷ USD. Bên cạnh những ứng dụng cực kỳ to lớn, có lợi cho con người, cũng cần nhìn nhận sự quan tâm, lo lắng chính đáng về các thực phẩm chuyển gen. Tuy ngày nay, các nhà khoa học đã có thể tổng hợp được các gen nhân tạo hay ghép gen này hay gen kia vào bộ máy di truyền của một sinh vật nào đó, nhưng chắc chắn, còn rất nhiều vấn đề về những bí ẩn của sự sống, nhất là ở các sinh vật bậc cao vẫn chưa được khám phá. Người ta có thể chứng tỏ sự vô hại của các loại thực phẩm từ thực vật, động vật hay vi sinh vật chuyển gen qua các thí nghiệm, nhưng về lâu dài, người ta chưa thể khẳng định được sự vô hại đó, vì vậy, không ít người đã tỏ ra lo lắng khi sử dụng chúng thường xuyên với một số lượng lớn. - 8 -
CHƯƠNG I BẢN CHẤT CỦA VẬT CHẤT DI TRUYỀN 1.1- AXIT NUCLEIC - VẬT CHẤT DI TRUYỀN CỦA MỌI SINH VẬT 1.1.1- Thành phần cấu tạo hóa học của axit nucleic Axit nucleic được F. Miescher phát hiện năm 1869. Có hai loại axit nucleic là axit deoxyribonucleic (DNA) và axit ribonucleic (RNA). Axit deoxyribonucleic (DNA) là polyme có phân tử lượng lớn, có mặt trong tất cả tế bào sống. DNA tập trung chủ yếu ở các nhiễm sắc thể trong nhân tế bào, ngoài ra còn có một số lượng nhỏ nằm ở ty thể và lục lạp - là các DNA ngoài nhân. Số lượng DNA là không thay đổi trong nhân của các tế bào cùng loài. Axit ribonucleic có mặt cả trong nhân tế bào và trong nguyên sinh chất 1.1.1.1- Thành phần nguyên tố Trong cấu tạo của axit nucleic có 5 nguyên tố hóa học là carbon (C), hydro (H), oxy (O), nitơ (N) và phospho (P). Trong đó, thành phần nitơ thường chiếm khoảng từ 8-10% và phospho là 15-16%. 1.1.1.2- Thành phần cấu tạo hóa học Phân tử axit nucleic được cấu tạo từ 3 thành phần chính là các bazơ nitơ, đường pentose và axit phosphoric. Khi thuỷ phân hoàn toàn axit nucleic bằng enzyme hoặc bằng axit thì thu được ba thành phần chính là bazơ nitơ, đường pentose và axit phosphoric. Nếu thuỷ phân từng bước bằng các enzyme thì đầu tiên, enzym ribonuclease cắt liên kết phosphoester, giải phóng các nucleotide - là đơn vị cấu tạo cơ bản của phân tử axit nucleic. Các nucleotide sẽ tiếp tục bị thuỷ phân dưới tác dụng của các enzyme nucleotidase và nucleosidase để giải phóng axit phosphoric, đường pentose và bazơ nitơ (Hình 1-1). - 9 -
Axit nucleic (DNA vµ RNA) - Deoxyribonulease - Ribonuclease Nucleotide Nucleotidase Nucleoside Axit phosphoric Nucleosidase §−êng pentose Baz¬ nit¬ - Deoxyribose - Purine - Ribose - Pyrimidine Hình 1-1: Sơ đồ thuỷ phân từng bước của axit nucleic 1,- Các bazơ nitơ: Có 2 nhóm bazơ nitơ là purine và pyrimidine (Hình 1-2): - Bazơ purine là hợp chất nitơ dị vòng. Vòng purine được nhà hoá học Đức E. Fischer gọi lần đầu tiên, trong đó, bao gồm một vòng pyrimidine và một vòng imidazol ghép lại. Các bazơ có nhân purine là adenine (A) và guanine (G). Mỗi bazơ đều có 2 dạng đồng phân. Một dẫn xuất quan trọng của bazơ adenine là hypoxanthine. Hypoxanthine được tạo thành khi nhóm −NH2 của adenine được thay bằng nhóm −OH. Hypoxanthine có ý nghĩa quan trọng trong quá trình trao đổi chất của tế bào sống. - Bazơ pyrimidine là một vòng 6 cạnh có chứa hai nguyên tử nitơ. Các bazơ có nhân pyrimidine là cytosine (C) và thymine (T). Trong điều kiện sinh lý, guanine và thymine thường tồn tại ở dạng ceton. Đôi khi, bazơ cytosine còn gặp dưới dạng 5-methyl cytosine, còn adenine và cytosine thường tồn tại dưới dạng amin. - 10 -
2 N N HN N N NH N NH 5 N N 6 7 Adenine (A) 1 8 (6-aminopurine) 2 3 9 N 4 NH O OH N N HN N HN2 N NH HN2 N NH Guanine (G) (2-amino 6-oxypurine) NH NH2 HN N O NH O NH N 4 5 Cytozine (C) 3 (2-oxy-4-aminopyrimidine) 2 1 6 N O OH CH CH HN 3 N 3 O NH O NH Thymine (T) (2,4 dioxy-5 methylpyrimidine) O OH HN N O NH O NH Uracil (U) (2,4 dioxypyrimidine) Hình 1-2: Công thức cấu tạo của các bazơ nitơ - 11 -
2,- Đường pentose: Trong DNA có chứa gốc đường deoxyribose, trong RNA chứa gốc đường ribose nằm dưới dạng vòng, có công thức cấu tạo là: ch5 105o hoh2c OH Ho h2c OH Pentose H H H H H H H H OH H OH OH Deoxyribose Ribose 1.1.1.3- Nucleoside và nucleotide 1,- Nucleoside: NH2 O N N HN Liªn kÕt N N N 9 glycoside O 1 O O HOH2C HOH2C 1’ 1’ H H H H H H H H OH R R = OH hoÆc H OH R Hình 1-3: Liên kết glycoside giữa bazơ nitơ và đường pentose Khi một bazơ nitơ liên kết với phân tử đường pentose bằng liên kết β,N-glycoside sẽ tạo thành một nucleoside. Liên kết β,N-glycoside này hình thành giữa nguyên tử carbon thứ nhất (C1) của đường pentose với nguyên tử thứ 9 (N9) của bazơ purine hoặc với nguyên tử thứ nhất (N1) của bazơ pyrimidine. - Nucleoside của bazơ pyrimidine với đường ribose mang tên của bazơ và có đuôi là “-idine” (thymidine, uridine, cytidine). - 12 -
- Nucleoside của bazơ purin với đường ribose mang tên của bazơ và có đuôi là “-osine” (adenosine, guanosine). - Khi bazơ nitơ liên kết với đường deoxyribose thì có thêm tiếp đầu ngữ “deoxy-“ (deoxyadenosine, deoxyguanosine, deoxycytisine). Riêng bazơ thymine chỉ có mặt trong DNA nên gốc đường trong nucleoside luôn là deoxyribose, trong trường hợp này, nhiều khi người ta không cần gọi thêm tiếp đầu ngữ “deoxy-“, mà chỉ gọi một cách đơn giản là thymidine. 2,- Nucleotide: NH2 O N N HN N N O N O O HO P O CH2 HO P O CH2 O O OH OH H H H H H H H H OH OH OH OH Adenosine 5’-monophosphat Uridine 5’-monophosphat (Adenosine monophosphat) (Uridine monophosphat) (AMP) (UMP) Hình 1-4: Sơ đồ AMP và UMP Nucleotide là ester phosphat của nucleoside. Axit phosphoric tạo liên kết ester với một nguyên tử carbon nào đó của đường (thường là ở C5), tạo thành nucleotide (Hình 1-4). Các nucleotide là đơn vị cấu tạo của axit nucleic, phân tử DNA được cấu tạo nên từ 4 loại nucleotide: dAMP, dGMP, dCMP và dTMP. Nucleotide đóng vai trò sinh học quan trọng. Ngoài chức năng cấu tạo nên vật chất di truyền, chúng còn có mặt trong các coenzyme, xúc tác nhiều phản ứng hóa học trong tế bào như các coenzyme NAD, FAD, FMN và coenzyme A. - 13 -
Bảng 1-1: Tên gọi và chữ viết tắt của một số nucleotide Tên gọi Ký hiệu Adenozine 5’-monophosphat (axit adenylic) AMP Guanosine 5’-monophosphat (axit guanylic) GMP Cytidine 5’-monophosphat (axit cytidytic) CMP Uridine 5’-monophosphat (axit thymidylic) UMP Deoxyadenosine 5’-monophosphat (axit deoxyadenylic) dAMP Deoxyguanosine 5’-monophosphat (axit deoxyadenylic) dGMP Deoxycytidine 5’-monophosphat (axit deoxycytidylic) dCMP Deoxythymidine 5’-monophosphat (axit deoxythymidylic) dTMP 1.1.2- Cấu trúc phân tử DNA 1.1.2.1- Đặc điểm cấu tạo Axit deoxyribonucleic (DNA) là phân tử mang thông tin di truyền của tế bào sống mà trong đó, gen là đơn vị di truyền cơ bản. DNA được xây dựng từ 4 loại nucleotide: dAMP, dGMP, dCMP và dTMP. Gốc đường trong các nucleotide này là deoxyribose. DNA là một polynucleotide, các nucleotide nối với nhau bằng liên kết 3',5' phosphodiester. Hai liên kết ester được hình thành giữa gốc phosphat với carbon thứ 3 của nucleotide này và carbon thứ 5 của nucleotide nằm kề nó (Hình 1-5). Phân tử DNA bao gồm hai sợi polynucleotide ngược chiều nhau, bazơ purine của sợi polynucleotide này nằm đối diện với bazơ pyrimidine của sợi polynucleotide kia theo quy luật bổ sung nghiêm ngặt: adenine đứng đối diện với thymine (A−T) và guanine đứng đối diện với cytosine (G-C). Hai sợi polynucleotide được giữ vững và ổn định nhờ các liên kết hydro giữa các bazơ nitơ của hai mạch (Hình 1-5). - 14 -
H H H H N N N 7 N H N H N 6 5 1N N N 8 2 9 N 4 N N N N N A 3 R R R H H H H N N O H H 4 3 N 5 N N 2 1 6 O N O N O N C R R R D¹ng amin D¹ng imin Ýt gÆp (2 d¹ng quay) H H O O O H N N N N 6 N N H H H N N N N N N N N N G H R H R H R H H O O CH3 CH3 N N O N O N O H R R CH3 N 4 O N O O T R CH 3 CH3 N N D¹ng ceton H O N O N H R R D¹ng enol Ýt gÆp (2 d¹ng quay) Hình 1-5: Vị trí có thể hình thành liên kết hydro của các dạng bazơ nitơ Hướng chuyển dịch điện tử trong liên kết hydro - 15 -
Quy luật liên kết bổ sung giữa hai loại bazơ nitơ do E. Chargaft phát hiện. Khi nghiên cứu thành phần các bazơ nitơ trong phân tử axit nucleic, ông thấy rằng: Số bazơ adenine luôn bằng thymine và số bazơ guanine luôn bằng cytosine. Quy tắc này được gọi là quy tắc Chargaft: A+G A = T và G = C hay = 1 T+C Về sau, các nhà nghiên cứu thấy rằng: số lượng các cặp bazơ A−T và G−C rất khác nhau ở mỗi loài nên quy tắc này được bổ sung nội dung sau: Tỷ lệ (A+T)/(G+C) là tuỳ theo loài Một đặc điểm rất quan trọng của các bazơ nitơ như đã nêu ở phần trên là chúng có các dạng đồng phân. Nếu xét về góc độ hoá học thuần tuý, dựa vào khả năng cho và nhận điện tử của các nguyên tử trong các loại bazơ nitơ (Hình 1-5), thì khi thay đổi dạng đồng phân, bazơ adenine có thể tạo liên kết hydro với cả bazơ thymine (A−T) và cytosine (A−C), tương tự như vậy, bazơ guanine cũng có thể tạo liên kết với cytosine (G−C) và thymine (G−T). Trong điều kiện sinh lý của tế bào, người ta thấy, bazơ adenine và cytosine thường nằm dưới dạng amino, nghĩa là, nguyên tử nitơ gắn với vòng purine và pyrimidine luôn có hai nguyên tử nitơ (−NH2), rất ít khi gặp ở dạng imin (−NH). Tương tự như vậy, ở bazơ guanine và thymine, nguyên tử oxy gắn ở carbon thứ 6 của vòng purine và pyrimidine luôn nằm dưới dạng ceton (C=O) và rất ít khi gặp ở dạng enol (C−OH) (Hình 1-5). Như vậy, vị trí của nguyên tử hydro ở các nhóm thế trên là hết sức quan trọng. Nếu nguyên tử hydro không cố định vị trí thì sẽ dẫn đến sự bắt cặp nhầm giữa A−C và G−T, làm thay đổi trình tự sắp xếp và thành phần các bazơ nitơ trên các sợi polynucleotide. Nếu trường hợp này xảy ra thì bộ máy di truyền sẽ bị biến động, phân tử DNA của thế hệ này sẽ khác thế hệ trước. Tuy nhiên, tế bào cơ thể sống luôn có cách kiểm soát thích hợp để đảm bảo bộ máy di truyền ổn định từ thế hệ này qua thế hệ khác, về vấn đề này, chúng ta sẽ xem xét ở phần sau. - 16 -
1.1.2.2- Cấu trúc bậc II - Mô hình Watson và Crick Năm 1953, Watson và Crick đã khám phá ra mô hình cấu trúc phân tử DNA - đây là một phát minh quan trọng của thế kỷ XX, đánh dấu một bước ngoặt cho sự phát triển của di truyền học. Watson và Crick đã được trao giải thưởng Nobel năm 1962. Theo Watson và Crick, mô hình cấu tạo không gian của DNA có những đặc điểm chính sau: - Phân DNA gồm hai sợi polynucleotide sắp xếp theo hai hướng ngược chiều nhau (đối song song): sợi bên này có đầu 3'−OH thì sợi bên kia sẽ là 5'−P. - Hai sợi cùng xoắn (xoắn đôi) xung quanh một trục chung. - Các bazơ nitơ của hai sợi nằm quay vào trong. Bazơ của sợi này đứng đối diện với bazơ của sợi kia theo quy luật bổ sung A đối diện T và G đối diện C. A nối với T bằng hai liên kết hydro, G nối với C bằng 3 liên kết hydro. - Nhóm phosphat và gốc đường trong chuỗi polynucleotide xoay ra ngoài, hình thành liên kết với nước, đảm bảo tính ổn định cho phân tử. - Mỗi vòng xoắn ốc tương ứng với 10 cặp bazơ, chiều cao của mỗi vòng xoắn ốc là 34Å (1Å = 10-10 m). Như vậy, chiều cao của mỗi nucleotide là 3,4Å, đường kính trong là 20Å (Hình 1-6). 1.1.2.3- Các dạng cấu trúc của DNA Phân tử DNA ở sinh vật eucaryote có dạng thẳng, còn phần lớn tế bào procaryote có dạng vòng. Tuy nhiên, dù vòng hay thẳng, các DNA đều có cấu tạo cuộn xoắn. + Dạng thẳng: Phân tử gồm hai sợi xoắn kép, đối song song, mỗi sợi đều có đầu 3'−OH và 5'−Phosphat tự do. - 17 -
3’ 5’ H O O H N O H 2’ 3’ H OOP H H H N 1’ 4’ N O O H N N N CH Ch2 2 O Guanine N N 4’ H H H 1’ O H 3’ 2’ H H Cytosine O O H O P O O O H ch P O 3 H O H O N N H 3’ H N H H CH H 2 O N N N O H H N O Thymine CH H 3’ H 2 Adenine O H O O P O O 3’ 5’ Hình 1-6: Cấu tạo của 2 sợi polynucleotide và sự bắt cặp bổ sung của các bazơ nitơ - 18 -
3' P OH 5' A T 5' 5' 3' 3' P P 5' C G 5' 3' 3' P P 3' 5' T A 5' 3' 3' P P 3' 5' G 5' 3' C 3' P P 5' 5' A T 5' 3' 3' OH P 3' 5' 3’ ) A nm 4 (3 3,4 ) m n 4A , 34 (3 0, 3’ 5’ Hình 1-7: Mô hình cấu trúc phân tử DNA - 19 -
Ngày nay, người ta đã phát hiện và mô tả được 6 loại cấu trúc xoắn đôi của DNA là A, B, C, D, E và Z. Sự khác nhau giữa các loại được thể hiện chủ yếu ở những đặc điểm sau: - Chiều xoắn (xoắn phải hoặc xoắn trái), - Số lượng đôi bazơ trong mỗi vòng xoắn, - Khoảng cách giữa mỗi đôi bazơ, - Khoảng cách lớn nhất giữa mỗi sợi. Loại B là loại hay gặp nhất trong điều kiện sinh lý và là loại đúng theo mô hình của Watson và Crick, có chiều xoắn phải. Loại Z được tìm thấy trong nhiễm sắc thể của ruồi dấm, có chiều xoắn trái và 12 đôi bazơ trong mỗi vòng xoắn. Loại A được tìm thấy trong môi trường chứa nhiều ion natri hay canxi, có chiều xoắn phải và có 11 đôi bazơ trong mỗi vòng xoắn. Loại C, D và E không có mặt trong cơ thể sống. + Dạng vòng: Phân tử hình tròn, xoắn. Có thể gặp dạng xoắn đơn vòng như DNA và một số virus hay dạng xoắn đôi của DNA vi khuẩn. 1.1.3- Tính chất của DNA Dung dịch DNA có tính keo do phân tử lớn và có tính axit do có chứa gốc axit phosphoric. Dưới tác dụng của các tác nhân như nhiệt hay các chất hóa học (formamide, urê), hai sợi đơn của phân tử DNA bị tách rời do các liên kết hydro giữa các bazơ bổ sung bị phá vỡ - hiện tượng này gọi là sự biến tính của DNA. Giá trị trung bình của khoảng nhiệt độ trong quá trình biến tính gọi là nhiệt độ nóng chảy của DNA (Tm - melting Temperature). Sau khi hai mạch đơn của phân tử DNA tách rời ra, nếu ta giảm nhiệt độ từ từ, cộng với điều kiện thích hợp thì hai mạch sẽ bắt cặp trở lại - hiện tượng này gọi là sự hồi tính. Nếu ta giảm nhiệt độ một cách đột ngột thì sự bắt cặp trở lại sẽ không diễn ra. - 20 -
Các nucleotide trong DNA hấp thụ tia cực tím với độ dài bước sóng tối đa là 260nm. Do vậy, khả năng hấp thụ tia cực tím của hai sợi đơn sẽ lớn hơn một sợi kép. DNA bị thủy phân dưới tác dụng của các enzyme nuclease. 1.1.4- Các thí nghiệm chứng minh DNA là vật chất di truyền 1.1.4.1- Các chứng minh gián tiếp Trước đây, người ta cho rằng, protein là vật chất di truyền, quan niệm này vẫn còn tồn tại cho đến những năm đầu của thế kỷ XX. Sau khi phát hiện ra axit nucleic (1869) và nhà hóa học Đức R. Feulgen tìm ra phương pháp nhuộm màu đặc hiệu với axit nucleic (1914), thì rất nhiều kết quả nghiên cứu về axit nucleic đã làm sáng tỏ rằng, DNA mới là vật chất di truyền chứ không phải là protein. Những phát hiện sau đây gián tiếp cho thấy DNA là vật chất di truyền: - DNA có mặt trong tất cả các tế bào sống, từ vi sinh vật, thực vật cho đến các động vật bậc cao. - DNA là thành phần chủ yếu của các nhiễm sắc thể trong nhân tế bào. - Hàm lượng DNA trong tất cả các tế bào dinh dưỡng (tế bào soma) của một loại sinh vật bất kỳ nào đều giống nhau, không phụ thuộc vào trạng thái hay chức năng của chúng. Ngược lại, hàm lượng RNA và protein lại thay đổi tùy theo trạng thái sinh lý. - Khi gây đột biến bằng tia tử ngoại, người ta thấy hiệu quả gây đột biến cao nhất là ở bước sóng 260nm, là bước sóng mà DNA hấp thụ cao nhất. - Số lượng DNA trong các tế bào sinh dục (trứng, tinh trùng, noãn, phấn hoa, ) bằng một nửa số lượng DNA trong tế bào dinh dưỡng của cơ thể. 1.1.4.2- Thí nghiệm của Griffith và Oswald Avery Năm 1928, Griffith đã phát hiện ra hiện tượng biến nạp (transformation) ở vi khuẩn Streptococcus pneumoniae gây bệnh sưng phổi ở động vật có vú. Vi khuẩn này có hai dạng khác nhau: - 21 -
- Dạng S (Smooth) có khuẩn lạc láng trên môi trường thạch. Tế bào của vi khuẩn dạng này có vỏ bao (capsule) nên hệ thống miễn dịch của cơ thể động vật không thể tấn công tiêu diệt được, vì vậy, khi xâm nhập vào cơ thể, chúng gây nên bệnh sưng phổi. - Dạng R (Rough) có khuẩn lạc nhăn, tế bào của chúng không có vỏ bao, nên khi xâm nhập vào cơ thể động vật, chúng sẽ bị hệ thống miễn dịch của động vật tiêu diệt, không gây nên bệnh. Griffith đã phát hiện ra rằng, nếu tiêm dịch vi khuẩn dạng S đã đun sôi đến chết vào chuột thì chuột không bị bệnh. Nhưng khi tiêm vào chuột hỗn hợp bao gồm một lượng nhỏ vi khuẩn sống dạng R với một lượng lớn tế bào vi khuẩn dạng S đã đun chết, thì chuột phát bệnh và chết. Lấy máu của chuột chết vì bệnh này đưa vào môi trường nuôi cấy, ông thấy sự có mặt của vi khuẩn dạng S. Như vậy, vi khuẩn dạng S không thể tự sống trở lại sau khi bị đun đến chết được, nhưng các tế bào chết này đã truyền tính gây bệnh cho tế bào sống dạng R. Hiện tượng này gọi là biến nạp. Năm 1914, Oswald Avery, Colin Mc. Leod và Maclyn Mc. Carty đã xác định tác nhân gây biến nạp bằng thí nghiệm theo sơ đồ như Hình 1-8. e ym nz e ein ng t » pro ý b n l h© Xö p ñy D¹ng R vµ d¹ng S th TÕ bµo vi khuÈn d¹ng R T¸ch DNA Xö t lý hñ b» y ng ph e ©n nzy D m NA TÕ bµo vi khuÈn DNA + mét sè d¹ng S protein ChØ cã d¹ng R TÕ bµo vi khuÈn d¹ng R Hình 1-8: Sơ đồ thí nghiệm của Oswald Avery, Colin Mc. Leod và Maclyn Mc. Carty - 22 -
DNA của tế bào vi khuẩn gây bệnh dạng S được tách và làm sạch. Mặc dù đã tách và làm sạch nhưng sản phẩm thu nhận được vẫn còn một ít protein. Giả thiết, nếu protein là tác nhân gây biến nạp thì sau khi xử lý loại bỏ protein bằng enzyme protease và phối trộn với tế bào sống dạng R, thì hiện tượng biến nạp sẽ không xảy ra. Ngược lại, nếu tác nhân biến nạp là DNA thì sau khi loại bỏ DNA bằng enzyme deoxyribonuclease và phối trộn với tế bào sống dạng R thì cũng sẽ không xuất hiện hiện tượng biến nạp. Kết quả thí nghiệm cho thấy, hiện tượng biến nạp chỉ tìm thấy khi có mặt DNA, còn ở trường hợp DNA bị enzyme phá hủy thì không xuất hiện hiện tượng biến nạp. Điều đó khẳng định rằng, chính DNA là tác nhân gây biến nạp, truyền tính gây bệnh từ tế bào dạng S sang tế bào dạng R của vi khuẩn. 1.1.4.3- Thí ngiệm của A. Hershey và M. Chase Năm 1952, bằng thí nghiệm về sự xâm nhập của virus bacteriophage T2 (gọi tắt là phage) vào vi khuẩn E. Coli, Alfred Hershey và Martha Chase đã chứng minh trực tiếp rằng, DNA chính là vật chất di truyền. Protein §Çu DNA Trô ®u«i §u«i §Üa gèc L«ng ®u«i S 32 P 35 b¬m vµo Hình 1-9: Sơ đồ về sự xâm nhập của virus phage T2 Phage T2 có cấu tạo gồm 2 thành phần chính, vỏ protein bên ngoài và DNA ở bên trong phần đầu, tỷ lệ giữa 2 thành phần này là tương đương. Khi xâm nhập vào vi khuẩn, người ta xác định rằng: đầu tiên, phần đuôi của phage bám vào màng tế bào của vi khuẩn, sau đó, một phần chất nào đó được bơm - 23 -
vào tế bào vi khuẩn và sau một thời gian, rất nhiều tế bào virus mới được tạo thành bên trong tế bào của vi khuẩn và chui ra ngoài. Thí nghiệm của A. Hershey và M. Chase được tiến hành với mục đích xác định xem, chất nào của phage được bơm vào tế bào vi khuẩn để tạo ra các thế hệ phage mới. Dựa vào thành phần cấu tạo của DNA và protein, người ta thấy rằng: DNA chứa nhiều phospho nhưng không chứa lưu huỳnh, còn protein thì chứa lưu huỳnh. Vì vậy họ đã sử dụng 2 đồng vị phóng xạ là S35 và P32 để gắn vào protein và DNA của phage T2 nhằm dễ dàng theo dõi. Tiến trình thí nghiệm gồm các bước sau: 35 32 - Tạo ra một thế hệ phage T2 có protein chứa S và có DNA chứa P bằng cách nuôi vi khuẩn E. Coli trên môi trường có S35 và P32. Thế hệ phage 35 32 T2 mới tạo thành sẽ mang đồng vị phóng xạ S và P . - Tách virus đã mang đồng vị phóng xạ. - Cho virus mang đồng vị phóng xạ xâm nhập vào tế bào vi khuẩn E. Coli không mang đồng vị phóng xạ. Bước này thực hiện bằng cách cho phage T2 tiếp xúc với tế bào vi khuẩn trong khoảng thời gian đủ để virus bám vào màng tế bào của vi khuẩn và bơm vật chất di truyền của chúng vào trong tế bào, rồi dung dịch được lắc mạnh và li tâm để tách rời tế bào vi khuẩn ra khỏi phần còn lại của phage bên ngoài tế bào. - Phân tích thành phần phóng xạ ở phần nằm ngoài tế bào vi khuẩn của phage và phần nằm bên trong tế bào vi khuẩn. Kết quả cho thấy: Phần nằm ngoài tế bào vi khuẩn của phage có chứa nhiều S35 (80%) nhưng rất ít P32. Điều đó cho thấy rằng, phần lớn protein của vỏ phage nằm ngoài tế bào vi khuẩn. Ngược lại, phần bên trong tế bào vi khuẩn có chứa nhiều P32 (70%), nhưng ít S35, chứng tỏ rằng, DNA được bơm vào tế bào vi khuẩn để sinh sản ra một thế hệ phage mới. Từ các kết quả thí nghiệm đi đến kết luận: Vật chất di truyền của phage T2 là DNA. - 24 -
1.2- CÁC RNA 1.2.1- Cấu tạo hóa học và đặc điểm chung của RNA Axit ribonucleic (RNA) cũng là một axit nucleic. Hai đặc điểm cơ bản về cấu tạo, phân biệt giữa axit ribonucleic và axit deoxyribonucleic là cấu tử đường và bazơ nitơ. Trong phân tử RNA có chứa đường ribose, còn trong DNA có chứa đường deoxyribose. Thành phần các bazơ pyrimidine trong RNA và DNA cũng khác nhau. DNA chứa cytosine và thymine, không bao giờ có uracil, ngược lại, RNA chứa cytosine và uracil, không khi nào có thymine. Ngoài ra, trong RNA có nhiều bazơ thứ yếu (các bazơ nitơ ít gặp) hơn trong DNA. Đơn vị cơ bản xây dựng nên RNA cũng là các nucleotide. Các nucleotide liên kết với nhau cũng bằng liên kết 3'-5'-phosphodiester để tạo thành phân tử polynucleotide như DNA. Về cấu trúc phân tử, RNA có cấu trúc mạch đơn chứ không phải là mạch kép như DNA. Cấu trúc bậc I của RNA xác định trật tự sắp xếp các gốc nucleotide trong chuỗi polynucleotide. Hình 1-10: Mô hình biểu diễn khả năng tạo thành cấu trúc xoắn đôi ở những đoạn RNA có các trình tự bazơ bổ sung Cấu trúc bậc II của RNA cũng là xoắn nhưng khác với DNA, phân tử RNA là một chuỗi polynucleotide liên tục nên cấu tạo xoắn chỉ thực hiện trong phạm vi một phân tử. Khi đó, chuỗi polynucleotide tạo cấu trúc xoắn bằng cách tạo nên các liên kết hydro giữa adenine và uracil (A−U) và giữa guanine và cytosine (G−C). Trong cấu trúc bậc II của RNA, chỉ có khoảng 50% chuỗi polynucleotide của phân tử RNA được xoắn, còn các phần khác thì không. Hơn nữa, cấu hình của các đoạn xoắn cũng chưa hoàn thiện như ở DNA. Do không có sự tương ứng hoàn toàn trong trật tự của các bazơ bổ sung nên một số mắt xích nucleotide riêng lẻ có dạng vòm lồi. - 25 -
RNA nằm trong bào tương, trong ribosome và cả trong nhân tế bào, nhưng tập trung chủ yếu trong bào tương. 1.2.2- Các loại RNA 1.2.2.1- RNA thông tin (mRNA) RNA thông tin (messenger RNA) được tổng hợp trong nhân tế bào trên khuôn của DNA nên chúng chứa một lượng lớn thông tin cần thiết cho sự tổng hợp các protein đặc hiệu khác nhau. Độ lớn của mRNA phụ thuộc vào độ lớn của protein cần tổng hợp, như vậy, các phân tử mRNA của một tế bào có kích thước rất khác nhau và trình tự nucleotide của các RNA thông tin cũng rất khác nhau. Sau khi được tổng hợp ở nhân tế bào, mRNA sẽ chuyển từ nhân đến ribosome, mang những thông tin cần thiết cho quá trình tổng hợp protein. Sơ đồ cấu trúc chung của các phân tử mRNA có thể chia làm ba đoạn: ở đầu 5’ có đoạn dẫn đầu, tiếp sau là đoạn mã hóa protein và đoạn theo sau, đoạn dẫn đầu và đoạn theo sau không mang mã cho các axit amin. 5’ 3’ Hình 1-11: Sơ đồ cấu trúc chung của phân tử mRNA 1.2.2.2- RNA vận chuyển (tRNA) tRNA (transfer RNA) làm nhiệm vụ vận chuyển các axit amin đã được hoạt hóa đến ribosome là nơi tổng hợp nên phân tử protein. tRNA chiếm khoảng từ 10% đến 20% tổng lượng RNA của tế bào, và có trọng lượng phân tử không lớn lắm, nó chỉ chứa khoảng từ 75 đến 90 nucleotide. Ngày nay, người ta đã xác định được thành phần và trật tự sắp xếp của hơn 100 tRNA. Mỗi axit amin trong 20 axit amin, có thể kết hợp với một hoặc một số dạng tRNA. Điểm khác trong cấu tạo của tRNA là, ngoài bốn bazơ nitơ thông thường là A, G, C và U, nó còn chứa một lượng nhỏ các bazơ bổ sung phụ như 6-methylaminadenine, dimethylguanine, inosine, - 26 -
A Alanine C C I Inosine 5' A D Dihydrouridine G C T Ribothymidine G C mG1 Methylguanosine G U m 2G Dimethylguanosine G 2 C mI1 Methylinosine G C U U G C m 1 G A G G C C A U G U G C G C G D C U CCGG G GCG C C G A D 2 D m 2 G C G A G U A C¸c baz¬ ngo¹i lai C G Y Pseudouridine C G CCG C G Codon U I C C Anticodon U I G C m 1 I 3' C C G 5' mRNA Hình 1-12: Mô hình cấu tạo RNA vận chuyển alanine của nấm men Có thể tóm tắt một số điểm chính về cấu tạo của phân tử tRNA như: - Ở đầu 3’ của phân tử luôn kết thúc bằng bộ ba CCA, còn ở đầu 5’-(nhóm monophosphat) thường kết thúc bằng gốc axit guanilic (G). Ở mỗi phân tử thường có bốn đoạn có chứa các liên kết hydro giữa các bazơ bổ sung và 4 vùng lồi, ở đó, giữa các nucleotide không có liên kết hydro vì các bazơ không có cặp bổ sung. - Đầu 3’ kết thúc bằng 3 nucleotide CCA−OH. Phân tử aminoaxit luôn luôn gắn ở đầu 3’ ở bazơ A cuối. - 27 -
O H H H N O H N H HN O H N H C C C C C N N N C N H N C H N H O Ribose Ribose Ribose N C C N N H O Ribose N H H Inosine-Cytosine Anticodon Codon Guanine-Uracil Codon hoÆc Codon hoÆc anticodon anticodon O H CC H H N O H N C H HN O H N N H C C C C C C N C C CC N N N C N H O Ribose C N H N C Ribose Ribose Ribose N C N C C N H H H Inosine-Uracil Inosine-Adenine Anticodon Codon Anticodon Codon UCU Anticodon UCU 5’ AAG 3’ Sîi mRNA 5’ AAG 3’ Codon Codon Baz¬ U cña anticodon cã thÓ liªn kÕt víi baz¬ A hoÆc G cña codon CCI Anticodon CC I CC I 5’ GGU 3’ Sîi mRNA 5’ GGC 3’ 5’ GGA 3’ Codon Codon Codon Baz¬ I cña anticodon cã thÓ liªn kÕt víi baz¬ U, C hoÆc A cña codon Hình 1-13: Sự hình thành liên kết hydro giữa nucleotide thứ 3 trong codon với bazơ ngoại lai và bazơ không nằm theo quy luật (A−U, G−C) trong anticodon của phân tử tRNA - 28 -
- Vùng lồi nằm gần kề đầu 3’ (Hình 1-12) chứa 7 bazơ không sắp xếp theo quy luật bổ sung, nên giữa các bazơ không có các liên kết hydro. Hiện nay, người ta cho rằng, RNA vận chuyển gắn với bề mặt của ribosome nhờ vùng lồi này. - Vùng lồi kế tiếp (tính từ đầu 3’) với độ lớn rất thất thường, gọi là vùng lồi phụ (extra loop). - Vùng lồi thứ ba (Hình 1-12) chứa 7 bazơ không có liên kết hydro (không bổ sung), trong đó có 3 bazơ chủ yếu kề nhau - anticodon là bộ ba đối mã, bộ ba này sẽ bổ sung cho bộ ba mã hóa (codon) trên RNA thông tin. Nhờ vậy, các axit amin được đưa đến đúng vị trí trong quá trình tổng hợp protein. tRNA vận chuyển alanine ở nấm men ở vị trí thứ ba của bộ đối mã (anticodon) là bazơ inosine (I) là dẫn xuất của purine, inosine có thể tạo liên kết bổ sung với cả ba loại bazơ là A, U và C (Hình 1-13). - Vùng lồi tiếp theo (thứ tư) chứa 8 đến 12 bazơ không bổ sung, gọi là vùng lồi D (D-loop). 1.2.2.3- RNA ribosome (rRNA) Ribosome được cấu tạo từ hai tiểu đơn vị, gồm một tiểu đơn vị lớn và một tiểu đơn vị nhỏ. Mỗi tiểu đơn vị được xây dựng từ ba thành phần chính là protein, lipit và rRNA. Có ba loại phân tử rRNA thường gặp trong tế bào vi khuẩn, đó là: - rRNA có độ dài 1542 nucleotide (16S) trong tiểu đơn vị nhỏ của ribosome, - rRNA có độ dài 2904 nucleotide trong tiểu đơn vị lớn (23S), - rRNA rất nhỏ, có độ dài 120 nucleotide (5S) cũng nằm trong tiểu đơn vị lớn. - Trong tế bào sinh vật eucaryote, tiểu đơn vị nhỏ của ribosome chứa sợi rRNA 18S, còn tiểu đơn vị lớn chứa hai sợi rRNA là 28S và 5,8S. Trong cả ba loại rRNA đều có số lượng các bazơ bổ sung không bằng nhau (G≠C và A≠U). - 29 -
1.2.2.4- Nhiễm sắc thể Nhiễm sắc thể có thể quan sát rõ dưới kính hiển vi ở kỳ giữa của phân bào nguyên nhiễm. Nhiễm sắc thể có cấu trúc phức tạp, đặc biệt là nhiễm sắc thể của các vi sinh vật nhân chuẩn (eucaryote). Trong một nhiễm sắc thể có một phân tử DNA sợi kép cuộn xoắn, liên kết với protein histon. Mỗi nhiễm sắc thể có hình dạng đặc trưng riêng, hình dạng đó có thể quan sát rõ trong thời kỳ phân bào. Tế bào sinh vật đơn bội có một bộ nhiễm sắc thể (n NST), ví dụ như ở vi khuẩn có một nhiễm sắc thể. Sinh vật lưỡng bội như con người và động vật, tế bào có hai bộ nhiễm sắc thể (2n NST). Sinh vật lưỡng bội thường sinh sản hữu tính nên trong cơ thể, ngoài tế bào dinh dưỡng (tế bào soma) còn có tế bào giới tính. tế bào dinh dưỡng luôn có 2n nhiễm sắc thể, còn tế bào giới tính chỉ có n nhiễm sắc thể. Ở các tế bào lưỡng bội (2n NST), mỗi nhiễm sắc thể có một cặp giống nhau, gọi là nhiễm sắc thể tương đồng. Số lượng nhiễm sắc thể trong tất cả các tế bào dinh dưỡng của một cơ thể sống đều giống nhau, cho dù chức năng hoạt động của các cơ quan trong cơ thể sống khác nhau. Số lượng nhiễm sắc thể là đặc trưng cho từng loài, ví dụ: - Người : 2n = 46 nhiễm sắc thể, - Ruồi dấm: 2n = 8 nhiễm sắc thể, - Vịt: 2n = 80 nhiễm sắc thể, - Ngựa: 2n = 64 nhiễm sắc thể. Số lượng nhiễm sắc thể không mang ý nghĩa cho sự tiến hóa. Nhiễm sắc thể nhìn rõ nhất dưới kính hiển vi vào kỳ giữa của nguyên phân, khi các mạch đã xoắn và co ngắn một cách cực đại. Mỗi nhiễm sắc thể có một điểm thắt eo gọi là tâm động (centromere). Tâm động chia nhiễm sắc thể làm hai phần với chiều dài khác nhau. Dựa vào vị trí tâm động có thể phân biệt ba kiểu hình thái của nhiễm sắc thể: - Nhiễm sắc thể cân tâm: Tâm động nằm ở giữa nhiễm sắc thể. - 30 -
- Nhiễm sắc thể lệch tâm: Tâm động chia nhiễm sắc thể làm hai phần không đều nhau, một bên dài và một bên ngắn. - Nhiễm sắc thể mút tâm: Tâm động nằm ở gần cuối của một đầu, chia nhiễm sắc thể làm hai phần rất không đều nhau, một bên rất dài và một bên rất ngắn. Bằng phương pháp nhuộm màu và quan sát dưới kính hiển vi quang học ở giai đoạn không phân bào, người ta nhận thấy trên nhiễm sắc thể có vùng nhuộm màu đậm và có vùng nhuộm màu rất ít. Vùng bắt màu đậm gọi là chất dị nhiễm sắc (heterochromatine) và vùng ít bắt màu thuốc nhuộm gọi là chất nguyên nhiễm sắc (euchromatine). Ngày nay, bằng những thiết bị nghiên cứu hiện đại, người ta đã chứng minh rằng, ở trạng thái cuộn xắn cao của phân tử DNA và protein, nhiễm sắc thể sẽ bắt màu tốt với thuốc nhuộm, còn ở trạng thái giãn xoắn thì sự bắt màu kém hơn. Như vậy, chất dị nhiễm sắc là trạng thái cuộn xoắn, không phiên mã được của DNA, còn chất nguyên nhiễm sắc là trạng thái DNA đang hoạt động và giãn xoắn. 1.3- MÃ DI TRUYỀN 1.3.1- Khái niệm về mã di truyền Chúng ta biết rằng, trình tự các bazơ nitơ trên DNA quyết định trình tự của axit amin trên protein tương ứng. Tất cả có 20 axit amin trong protein, nhưng chỉ có 4 loại bazơ nitơ trong DNA. Như vậy, nếu mỗi bazơ nitơ xác định một axit amin, thì chỉ có 4 axit amin được xác định. Nếu cứ hai bazơ nitơ xác định một axit amin, thì số lượng các axit amin được xác định chỉ là 42=16, còn thiếu 4 axit amin chưa được xác định. Vậy, tối thiểu phải 3 bazơ nitơ xác định một axit amin. Như thế, số tổ hợp bộ ba có thể có từ 4 bazơ là 43=64. Nếu mã di truyền là những bộ ba thì xảy ra trường hợp nhiều bộ ba xác định một axit amin. Ngày nay, bằng kết quả thực nghiệm, người ta đã chứng minh rằng, bộ ba mã di truyền là đúng. Trong bộ mã di truyền, một bộ ba nucleotide được gọi là codon. - 31 -
1.3.2- Đặc tính của mã di truyền Mã di truyền có một số đặc tính sau: 1,- Mã di truyền không có dấu phẩy, nghĩa là thông tin di truyền được đọc theo từng cụm 3 nucleotide một cách liên tục, không ngắt quãng. 2,- Thông tin được đọc theo một chiều, bắt đầu từ một điểm xác định. Bảng 1-2: Bảng mã di truyền VÞ trÝ thø hai U C A G 5' u UUU UCU UAU UGU U 3' Phe Tyr Cys u Đầ UUC UCC UAC UGC C Ser Đầ t - U ấ UUA UCA UAA* Stop UGA* Stop A Leu ba - nh UUG UCG UAG* Stop UGG Trp G ứ ứ CUU CCU CAU CGU U His trí th trí th ị ị CUC CCC CAC CGC C V V C Leu Pro Arg CUA CCA CAA CGA A Gln CUG CCG CAG CGG G AUU ACU AAU Asn AGU Ser U AUC Ile ACC AAC AGC C A Thr AUA ACA AAA AGA A Lys Arg AUG* Met ACG AAG AGG G GUU GCU GAU Asp GGU U GUC GCC GAC GGC C G Val Ala Gly GUA GCA GAA Glu GGA A GUG* GCG GAG GGG G 3,- Mã di truyền mang tính phổ biến, nghĩa là tất cả mọi sinh vật đều dùng chung một loại thông tin. Ví dụ: Một gen lấy từ tế bào động vật mã hóa cho một loại protein nào đó. Gen đó dù được dịch mã trong tế bào động vật hay dịch mã trong tế bào E. Coli, thì cũng chỉ tổng hợp nên một loại protein mà thôi. 4,- Mã di truyền mang tính thoái hóa (degenerate), nghĩa là, nhiều bộ ba cùng xác định một axit amin, trừ hai ngoại lệ là bộ ba AUG mã hóa cho methionine và UGG mã hóa cho trytophan. - 32 -
Ví dụ: Valine có 4 bộ ba mã hóa cho nó là GUU, GUC, GUA và GUG. Sự khác nhau chủ yếu của các bộ ba này là ở nucleotide thứ ba. Tuy vậy, không phải lúc nào cặp nucleotide đầu giống nhau cũng mã hóa cho một axit amin, ví dụ trường hợp của leucine có 6 bộ ba mã hóa, trong đó có hai bộ ba có hai nucleotide đầu khác với 4 bộ ba kia, đó là UUA, UUG và CUU, CUC, CUA, CUG. 5,- Mã di truyền có những bộ ba khởi đầu và kết thúc đặc hiệu. AUG là tín hiệu khởi đầu, nếu nó không có ở đầu 5’ của RNA thông tin thì quá trình dịch mã không bắt đầu được. Các bộ ba kết thúc là UAG, UAA và UGA. 1.4- VẬT CHẤT DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ NHÓM SINH VẬT 1.4.1- Vật chất di truyền của virus Virus được phát hiện vào cuối thế kỷ 19, có kích thước rất nhỏ, sống ký sinh trên các loài sinh vật khác nhau, không có cấu tạo tế bào hoàn thiện, nghĩa là không có màng tế bào, không có các bào quan. Virus không có thể tự tổng hợp protein khi chúng nằm bên ngoài tế bào chủ, nên sau khi đã hình thành, chúng không tăng về kích thước. Cấu tạo của virus đơn giản gồm một bộ máy di truyền của nó, gói trong vỏ protein, bên ngoài có thể có màng bao. Bộ máy di truyền của virus chỉ có một loại axit nucleic: DNA (mạch kép hoặc mạch đơn) hoặc RNA. Cấu trúc của phân tử axit nucleic trong virus có thể ở dạng thẳng hoặc dạng vòng. Bộ gen nhỏ nhất có 4 gen, lớn nhất có chừng vài trăm gen. Virus chỉ có thể tự tái bản bộ máy di truyền của mình và tổng hợp protein bao gói bộ máy di truyền trong tế bào chủ. 1.4.2- Vật chất di truyền của vi khuẩn Vi khuẩn là loại vi sinh vật có cấu trúc tế bào nhưng đơn giản, tức là chúng có màng tế bào, nguyên sinh chất và các bào quan, tuy nhiên, chúng chưa có màng nhân. Bộ máy di truyền của vi khuẩn nằm trong nguyên sinh chất là phân tử DNA mạch kép vòng tròn, được gọi là nhiễm sắc thể. Ngoài nhiễm sắc thể, trong tế bào vi khuẩn còn có plasmid - là những phân tử DNA nhỏ, mạch vòng, xoắn kép, chúng có khả năng phân chia độc lập không phụ thuộc vào DNA nhiễm sắc thể. - 33 -
Vi khuẩn thuộc nhóm tế bào đơn bội - có số nhiễm sắc thể là n, các tế bào lưỡng bội luôn có số lượng nhiễm sắc thể là 2n. Bộ máy di truyền của vi khuẩn E. Coli được nghiên cứu kỹ nhất. E. Coli có một nhiễm sắc thể (chromosome), bộ gen có khoảng 2.000 đến 4.000 gen trên phân tử DNA vòng tròn, xoắn kép bao gồm khoảng 4,5 triệu nucleotide, cấu trúc không gian nằm dưới dạng siêu xoắn. 1.4.3- Vật chất di truyền của eucaryote 1.4.3.1- DNA trong nhân Tế bào của các sinh vật có nhân điển hình (eucaryote) cấu tạo hoàn thiện, bao gồm màng tế bào, nguyên sinh chất, các bào quan và nhân tế bào. Khác với tế bào vi khuẩn, nhân tế bào có màng nhân bao bọc. Bộ máy di truyền của tế bào là những phân tử DNA nằm trong cấu trúc nhiễm sắc thể. Mỗi nhiễm sắc thể chứa một phân tử DNA thẳng, mạch xoắn kép. Các nhiễm sắc thể phân bố trong nhân. Số lượng và hình dạng của nhiễm sắc thể là đặc trưng cho mỗi loài sinh vật. Các tế bào dinh dưỡng của nhóm sinh vật eucaryote đều có số lượng nhiễm sắc thể là 2n (tế bào lưỡng bội). Tế bào giới tính chỉ có một bộ nhiễm sắc thể n (tế bào đơn bội). Histone H2A, H2B, H3 vµ H4 5 5 A §o¹n liªn kÕt 110A Hình 1-14: Sơ đồ cấu tạo của nucleosome Các nhiễm sắc thể của eucaryote có tổ chức phức tạp. Mỗi nhiễm sắc thể chứa một phân tử DNA dài mạch xoắn kép liên kết với protein histone và cuộn lại, tạo thành phức hợp nucleoprotein. - 34 -
Histone là những protein có phân tử nhỏ chứa nhiều axit amin mang điện tích dương như lysine, arginine nên dễ liên kết với phân tử DNA mang điện tích âm. Phân tử DNA trong nhiễm sắc thể được cuộn xoắn ở nhiều mức độ khác nhau. Nucleosome là đơn vị cấu trúc cơ bản, được tạo nên do một đoạn DNA khoảng 200 cặp nucleotide liên kết với 5 loại protein histone là H1, H2A, H2B, H3 và H4. Cấu tạo của mỗi nucleosome gồm một đoạn DNA khoảng 145 cặp nucleotide quấn quanh một cái lõi gồm 8 protein histone là 2H2A, 2H2B, 2H3 và 2H4 và một đoạn DNA liên kết có độ dài khoảng 55 cặp nucleotide, đoạn này gắn với protein histone H1. Độ dài của đoạn DNA liên kết này thay đổi tùy theo chủng loại sinh vật. Các nucleosome xếp sát vào nhau, tạo thành sợi chromatin. Sợi chromatin cuộn xoắn, uốn khúc nhiều lần, tạo thành vùng xếp cuộn dày đậm đặc, gọi là chất dị nhiễm sắc. Chất dị nhiễm sắc là trạng thái cuộn xoắn cao của phức hợp nucleoprotein ở thời kỳ phân bào (Hình 1-15). Các nhiễm sắc thể được nhân đôi lên trước thời kỳ phân bào và sau đó, chia đều về cho các tế bào con trong thời kỳ phân bào. Như vậy, các thông tin di truyền được truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác. - 35 -
A B Nucleosome C Sîi Chromatin D Vïng xÕp cuén E ChÊt dÞ nhiÔm s¾c F NhiÔm s¾c thÓ Hình 1-15: Cách sắp xếp của phức hợp nucleprotein, tạo thành nhiễm sắc thể ở giai đoạn phân chia tế bào - 36 -
1.4.3.2- DNA ngoài nhân Có một số bào quan trong tế bào chất như ti thể và lục lạp của tế bào eucaryote có chứa DNA. Các DNA ngoài nhân này cũng mang gen mã hóa cho protein và truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác, tuy nhiên, sự phân ly của các gen tế bào chất không tuân theo các định luật của Mendel vì cơ chế phân chia tế bào chất về các tế bào con không đều như các nhiễm sắc thể trong nhân. Lục lạp và ti thể là hai loại bào quan tham gia trực tiếp vào quá trình chuyển hóa năng lượng của tế bào. Để phân biệt với DNA nhiễm sắc thể, DNA của lục lạp được ký hiệu là cpDNA (chloroplast DNA) và DNA của ti thể được ký hiệu là mtDNA (mitochondrial DNA). Bộ gen của cpDNA mã hóa cho các protein trong thành phần của lục lạp. cpDNA có cấu trúc dạng vòng tròn, sợi xoắn đôi có kích thước nhỏ, khoảng từ 120 đến 200kb (kilobazơ) tùy theo chủng loại thực vật. DNA của ti thể (mtDNA) mã hóa cho nhiều protein của màng bên trong ti thể và một số protein tham gia vào chuỗi chuyển vận điện tử. mtDNA cũng có cấu trúc dạng vòng tròn nhưng nhỏ hơn cpDNA nhiều lần. Mặc dù bộ máy di truyền ngoài nhân là các DNA của ti thể và lục lạp có thể tự nhân đôi một cách độc lập và có bộ máy tổng hợp protein riêng, nhưng hoạt động của chúng có sự phối hợp chặt chẽ với bộ máy di truyền trong nhân, hoạt động của các gen ngoài nhân góp phần bổ sung cho các hoạt động của các gen trong nhân. Như vậy, trong các loại tế bào eucaryote có chứa lục lạp thì tồn tại ba loại DNA là DNA nhiễm sắc thể, cpDNA và mtDNA, còn các tế bào không có lục lạp thì chỉ có hai loại là mtDNA và DNA nhiễm sắc thể. - 37 -
CHƯƠNG II HOẠT ĐỘNG VÀ SỰ BIỂU HIỆN CỦA GEN 2.1- GEN LÀ ĐƠN VỊ CHỨC NĂNG CỦA BỘ MÁY DI TRUYỀN 2.1.1- Các quan niệm về gen Thuật ngữ "gen" được Johansen nêu ra vào năm 1909 để chỉ nhân tố di truyền xác định một tính trạng nào đó. Vị trí và cấu trúc của gen đã được Morgan và các nhà khoa học xác định và ngày càng làm rõ thêm. Giai đoạn trước năm 1953, khi cấu trúc của phân tử DNA chưa được khám phá thì cấu tạo của gen cũng chưa được xác định, tuy nhiên các nhà khoa học đã khẳng định rằng, gen là một đơn vị di truyền, mỗi một gen xác định một tính trạng, có một vị trí nhất định trên nhiễm sắc thể và gen có thể phân chia nhỏ về mặt tái tổ hợp và đột biến. Năm 1941, Beadle và Tatum đã xác định rằng, gen kiểm tra hoạt tính của enzyme và nêu ra giả thuyết là: mỗi gen kiểm soát sự tổng hợp một enzyme. Giả thuyết này về sau được mở rộng và cụ thể hóa hơn là: mỗi gen kiểm soát sự tổng hợp một chuỗi polypeptide. Ví dụ, một phân tử enzyme được cấu tạo từ hai sợi polypeptide thì sẽ do hai gen xác định. Sau khi Watson và Crick xác định được cấu trúc DNA thì cấu tạo của gen cũng ngày càng được làm rõ hơn. Hiện nay, cấu tạo và chức năng của một gen được xác định như sau: - Gen là một đoạn DNA đảm bảo cho việc tạo ra một polypeptide hay một RNA. Mỗi gen có cấu tạo gồm ba vùng (region) có chức năng riêng biệt là: vùng trước, vùng sau và vùng mã hóa. Vùng trước làm nhiệm vụ điều hành, vùng trước và vùng sau không mã hóa cho các axit amin. Trong vùng mã hóa ở tế bào sinh vật eucaryote có những đoạn mang mã cho các axit amin gọi là exon xen kẽ với những đoạn không mang mã gọi là intron. Mỗi gen chiếm một vị trí (locus) nhất định trên nhiễm sắc thể và xác định một tính trạng nhất định. Gen có thể bị chia nhỏ bởi các đơn vị đột biến và tái tổ hợp. - 38 -
2.1.2- Cấu trúc của gen Mỗi một gen có cấu tạo tổng quát gồm ba vùng chính: vùng điều khiển (vùng trước), vùng mang thông tin di truyền (vùng mã hóa) và vùng kết thúc (vùng sau). Vùng điều khiển nằm ở đầu 3’ và vùng kết thúc nằm ở đầu 5’ của sợi DNA làm khuôn (coding strand hoặc sense) để phiên mã. Tuy nhiên, khi ghi sơ đồ của một gen bất kỳ nào đó vào ngân hàng gen, người ta đều lấy sợi DNA không làm khuôn (antisense) vì trình tự sắp xếp các bazơ trong sợi antisense giống như trình tự sắp xếp các bazơ trong sợi RNA sau khi phiên mã. Do đó, có thể nói vùng điều khiển nằm ở đầu 5’ và vùng kết thúc nằm ở đầu 3’ của gen. Vùng điều khiển và vùng kết thúc không mang mã cho các axit amin trong quá trình tổng hợp protein. Ngoài ra, trong một gen còn có thể có một số cấu trúc đặc thù khác, có vị trí không xác định như trình tự tăng cường (enhance), trình tự bất hoạt (silencer), Sơ đồ cấu trúc chung của một gen có thể biểu diễn như sau: vùng mang thông tin di truyền 5' R P O 3' vùng điều khiển vùng kết thúc R: Trình tự điều hoà P: Promoter O: Operator Vùng điều khiển không được phiên mã mà có chức năng giúp enzyme RNA-polymerase thực hiện sự phiên mã chính xác. 2.1.2.1- Cấu trúc của promoter Promoter là trình tự nhận biết của enzyme RNA-polymerase và là nơi mà enzyme RNA-polymerase gắn vào để xác định vị trí bắt đầu phiên mã. Do vậy nên promoter có những cấu trúc đặc hiệu giúp enzyme nhận biết chính xác. Khảo sát nhiều promoter khác nhau của các gen, người ta nhận thấy phần tâm của promoter có những trình tự chung giống nhau và gọi là các hộp, ví dụ ở E. Coli có hộp TATAAT. Hộp này thường nằm ở vị trí khoảng −10, - 39 -
tức là nằm ở khoảng 10 nucleotide phía trước vị trí khởi đầu phiên mã hay trình tự TTGACA nằm ở vị trí −35, tức là khoảng 35 nucleotide trước vị trí khởi đầu phiên mã. Ở vi khuẩn có một loại promoter vì chỉ có một loại RNA- polymerase. VÞ trÝ khëi ®Çu 35 10 phiªn m· cña RNA TTGACA TATAAT CTG TTGACA AATT AATCCT GGAACTATATAAT AGGGTACCAAT GAC AAC TGTTTAA TTAGGA CCTTGATAATTTATTCCCAAGGTT Hình 2-1: Vùng tâm promoter của operon Trp ở vi khuẩn Ở tế bào eucaryote, vùng điều khiển thường lớn hơn ở tế bào procaryote. Eucaryote có ba loại enzyme RNA-polymerase nên chúng có ba loại promoter, mỗi loại ứng với một loại enzyme để chúng dễ dàng nhận biết và bám vào đó để thực hiện phiên mã. Promoter nhóm I là vị trí bám của enzyme RNA-polymerase I, promoter nhóm II và nhóm III là vị trí bám của enzyme RNA-polymerase nhóm 2 và nhóm III. Mỗi loại promoter có những trình tự chung giống nhau, các trình tự này định vị ở những vị trí xác định, do đó, các enzyme dễ dàng nhận biết và thực hiện phiên mã chính xác. 2.1.2.2- Cấu trúc vùng mang thông tin di truyền Ở tế bào sinh vật procaryote, các gen được tổ chức theo dạng operon, nghiã là, mỗi một gen mang mã để tổng hợp một số chuỗi polypeptide. Vùng mang mã để tổng hợp một polypeptide gọi là một cistron. Như vậy, gen ở tế bào procaryote thuộc loại polycistron. Các cistron sắp xếp theo từng nhóm, chung một vùng điều khiển tạo thành một operon. Các protein được mã hóa trong một operon thường có liên quan chặt chẽ với nhau trong một quá trình chuyển hóa sinh hóa nào đó trong tế bào. Kiểu tổ chức bộ máy di truyền như vậy giúp vi khuẩn thích nghi nhanh với những thay đổi của điều kiện ngoại cảnh môi trường. Toàn bộ vùng mang thông tin di truyền được mã hóa cho các polypeptide. Vùng mang mã di truyền của sinh vật eucaryote có cấu trúc phức tạp hơn. Phần lớn các gen có chứa các đoạn không mang mã (intron) nằm xen kẽ với các đoạn mang mã (exon). Chỉ có một số ít các gen là không có intron như một số gen mã hóa cho protein histon. Ở nhiều gen, phần không mang mã (intron) có tổng độ dài lớn hơn tổng độ dài của các đoạn mang mã, như gen - 40 -
mã hóa cho albumin, conalbumin, Số lượng intron có mặt trong các gen cũng không giống nhau, ví dụ như ở gen mã hóa cho α-globin chỉ có hai intron, trong khi đó, ở gen mã hóa cho colagen lại có đến 52 intron. Các đoạn intron sẽ được cắt bỏ trong quá trình phiên mã. Điểm giao tiếp giữa intron và exon có những dấu hiệu riêng biệt, đó là các cặp bazơ GU và AG ( GU AG ). 2.1.2.3- Cấu trúc vùng kết thúc Vùng kết thúc nằm ở đầu 5’ của sợi DNA làm khuôn (sense) - là đầu 3' của gen (sợi antisense), bao gồm những trình tự không mã hóa cho các axit amin. Vùng này thường có các tín hiệu dừng phiên mã, giúp enzyme RNA- polymerase dừng phiên mã đúng vị trí. Ngoài ra, trong vùng này còn có một số trình tự có chức năng chưa rõ ràng. 2.2- SỰ SAO MÃ DNA (Replication) Một trong những tính chất căn bản của DNA là khả năng tự sao chép (replication) hay là tự nhân đôi (self duplication). Nghĩa là từ một phân tử DNA mẹ sao chép tạo ra hai phân tử DNA con giống y như phân tử DNA mẹ ban đầu. Sự tái bản DNA là một trong những tính chất quan trọng, nhờ đó mà thông tin di truyền được truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác. 2.2.1- Lý thuyết về sao mã DNA theo khuôn 2.2.1.1- Giả thuyết của Watson - Crick Sau khi xây dựng mô hình cấu trúc của phân tử DNA, Watson và Crick đã thấy rằng, nếu hai sợi DNA tách rời ra thì một sợi sẽ làm khuôn để tổng hợp một sợi mới vì do các bazơ nitơ luôn có xu hướng bắt cặp với nhau (A với T và G với C). Theo dự đoán của Watson và Crick, quá trình tổng hợp DNA có thể tóm tắt như sau: - Đầu tiên liên kết hydrô sẽ bị đứt ra để tạo hai mạch đơn làm khuôn. - Các bazơ nitơ mới sẽ bắt cặp bổ sung với các bazơ nitơ trên sợi làm khuôn theo qui tắc A đối diện với T và G đối diện với C. - 41 -
- Kết thúc quá trình sao mã, từ một sợi DNA xoắn kép mẹ sẽ tạo hai sợi xoắn kép con. Mỗi sợi xoắn kép con có một sợi mới tổng hợp và một sợi sẽ làm khuôn. Ngay sau khi mô hình được nêu ra, nhiều thí nghiệm chứng minh đã được tiến hành để xác nhận dự đoán. 2.2.1.2- Thí nghiệm chứng minh của Meselson - Stahl (1958) Thí nghiệm này nhằm mục đích chứng minh kiểu tổng hợp theo khuôn của DNA như dự đoán của Watson và Crick. Thí nghiệm được thực hiện trên E. Coli. Vi khuẩn được nuôi cấy qua nhiều thế hệ trên môi trường có chứa nitơ đồng vị nặng N15 và nitơ thường N14 . Nguyên tắc của thí nghiệm là dựa trên khả năng phân biệt tỉ trọng của hai đồng vị N15 và N14 có mặt trong các loại DNA khi li tâm trên thang nồng độ CsCl2 . Quá trình thí nghiệm được tiến hành như sau: - Thế hệ đầu (gọi là thế hệ 0): vi khuẩn được nuôi trên môi trường chứa N15 như vậy ở thế hệ này, các nguyên tử nitơ trong DNA của vi khuẩn sẽ là N15 . Sau khi nuôi tiến hành tách DNA và đem li tâm trên thang nồng độ CsCl2, nhận thấy: + Ở thế hệ 0: chỉ chứa 1 giải đơn có tỉ trọng cao. Như vậy tất cả DNA của thế hệ cha mẹ đều chứa 2 sợi với nitơ nặng. - Thế hệ 1: Chuyển vi khuẩn ở thế hệ 0 sang nuôi trên môi trường chứa N14. Thời gian và điều kiện nuôi tuơng tự như ở thế hệ 0. Sau khi tách DNA và đem li tâm như ở thế hệ 0, thì thấy: + Ở thế hệ 1 chỉ chứa 1 giải đơn có tỉ trọng trung bình. Như vậy mỗi phân tử con ở thế hệ 1 có 1 sợi chứa nitơ nặng của bố mẹ và 1 sợi bổ sung mới tổng hợp có cấu tạo từ nitơ nhẹ N14, gọi là sợi DNA lai. - Thế hệ 2: Tiếp tục chuyển vi khuẩn của thế hệ 1 sang thế hệ 2 và cũng nuôi trên môi trường chứa N14. Quá trình thí nghiệm tiến hành tương tự như ở các thế hệ trên. Sau khi li tâm, quan sát thấy có một nửa số lượng phân tử DNA là phân tử lai giống thế hệ 1 và một nửa số lượng còn lại là phân tử DNA với cả hai sợi đều mang N14 (Hình 2-2). - 42 -
ThÕ hÖ 0: DNA nÆng nu«i trªn m«i tr−êng N15 ThÕ hÖ 1: DNA lai nu«i trªn m«i tr−êng N14 ThÕ hÖ 2: Nu«i trªn m«i tr−êng N14 Hình 2-2: Mô hình thí nghiệm của Meselson-Stahl Thí nghiệm trên là một bằng chứng chứng minh giả thuyết của Watson và Crick là đúng. Quá trình tổng hợp DNA phải thực hiện theo khuôn, hai mạch ban đầu được tách ra, mỗi cái làm khuôn để tổng hợp mạch mới. Kết quả là, mỗi phân tử con đều mang một mạch cũ và một mạch mới. Kiểu sao mã như vậy gọi là “sao mã bán bảo tồn” (semi-conservative). 2.2.1.3- Thí nghiệm chứng minh của Arthur và Kornberg Cũng trong năm này (1958), Arthur và Kornberg tại trường Đại học Washington đã tinh sạch một loại enzyme từ E. Coli, gọi là DNA-polymerase. Enzyme này xúc tác tổng hợp một sợi polynucleotide từ các nucleotide-3- phosphat. Nguyên liệu dùng cho thí nghiệm gồm: - Bốn loại nucleotide dạng triphosphat: dATP, dTTP, dGTP, dCTP. - Enzyme DNA-polymerase chiết từ vi khuẩn E. Coli. - Ion Mg+2 là cofactor của enzyme, tạo điều kiện thuận lợi cho hoạt động của enzyme. - 43 -
Tiến trình thí nghiệm có thể mô tả như sau: Thí nghiệm thứ nhất được tiến hành với đầy đủ các nguyên liệu như đã giới thiệu ở trên, trong các điều kiện thuận lợi cho sự tổng hợp sợi DNA mới, nhưng không có sợi làm khuôn. Thí nghiệm thứ hai cũng được tiến hành tương tự như thí nghiệm 1 nhưng có một sợi DNA làm khuôn. Sợi làm khuôn được thu nhận bằng cách làm biến tính và tách mạch, sau đó đưa vào thí nghiệm. Họ thấy rằng, ở thí nghiệm thứ nhất, enzyme DNA-polymerase không thể tổng hợp sợi DNA từ các nguyên liệu khi không có mặt của sợi khuôn, việc tổng hợp sợi DNA mới chỉ xảy ra ở thí nghiệm thứ hai, khi có mặt DNA khuôn. Điều đó khẳng định rằng giả thuyết của Watson và Crick là đúng. DNA được tổng hợp chỉ khi có một sợi làm khuôn. 2.2.2- Quá trình sao mã 2.2.2.1- Các enzyme và protein đặc hiệu tham gia sao mã Đây là một quá trình phức tạp, để thực hiện sao mã cần thiết phải có mặt của các enzyme, các protein đặc hiệu và các điều kiện cần thiết sau đây: 1,- Liên kết hydro giữa 2 mạch bổ sung của sợi DNA mẹ phải bị phá vỡ và tách rời từng bước làm 2 mạch để làm khuôn. 2,- Phải có đoạn mồi (primer), tức đoạn RNA mạch đơn ngắn bắt cặp với mạch đơn DNA khuôn từ vị trí bắt đầu của mỗi đoạn sao chép. 3,- Có đủ 4 loại nucleotide ở dạng triphosphat (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) để bắt cặp bổ sung với các nucleotide mạch khuôn. 4,- Mạch mới được tổng hợp theo hướng 5’−P → 3’−OH. 5,- Mỗi bước được điều khiển bởi enzyme đặc hiệu và được thực hiện một cách nhanh chóng, chính xác. 6,- Có mặt của ion Mg+2 làm cofactor của enzyme. 7,- Trong quá trình sao chép, ngoài các enzyme đặc hiệu còn có các protein đặc hiệu. - 44 -
Các enzyme và protein đặc hiệu tham gia sao chép gồm có: - Enzyme topoisomerase, làm nhiệm vụ tháo xoắn về hai phía trên sợi DNA kép. - Enzyme helicase, sử dụng năng lượng ATP để làm đứt liên kết hydrô giữa các bazơ nitơ của hai mạch khuôn. - DNA-polymerase I, -II, -III làm nhiệm vụ tổng hợp sợi mới và sửa sai. - RNA-polymerase, làm nhiệm vụ tổng hợp đoạn mồi. - Enzyme primase, làm nhiệm vụ gắn mồi. - Enzyme ligase, làm nhiệm vụ nối hai nucleotide đứng cạnh nhau bằng liên kết phosphodiester để tạo mạch polynucleotide. - Enzyme ribonuclease (RNase) làm nhiệm vụ cắt bỏ mồi sau khi tổng hợp xong mạch mới. Cg Cg Cg At Cg DNA con Ta at AtA CgA t t Gc ta t t t A A CgA C g gc Ta g C A Ta T G C DNA mÑ g c C g t a g c A t C g C g t a A t t a Hình 2-3: Sao chép theo quy luật bổ sung Các protein tham gia sao mã gồm có: - Protein B, nhận biết điểm khởi đầu (origin) sao chép trên sợi DNA kép. - Protein SSB (Single Strand Buiding), làm nhiệm vụ giữ hai mạch của sợi DNA không cho chập vào nhau, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình sao chép. - 45 -
2.2.2.2- Quá trình sao mã 1,- Nhận biết điểm khởi sự và tháo xoắn DNA: Quá trình sao mã được nghiên cứu khá kỹ ở tế bào vi khuẩn E. Coli. Sự sao mã bắt đầu khi protein B đặc hiệu nhận biết điểm khởi sự sao mã (replication origine) và gắn vào trình tự đặc hiệu đó. Tiếp theo, enzyme topoisomerase thực hiện tháo xoắn phân tử DNA từ điểm khởi sự. Enzyme helicase sử dụng năng lượng ATP cắt đứt các liên kết hydro giữa các bazơ bắt cặp của hai mạch phân tử, tách hai mạch để tạo thành chạc ba hình chữ Y, gọi là chạc ba sao mã (replication fork). Có nhiều loại enzyme helicase: có loại gắn trên mạch, di chuyển và cắt liên kết hydro theo chiều từ đầu 3' đến đầu 5'; có loại gắn lên mạch, di chuyển và cắt liên kết hydro theo chiều 5' → 3'. Sau khi tách rời, hai mạch đơn sẽ được protein làm căng mạch SSB giữ không cho chập lại, làm cho trạng thái mở xoắn được bền vững. Mỗi phân tử protein SSB bám vào 8 nucleotide trên mạch đơn, mỗi chạc ba sao mã có khoảng 250 phân tử protein SSB hoạt động. Mạch khuôn được sử dụng đến đâu, các phân tử protein SSB sẽ được giải phóng đến đó. 2,- Tổng hợp mồi: Enzyme DNA-polymerase chỉ có khả năng tổng hợp sợi DNA mới bằng cách nối dài đầu 3'−OH tự do của một đoạn mồi đã bắt cặp sẵn trên khuôn theo chiều 3'−OH đến đầu 5'−P. Mồi là một đoạn RNA nhỏ chừng 10 nucleotide, được tổng hợp từ khuôn của sợi DNA. Phức hợp enzyme primase- RNA-polymerase bám vào mạch đơn của chạc sao mã tổng hợp đoạn RNA mồi tạo đầu 3'−OH tự do của đoạn mồi. Enzyme DNA-polymerase III xúc tác tổng hợp mạch bổ sung từ đầu 3'−OH tự do của mồi, kéo dài mạch. Sự tổng hợp các mạch đơn DNA mới, vì vậy, chỉ đi theo một chiều xác định từ đầu 5' đến đầu 3' (5'→3'). 3,- Sự tổng hợp mạch DNA mới xảy ra một cách liên tục trên mạch khuôn có chiều 3'→ 5' và gián đoạn trên mạch khuôn có chiều 5'→ 3': Trên mạch khuôn có chiều 3'→5', mạch mới được tổng hợp theo chiều 5'→3' một cách liên tục, cùng hướng tháo xoắn của phân tử DNA. Đoạn mồi sẽ được tổng hợp từ điểm khởi sự sao mã. Khi xuất hiện đầu 3'−OH tự do của đoạn mồi thì enzyme DNA-polymerase III gắn vào và tổng hợp ngay mạch bổ - 46 -
sung theo chiều 5'→3' một cách liên tục cho đến điểm kết thúc sao mã. Mạch này được tổng hợp nhanh hơn nên người ta thường gọi là mạch nhanh (leading strand). Như vậy, để tổng hợp được sợi DNA mới bổ sung cho sợi làm khuôn này, enzyme DNA-polymerase chỉ cần có một đoạn mồi (Hình 2- 4). 3 5’ Ch¹c ba sao m· 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ ’ H−íng sao m· chËm 5’ 3 ch ¹ M ’ Hình 2-4: Sơ đồ biểu diễn cách sao chép gián đoạn và liên tục trên 2 sợi DNA khuôn Trên mạch khuôn có chiều từ đầu 5'→3', việc tổng hợp mạch mới phức tạp hơn, do qui luật tổng hợp sợi DNA mới bổ sung luôn thực hiện theo chiều từ đầu 5'→3'. Mạch mới bổ sung cho mạch khuôn này được tổng hợp dưới dạng từng đoạn ngắn gọi là okazaki. Mỗi một okazaki có một đoạn mồi. Ở vi khuẩn, độ dài một okazaki khoảng 1.000 đến 2.000 nucleotide, còn ở tế bào eucaryote, số lượng nucleotide trong một okazaki ngắn hơn so với ở vi khuẩn. Hướng di chuyển để tổng hợp sợi mới của DNA-polymerase III ngược với hướng tháo xoắn của phân tử DNA mẹ. Sợi con thứ hai này được tổng hợp một cách chậm hơn nên thường gọi là mạch chậm hay mạch sau (lagging strand). Các đoạn RNA mồi sau đó sẽ bị enzyme ribonuclease phân huỷ. Các lỗ trống xuất hiện sau khi các đoạn mồi mất đi sẽ được lấp đầy nhờ hoạt động của enzyme DNA-polymerase I. Cuối cùng, enzyme DNA-lygase nối các liên kết phosphodiester giữa các đoạn, tạo nên mạch DNA con hoàn chỉnh. Ngoài chức năng tổng hợp sợi DNA mới theo chiều từ đầu 5'→3', enzyme DNA-polymerase III còn có khả năng sửa sai nhờ hoạt tính exonuclease. Trên đường di chuyển để tổng hợp, nếu nó gặp chỗ mà - 47 -
nucleotide mới bắt cặp sai, nó sẽ lùi lại cắt bỏ nucleotide sai và lắp nucleotide đúng vào. Kết quả, sau quá trình sao mã, hai phân tử DNA con được hình thành có cấu tạo giống y như phân tử DNA mẹ ban đầu, đảm bảo thông tin di truyền được truyền từ thế hệ này qua thế hệ khác một cách chính xác. 2.2.3- Sao mã DNA sợi kép dạng vòng của tế bào procaryote 2.2.3.1- Sao mã theo kiểu hình mắt H−íng sao m· §iÓm khëi sù sao m· H−íng th¸o xo¾n H−íng th¸o xo¾n Sao m· thùc hiÖn Sao m· thùc hiÖn theo 1 h−íng theo c¶ 2 h−íng Hình 2-5: Sơ đồ tổng hợp DNA dạng vòng ở vi khuẩn DNA của tế bào procaryote thường có dạng xoắn kép hình tròn. Quá trình tổng hợp cũng được thực hiện từ một điểm khởi đầu (replication origine) gọi là điểm xuất phát và triển khai ra cả hai phía chạc ba sao mã và lan dần về hai phía, cuối cùng tạo ra hai phân tử DNA lai. Có trường hợp sự tổng hợp chỉ xảy ra về một phía của điểm khởi đầu. Khi DNA dạng vòng tròn đang sao chép, quan sát thấy có dạng hình con mắt (eye replication). Một đơn vị sao mã thống nhất (từ một điểm xuất phát) gọi là replicon. Bộ gen của các sinh vật procaryote chỉ có một replicon. Tốc độ tổng hợp DNA của E. Coli có thể đạt 50.000 nucleotide/phút, chu kỳ sao mã kéo dài khoảng 20 phút (Hình 2-5). - 48 -
2.2.3.2- Sao mã kiểu hình tròn xoay 3’ C¾t liªn kÕt 5’ phosphodiester Sîi míi ®−îc tæng hîp tõ ®Çu 3 ’’ 5 mét c¸ch liªn tôc 3’ SSB 5’ Sîi khu«n cã chiÒu Replisome 5 ’’ 3 ®−îc tæng hîp mét c¸ch gi¸n ®o¹n Okazaki tr−íc §o¹n måi Okazaki sau Hình 2-6: Sao mã theo kiểu hình tròn xoay Ngoài kiểu sao mã có dạng hình con mắt như trên, ở một số vi khuẩn và virus còn có kiểu tổng hợp khác gọi là sao mã hình tròn xoay. Quá trình tổng hợp bắt đầu bằng sự cắt liên kết phosphodiester tại một điểm xác định trên một sợi DNA tròn kép tạo ra hai đầu mút, một đầu kết thúc bằng nhóm 3'−OH và đầu kia là đầu 5'−phosphat. Sự tổng hợp một mạch mới một cách - 49 -
liên tục bằng cách kéo dài mạch từ đầu 3'−OH đồng thời dịch chuyển theo dạng xoay tròn, đầu 5'−P được xoay ra ngoài và một mạch mới khác được tổng hợp gián đoạn theo okazaki, sau khi kết thúc, hai phân tử DNA con được hình thành (Hình 2-6). 2.2.4- Sao mã ở tế bào eucaryote Ở tế bào eucaryote có nhiều nhiễm sắc thể, đa dạng, mỗi nhiễm sắc thể là một phân tử DNA nằm liên kết với protein, nên quá trình sao mã phức tạp. Nhiều điểm sao mã xảy ra đồng thời, hay nói cách khác là trong cùng một thời điểm có nhiều đơn vị sao mã (replicon). Ví dụ như ở nấm men bánh mỳ S. Cerevisiae có 500 replicon. 5’ 5’ 3 ’ 3’ Quá trình tổng hợp DNA ở tế bào eucaryote phức tạp hơn và tốc độ chậm hơn (3.000 nucleotide/phút). Đặc điểm quan trọng trong quá trình sao mã ở tế bào eucaryote là có nhiều đơn vị sao mã xảy ra, đồng thời, trên một phân tử DNA và tế bào có cơ chế kiểm soát nghiêm ngặt quá trình này. Điểm nào đã sao qua một lần rồi thì không lặp lại trước khi toàn bộ phân tử DNA được tái tạo hoàn toàn. Sau khi sao mã, các DNA con có cấu tạo giống y như DNA mẹ ban đầu được phân chia đều đặn về mỗi tế bào con trong quá trình phân bào. 2.2.5- Sửa sai DNA trong tế bào 2.2.4.1- Sửa sai trong sao mã Sửa chữa những sai sót trên DNA nhằm khôi phục lại cấu trúc ban đầu là một đặc tính của mọi tế bào sống. Trong quá trình sao mã, các bazơ nittơ cũng có thể bắt cặp sai. Sự bắt cặp sai thường xảy ra là A bắt cặp sai với C (A C) và G bắt cặp sai với T (G T). Sở dĩ có sự bắt cặp sai như vậy là do trạng thái tồn tại của các bazơ có những thay đổi, dẫn đến sự nhận biết sai. - 50 -
Nhờ cơ chế tổng hợp DNA luôn luôn khởi động từ đầu 5’→ 3’, nên việc sao mã được kiểm soát và sửa chữa một cách chính xác. Các enzyme DNA-polymerase I và III vừa làm chức năng polymer hóa vừa có hoạt tính exonuclease theo hướng 5’→ 3’ và 3’→ 5’. Nếu trên đường di chuyển bắt gặp một nucleotide lắp sai, chúng sẽ lùi lại để cắt bỏ và lắp nucleotide đúng vào. Khi hệ thống kiểm tra phát hiện có sai sót, các enzyme endonuclease sẽ cắt bỏ đoạn sai, sau đó, enzyme DNA-polymerase I sẽ tổng hợp lại cho đúng và enzyme DNA-ligase sẽ nối lại để phục hồi trạng thái bình thường. Khi tổng hợp nhân tạo phân tử DNA (invitro) người ta ước tính sai sót là 10−5 , nghĩa là, trong 105 nucleotide được tổng hợp thì có 1 nucleotide sai. Ví dụ DNA trong tế bào E. Coli có 3x106 nucleotide, như vậy cứ sau mỗi lần sao mã thì có 30 nucleotide sai, hay các nhiễm sắc thể ở người có 3x109 nucleotide, như vậy cứ sau mỗi lần sao mã thì có 30.000 nucleotide sai. Nếu với tần xuất sai này thì số lượng đột biến sẽ rất lớn. Qua thực tế nghiên cứu cho thấy tần xuất đột biến trong các quần thể sinh vật là nhỏ hơn rất nhiều. Bằng cách đánh giá tần số đột biến xuất hiện trong các quần thể, người ta ước tính sự sai sót trong sao mã nằm trong khoảng 10−9. Tuy nhiên, trong thực tế, tỉ lệ sai sót còn thấp hơn nhiều, vào khoảng 10−10 đến 10−11, điều này chứng tỏ sự tồn tại một hệ thống kiểm tra và sửa sai rất hiệu quả của tế bào. 2.2.4.2- Sửa sai sau khi sao mã Môi trường sống và cơ thể sống có mối quan hệ mật thiết với nhau. Các biến động của môi trường sống luôn tác động đến các sinh vật. Những thay đổi của môi trường bên ngoài có tác động trực tiếp đến bộ máy di truyền, làm biến đổi nó. 1,- Các tác nhân có thể làm thương tổn DNA trong quá trình tồn tại: - Các tia vũ trụ và các tia phóng xạ có năng lượng cao có thể làm biến đổi các bazơ nitơ như gắn thêm các nhóm chức khác vào mạch vòng hay làm đứt vòng, làm đứt các liên kết hydro giữa hai mạch hay làm cắt mạch của DNA, - Các tia cực tím trong ánh sáng mặt trời thường gây nên sự dimer hóa các bazơ thymine, hình thành liên kết giữa hai bazơ thymine nằm kề nhau, làm chúng mất khả năng liên kết với bazơ adenine của mạch bổ sung. - 51 -
- Tác động của các thành phần trong nội bào. Sự tổn thương phân tử DNA có thể gây ra do quá trình trao đổi chất bất bình thường gây ra các chất độc hại và các gốc tự do bất lợi, hay do hoạt động của các enzyme không đồng bộ làm tồn đọng những sản phẩm trung gian bất lợi. Ngoài ra, còn có nhiều tác nhân hóa học khác của môi trường bên ngoài cũng gây nên sự biến đổi có thể xảy ra trên DNA. 2,- Một số khả năng gây biến đổi trên phân tử DNA: - Gãy mạch hay đứt mạch: Do sợi DNA rất mảnh, bản thân nó lại xoắn cuộn nhiều lần nên rất dễ bị gãy hay đứt mạch do tác động bên ngoài hay khi tháo xoắn. - Mất các bazơ bổ sung, nghĩa là làm cho bazơ tương ứng không có cặp (như mất bazơ purine). - Biến bazơ nitơ này thành bazơ khác, gây nên sự bắt cặp sai, như: Khi mất nhóm amin, cytosine sẽ biến nó thành uracil hoặc 5-metyl-cytosine-desamin bị nhận nhầm là thymine. - Các bazơ nitơ có thể tồn tại dưới 2 dạng ceton và enol nên dẫn dến bắt cặp sai. - Gắn thêm nhóm −CH3 , −C2H5: Khi gắn thêm nhóm ankyl sẽ làm thay đổi tính chất của các bazơ nitơ dẫn đến bắt cặp sai. 3,- Cơ chế phòng ngừa và sửa sai: Để bảo vệ và thích nghi với những biến đổi, tế bào có cơ chế phòng ngừa và sửa sai. Các cơ chế phòng ngừa của tế bào như hệ thống enzyme khử độc, loại bỏ các độc tố, hệ thống điều hoà cân bằng cần thiết cho tế bào, hệ thống enzyme tham gia sửa sai. Ví dụ sau cho thấy hệ thống sửa sai và phòng ngừa của tế bào: - Enzyme Superoxide Dismutase (SOD) làm nhiệm vụ giảm độc: Enzyme SOD được phát hiện năm 1968, có mã số EC.1.15.1.1 , có mặt trong tất cả các tế bào có chuyển hóa oxy. Chúng xúc tác phản ứng phân huỷ gốc superoxyt − O2 trong tế bào theo sơ đồ phản ứng sau: - 52 -
− + 2O2 + 2H H2O2 + O2 H2O2 sẽ được enzyme catalase hoặc peroxydase chuyển hóa. Do đó, SOD cùng với catalase được xem là nhân tố quan trọng có thể giải độc, bảo − vệ và chống lão hóa cho tế bào. Gốc O2 được sinh ra liên tục và cũng bị phân huỷ không ngừng bởi hoạt động của SOD, do đó, khi SOD có hoạt độ càng − cao thì nồng độ O2 càng thấp. - Hệ thống sửa sai trong tế bào rất đa dạng và có hiệu quả với sự tham gia của các enzyme, như photolyase, DNA-metyl-transfersase, hệ thống enzyme mã hóa trong hệ thống gen SOS. Ở vi khuẩn E.Coli, do tác động của tia tử ngoại làm xuất hiện các thymine dimer (T=T) trên DNA. Khi có ánh sáng, enzyme photolyase sẽ được hoạt hóa và cắt bỏ liên kết T=T, chuyển về trạng thái bình thường và ổn định. Hệ thống enzyme nuclease có thể cắt bỏ chỗ sai hỏng bằng nhiều cách và tổng hợp lại cho đúng. Enzyme DNA-metyl-transferase có khả năng loại bỏ gốc metyl trong trường hợp các bazơ bị metyl hóa. Tóm lại, tế bào có cơ chế kiểm tra và sửa những sai sót nếu có. Ngoài ra, tế bào còn có hệ thống SOS (cấp cứu): Hệ thống này hoạt động khi tế bào bị tác động mạnh bởi các tác nhân gây đột biến, tạo nhiều sai hỏng trên DNA. Trong trường hợp cấp bách có nhiều sai hỏng cần cấp cứu, các gen SOS được mở ra. Nếu sửa sai không kịp, tế bào phải chấp nhận hoặc bị đột biến hoặc chết. Trong tế bào còn có hệ thống điều hoà cân bằng axit-bazơ, tạo điều kiện thuận lợi cho hoạt động trao đổi chất làm giảm khả năng tạo các chất độc hại. Ở sinh vật đa bào, việc khử độc và loại bỏ nhiều hóa chất gây độc được đảm bảo bởi gan và thận. 2.3- SỰ PHIÊN MÃ (Transcription) Quá trình tổng hợp phân tử RNA từ khuôn DNA được gọi là quá trình phiên mã (transcription). Những thông tin di truyền có trong phân tử DNA được sử dụng để tổng hợp protein. Tuy nhiên, phân tử DNA không phải là chất làm khuôn để tổng hợp protein, bởi vì, các phân tử DNA tập trung chủ yếu trong nhiễm sắc thể, - 53 -
phân bố trong nhân tế bào, còn quá trình tổng hợp protein lại diễn ra trong tế bào chất. Như vậy, phải có một chất trung gian làm nhiệm vụ chuyển thông tin di truyền từ DNA trong nhân ra tế bào chất và làm khuôn cho quá trình tổng hợp protein. Năm 1957, sau khi khám phá ra cấu trúc phân tử DNA, Francis Crick đã nêu ý tưởng về một chất trung gian truyền thông tin di truyền cho quá trình tổng hợp protein, và dự đoán "người phiên dịch" trung gian đó là RNA. Dự đoán này đã được khẳng định bằng các nghiên cứu chứng minh RNA có cấu tạo hóa học tương tự như DNA và được tổng hợp trên khuôn của DNA. Năm 1960, có 3 nhóm nghiên cứu độc lập ở Mỹ đã chiết tách được enzyme RNA-polymerase, enzyme này có khả năng tổng hợp phân tử RNA từ khuôn DNA. Benjamin Hall và Sol Spiegelman (1961) đã tách và tinh sạch RNA và DNA từ thực khuẩn thể T2 . Lấy DNA của T2 làm biến tính để tách thành 2 sợi đơn. Khi cho các sợi đơn DNA bắt cặp với sợi đơn RNA thì chúng tạo thành dạng phân tử lai DNA/RNA. Tuy nhiên, khi họ lấy DNA của các cơ thể khác trộn với RNA của T2 thì chúng không bắt cặp, nghĩa là không tạo phân tử lai. Điều đó chứng tỏ rằng, RNA của T2 đã được tổng hợp trên khuôn DNA của nó theo cơ chế bổ sung nên chúng có thể bắt cặp và tạo thành phân tử lai. Những bằng chứng khác như RNA tập trung chủ yếu ở tế bào chất nhưng chúng cũng có mặt trong nhân tế bào. Ở những loại tế bào mà sự tổng hợp protein xảy ra mạnh mẽ thì hàm lượng RNA tập trung nhiều hơn so với những tế bào ít tổng hợp protein. Như vậy, RNA chính là chất trung gian truyền thông tin di truyền để tổng hợp protein. Mối quan hệ giữa DNA, RNA và protein được thể hiện như sau: Phiên mã Dịch mã DNA mRNA protein (Transcription) (Translation) Sao mã Về sau, người ta còn phát hiện quá trình phiên mã ngược, nghĩa là, phân tử DNA được tổng hợp trên khuôn của phân tử RNA. Quá trình phiên mã ngược được enzyme phiên mã ngược (reverse transcriptase) xúc tác. - 54 -
Enzyme này được phát hiện lần đầu tiên khi nghiên cứu sự sao chép bộ gen của virus gây ung thư (retrovirus). Đầu tiên, enzyme phiên mã ngược sẽ tổng hợp sợi DNA đơn (cDNA) trên khuôn của phân tử RNA, sau đó, enzyme DNA-polymerase sẽ tổng hợp mạch bổ sung để tạo thành sợi DNA kép (cDNA kép). Quá trình có thể biểu diễn qua sơ đồ sau: E phiên mã ADN- Phiên Dịch RNA cDNA cDNA mRNA protein ngược polymerase mã (sợi (sợi (sợi mã đơn) đơn) kép) 2.3.1- Đặc điểm chung của quá trình phiên mã Sự phiên mã được thực hiện theo một số nguyên tắc chung sau: - Sản phẩm phiên mã là một sợi polyribonucleotide mạch đơn (RNA). - Để thực hiện phiên mã, phân tử DNA phải dãn xoắn cục bộ. Đối với mỗi gen, chỉ một trong hai sợi DNA được chọn làm khuôn để tổng hợp phân tử RNA. Enzyme RNA-polymerase sẽ quyết định việc chọn sợi làm khuôn và xúc tác quá trình tổng hợp phân tử RNA. - Phân tử RNA mới được tổng hợp theo chiều từ đầu 5'−phosphat đến đầu 3'−OH. - Sự phiên mã được thực hiện khi có mặt của các enzyme và 4 loại nucleotide là GTP, CTP, UTP và ATP. - Phân tử RNA được tổng hợp theo cơ chế bổ sung tương tự như sự sao mã ở DNA nhưng đối diện với A trên sợi DNA sẽ là U trên RNA. - Không có cơ chế sửa sai đi kèm với quá trình phiên mã, do vậy, những sai sót sẽ dẫn đến sự sai khác trong biểu hiện gen. Tuy nhiên, sự sai khác trong quá trình phiên mã không ảnh hưởng gì đến việc truyền đạt thông tin di truyền cho thế hệ sau. - 55 -
2.3.2- Phiên mã tổng hợp mRNA ở procaryote 2.3.2.1- Enzyme RNA-polymerase ở procaryote Ở các sinh vật procaryote chỉ có một loại enzyme RNA-polymerase, nó chịu trách nhiệm xúc tác quá trình tổng hợp cả ba loại RNA là mRNA, tRNA và rRNA. RNA-polymerase của vi khuẩn E. Coli được nghiên cứu kỹ nhất. Enzyme này có cấu trúc bậc 4 rất phức tạp, bao gồm hai hợp phần chính là enzyme lõi và nhân tố σ. Nhân tố σ có thể tách ra khỏi enzyme lõi, có trọng lượng phân tử là 70.000dalton (1dalton=1,66x10-24g=1/12 khối lượng nguyên tử carbon). Enzyme lõi được cấu tạo từ 5 chuỗi polypeptide: hai chuỗi α, một chuỗi β, một chuỗi β' và một chuỗi ω. Ngoài ra, ở enzyme lõi còn có nhân tố phiên mã là ρ và nus A. Các nhân tố phiên mã này dễ dàng tách ra khỏi enzyme lõi, nên trong quá trình tách và tinh sạch enzyme thường không tìm thấy. Bảng 2-1: Các tiểu đơn vị RNA-polymerase của E.Coli Tiểu đơn vị Số lượng Trọng lượng phân tử Chức năng (dalton) β' (beta) 1 160.000 - liên kết với DNA khuôn β (beta) 1 150.000 - kéo dài mạch RNA α (alpha) 2 42.000 - chưa rõ ω (omega) 1 11.000 - chưa rõ σ (sigma) 1 70.000 - nhận biết promoter ρ (rho) 6 46.000 - kết thúc phiên mã Nus A 1 70.000 - kéo dài và kết thúc Tư liệu dựa theo S.C. Rastogi Giữa các sợi polypeptide trong enzyme lõi không có liên kết đồng hóa trị bền vững mà chỉ hình thành các liên kết thứ cấp. Trọng lượng phân tử của các chuỗi polypeptide được biểu diễn ở Bảng 2-1. - 56 -
Chức năng của chuỗi β' là liên kết với sợi DNA khuôn, còn chuỗi β có tác dụng xúc tác hình thành liên kết phosphodiester. Vai trò của hai chuỗi α hiện chưa biết rõ. Nhân tố σ đóng vai trò quan trọng trong việc tổng hợp RNA, nó giúp cho enzyme lõi có thể khởi đầu quá trình phiên mã tại một điểm đặc thù. Nhiều thí nghiệm (in vitro) cho thấy, khi thiếu nhân tố σ, enzyme lõi sẽ khởi đầu phiên mã một cách tùy tiện, không đúng vị trí quy định. Ở E. Coli, người ta đã tìm thấy 3 loại nhân tố σ, mỗi loại có trọng lượng phân tử riêng. RNA-polymerase phát hiện ra promoter, sau đó gắn lên phân tử DNA, mở xoắn cục bộ và thực hiện quá trình tổng hợp phân tử RNA. Sự có mặt của Mg+2 là cần thiết cho hoạt động xúc tác của enzyme RNA-polymerase. β' α ω σ α β Hình 2-7: Cấu trúc RNA-polymerase ở procaryote 2.3.2.2- Phiên mã tổng hợp mRNA ở procaryote Đặc điểm của mRNA procaryote là mỗi phân tử mang dữ liệu thông tin cho sự tổng hợp nhiều sợi polypeptide đồng thời (polycistronic mRNA). Phiên mã tổng hợp mRNA ở procaryote được nghiên cứu khá kỹ ở vi khuẩn E. Coli. Quá trình này có thể chia làm 3 giai đoạn: khởi động, kéo dài và kết thúc. 1,- Giai đoạn khởi động: Tiểu đơn vị σ của enzyme RNA-polymerase nhận biết và gắn enzyme vào promoter để khởi động quá trình phiên mã. Promoter là đoạn phân tử - 57 -
DNA có cấu trúc đặc biệt, giúp enzyme RNA- polymerase nhận biết vị trí bắt đầu của sự phiên mã. Enzyme RNA-polymerase gắn vào trình tự −35 của ptomoter, trượt dọc theo phân tử DNA đến trình tự −10 thì mở xoắn, làm lộ sợi làm khuôn, đoạn mở xoắn có độ dài khoảng 12÷17 nucleotide, quá trình phiên mã bắt đầu tại vị trí xác định. 35 10 TTGCA A TAAT AT AAT GGTTGGAAT P 5’ CCCCAGGC TTGACA CTTTATGGCTTCC GCTCGTTA TTGGAGC 3 ’ P 3’ GGGGTCCG AACTGT GAAATACCGGAA GCGAGCAAT P AA AACCTCG 5 ’ TAC CCCAACTTA §iÓm khëi ®Çu phiªn m· Hình 2-8: Khởi đầu phiên mã ở promoter UV5 operon lactose Sau khi tổng hợp được đoạn RNA ngắn khoảng 8÷10 nucleotide thì nhân tố σ tách khỏi enzyme lõi và sợi khuôn DNA, kết thúc giai đoạn mở đầu. Sau đó, nhân tố σ có thể kết hợp với một enzyme lõi khác để khởi đầu một sự phiên mã mới. 2,- Giai đoạn kéo dài: Sau khi nhân tố σ tách khỏi phức hợp, một nhân tố kéo dài là protein Nus A gắn vào, enzyme DNA-polymerase tiếp tục chuyển dịch dọc theo gen, làm giãn xoắn sợi DNA và thực hiện quá trình polymer hóa, kéo dài sợi RNA mới. Sợi mRNA được tổng hợp theo nguyên tắc bổ sung: A đối diện với U, T đối diện với A, G đối diện với C và C đối diện với G, như sau: Sợi khuôn DNA: A T G C Sợi RNA mới: U A C G Khi enzyme RNA-polymerase trượt dọc theo gen đến đâu thì sự tháo xoắn và tổng hợp mới được thực hiện đến đó, còn đoạn gen sau khi đã tháo xoắn, phân tử RNA-polymerase trượt qua rồi thì được xoắn trở lại cấu trúc ban đầu (Hình 2-9). - 58 -
Gen khëi ®Çu §iÓm kÕt thóc DNA RNA- σ b¸m vµo NusA rêi khái E RNA-polymerase polymerase Eσ ρ rêi khái σ gióp E RNA vµ RNA- nhËn biÕt polymerase gen khëi PPP ®Çu ®Ó b¾t ®Çu phiªn ρ b¸m vµo m· RNA vµ polymerase Nucleotide triphosphat σ t¸ch ra ngay NusA sau khi phiªn b¸m vµo m· b¾t ®Çu PPP PPP RNA ®−îc Nucleotide Sîi RNA phiªn m· dµi thªm ra phiªn m· triphosphat RNA-polymerase Nh©n tè sigma (σ) Nh©n tè rho (ρ) Protein NusA Hình 2-9: Sơ đồ biểu diễn quá trình tổng hợp RNA 3,- Giai đoạn kết thúc: Trên sợi DNA khuôn có chứa đoạn mã kết thúc, có chức năng làm dừng quá trình phiên mã ở điểm qui định. Tại điểm kết thúc, enzyme RNA- polymerase dừng quá trình nối các nucleotide, giải phóng phân tử RNA mới tổng hợp ra khỏi phức hệ enzyme và DNA khuôn, đồng thời, enzyme cũng tách khỏi sợi DNA để có thể đến với một trình tự khởi động mới. - 59 -
Có hai kiểu kết thúc phiên mã: - Thứ nhất: Enzyme RNA-polymerase tiếp nhận tác nhân kết thúc ρ. - Thứ hai: Kết thúc xảy ra không cần sự có mặt của tác nhân ρ. Khi nghiên cứu về cách kết thúc phiên mã theo kiểu thứ hai ở vi khuẩn và phage, người ta nhận thấy có hai điểm đặc trưng về cách sắp xếp các bazơ nitơ ở đoạn cuối trên sợi làm khuôn như sau: - Có 2 trình tự đối xứng bổ sung phía trước điểm kết thúc. - Một đoạn poly A nằm ngay trước điểm kết thúc (Hình 2-10). Nhờ cấu trúc đặc biệt như vậy nên sau khi hai trình tự đối xứng bổ sung được hình thành trên sợi RNA, chúng có thể bắt cặp với nhau, tạo thành cấu trúc có dạng "kẹp tóc", ngăn cản RNA-polymerase phiên mã tiếp tục, đồng thời, có tác dụng kéo sợi RNA mới được tổng hợp ra khỏi phức hệ enzyme và sợi khuôn. Quá trình tổng hợp sẽ dừng lại ở đoạn poly-U. 5’ CCCAGCCCGCCTAATGAGCGGGC T TTTTTTTTGAAAC AAA3’ _ _ Sîi khu«n Dna: 3’ GGGTCCGGGGCGGATTTAC CCCGAAAAAAAAACTTGTTTT 5’ _ _ RnA: 5’ CCCAGCCCGCCUAAUGAGCGGGCUUUUUUUU OH 3’ A A U U G C A C G G C D¹ng “kÑp tãc”: C G C G C G G C 5’ CCCA UUUUUUUU OH3’ Hình 2-10: Sơ đồ biểu diễn cách hình thành cấu trúc dạng "kẹp tóc" Tại các vị trí kết thúc cần sự có mặt của protein kết thúc phiên mã ρ, cấu trúc của đoạn DNA khuôn thường thấy thiếu đoạn poly-A trước điểm kết thúc và không phải lúc nào cũng có các trình tự đối xứng bổ sung để có thể hình thành dạng "kẹp tóc" nêu trên. - 60 -
Hiện nay, chúng ta còn chưa biết rõ, bằng cách nào mà nhân tố ρ tác động lên quá trình kết thúc phiên mã. Có thể nó đã sử dụng năng lượng từ phân tử ATP để thực hiện sự tác động này. Một đặc điểm nổi bật ở tế bào sinh vật procaryote là các phân tử DNA nằm trong tế bào chất, nên quá trình phiên mã và dịch mã được tiến hành đồng thời. 2.3.3- Phiên mã tổng hợp mRNA ở eucaryote Sự phiên mã ở eucaryote xảy ra phức tạp hơn nhiều so với ở procaryote. Đặc điểm của mRNA eucaryote là mỗi phân tử mang dữ liệu thông tin cho sự tổng hợp một polypeptide. Quá trình phiên mã được thực hiện trong nhân tế bào, còn sự dịch mã xảy ra ở tế bào chất, hai quá trình này xảy ra ở hai vị trí khác nhau. 2.3.3.1- Enzyme RNA-polymerase ở eucaryote Ở tế bào eucaryote có 3 loại enzyme RNA-polymerase, mỗi loại đảm nhận một chức năng riêng biệt, RNA-polymerase I chịu trách nhiệm tổng hợp rRNA; RNA-polymerase II chịu trách nhiệm tổng hợp mRNA và RNA- polymerase III chịu trách nhiệm tổng hợp các loại RNA có kích thước nhỏ như tRNA, RNA 5S ở ribosome và các phân tử RNA nhỏ khác. Cấu trúc của các RNA-polymerase ở sinh vật eucaryote rất phức tạp, có trọng lượng phân tử lớn và cũng được hình thành từ nhiều tiểu đơn vị như enzyme RNA-polymerase ở sinh vật procaryote. Số lượng tiểu đơn vị cấu tạo thường ở khoảng 10. Mỗi loại RNA-polymerase chịu trách nhiệm chính để tổng hợp một loại RNA, do vậy, các RNA-polymerase khác nhau sẽ có khả năng nhận biết promoter của mình để khởi đầu phiên mã đúng vị trí. Nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy, ở eucaryote, trình tự đoạn DNA promoter dài hơn so với ở tế bào procaryote, đặc biệt là đôi khi còn có sự hiện diện của nhóm trình tự khuyếch đại (enhancer), có tác dụng làm tăng biểu hiện gen. Ngoài 3 loại RNA-polymerase chủ yếu kể trên, trong tế bào sinh vật eucaryote còn có các RNA-polymerase của ty thể và của lạp thể. Các enzyme này chịu trách nhiệm phiên mã các gen nằm trên DNA ty thể và lạp thể. - 61 -
2.3.3.2- Quá trình phiên mã ở eucaryote DNA của tế bào eucaryote tập trung chủ yếu trong các nhiễm sắc thể trong nhân, có phân tử lượng lớn và chứa nhiều gen. Phần lớn các gen, ở phần mang mã để tổng hợp protein, có sự đan xen giữa các đoạn mang mã (exon) và các đoạn không mang mã (intron). Do vậy, quá trình phiên mã xảy ra phức tạp hơn và thường bao gồm hai quá trình chính: - Quá trình phiên mã tạo nên phân tử mRNA đầu tiên, gọi là phân tử tiền mRNA. - Quá trình biến đổi phân tử tiền mRNA thành phân tử mRNA trưởng thành. Quá trình phiên mã tạo nên phân tử tiền mRNA cũng được thực hiện theo các giai đoạn tương tự như quá trìmh phiên mã ở tế bào procaryote: Tức là, enzyme RNA-polymerase cùng với tác nhân khởi động phiên mã nhận biết promoter và khởi động phiên mã ở vị trí chính xác, tiếp theo đó là quá trình kéo dài mạch mRNA và kết thúc phiên mã tại vị trí xác định. Enzyme RNA- polymerase II sẽ chịu trách nhiệm phiên mã tổng hợp phân tử mRNA. Phân tử tiền mRNA trải qua một số biến đổi mới trở thành phân tử mRNA trưởng thành. Quá trình biến đổi bao gồm: gắn mũ, hình thành đuôi poly−A và loại bỏ các intron, nối các exon. 1,- Gắn mũ (capping): Phân tử mRNA được tổng hợp theo hướng từ đầu 5’−P đến đầu 3’−OH. Sau khi phân tử tiền mRNA hình thành được một đoạn thì ở đầu 5’−P được gắn thêm một nucleotide là 7−methylguanosine (Hình 2-11). Với chiều ngược lại tạo liên kết phosphodiester giữa hai cacbon thứ 5 của hai nucleotide. Tạo mạch liên kết 5’−5’ thường được gọi là “mũ”. Sau khi được gắn “mũ” thì ở đầu 5’ của phân tử mRNA cũng sẽ có nhóm 3’−OH tự do ở gốc đường giống như ở đầu 3’. Tuy vậy, nhờ nhóm metyl (−CH3) ở vị trí nitơ thứ 7 của bazơ guanosine có thể phân biệt được đầu 5’. Như vậy, sau khi gắn “mũ”, đầu 5’ không còn nhóm phosphat tự do nữa. “Mũ” giúp cho ribosome nhận biết và gắn vào đầu 5’ của mRNA, khởi đầu dịch mã đúng vị trí qui định, đồng thời, “mũ” bảo vệ mRNA khỏi bị các enzyme nuclease phân huỷ. - 62 -
O ch3 N N hN2 N N O O O 5’ 5’ 2’ 3’ Baz¬ Ch2 O P O P O P O Ch2 OH HO O OH OH OH O 3’ 2’ O O Ch3 Baz¬ HO P O Ch2 O O 3’ 2’ O (Ch3 hoÆc H) 7 mGpppNm(Nm)N aaaaaa(n)aaa oh 5’ 3’ Hình 2-11: Cấu tạo "mũ" chụp ở đầu 5' của mRNA 2,- Hình thành đuôi poly-A ở đầu 3’−OH: Người ta phát hiện rằng, trong phần lớn các phân tử mRNA của nấm men và tế bào eucaryote, ở đầu 3’ có chứa một trình tự dài khoảng 200 nucleotide với các bazơ adenine (A) gọi là đuôi poly-A. Đuôi poly-A là điểm đặc trưng của các phân tử mRNA ở eucaryote. Ở các loại RNA khác như rRNA, tRNA không có đuôi poly-A. Đuôi poly-A được gắn vào sau khi phân tử tiền mRNA đã được tổng hợp xong. Enzyme chịu trách nhiệm gắn đuôi poly-A vào tiền mRNA là poly-A-polymerase. Quá trình hình thành đuôi poly-A được tiến hành theo mô tả ở Hình 2- 12. Ở đầu 3'−OH của phân tử tiền mRNA có chứa một trình tự nhận biết là AAUAAA. Một enzyme endonuclease đặc hiệu nhận biết và cắt sợi tiền mRNA ở một vị trí khoảng từ 11 đến 30 nucleotide sau trình tự nhận biết về phía đầu 3'−OH, tiếp sau đó, enzyme poly-A-polymerase sẽ xúc tác gắn các nucleotide A vào đầu 3'−OH tạo thành đuôi poly-A. Độ dài đuôi poly-A của các mRNA thay đổi tuỳ theo loài và giai đoạn phát triển của tế bào. Khi mRNA di chuyển từ nhân ra tế bào chất cũng như trong quá trình tồn tại, đuôi poly-A bị thoái hóa ngắn dần. Đuôi poly-A càng dài, thời gian tồn tại của mRNA trong tế bào càng lâu. Trong một số ít trường hợp, mRNA - 63 -
không có đuôi poly-A như các mRNA phiên mã từ gen mã hóa histon không có đuôi poly-A. AAT AAA TTATTT Phiªn m· mRnA AAUAAA 5’ 3’ Enzym endonuclease nhËn biÕt tr×nh tù AAUAAA vµ c¾t m-RNA ë kho¶ng 11 ®Õn 30 nucleotide C¾t AAUAAA 5’ 3’ Enzyme poly-A polymerase g¾n ®u«i poly-A AAUAAA AAAAAAAAA 5’ 3’ §u«i poly-A (kho¶ng 200 nucleotide) Hình 2-12: Sơ đồ về sự hình thành đuôi poly-A 3,- Cắt bỏ intron và nối các exon (splicing): Các gen ở sinh vật eucaryote thường rất dài. Phần lớn có chứa các đoạn không mang mã cho protein (intron) xen lẫn với đoạn mang mã (exon). Nhiều gen có tổng độ dài của các intron lớn hơn tổng độ dài của các exon. Ví dụ như gen mã hóa cho β-globulin có 2 intron: Một intron nhỏ có độ dài 116 cặp bazơ và một intron lớn có độ dài là 646 cặp bazơ, thêm vào đó, ở đầu 5’ có 52 cặp bazơ và ở đầu 3’ có 110 cặp bazơ không mang mã cho protein. Tổng độ dài của các đoạn không mang mã lớn hơn tổng độ dài của các đoạn mang mã (Hình 2-13). Tương tự như vậy, ở gen mã hóa cho ovalbumin cũng có tổng độ dài của các đoạn intron lớn hơn tổng độ dài của các đoạn exon cộng lại. - 64 -
Intron Intron gen mRNA AAAA (150) mũ đuôi 0 0,4 0,8 1,2 1,6 2,0Kb Hình 2-13: So sánh độ dài của mRNA của β-globulin của chuột với độ dài của gen mã hóa Đối với các gen có chứa intron thì sau khi hình thành bản phiên mã đầu tiên phải trải qua giai đoạn cắt bỏ intron và nối các exon để tạo thành phân tử RNA trưởng thành. Quá trình này xảy ra theo hai bước chính: Các endonuclease thực hiện vết cắt ở ranh giới giữa intron và exon, tiếp theo đó là sự nối các exon lại và loại bỏ intron. Trong quá trình loại bỏ intron và nối các exon có sự tham gia của các phần tử ghép nối (spliceosome) đó là phức hợp giữa RNA có phân tử lượng nhỏ giàu uracil có mặt trong nhân tế bào với một số protein chuyên biệt trong nhân. Sau khi các intron được loại bỏ, các exon được nối lại, phân tử mRNA trưởng thành lúc này có mũ chụp ở đầu 5’, đuôi poly-A ở đầu 3’ và các trình tự mang mã cho protein. mRNA trưởng thành sẽ đi qua lỗ màng nhân vào tế bào chất kết hợp với ribosome thực hiện quá trình tổng hợp protein. Tuy nhiên, không phải tất cả các gen trong tế bào sinh vật eucaryote đều có chứa intron. Có một số gen không có intron, ví dụ như phần lớn các gen mã hóa cho các protein histon. Trong trường hợp này, quá trình phiên mã tạo mRNA sẽ không có giai đoạn splicing. 2.3.4- Phiên mã tổng hợp tRNA Trong bộ gen của tế bào procaryote cũng như eucaryote có các gen mã hóa cho tRNA. Ở vi khuẩn, thông thường một gen có thể mã hóa cho một số tRNA khác nhau. Ví dụ ở E. Coli, một gen có thể mã hóa cho 7 loại tRNA khác nhau. Tuy vậy, đôi lúc người ta cũng tìm thấy có những gen chỉ mã hóa cho một tRNA. - 65 -
Quá trình phiên mã tổng hợp tRNA ở vi khuẩn do enzyme RNA- polymerase xúc tác, còn ở nấm men và các sinh vật đa bào do enzyme RNA- polymerase III xúc tác. Sự phiên mã tổng hợp tRNA ở sinh vật nói chung thường diễn ra theo 2 giai đoạn: - Phiên mã tổng hợp phân tử tiền tRNA chung, - Cắt bỏ các intron tạo phân tử tRNA hoàn thiện. Trong trường hợp một gen mã hóa cho nhiều tRNA thì ở bản phiên mã đầu tiên có đoạn dẫn đầu ở đầu 5’, đoạn cuối ở đầu 3’ và các đoạn đệm nằm giữa các tRNA cần được loại bỏ để tạo các phân tử tRNA hoàn thiện. Phân tử tiền tRNA sẽ được một endonuclease là ribonuclease P (RNase P) cắt tại các vị trí xác định ở đầu 5’, tạo đầu 5’−phosphat và một exonuclease khác là ribonuclease D cắt bỏ đoạn không mang mã ở đầu 3’, tạo đầu 3’−OH. Tuy nhiên, ở đầu 3’ của tRNA luôn có bộ ba CCA cuối cùng, là nơi axit amin gắn vào. Nếu ribonuclease D cắt sai vị trí ở đầu 3’ thì enzyme đặc hiệu CCA- nucleotidyltranferase sẽ sửa sai để đầu 3’ luôn có bộ ba CCA. Mỗi loại tRNA đặc hiệu cho một axit amin, do vậy, có ít nhất là 20 loại tRNA. Ở tế bào eucaryote, số lượng gen mã hóa cho tRNA nhiều hơn ở tế bào vi khuẩn. Ở tế bào nấm men S. Cerevisiae, người ta đã xác định được 46 loại tRNA khác nhau, nhưng có đến khoảng 360 gen mã hóa cho các tRNA này. Như vậy, tính trung bình, mỗi tRNA có khoảng 8 gen mã hóa riêng biệt. Tuy nhiên, con số này không thể chia đều như vậy mà thông thường, những loại axit amin nào có mặt trong protein với số lượng lớn thì số lượng gen mã hóa cho tRNA vận chuyển axit amin đó sẽ nhiều hơn. Các gen mã hóa cho một loại tRNA thường phân bố trên các nhiễm sắc thể khác nhau. Do đó, các promoter của các gen đóng vai trò quan trọng trong sự kiểm soát quá trình phiên mã. 2.3.5- Phiên mã tổng hợp rRNA Các phân tử rRNA cũng được tổng hợp từ các gen mã hóa cho chúng trên DNA. Trong tế bào procaryote có 3 loại rRNA tham gia vào quá trình tổng hợp protein là 16S, 23S và 5S; còn ở tế bào eucaryote, các rRNA có mặt trong ribosome là 18S, 28S và 5,8S. - 66 -
Quá trình phiên mã tổng hợp rRNA cũng xảy ra theo hai bước như ở tRNA. Phân tử tiền rRNA được tổng hợp đầu tiên dựa trên khuôn DNA. Ở tế bào eucaryote, quá trình được xúc tác nhờ enzyme RNA-polymerase I. Phân tử tiền rRNA trải qua giai đoạn cắt loại intron để tạo các phân tử rRNA hoàn thiện. 23S 16S Rm Rm Rm Rm 5S 1 hoÆc 2 0 hoÆc 2 Rm - Vị trí cắt của enzyme RNase III trên sợi tiền RNA Hình 2-14: Nhiều rRNA có mặt trong cùng một phân tử tiền RNA ở E. Coli Ở vi khuẩn E. Coli, một gen thường mã hóa cho một số phân tử rRNA. Ví dụ 3 loại rRNA là 16S, 23S và 5S được mã hóa trong một gen. Khi phiên mã sẽ tạo một phân tử tiền rRNA chung cho cả 3 loại rRNA trên, sau đó, các enzyme ribonuclease sẽ thực hiện quá trình cắt loại các intron để tạo 3 phân tử rRNA hoàn thiện. Cũng có trường hợp, trong một operon mã hóa cho rRNA có cả phần mã hóa cho cả tRNA (Hình 2-14). 2.4- DỊCH MÃ (Translation) 2.4.1- Đặc điểm chung của quá trình dịch mã Dịch mã là quá trình tổng hợp chuỗi polypeptide dựa trên các thông tin mã hóa trên mRNA về trình tự sắp xếp các axit amin trên sợi polypeptide đó. Quá trình dịch mã phức tạp hơn nhiều so với quá trình sao mã và phiên mã. Dịch mã được thực hiện ở ribosome với sự tham gia của ba loại RNA. Mỗi ribosome gồm một đơn vị lớn và một đơn vị nhỏ. Ở tế bào vi khuẩn, tiểu đơn vị lớn chứa hai sợi rRNA là 23S và 5S, còn ở tiểu đơn vị nhỏ chứa một sợi rRNA 16S. Ở tế bào nấm men và sinh vật đa bào, tiểu đơn vị lớn chứa hai sợi - 67 -
rRNA là 28S và 5,8S , còn tiểu đơn vị nhỏ chứa một sợi rRNA là 18S. Khi không tiến hành tổng hợp protein, mỗi đơn vị tồn tại tách rời trong tế bào chất. Trong thời gian dịch mã, hai tiểu đơn vị ribosome kết hợp với mRNA và tRNA thực hiện quá trình tổng hợp protein. Hướng dịch mã trên mRNA từ đầu 5’ đến đầu 3’. Quá trình dịch mã được tiến hành khi hội tụ đủ các yếu tố như sự có mặt của mRNA, các ribosome, tRNA, các axit amin và các enzyme cần thiết, đảm bảo quá trình vận chuyển và hình thành liên kết peptit. Dịch mã được thực hiện ở tế bào chất. Ở sinh vật procaryote, hai quá trình dịch mã và phiên mã xảy ra dồng thời. Sau khi sợi mRNA được phiên mã được một đoạn thì quá trình dịch mã khởi đầu. Ở sinh vật eucaryote, hai quá trình này xảy ra độc lập ở hai vị trí khác nhau. 2.4.2- Sự hoạt hóa và vận chuyển axit amin Các phân tử tRNA làm nhiệm vụ vận chuyển các axit amin cho quá trình tổng hợp protein. Mỗi axit amin có ít nhất một phân tử tRNA làm nhiệm vụ vận chuyển. Các axit amin (Aa) được hoạt hóa nhờ enzyme aminoacyl-tRNA synthetase với năng lượng từ phân tử ATP. Enzyme này làm nhiệm vụ gắn axit amin vào đầu 3' của phân tử tRNA. Bộ ba cuối cùng ở đầu 3' của phân tử tRNA là −CCA. Nhóm cacboxyl của axit amin sẽ tạo liên kết đồng hóa trị với gốc đường ribose ở nucleotide cuối. Sản phẩm trung gian: Aa∼AMP sau khi xuất hiện lập tức gắn với phân tử enzyme cho đến khi gặp tRNA tương ứng thì axit amin sẽ được trao cho tRNA hình thành tổ hợp Aa∼t-RNA, giải phóng AMP. Quá trình chuyển hóa có thể biểu diễn như sau: Aa ATP Aa AMP P ∼ P Aminoacyl-tRNA synthetase Aa AMP tRNA Aa tRNA ATP - 68 -