Giáo án môn Công nghệ dược phẩm - Ts. Trương Thị Minh Hạnh

Nội dung text: Giáo án môn Công nghệ dược phẩm - Ts. Trương Thị Minh Hạnh

1. I H C À N NG TR ƯNG I H C BÁCH KHOA KHOA HÓA - B MÔN CÔNG NGH TH C PH M B MÔN CÔNG NGH SINH H C GIÁO ÁN MÔN H C CÔNG NGH D ƯC PH M ( 5 Ơ N V HC TRÌNH) BIÊN SO N: GVC.TS. TR ƯƠ NG TH MINH H NH À N NG 2007 1
2. TÀI LI U THAM KH O [1] Nguy n V ăn Cách, Công ngh lên men các ch t kháng sinh , Nhà xu t b n Khoa h c K thu t, Hà N i 2005 [2] Nguy n Lân D ũng, Nguy n ình Quy n, Ph m V ăn T , Vi sinh v t h c, Nhà xu t b n giáo d c1997 [3] Lê v ăn Hi p: Văcxin ho gà Mi n d ch và công ngh , Nhà xu t b n y h c Hà Ni 2004 [4] Bài gi ng v kháng sinh, tr ưng i h c D ưc Hà N i [5] Erick j. Vandamme, Marcel Dekker, Biotechnology of industrial Antibiotic, Inc., New York 1984 [6] McKane, Larry, McGraw-Hill, Microbiology, Inc.1996 [7] Harvey W. Blanch, Stephen Drew and Daniel I. C. Wan, Comprehensive Biotechnology, Pergamon Press, 1985 [8] H Weide, J. Páca und W. A. Knorre,, Biotechnology, VEB Gustav Fischer Verlag Jena, 1987 2
3. NI DUNG CH ƯƠ NG TRÌNH PH N M U: I C ƯƠ NG V KHÁNG SINH 1.1. Gi i thi u l ch s các ch t kháng sinh. 1.2. nh ngh ĩa kháng sinh. 1.3. ơ n v o kháng sinh. 1.4. Phân lo i kháng sinh. 1.5. Ph ươ ng pháp nh l ưng kháng sinh. 1.6. Giá tr s d ng iu tr c a kháng sinh. 1.7. Ch c n ăng sinh h c c a kháng sinh (c ơ ch sinh kháng sinh). 1.8. Hi n t ưng và b n ch t c a s kháng thu c. 1.9. Nguyên t c iu hoà sinh t ng h p kháng sinh. PH N 2: CÔNG NGH S N XU T M T S KHÁNG SINH CH ƯƠ NG 1: CÔNG NGH S N XU T PENICILLIN 1.1. iêm l ch s phát hi n và công ngh s n xu t Penicillin. 1.1.1. im l ch s ( phát hi n n ăm1928; tinh ch thành công 1939; s n xu t công nghi p 1940; lên men chìm penicillin G 1942; tinh ch ưc a xit 6- aminopenicillanic 1959 ) 1.1.2. nh ngh ĩa và công th c hoá h c t ng quát c a penicillin. 1.2. C ơ s công ngh sinh t ng h p penicillin. 1.2.1. Tuyn ch n ch ng công nghi p. 1.2.2. C ơ ch sinh t ng h p penicillin n m m c Penicillium chrysogenum. 1.2.3. Ph ươ ng pháp ki m tra và nh l ưng penicillin. 1.2.4. Tác ng c a các thông s công ngh n quá trình lên men. - S phát tri n h h ơi và c im hình thái s i. - c tính nhi t ng c a d ch lên men. - Thành ph n môi tr ưng lên men. - iu ki n ti n hành lên men (nhi t , pH, oxy, khu y tr n, CO 2). 1.3. Qui trình s n xu t penicillin công nghi p. * c im chung c a qui trình ( 4 công on: Lên men, tinh ch , sn xu t các ch ph m bán t ng h p, s n xu t thu c Penicillin bán t ng h p. 1.4. Lên men 1.4.1. Chu n b lên men ( nhân gi ng, chu n b môi tr ưng và thi t b ). 3
4. 1.4.2. Các k thu t lên men ( gián on, bán liên t c, c im v thi t b ). 1.4.3. Hi u qu kinh t chung c a quá trình lên men. 1.5. X lý d ch lên men và tinh ch thu penicillin. 1.5.1. L c . 1.5.2. Trích ly. 1.5.3. T y màu. 1.5.4. K t tinh và s y thu penicillin t nhiên. 1.6. S n xu t các ch ph m beta-lac tam bán t ng h p t penicillin G. 1.6.1. Nhu c u s n xu t ch ph m bán t ng h p. - C ơ ch tác d ng. - S kháng thu c và h ưng gi i quy t. - M r ng c tính và hi u qu iu tr cho ch ph m. 1.6.2. S n xu t 6 - APA và s n xu t các penicillin bán t ng h p. - S n xu t 6- AP A (ph ươ ng pháp hoá h c, ph ươ ng pháp enzim). - S n xu t penicillium bán t ng h p (Ph ươ ng pháp hoá h c, ph ươ ng pháp enzim) 1.6.3. S n xu t các cephalosporin bán t ng h p t penicillin G. 1.6.4. S n xu t các ch ph m beta - lactam bán t ng h p có ho t tính kìm hãm beta- lactamase CH ƯƠ NG 2: CÔNG NGH S N XU T M T S CH T KHÁNG SINH KHÁC PH N 3: CÔNG NGH S N XU T VACXIN CHO NG ƯI 3.1. C ơ s sinh hóa c a công ngh s n xu t vacxin 3.1.1. H th ng mi n d ch c a c ơ th - H th ng mi n d ch t nhiên - H th ng mi n d ch thu ưc - Các c ơ quan và t bào tham gia ph n ng mi n d ch 3.1.2. Tính c hi u và ghi nh mi n d ch 3.2. Vacxin 3.2.1. Vài nét v l ch s và h ưng phát tri n c a công ngh vacxin 3.2.2. Nguyên lý s d ng vacxin 43.2.3. c tính cơ b n c a m t vac xin: tính mi n d ch, tính kháng nguyên, hi u l c, tính không c 4
5. 4.2.4. Các vac xin: vacxin b t ho t, vaxin d ưi t h p, vacxin tái t h p, gi i c t 4.3. Công ngh s n xu t vac xin 4.3.1. C ơ s cho vi c thi t k các lo i vaxin: thông tin v m m b nh, con ưng lây nhi m, d ch t h c. 4.3.2. M t s k thu t thông d ng ưc s d ng trong s n xu t vac xin: K thu t nuôi t bào, k thu t gây nhi m virus, k thu t lên men, k thu t ADN tái t hp, k thu t tách tinh ch protein. 4.3.3.Ki m tra ch t l ưng c a vacxin. 4.4. Minh h a m t vài qui trình s n xu t vacxin 4.4.1. Vacxin s ng gi m c l c (Vacxin b i li t u ng trên t bào th n kh ) 4.4.2. Vacxin d ưi ơn v (Vacxin viêm gan ch t huy t thanh ng ưi) 4.4.3. Vacxin b t ho t tinh ch (Vacxin viêm não Nh t B n) 4.4.4.Vacxin tam liên (Vacxin DPT: B ch h u, ho gà, u n ván) 4.4.5. Vacxin tái t h p (Vacxin viêm gan B tái t h p PH N 4: CÔNG NGH S N XU T VITAMIN 3.1. CNSX Ergosterol ( vitamin D2). 3.2. CNSX vitamin B12 ( riboflavin). 3.3. CNSX vitamin B12.( Cyanocobanamin 3.4. CNSX beta- caroten và vitamin C. 5
6. CH ƯƠ NG 1 I C ƯƠ NG V CH T KHÁNG SINH 1.1. I CƯƠ NG V CH T KHÁNG SINH: S phát tri n v vi sinh v t h c nói chung, và vi sinh v t công nghi p nói riêng, vi b ưc ngo c l ch s là phát minh v ĩ i v ch t kháng sinh c a Alexander Fleming (1982) ã m ra k nguyên m i trong y h c: khai sinh ra ngành công ngh s n xu t ch t kháng sinh và ng d ng thu c kháng sinh vào iu tr cho con ng ưi. Thu t ng " ch t kháng sinh " l n u tiên ưc Pasteur và Joubert (1877) s dng mô t hi n t ưng kìm hãm kh n ăng gây b nh c a vi khu n Bacillus anthracis trên ng v t nhi m b nh n u tiêm vào các ng v t này m t s lo i vi khu n hi u khí lành tính khác. Babes (1885) ã nêu ra nh ngh ĩa ho t tính kháng khu n c a m t ch ng là c tính t ng h p ưc các h p ch t hoá h c có ho t tính kìm hãm các ch ng i kháng. Nicolle (1907) là ng ưi u tiên phát hi n ra ho t tính kháng khu n c a Bacillus subtilis có liên quan n quá trình hình thành bào t c a lo i tr c khu n này. Gratia và ng nghi p (1925) ã tách ưc t n m m c m t ch ph m có th s d ng iu tr hi u qu các b nh truy n nhi m trên da do c u khu n. Mc dù v y, trong th c t mãi t i n ăm 1929 thu t ng " Ch t kháng sinh " m i ưc Alexander Fleming mô t m t cách y và chính th c trong báo cáo chi ti t v penicillin. Th p k 40 và 50 c a th k XX ã ghi nh n nh ng b ưc ti n v ưt b c c a ngành công ngh s n xu t kháng sinh non tr , v i hàng lo t s ki n nh ư :
   Khám phá ra hàng lo t Ch t kháng sinh, thí d nh ư Griseofulvin (1939), gramicidin S (1942) , Streptomycin (1943), bacitracin (1945), cloramphenicol và polymicin (1947), clotetracyclin và Cephalosporin (1948), neomycin (1949), oxytetracyclin và nystatin (1950), erythromycin (1952), cycloserin (1954), amphotericin B và Vancomycin (1956), metronidazol, kanamycin và rifamycin (1957)
   Áp d ng ph i h p các k thu t tuy n ch n và t o gi ng tiên ti n ( c bi t là các k thu t gây t bi n, k thu t dung h p t bào, k thu t tái t h p gen ) ã t o ra nh ng bi n ch ng công nghi p có n ăng l c "siêu t ng h p" các ch t kháng sinh cao gp hàng ngàn vn l n các ch ng ban u. 6
7. 
   Tri n khai thành công công ngh lên men chìm quy mô s n xu t công nghi p s n xu t Penicillin G (1942) và vi c hoàn thi n công ngh lên men này trên các s n ph m khác.
   Vi c phát hi n, tinh ch và s d ng axit 6 - aminopenicillanic (6-APA, 1959) làm nguyên li u s n xu t các ch t kháng sinh penicilin bán t ng h p ã cho phép to ra hàng lo t d n xu t penicilin và m t s kháng sinh β - lactam bán t ng h p khác. 1.1.1. nh ngh ĩa kháng sinh: Ch t kháng sinh ưc hi u là các ch t hoá h c xác nh, không có b n ch t enzym, có ngu n g c sinh h c (trong ó ph bi n nh t là t vi sinh v t), v i c tính là ngay n ng th p (ho c r t th p) ã có kh n ăng c ch m nh m ho c tiêu di t ưc các vi sinh v t gây b nh mà v n m bo an toàn cho ng ưi hay ng v t ưc iu tr . 1.1.2. C ơ ch tác d ng: Cơ ch tác d ng lên vi sinh v t gây b nh ( hay các i t ưng gây b nh khác - gi t t là m m b nh) c a m i ch t kháng sinh th ưng mang c im riêng, tùy thu c vào b n ch t c a kháng sinh ó; trong ó, nh ng ki u tác ng th ưng g p là làm r i lo n c u trúc thành t bào, r i lo n ch c n ăng iu ti t quá trình v n chuy n v t ch t ca màng t bào ch t, làm r i lo n hay ki m to quá trình sinh t ng h p protein, r i lo n quá trình tái b n ADN, ho c t ươ ng tác c hi u v i nh ng giai on nh t nh trong các chuy n hóa trao i ch t (hình 1.1) Hình 1.1. V trí tác d ng chính c a m t s ch t kháng sinh 7
8. 1.1.3. ơ n v kháng sinh: Năng l c tích t kháng sinh c a ch ng hay n ng ch t kháng sinh th ưng ưc bi u th b ng m t trong các ơn v là : mg/ml, µg/ml, hay ơ n v kháng sinh UI/ml (hay UI/g, International Unit . ơ n v c a m i kháng sinh ưc nh ngh ĩa là l ưng kháng sinh t i thi u pha trong m t th tích quy ưc dung d ch có kh n ăng c ch hoàn toàn s phát tri n c a ch ng vi sinh v t ki m nh ã ch n, thí d , v i penicillin là s miligam penicillin pha vào trong 50 ml môi tr ưng canh thang và s d ng Staphylococcus aureus 209P làm ch ng ki m nh; v i Streptomicin là s miligam pha trong 1 ml môi tr ưng canh thang và ki m nh b ng vi khu n Escherichia coli). 1.1.4. Ho t tính kháng sinh c hi u: Ho t tính kháng sinh c hi u là c tính cho th y n ăng l c kìm hãm hay tiêu di t m t cách ch n l c các ch ng vi sinh gây b nh, trong khi không gây ra các hi u ng ph quá ng ưng cho phép trên ng ưi b nh ưc iu tr . c tính này ưc bi u th qua hai giá tr là: N ng kìm hãm t i thi u ( Minimun Inhibitory Concentration - Vi t t t là MIC ) và nng di t khu n t i thi u ( Minimun Bactericidal Concentration - Vi t tt là MBC ), xác nh trên các i t ưng vi sinh v t gây b nh ki m nh l a ch n tươ ng ng cho m i ch t kháng sinh. 1.1.5. Ph kháng khu n c a kháng sinh: Ph kháng khu n c a ch t kháng sinh bi u th s l ưng các ch ng gây b nh b tiêu di t b i kháng sinh này. Theo ó, ch t kháng sinh có th tiêu di t ưc nhi u lo i mm b nh khác nhau ưc g i là ch t kháng sinh ph r ng, ch t kháng sinh ch tiêu di t ưc ít m m b nh là ch t kháng sinh ph h p. 1.2. Hi n t ưng kháng thu c và b n ch t kháng thu c c a vi sinh v t: Hi n t ưng kháng thu c: Hi n t ưng m m b nh v n còn s ng sót sau khi ã iu tr kháng sinh ưc g i là hi n t ưng kháng thu c (trên ph ươ ng di n ki m nghi m, vi sinh v t gây b nh ưc coi là kháng thu c nu n ng MIC c a ch t kháng sinh ki m nghi m in vitro trên i t ưng này cao h ơn n ng iu tr t i a cho phép i v i b nh nhân. Có hai d ng kháng thu c: Kh n ăng kháng sinh h c: Kh n ăng kháng thu c c a vi sinh v t gây b nh có th ưc hình thành ng u nhiên trong qu n th , ngh ĩa là kh n ăng này ã ưc hình 8
9. thành m m b nh ngay khi chúng ch ưa ti p xúc v i môi tr ưng ch a ch t kháng sinh. Dng kháng thu c này ưc g i là kh n ăng kháng sinh h c. Nguyên nhân c a hi n tưng này có th do t bi n ng u nhiên trong nhi m s c th làm trong qu n th vi sinh v t gây b nh xu t hi n các t bào (hay th m chí ch c n m t vài t bào) có kh năng kháng thu c. Do ó, khi b nh nhân ưc iu tr kháng sinh trong m t th i gian nh t nh thì ch có các t bào thưng b tiêu di t, còn các t bào kháng thu c này v n còn s ng sót, ti p t c sinh tr ưng phát tri n d n bù ep cho c s t bào ã b tiêu di t. K t qu làm thay i hoàn toàn b n ch t vi sinh c a b nh và vô hi u hóa tác d ng iu tr c a thu c kháng sinh ó. Kh n ăng kháng iu tr : Kh n ăng kháng thu c c a vi sinh v t gây b nh th ưng xu t hi n ph bi n h ơn nhi u sau khi chúng ã ti p xúc v i kháng sinh, vì v y tr ưng h p này còn ưc g i là kh n ăng kháng iu tr . Nguyên nhân c a hi n tưng này là do trong t bào vi sinh v t có ch a các y u t kháng thu c R ti m n (Resistance Factor) . Y u t kháng thu c R có b n ch t plasmid. Khi vi sinh v t s ng trong môi tr ưng có kháng sinh, các plasmid kháng thu c c a chúng s ưc ho t hoá, t sao chép t ng h p ra vô s plasmid m i. Chính ho t tính c a các plasmid này s làm t ăng s c kháng cho t bào ch , nh v y chúng v n có th t n t i và phát tri n trong môi tr ưng có kháng sinh. Do có b n ch t plasmid nên các y u t kháng thu c R này r t d dàng v n chuy n qua l i gi a các loài g n g ũi nhau qua bi n n p, ti n p hay ti p h p. Nguyên nhân hi n t ưng kháng thu c: - Vi c s d ng cùng lo i kháng sinh kéo dài ho c l m d ng thu c kháng sinh (tu ỳ ti n s d ng thu c không úng li u l ưng, không úng ch nh và không th i gian c n thi t) ã vô tình t o ra ưu th phát tri n c nh tranh cho các ch ng vi sinh v t có kh n ăng kháng thu c, ng th i tr thành li u pháp kích thích các ch ng kháng thu c này t ng h p ra vô s plasmid m i. - Xu th s d ng tu ỳ ti n ch t kháng sinh trong ch ăn nuôi, c bi t là b sung vào khi ch bi n th c ăn gia súc, gia c m nuôi l y th t, tr ng, s a Khi ó, ngoài các tác d ng có l i d ki n, chính ch t kháng sinh b sung s t o ra môi tr ưng phát tri n ch n l c cho các ch ng mang yu t kháng thu c R trên ng v t nuôi. Khi s d ng th t, tr ng, s a c a chúng làm nguyên li u ch bi n, các ch ng kháng thu c này s kéo theo vào trong các s n ph m th c ph m. K t qu khi ng ưi tiêu dùng s d ng các th c ph m này, m t m t h ph i ti p nh n ph n d ư l ưng kháng sinh trong s n ph m; nh ưng m t khác, nguy hi m h ơn là các lo i vi sinh v t kháng thu c trong các s n ph m th c ph m thu c nhóm này có ưu th t n t i, phát tri n cao h ơn và các plasmid kháng thu c c a chúng l i ang trong tr ng thái ho t hoá. 9
10. Cơ ch c a s kháng thu c: C ơ ch c a s kháng thu c r t a d ng và th ưng khác nhau i v i t ng ch ng vi sinh v t: * M t s loài vi sinh v t có kh n ăng kháng thu c t nhiên v i m t s kháng sinh nh t nh, do thu c này không tác ng lên chúng ( thí d nh ư: n m, virus, nguyên sinh ng v t, do trên thành t bào không có l p peptidoglucan nên không ch u tác ng c a các kháng sinh β – lactam). * M t s ch ng v n nh y c m v i ch t kháng sinh tr nên kháng thu c khi chúng thu nh n ưc m t trong các c tính m i nh ư: Có kh n ăng vô ho t hay phá h y ch t kháng sinh (b ng cách t ng h p ra các enzym ngo i bào làm phá v c u trúc c a ch t kháng sinh hay liên k t v i ch t kháng sinh t o ra d ng kém hi u l c kháng sinh h ơn). Có th t iu ch nh kh n ăng h p th c a màng t bào ch t làm gi m ho c ng ăn ng a ch t kháng sinh xâm nh p vào t bào ch t. Có kh n ăng làm bi n i c u trúc phân t c a n ơi ho c v trí mà ch t kháng sinh tác d ng vào T iu ch nh thay i ưng h ưng trao i ch t vô hiu hóa tác d ng c a ch t kháng sinh ó Hi n t ưng kháng chéo : Bên c nh hai hi n t ưng kháng thu c nêu trên, trong th c ti n còn t n t i hi n t ưng kháng chéo (hay kháng nhóm), ngh ĩa là m t ch ng khi ã kháng l i ch t kháng sinh nh t nh thì chúng c ũng có kh n ăng kháng luôn m t s ch t kháng sinh khác cùng nhóm c u trúc hay có các c tính t ươ ng ng v i ch t kháng sinh y, thí d nh ư m t s ch ng vi sinh v t gây b nh ã kháng ưc penicillin thì c ũng có tr ưng h p kháng luôn nhi u kháng sinh β - lactam khác. Kh c ph c hi n t ưng kháng thu c c a vi sinh v t gây b nh : gi i pháp tr c quan và ơ n gi n là s d ng các d ng kháng sinh m i. Tuy nhiên, vi c tìm ki m, phát hi n và s n xu t m t kháng sinh m i là c m t kh i l ưng công vi c kh ng l , tiêu t n rt nhi u th i gian, nhân l c và ti n b c Tr ưc h t c n tri t tôn tr ng ba nguyên t c s d ng thu c kháng sinh là:
    Ch nh iu tr kháng sinh úng (làm kháng sinh ch n úng kháng sinh thích h p ch nh iu tr ; dùng thu c úng li u, úng phác , th i gian iu tr ; chú ý phát hi n s m d u hi u kháng thu c);
    Không l m d ng kháng sinh khi ch ưa c n thi t (không l m d ng " iu tr phòng ng a" b ng thu c kháng sinh, nghiêm c m b nh nhân t ch nh iu tr thu c kháng sinh thay bác s ĩ); 10
11. 
    Nghiêm c m s d ng tràn lan ch t kháng sinh trong ch ăn nuôi và giám sát ch t ch vi c s d ng kháng sinh trong thú y. 1.3. IU CH NH SINH T NG H P CH T KHÁNG SINH: Cũng nh ư v i t t c quá trình lên men khác, vi c iu ch nh sinh t ng h p ch t kháng sinh trên nguyên t c có th ưc th c hi n qua hàng lo t c ơ ch khác nhau, thí d, c ơ ch c m ng, c ơ ch ki m to , c ơ ch c ch ng ưc Trong th c ti n c n ph i ph i h p hàng lo t các gi i pháp khoa h c và công ngh , c th có th phân chia thành hai nhóm l n là:
    Tuy n ch n và t o ra các ch ng công nghi p siêu t ng h p ch t kháng sinh ;
    T i ưu hoá thành ph n môi tr ưng, thi t b lên men và iu ki n v n hành quá trình lên men. 1.3.1. Tuy n ch n và t o ra các ch ng công nghi p siêu t ng h p ch t kháng sinh : ây là thành qu c a s ph i h p ng b hàng lo t gi i pháp k thu t tuy n ch n gi ng và t o ch ng tiên ti n nh ư: k thu t gây t bi n, k thu t dung h p t bào, k thu t tái t h p và các gi i pháp k thu t gen khác Nhìn chung, quá trình tuy n ch n t o ch ng công nghi p siêu t ng h p kháng sinh c ũng th ưng tr i qua sáu giai on c ơ b n là: - Phân l p t thiên nhiên. - Nghiên c u x lý t o các bi n ch ng " Siêu t ng h p" có ho t l c cao. - Tuy n ch n s ơ b . - Tuy n ch n l i thu các ch ng có ho t tính cao quy mô phòng thí nghi m. - Th nghi m và tuy n ch n l i trên quy mô s n xu t th nghi m pilot. - Th nghi m và ch n l c l i các ch ng phù h p v i iu ki n lên men s n xu t l n công nghi p. Trong các giai on trên, b ưc tuy n ch n l i quy mô phòng thí nghi m là công on tuy n ch n toàn di n và k l ưng nh t; Mc tiêu c a quá trình tuy n ch n t o bi n c ng công nghi p không ch d ng li n ăng l c siêu t ng h p kháng sinh c a ch ng, mà còn nh h ưng ng th i vào các m c tiêu khác nh ư: t o ra các bi n ch ng tích t ít các s n ph m không mong mu n, các bi n ch ng t ng h p ra các s n ph m hoàn toàn m i (nh t là các s n ph m 11
12. có c u trúc và c tính mong mu n theo "thi t k " c a con ng ưi), các bi n ch ng r t nh y c m v i ch t kháng sinh hay các ch ng có s c kháng cao v i nh ng ch t kháng sinh nào ó Vi c tuy n ch n và t o ch ng công nghi p là công vi c lâu dài và tiêu t n r t nhi u nhân l c, òi h i ph i ưc ti n hành nghiêm túc, liên t c và th ưng xuyên. 1.3.2. T i ưu hoá thành ph n môi tr ưng, thi t b lên men và iu ki n v n hành quá trình lên men: - Vi c t i ưu hóa thành ph n môi tr ưng lên men có vai trò r t quan tr ng, quy t nh n ăng l c và hi u qu chung c a toàn quá trình: xác nh ngu n nguyên li u chính, thành ph n môi tr ưng lên men, n ng t ươ ng ng c a t ng c u t trong t ng th i im c th , u ưc xác nh qua con ưng th c nghi m, trên c ơ s ki m tra trên hàng lo t c ơ ch t d ki n chính, các ti n ch t, các ch t dinh d ưng khác, các cht ph gia k thu t . Ngu n th c ăn cacbon th ưng ưc l a ch n là: các lo i b t và h t ng ũ c c, cám m ỳ, cám g o, v khoai tây, r ưng, các lo i ưng ( glucoza, fructoza, maltoza, lactoza ) dextrin, glycerin, axit axetic, manit, các lo i r ưu, d ch thy phân g , n ưc th i h sunfit . Ngu n th c ăn nit ơ có th là: b t u t ươ ng, n ưc chi t ngô, cao n m men, - + nưc chi t n m nem, pepton, các mu i NO 3 , NH 4 Các nguyên t khoáng a l ưng th ưng g p nh ư: photpho, l ưu hu ỳnh, ma nhê, st, canxi, kali, natri; các nguyên t vi l ưng nh ư: ng, k m, coban, molipden và các ch t sinh tr ưng .Vi c thay i thành phân môi tr ưng, n ng các c u t và s bi n thiên nng c a chúng trong su t quá trình có quan h ch t ch v i ho t ng trao i ch t ca vi sinh v t, vì v y quan h ch t ch n các s n ph m t o thành c a quá trình. - Ngoài ra, trong quá trình lên men, ng ưi ta còn khai thác hi u qu tác ng ca các y u t khác trong môi tr ưng nh ư: nhi t lên men t i ưu, pH, n ng oxy, th oxy hóa kh , c ưng s c khí, c ưng khu y tr n d ch lên men Nh ư v y hi u qu sinh t ng h p s n ph m thu ưc bao gi c ũng là k t qu c a s ph i h p tác d ng c a t t c các y u t , các iu ki n trang thi t b công ngh c u thành nên công ngh lên men các s n ph m ó. 12
13. CH ƯƠ NG 2 CÔNG NGH LÊN MEN KHÁNG SINH PENICILLIN 2.1. IM L CH S PHÁT HI N VÀ S N XU T PENICILLIN - Phát hi n tình c vào n ăm 1928 do Alexander Fleming, khi nh n th y m t h p petri nuôi Staphylococcus b nhi m n m m c Penicillium notatum có xu t hi n hi n tưng vòng vi khu n b tan xung quanh khu n l c n m. Ông ã s d ng ngay tên gi ng n m Penicillin t tên cho ch t kháng sinh này (1929). M ã tri n khai lên men thành công penicillin theo ph ươ ng pháp lên men b mt (1931). Tuy nhiên, c ũng trong kho ng th i gian ó m i n l c nh m tách và tinh ch penicillin t d ch lên men u th t b i do không b o v ưc ho t tính kháng sinh ca ch ph m tinh ch và do ó v n penicillin t m th i b lãng quên. Năm 1938 Oxford, khi tìm l i các tài li u khoa h c ã công b , Ernst Boris Chain quan tâm n phát minh c a Fleming và ông ã ngh Howara Walter Florey cho ti p t c tri n khai nghiên c u này. Ngày 25/05/1940 penicillin ã ưc th nghi m r t thành công trên chu t. 1942: ã tuy n ch n ưc ch ng công nghi p Penicillium chrysogenum NRRL 1951 (1943) và sau ó ã ưc bi n ch ng P. chrysogenum Wis Q - 176 (ch ng này ưc xem là ch ng g c c a h u h t các ch ng công nghi p ang s d ng hi n nay trên toàn th gi i ); ã thành công trong vi c iu ch nh ưng h ưng quá trình lên men lên men s n xu t penicillin G (b ng s d ng ti n ch t Phenylacetic, 1944) 13
14. Hình 2.1. Các tác gi gi i th ưng Nobel y h c n ăm 1945 v công trình penicillin Penicillin ưc xem là lo i kháng sinh ph r ng, ưc ng d ng r ng rãi trong iu tr và ưc s n xu t ra v i l ưng l n nh t trong s các ch t kháng sinh ã ưc bi t hi n nay. Chúng tác d ng lên h u h t các vi khu n Gram d ươ ng và th ưng ưc ch nh iu tr trong các tr ưng h p viêm nhi m do liên c u khu n, t c u khu n, thí d nh ư viêm màng não, viêm tai - m ũi - h ng, viêm ph qu n, viêm ph i, l u c u, nhi m trùng máu Th i gian u penicillin ưc ng d ng iu tr r t hi u qu . Tuy nhiên, ch vài n ăm sau ã xu t hi n các tr ưng h p kháng thu c và hin t ưng này ngày càng ph bi n h ơn. Vì v y 1959, Batchelor và ng nghi p ã tách ra ưc axit 6- aminopenicillanic. ây là nguyên li u s n xu t ra hàng lo t ch ph m penicillin bán tng h p khác nhau. Ngày nay trên th gi i ã s n xu t ra ưc trên 500 ch ph m penicillin ( trong ó ch lên men tr c ti p hai s n ph m là penicillin V và penicillin G) và ti p t c tri n khai s n xu t các ch ph m penicillin bán t ng h p khác. Hình 2.2: S n ph m penicillin lên men t nhiên nh P.chrysogenum 14
15. 2.2. C Ơ S CÔNG NGH SINH T NG H P PENICILLIN NH N M M C: 2.2.1. L ch s tuy n ch n ch ng công nghi p P. chrysogenum : Vào nh ng n ăm u, vi c nghiên c u s n xu t penicillin th ưng s d ng các ch ng có ho t l c cao thu c loài P. notatum và P. baculatum. Nh ưng t khi tr ưng i h c Wisconsin (M ) phân l p ưc ch ng P.chrysogenum có ho t tính cao h ơn thì ch ng này d n d n ã thay th và t kho ng sau nh ng n ăm 50 c a th k XX n nay tt c các công ty s n xu t penicillin trên th gi i u s d ng các bi n ch ng P.chrysogenum công nghi p. - Vi c tuy n ch n ch ng công nghi p lên men s n xu t penicillin trên nguyên t c c ũng tr i qua sáu giai on c ơ b n ã mô t trong m c 1.3.1, trong ó gi i pháp k thu t ã ưc áp d ng hi u qu thu nh n bi n ch ng "siêu t ng h p" penicillin l i chính là các k thu t gây t bi n th ưng nh ư: x lý tia R ơn - ghen, x lý tia c c tím và t o t bi n b ng hoá ch t, thí d nh ư Metylbis - amin (metyl -2-β-clo- etylamin), N-mustar (tris - β-clo- etylamin), Sarcrolyzin, HNO 2, Dimetylsulfat, 1,2,3,4 -diepoxybutan. 2.2.2. C ơ ch sinh t ng h p penicillin n m m c P. chrysogenum : Theo quan im ph bi n hi n nay, quá trình sinh t ng h p penicillin n m mc P. chrysogenum có th tóm t t nh ư sau: t ba ti n ch t ban u là α-aminoadipic, cystein và valin s ng ưng t l i thành tripeptit δ -(α- aminoadipyl) - cysteinyl - valin ; ti p theo là quá trình khép m ch t o vòng β-lactam và vòng thiazolidin t o thành izopenicillin-N; r i trao i nhóm α-aminoadipyl vi phenylacetic (hay phenooxyacetic) t o thành s n ph m penicillin G (hay penicillin V, xem s ơ t ng hp penicillin G trong hình 2.3. 15
16. Hình 2.3. S ơ c ơ ch sinh t ng h p penicillin t axit L-ααα- aminoadipic, L- cystein và L-valin Trong 3 axit amin ti n ch t trên thì cystein có th ưc t ng h p b ng m t trong ba con ưng là ưc t ng h p t xerin (hình 2.4), t homoxerin v i vi c tu n hoàn chuy n hóa α-cetobutyrat qua oxaloacetat (hình 2.5), hay t homoxerin v i s chuy n hóa α- cetobutyrat qua izolecin. ng th i α- aminoadipic ưc gi i phóng ra trong s ơ hình 2.6 có th ưc tu n hoàn tham gia quá trình ng ưng t ban u. . 16
17. Hình 2.4. S ơ c ơ ch sinh t ng h p cystein t xerin Hình 2.5. S ơ c ơ ch sinh t ng h p cistein t homoxerin v i s bi n i ααα- cetobutyrat thành oxaloacetat Tuy nhiên, c ũng có th nó ưc gi i phóng ra và tích t trong môi tr ưng (vì trong quá trình lên men s n xu t penicillin V bao gi c ũng phát hi n th y trong d ch lên men lưng l n α- aminoadipic d ng vòng). Nh ư v y, quá trình sinh t ng h p penicillin, ph 17
18. thu c vào iu ki n lên men c th nh t nh, có th x y ra theo sáu ưng h ưng khác nhau. Do ó, hi u su t chuy n hoá c ơ ch t - s n ph m c ũng bi n i và ph thu c vào ưng h ưng sinh t ng h p t ươ ng ng. Theo lý thuy t thì hi u su t lên men s trong kho ng 683 - 1544 UI penicillin/g glucoza; song, trong th c t , v i nh ng ch ng có ho t tính sinh t ng h p cao nh t c ũng m i ch t kho ng 200 UI/g glucoza. Hình 2.6. S ơ c ơ ch sinh t ng h p ααα- aminoadipic Hình 2.7. S ơ c ơ ch sinh t ng h p valin 18
19. 2.2.3. Tác ng c a các thông s công ngh n quá trình sinh t ng h p penicillin. 2.2.3.1. S phát tri n h s i và c im hình thái h s i n m: S phát tri n h s i n m trong quá trình lên men bao g m: - S t ăng tr ưng v kích th ưc h s i (t ăng dài s i, s l n lên v kích th ưc, m c phân nhánh c a h s i ) - S bi n thiên v s l ưng khóm s i n m trong môi tr ưng : Thông th ưng, s phát tri n này ưc ánh giá qua hai ch tiêu là: hàm l ưng sinh kh i và t c bi n thiên hàm l ưng sinh kh i trong môi tr ưng. Hai ch tiêu này có th xác nh b ng nhi u ph ươ ng pháp khác nhau nh ư: hàm l ưng sinh kh i (Sinh kh i t ươ i ho c sinh kh i khô), m t quang d ch lên men, tr l c l c c a d ch lên men, hàm l ưng nit ơ, hàm lưng hydratcacbon, hàm l ưng axit nucleic Trong các ph ươ ng pháp trên, ưc áp dng ph bi n h ơn c trong s n xu t công nghi p là ph ươ ng pháp xác nh qua hàm lưng sinh kh i. T c phát tri n h s i n m ph thu c hàng lo t các y u t khác nhau trong quá trình lên men và s tích t penicillin th ưng x y ra m nh m khi h s i phát tri n t tr ng thái cân b ng. Tr ng thái này có th xác l p ưc khi ch cung c p v a và liên tc l ưng th c ăn t i thi u cho n m m c. Thi u th c ăn, h s i n m s t phân, còn nu cung c p quá nhu c u trên, h s i s phát tri n, nh ưng không tích t m nh penicillin mà tích t nhi u axit gluconic và axit malic. c im hình thái và c u trúc h s i n m: Trong quá trình lên men, do nhi u nguyên nhân khác nhau, s l ưng khóm s i n m bao gi c ũng có xu h ưng t ăng lên, ngay c trong quá trình lên men t ĩnh. Trong iu ki n lên men có s c khí và khu y tr n, do tác d ng va p c ơ h c v i cánh khu y và các chuy n ng dòng xoáy trong môi tr ưng, m t m t s t gãy h s i n m x y ra nhi u h ơn và h s i n m bao gi cũng có xu h ưng vón cu n l i thành c u trúc búi s i cu n xo n, ưc g i là pellet.
    Pellet x p (fluffy loose pellets) là d ng pellet có ph n bên trong h s i cu n thành kh i ch c và m n, l p s i phía bên ngoài cu n l ng l o t o thành c u trúc x p hơn.
    Pellet ch c và m n (compact smooth pellets) có c im là ph n s i phía bên trong pellet cu n t ươ ng i ch t ch ra n g n sát l p s i phía ngoài, l p s i phía ngoài cùng c ũng cu n ch c thành l p s i m n.
    Pellet r ng (hollow pellets) là d ng pellet có ph n s i bên trong b t phân t o thành kho ng r ng, h s i phía bên ngoài cu n r t ch t thành l p s i m n và ch c ch n. - Hi u qu chung c a quá trình lên men có quan h h u c ơ v i s l ưng, kích th ưc và c u trúc pellet n m. Trong th c ti n s n xu t công nghi p, ng ưi ta th ưng 19
20. iu ch nh các thông s công ngh theo h ưng ưu tiên t o ra d ng pellet nh và mn, h n ch t o pellet x p và ng ăn ng a hình thành các pellet r ng. iu ki n công ngh t ươ ng ng v i m c tiêu trên th ưng áp d ng là : t l cây gi ng 10%, v i m t dch gi ng (2-10).10 11 bào t /m 3; ph i h p iu ch nh gi a s c khí và khu y tr n m b o cung c p oxy hòa tan d ư so v i nhu c u t ươ ng ng v i th i im lên men, và t o ra pellet m n và nh (kích th ưc pellet thích h p nh t kho ng 0,2 - 0,5mm), trong iu ki n ã cân i v i nhu c u ti t ki m m c tiêu t n n ăng l ưng do khu y tr n. 2.2.3.2. c tính nhi t ng c a d ch lên men: Trong các thi t b lên men dung tích l n có s c khí và khu t tr n, th c t không th xác l p ưc s ng u t i kh p các vùng th tích làm vi c c a thi t b . T i các vùng ch y r i (vùng g n cánh khu y), t c trao i nhi t, t c chuy n kh i x y ra mnh m h ơn. Còn t i các vùng ch y màng (vùng sát thành thi t b , vùng g n các ng xo n trao i nhi t, vùng kém hi u qu hay vùng ch t c a thi t b ) t c chuy n kh i hay t c truy n nhi t c ũng gi m i. Ngoài ra, t i nh ng khu v c nh t nh c a thi t b có th xu t hi n vùng xoáy c c b hay các dòng ch y th c p làm thi u h t v hàm l ưng oxy hòa tan. Các y u t nêu trên ây s tác ng tr c ti p n n ăng l c sinh t ng h p c a ch ng, hi u qu chuy n hóa t o s n ph m và hi u qu kinh t chung c a toàn quá trình lên men. Th c t th ưng ch n ch khu y tr n d ư trên m c yêu c u. 2.2.3.3. Thành ph n môi tr ưng lên men: Môi tr ưng c ơ s lên men penicillin, vào th i k ỳ u trong nh ng n ăm 40 - 50, là môi tr ưng lactoza - n ưc chi t ngô, v i thành ph n chính nêu trong b ng 2.1. Ngu n c ơ ch t chính : là lactoza có th ưc thay th t ng ph n ho c toàn b bng các c ơ ch t khác nh ư: các lo i ưng hexoza, ưng pentoza, disaccarit, dextrin hay thay th b ng d u th c v t. Trong các c ơ ch t nêu trên, hi u qu cao h ơn c v n là glucoza. Ngoài ra, khi s d ng d u th c v t làm ch t phá b t ph i xét n hi u ng n m mc s d ng m t ph n d u th c v t làm ngu n cung c p th c ăn cacbon, tính toán iu ch nh n ng glucoza trong môi tr ưng lên men (và c s c n tr quá trình chuy n kh i do nh h ưng c a d u phá b t). Ngu n cung c p th c ăn nit ơ: có th s d ng là b t u t ươ ng, b t h t bông, các lo i d u cám. Nhu c u v th c ăn nit ơ c ũng có th ưc áp ng b ng cách cung cp liên t c (NH 4)2SO 4, nh ưng duy trì n ng th p, kho ng 250 - 340g/l (n u d ư th a hi u qu sinh t ng h p penicillin s gi m, n u thi u s x y ra hi n t ưng t phân h s i) . 20
21. Hàm l ưng các ch t khoáng b sung: ưc tính toán, ph thu c vào l ưng dch chi t ngô s d ng; pH môi tr ưng ưc iu ch nh tr ưc khi thanh trùng, sau ó trong su t quá trình lên men ưc giám sát ch t ch và iu ch nh theo yêu c u công ngh . Nng ti n ch t t o nhánh: Trong quá trình sinh t ng h p penicillin, vi c k t gn m ch nhánh c a phân t penicillin không mang tính c hi u ch t ch . Nh v y, nu duy trì n ng ti n ch t t o nhánh c n thi t phenylacetat (ho c phenooxyacetat) s cho phép thu nh n ch y u m t lo i penicillin G trong d ch lên men (ho c penicillin V). Theo lý thuy t, nhu c u v phenylaceta là 0,47g/gam penicillin G (ho c phenooxyacetat là 0,50g/gam penicillin V ). C n chú ý c hai c u t trên th c ch t u gây c cho n m nên ng ưi ta th ưng l a ch n gi i pháp b sung liên t c c u t này và kh ng ch ch t ch n ng theo yêu c u, không làm suy gi m n ăng l c lên men ca ch ng s n xu t. 2.2.3.4. iu ki n ti n hành lên men: Nhi t là thông s có nh h ưng l n n s phát tri n c a n m m c, kh n ăng sinh t ng h p và n ăng l c tích t penicillin c a chúng. Nhìn chung n m m c phát tri n thu n l i h ơn d i nhi t kho ng 30 0C. Tuy nhiên, d i nhi t này t c phân hu penicillin c ũng x y ra m nh m . Trong th c t , giai on nhân gi ng s n xu t ng ưi ta th ưng nhân d i nhi t 30 0C; sang giai on lên men th ưng áp d ng m t trong hai ch nhi t là : 21
22. 
    Lên men m t d i nhi t : Th ưng duy trì nhi t trong su t quá trình lên men d i nhi t 25 - 27 0C.
    Lên men hai ch nhi t : Giai on lên men b t u ti n hành 30 0C cho n khi h s i phát tri n t yêu c u v hàm l ưng sinh kh i thì iu ch nh nhi t sang ch lên men penicillin d i nhi t 22 - 25 0C (có công ngh iu ch nh xu ng 22 - 23 0C, gi nhi t này ti p hai ngày r i chuy n sang lên men ti p 25 0C cho n khi k t thúc quá trình lên men). pH môi tr ưng thu n l i cho s phát tri n h s i và cho quá trình sinh t ng h p penicillin th ưng dao ng trong kho ng pH = 6,8 - 7,4. Tuy nhiên iu ki n pH cao xu h ưng phân hu penicillin c ũng t ăng lên. Vì v y, trong s n xu t pH môi tr ưng th ưng ưc kh ng ch ch t ch giá tr l a ch n trong kho ng pH = 6,2 - 6,8. Nng oxy hoà tan và c ưng khu y tr n d ch lên men: V i nhi u ch ng nm m c, n ng oxy hòa tan thu n l i cho quá trình sinh t ng h p penicillin dao ng quanh m c 30% n ng oxy bão hòa. Nng CO 2 trong d ch lên men m c nh t nh c ũng c n thi t cho quá trình ny m m c a bào t n m m c; tuy nhiên n u n ng CO 2 quá cao s làm c n tr quá trình h p thu và chuy n hoá c ơ ch t c a ch ng, ngh ĩa làm làm c n tr quá trình sinh tng h p penicillin. 2.2.3.5. S tích t và phân hu penicillin: Trong quá trình lên men, do nhi u nguyên nhân khác nhau, trong ó có nh hưng c a n ng penicillin tích t trong môi tr ưng ngày càng t ăng, làm cho n ăng lc sinh t ng h p penicillin c a ch ng có xu h ưng gi m d n theo th i gian lên men. ng th i, ph thu c vào nhi t và pH môi tr ưng, m t ph n l ưng penicillin ã tích t cũng b phân hu theo th i gian. Nh m gi m t n th t trên, ngay sau khi k t thúc quá trình lên men c n x lý thu sn ph m s m ho c có gi i pháp h th p nhanh nhi t d ch lên men. 2.3. QUY TRÌNH LÊN MEN S N XU T PENICILLIN TRONG CÔNG NGHI P: 2.3.1. c im chung: Công ngh lên men s n xu t penicillin mang nét c thù riêng c a t ng c ơ s sn xu t và các thông tin này r t h n ch cung c p công khai, ngay m i b ng sáng ch th ưng c ũng ch gi i h n nh ng công on nh t nh; vì v y r t khó ưa ra ưc công ngh t ng quát chung. Theo công ngh lên men c a hãng Gist-Brocades (Hà Lan), toàn b dây chuy n s n xu t thu c kháng sinh penicillin có th phân chia làm bn công on chính nh ư sau (xem s ơ hình 2.8) 22
23. 
    Lên men s n xu t penicillin t nhiên (th ưng thu penicillin V ho c penicillin G) .
    X lý d ch lên men tinh ch thu bán thành ph m penicillin t nhiên.
    S n xu t các penicillin bán t ng h p (t nguyên li u penicillin t nhiên)
    Pha ch các lo i thu c kháng sinh penicillin th ươ ng m i. Hình 2.8. S ơ dây chuy n s n xu t penicillin (theo Gist-Brocades Copr. (Hà Lan)) 2.3.2. Chu n b lên men : Gi ng, b o qu n và nhân gi ng cho s n xu t: Gi ng công nghi p P.chrysogenum ưc b o qu n lâu dài d ng ông khô, b o qu n siêu l nh 70 0C ho c b o qu n trong nit ơ l ng. Gi ng t môi tr ưng b o qu n ưc c y chuy n ra trên môi tr ưng th ch h p ho t hoá và nuôi thu bào t . D ch huy n phù bào t thu t h p petri ưc cy chuy n ti p sang môi tr ưng bình tam giác, r i sang thi t b phân gi ng nh , qua thi t b nhân gi ng trung gian và cu i cùng là trên thi t b nhân gi ng s n xu t. Yêu cu quan tr ng c a c a công on nhân gi ng là ph i m b o cung c p l ưng gi ng c n thi t, v i ho t l c cao, ch t l ưng m b o úng th i im hco các công on nhân gi ng k ti p và cu i cùng là cung c p l ưng gi ng t các yêu c u k thu t cho lên men s n xu t. Trong thc ti n, m b o cho quá trình lên men thu n li ng ưi ta th ưng tính toán l ưng gi ng c p sao cho m t gi ng trong d ch lên men ban u kho ng 1 - 5.10 9 bào t / m 3. Thành ph n môi tr ưng nhân gi ng c n ưc tính toán m b o cung c p ngu n th c ăn C, N, các ch t khoáng và các thành ph n khác, m b o cho s hình thành và phát tri n thu n l i c a pellet. Chu n b môi tr ưng lên men và thi t b : - Chu n b môi tr ưng lên men: 23
24. . Cân ong, pha ch riêng r các thành ph n môi tr ưng lên men trong các thùng ch a phù h p . Thanh trùng gián on 121 0C ( hay thanh trùng liên t c kho ng 140-146 0C) ho c l c qua các v t li u siêu l c r i m i b ơm vào thùng lên men. Nu c tính công ngh c a thi t b lên men cho phép, có th pha ch r i thanh trùng ng th i d ch lên men trong cùng m t thi t b . T t c các c u t b sung vào môi tr ưng lên men u ph i ưc x lý kh khu n tr ưc và sau ó b sung theo ch v n hành vô khu n. - Thi t b lên men: Ph i ưc vô khu n tr ưc khi ưa vào s d ng. Th ưng thanh trùng b ng h ơi quá nhi t 2,5 – 3,0 at trong th i gian 3 gi . ông th i kh khu n nghiêm ng t t t c các h th ng ng d n, kh p n i, van, phin l c và t t c các thi t b ph tr khác .Trong quá trình lên men luuôn c g ng duy trì áp su t d ư trong thi t b nh m h n ch r ũi ro do nhi m t p. - Không khí th ưng ưc kh khu n s ơ b b ng nén on nhi t, sau ó qua màng l c vô khu n hay màng siêu l c . 2.3.3. K thu t lên men: 2.3.3.1. K thu t lên men b m t: Áp d ng t lâu, hi n nay h u nh ư không còn ưc tri n khai trong s n xu t ln n a. G m 2 ph ươ ng pháp: * Lên men trên nguyên li u r n (cám mì, cám ngô có b sung ưng lactoza) * Lên men trên b m t môi tr ưng l ng t ĩnh (ph bi n s d ng môi tr ưng c ơ bn lactoza- n ưc chi t ngô) Do ưng lactoza ưc n m m c ng hóa ch m nên không x y ra hi n t ưng d ư th a ưng trong t bào. Còn d ch n ưc chi t ngô cung c p cho n m m c ngu n th c ăn nit ơ, các ch t khoáng và các ch t sinh tr ưng, trong ó phenylalanin khi b th y phân s t o thành phenylacetic cung c p ti n ch t t o m ch nhánh cho phân t penicillin. Khi lên men trong môi tr ưng l ng, áp d ng công ngh b sung liên t c phenylacetic vào môi tr ưng lên men, hàm l ưng b sung ph thu c pH môi tr ưng th ưng là 0,2-0,8 kg phenylacetic/m 3 d ch lên men.Trong iu ki n ó, l ưng penicillin G ưc t ng h p t ăng rõ r t còn hàm l ưng các penicillin khác c ũng gi m i. h n ch quá trình oxy hóa ti n ch t, th ưng ph i b sung vào môi tr ưng m t lưng nh axit axetic. Trong k thu t lên men l ng gián on không iu ch nh pH môi tr ưng th ưng t ăng nh , sau ó t ươ ng i n nh và vào cu i quá trình lên men th ưng trong kho ng pH = 6,8-7,4. Khi s d ng c ơ ch t chính là lactoza, ng ưi ta ã 24
25. xác nh ưc penicillin chie ưc t ng h p và tích t m nh m trong môi tr ưng khi nm m c ã s d ng ưng này và khi lactoza có d u hi u c n ki t thì s i n m c ũng bt u t phân. Vì v y ng ưi ta th ưng k t thúc quá trình lên men vào th i im s p ht ưng lactoza. 2.3.3.2. K thu t lên men chìm: 25
26. 2.3.4. Hi u qu kinh t chung c a quá trình lên men : Năng l c sinh t ng h p và tích t penicillin trong d ch lên men là k t qu c a mi t ươ ng tác ng th i c a hàng lo t y u t công ngh nh ư: ho t tính sinh t ng h p ca chúng, công ngh lên men áp d ng, ch t l ưng nguyên li u, c tính thi t b và năng l c áp ng các yêu c u công ngh c a thi t b , ch giám sát và iu ch nh các thông s công ngh , n ăng l c và k n ăng v n hành c a công nhân V i ngu n c ơ ch t chính là glucoza và lên men theo ph ươ ng pháp chìm, h s phân b nguyên li u d tính kho ng 25% glucoza ưc n m m c s d ng t ng h p h s i, 65% ưng ưc s d ng duy trì s s ng sót c a h s i, còn l i ch kho ng 10% ưc n m m c s d ng t ng h p penicillin. H s s d ng th c ăn nit ơ và l ưu hu ỳnh t ng h p penicillin t ươ ng ng là 20% và 80%. N ng penicillin G trong d ch lên men nh ng năm 80 - 90 c a th k XX t kho ng 80.000 UI/ml (t ươ ng ng n ăng su t kho ng 40 - 50 kg penicillin G/ m 3 d ch lên men ) 2.4. X LÝ D CH LÊN MEN VÀ TINH CH THU PENICILLIN T NHIÊN: Công on x lý d ch lên men và tinh ch thu penicillin t nhiên ưc tóm t t trong s ơ hình 2.9 , bao g m các công on chính sau ây: Hình 2.9. S ơ tóm t t công on x lý d ch lên men thu penicillin t nhiên 27
27. 2.4.1. L c d ch lên men : Mc ích : Penicillin là s n ph m lên men ngo i bào. Vì v y, ngay sau khi k t thúc quá trình lên men ng ưi ta th ưng ti n hành l c ngay gi m t n hao do phân hu penicillin và gi m b t khó kh ăn khi tinh ch , do các t p ch t t o ra khi h s i n m t phân. Thi t b l c: ph bi n là thi t b l c hút ki u b ăng t i ho c ki u thùng quay. Thông th ưng, ng ưi ta ch c n l c m t l n r i làm l nh d ch ngay chuy n sang công on ti p theo. Ch trong nh ng tr ưng h p r t c bi t m i c n ph i x lý k t ta m t ph n protein và l c l i d ch l n th hai. Hi n t ưng t phân h s i n m th ưng kéo theo h u qu làm cho d ch khó l c h ơn. Thu h i sinh kh i n m: Ph n sinh kh i n m ưc r a s ch, s y khô và s d ng ch bi n th c ăn gia súc. 2.4.2. Trích ly : Penicillin th ưng ưc trích ly d ng axít ra kh i d ch l c b ng dung môi amylacetat ho c butylacetat pH = 2,0 - 2,5, nhi t 0 - 3 0C. Nh m h n ch l ưng penicillin b phân hu , quá trình trích ly ưc th c hi n trong th i gian r t ng n trong thi t b trích ly ng ưc dòng liên t c ki u ly tâm nhi u t ng cánh. ng th i, trong th i gian trích ly c n giám sát ch t ch các thông s công ngh nh ư: nhi t pH, vô khu n h n ch t n th t do phân hu penicillin. D ch lên men sau khi l c ưc bơm tr n ng th i v i dung d ch H 2SO 4 ho c H 3PO 4 loãng có b sung thêm ch t ch ng t o nh ũ và b ơm song song cùng v i dung môi trích ly vào trong thi t b . T l dch l c: dung môi th ưng ch n trong kho ng 4 - 10V d ch l c /1V dung môi. Trong mt s công ngh , nh m c i thi n ch t l ưng s n ph m, ng ưi ta có th áp d ng ph ươ ng pháp trích ly hai l n dung môi, v i l n u trích ly penicillin b ng amylacetat ho c butylacetat; ti p theo penicillin l i ưc trích ly ng ưc sang dung d ch êm pH = 7,2 - 7,5, th ưng là dung d ch KOH loãng ho c dung d ch NaHCO 3; sau ó penicillin l i ưc trích ly sang dung môi l n th 2, v i l ưng dung môi ít h ơn.(hình 2.10) 28
28. Hình 2.10. S ơ công ngh trích ly 2 l n dung môi tinh ch penicillin 2.4.3. T y màu : t y màu và lo i b m t s t p ch t khác, ng ưi ta th ưng b sung tr c ti p ch t h p ph vào dung môi ch a penicillin sau trích ly, s d ng ph bi n nh t là than ho t tính. Sau ó than ho t tính ưc tách và r a l i b ng s d ng thi t b l c hút b ăng ti ho c thi t b l c hút ki u thùng quay. Ph n than sau l c ưc ưa i ch ưng thu h i dung môi và x lý hoàn nguyên, ph c v cho các m sau. 2.4.4. K t tinh, l c, r a và s y thu penicillin t nhiên: Vi c k t tinh penicillin V hay penicillin G d ưi d ng mu i có th ưc th c hi n r t ơn gi n, b ng cách b sung tr c ti p vào dung môi sau khi t y màu m t lưng nh kali acetat (hay natri acetat) ho c ng ưi ta trích ly l i sang dung d ch KOH loãng (hay NaOH loãng), ti n hành cô chân không nhi t th p, sau ó b sung BuOH penicillin t k t tinh. Các thông s công ngh có nh h ưng l n n hi u qa k t tinh là : n ng penicillin, n ng mu i acetat, pH dung môi hay pH dung dch cô c, nhi t k t tinh Sau khi k t tinh, tinh th penicillin ưc l c tách b ng máy l c hút thùng quay. m b o tinh khi t cao h ơn, có th ti n hành hòa tan và kt tinh l i penicillin. Khi s n ph m ã t tinh s ch theo yêu c u, th ưng tinh khi t không d ưi 99,5%, chúng ưc l c tánh tinh th ; ti p theo r a và làm khô s ơ b bng dung môi k n ưc nh ư izopropanol hay butylalcohl; hút chân không tách dung môi trên máy l c b ăng t i r i s y b ng không khí nóng n d ng s n ph m b t mu i penicillin. S n ph m này, m t ph n ưc s d ng tr c ti p pha ch thu c kháng sinh penicillin; còn l i, ph n l n ưc s d ng làm nguyên li u ph c v cho vi c s n xu t các s n ph m penicillin và cephalosporin bán t ng h p khác. Ngoài ra, s n xu t ra các s n ph m penicillin có tinh khi t r t cao, ng ưi ta c n ph i s d ng ph i hp thêm m t s gi i pháp công ngh khác. 29
29. 2.5. S N XU T CÁC βββ- LACTAM BÁN T NG H P T PENICILLIN G 2.5.1. Nhu c u s n xu t các penicillin bán t ng h p : Tác d ng iu tr chính c a penicillin và các kháng sinh khác thu c h β-lactam ưc xác nh là: c u trúc penicillin có nhi u im g n g ũi v i dipeptit D-alanin-D- alanin, là h p ph n c u trúc c a l p peptido-glucan thành t bào. Do s t ươ ng ng v c tính và c u trúc này làm cho ho t tính các enzym tham gia vào quá trình t ng h p t bào b bi n i, các enzym này ã nh n "nh m" c ơ ch t. K t qu là ph n thành t bào m i t ng h p v i s "nh m l n" trên s không ưc hình thành, làm cho thành t bào c a m m b nh ch có t ng ph n hay chúng hoàn toàn không có thành t bào do ó chúng d dàng b t phân trong môi tr ưng và b các công c t v c a c ơ th b nh nhân tiêu di t. ng th i, các kháng sinh β-lactam còn liên k t c hi u v i m t s protein trên màng t bào ch t ( n nay ã xác nh ưc chín protein trên). S liên k t này ã làm "b t ho t" và "hòa tan" các protein c hi u trên màng, d n n làm m t ho t tính polymeraza và ATPaza (ng ưi ta ã xác nh ưc trong môi tr ưng kháng sinh ch có các D-alanin -cacboxylpeptidaza còn ho t ng và m t s ACPaza này l i có ho t tính B-lactamaza y u). Ngoài ra, ngưi ta còn phát hi n th y nh h ưng c a pencillin n các chuy n hóa photpholipit trong t bào. Tuy nhiên nhi u tr ưng h p iu tr v i penicillin ã xu t hi n d u kháng thu c. Nguyên nhân chính c a hi n t ưng kháng penicillin này là chúng t ng h p uc mt trong hai enzym penicillinaza và c bi t là enzym β-lactamaza. Gen mã hóa sinh tng h p enzym β-lactamaza ưc l ưu gi trên các plasmid (ho c trasporon ). Vì v y, cùng v i th i gian iu tr , n ăng l c kháng thu c c a chúng s tr nên thành th c. vô hi u kh n ăng kháng thu c nêu trên, v nguyên lý, gi i pháp ơn gi n h ơn c là làm vô hi u kh n ăng t ươ ng tác c a enzym v i c ơ ch t b ng cách làm bi n i c u trúc phân t penicillin. t o ra các penicillin khác nhau, trên nguyên t c có th hoàn thi n theo hưng lên men tr c ti p v i các ti n ch t t o nhánh thích h p thu các .penicillin mong mu n hay lên men không s d ng ti n ch t thu axit 6- aminopenicillanic làm nguyên li u t ng h p ra các penicillin khác. Tuy nhiên, b ng con ưng lên men tr c tip cho n nay ng ưi ta m i ch có kh n ăng lên men ưc m t vài lo i penicillin. Trong khi ó, con ưng kinh t h ơn c và ưc tri n khai trong s n xu t ln l i là ch lên men tr c ti p thu penicillin G (ho c penicillin V) làm ra nguyên li u, t ó tng h p ra penicillin bán t ng h p khác. Ngoài ra, b ng con ưng bán t ng hp penicillin G ho c penicillin V, có th s n xu t ra m t s d n xu t β -lactam có giá tr nh ư các cepalosporin bán t ng h p hay các penicillin có ho t tính kìm hãm β- lactamaza. 30
30. 2.5.2 S n xu t axit 6- aminopenicillanic và s n xu t penicillin bán t ng h p Axit 6- aminopenicillanic tuy không có ho t tính kháng khu n, nh ưng có th s dng làm nguyên li u t ng h p ra nhi u lo i penicillin khác nhau và c cephalosporin. s n xu t axit 6- aminopenicillanic, con ưng hi u qu h ơn c hi n nay là lên men s n xu t penicillin G (ho c penicillin V); sau ó áp d ng ph ươ ng pháp hóa h c hay s d ng enzym acylaza phân c t m ch nhánh bên xem s ơ hình 2.11. Hình 2.11. S ơ t ng h p axit 6- aminopenicillanic t penicillin G Ph ươ ng pháp hóa h c có hi u su t chuy n hóa cao, t i 90-95%, và t c ph n ng nhanh, song l i tiêu hao nhi u n ăng l ưng, nhi u dung môi và ch a ng nguy c ơ ô nhi m môi tr ưng cao. Trong khi ó, ph ươ ng pháp enzym, tuy hi u qu chuy n hóa th p h ơn nh ưng iu ki n ph n ng êm d u và mang l i hi u qu kinh t cao h ơn nên ưc tri n khai ph bi n trong th c ti n s n xu t công nghi p. ng th i, c ũng nh ưu th trên, ph ươ ng pháp enzym ưc hoàn thi n liên t c và ngày nay ã t ưc ưu th vưt tr i so v i ph ươ ng pháp hóa h c (xem b ng 2.2). 31
31. Bng 2.2 Phân b chi phí trong s n xu t axit 6- aminopenicillanic (40t n/n ăm theo hãng Snam Progetti) 2.5.3 S n xu t axit 7- deminodeaxetoxy-cephalosporin (7-ADCA) và s n xu t cepalosporin bán t ng h p Cepalosporin là h ch t kháng sinh thu c nhóm β -lactam v i c tính quý nh ít b kháng thu c h ơn penicillin và ưc ánh giá an toàn h ơn cho ng ưi b nh. Các s n ph m Cepalosporin bán t ng h p khác nhau u ưc t ng h p t s n ph m trung gian là axit 7- deminodeaxetoxy-cepalosporin (7-ADCA xem m c 3). S n ph m 7-ADCA này có th ưc t ng h p t penicillin G , t axit 6- aminopenicillanic hay t cepalosporin C là (m t s n ph m lên men t nhiên), trong ó n cu i th k XX con ưng hi u qu kinh t nh t v n là t ng h p t penicillin G theo s ơ 2.12 T s n ph m 7-ADCA ng ưi ta d dàng acyl hóa b ng các m ch nhánh t ươ ng ng s n xu t ra các cepalosporin bán t ng h p, trong ó bao g m theo c hai h ưng là thay th nhánh tai v trí C 7 (thí d nh ư cephalecin,cephadrin, cephadroxil ), hay , thay th các ng th i m ch nhánh t i c hai v trí C3 và C 7 (nh ư: cephazolin, cephatrizin, cefoperazon,cephamadol,cefotiam ) 2.5.4. S n xu t các B-lactam bán t ng h p các ho t tính kìm hãm βββ - lactamaza Bên c nh các ng d ng nêu trên, axit 6- aminopenicillanic còn ưc s d ng làm nguyên li u s n xu t m t s ch ph m penicillin bán t ng h p có c ho t tính kĩm hãm B-lactamaza (thí d nh ư oxacillin,cloxacillin,dicloxacyllin, flucloxacillin ), 32
32. hay k t h p s d ng axit clavunic ho c olivanic làm m ch nhánh làm t ăng hi u qu iu tr (hai axit này tuy có ho t tính kháng sinh y u nh ưng có ho t tính kìm hãm B- lactamaza (thí d nh ư axit bromopenicillanic). Hình 2.12. S ơ t ng h p hóa h c axit 7-ADCA t penicillin G = 33
33. CH ƯƠ NG 3 CÔNG NGH LÊN MEN CEPHALOSPORIN VÀ CEPHAMYCIN 3.1. I C ƯƠ NG Cephalosporin và cephamycin thu c h ch t kháng sinh có c u trúc vòng chính gm vòng β -lactam liên k t v i vòng dihydrotiazin (hình 3.1). Ngày nay, ng ưi ta ã phát hi n ưc nhi u lo i n m, x khu n và vi khu n khác nhau có kh n ăng t ng h p Cephalosporin; nh ưng kh n ăng t ng h p cephamycin m i tìm th y x khu n và m t vài ch ng Norcardia. Ch t kháng sinh in hình cho h này là cephalospoin C ưc newton và Abaraham phát hi n n ăm 1956 (Nagarajan và ng nghi p phát hi n ưc cephamycin mu n h ơn vào n ăm 1971). Ưu im l n nh t Cephalosporin C là có tác d ng kháng khu n i c c u khu n có ho t tính B-lactamaza nhi u vi khu n Gram âm h u nh ư 34
34. không c (li u tiêm d ưi da LD 50 là 4g/kg th tr ng). s n xu t ra các CephalosporinC ng ưi ta th ưng s d ng các ch ng x khu n có ho t tính cao c a loài cephalosporium acremonium . C ơ ch quá trình t ng h p Cephalosporin C c ũng qua sn ph m trung gian penicillin N r i chúng ưc chuy n hóa ti p t c theo s ơ 3.2 ti p theo cepaloporin C qua quá trình metoxyl hoá t i v trí C 7 s hình thành cephamycin. im c bi t c a quá trình hình thành cephalosporin C là m ch nhánh α- aminoadipyl liên k t c hi u h ơn v i vòng β - lactam (ho c chính các ch ng này không có enzym acyltransferaza), nên vi c s d ng các ti n ch t t o nhánh thay th trong quá trình lên men nh m thu nh n các cephalosporin khác h u nh ư không thu ưc hi u qu áng k . Hình 3.2. C ơ ch t ng h p cephalosporin C ( giai on cu i t penicillin N) 35
35. 3.2. im công ngh lên men: 36
36. \ Hình 3 3. S ơ ph n ng bi n i cephalosporrin C thành axit 7- ADCA 37
37. Hình 3.4. C u trúc m t s kháng sinh cephaslosporin bán t ng h p ph d ng 38
38. CH ƯƠ NG 4 CÔNG NGH S N XU T CÁC KHÁNG SINH KHÁC 1. CÔNG NGH S N XU T CÁC KHÁNG SINH CÓ NGU N G C T X KHU N 1.1.CÔNG NGH LÊN MEN KHÁNG SINH NHÓM AMINOSID (MINOGLYCOSID) 1.1.1. Streptomycin 1.1.2. Neomycin 1.2. CÔNG NGH LÊN MEN KHÁNG SINH NHÓM TETRACYLIN 1.2.1. Tetracyclin ( Acromycine, tetracin) 1.2.2. Oxytetracyclin ( terramycin ) 1.3. CÔNG NGH LÊN MEN KHÁNG SINH NHÓM MACROLID Erythomycin: 1.3.1. c im ch ng Streptomyces erythreus 1.3.2. iu kiên sinh t ng h p. 1.3.3. Chi t xu t 1.4. KHÁNG SINH CH NG N M CANDIDA: NYSTATINE 2. CÔNG NGH S N XU T KHÁNG SINH CÓ NGU N G C VI KHU N 3. CÔNG NGH S N XU T KHÁNG SINH KHÁNG N M 39
39. PH N 3. CÔNG NGH S N XU T V C XIN CHO NG Ưi CH ƯƠ NG 7 CƠ S SINH HÓA C A CÔNG NGH S N XU T V C XIN 1. H th ng mi n d ch c a c ơ th : 1.1. Khái ni m: Mi n d ch (hay mi n nhi m) là t p h p t t c các c ơ ch sinh h c giúp cho m t cơ th a bào gi ưc s liên k t gi a các t bào và các mô , m b o s toàn v n c a cơ th bng cách lo i b nh ng thành ph n b h ư h ng c ũng nh ư các ch t và sinh v t xâm h i. Ch c n ăng b o v c ơ th bao g m hai lo i c ơ ch mi n d ch, l n l ưt xu t hi n trong quá trình ti n hóa c a các loài và liên h ch t ch v i nhau các ng v t b c cao 1.2. Cơ ch b o v c ơ th 1.3. Phân lo i mi n d ch: • Mi n d ch t nhiên (hay mi n d ch không c hi u), áp ng t c thì. • Mi n d ch thu ưc (mi n d ch c hi u), áp ng sau vài ngày v i c im là kh n ăng "ghi nh ". c p phân t , c hai c ơ ch u có kh n ăng phân bi t ("nh n di n") các thành ph n c a c ơ th , t c cái "ta" v i t t c nh ng phân t khác g i chung là cái "không ta". Mi n d ch c hi u xu t hi n vào th i im phân k ỳ gi a ng v t có xươ ng s ng và ng v t không x ươ ng s ng cách ây 500 tri u n ăm. Mi n dch t nhiên có tính nguyên th y h ơn, c n thi t cho s sinh t n c a m i sinh vt. 1.3.1. Mi n d ch t nhiên 1.3.2. Mi n d ch ti p thu ( Mi n d ch thu ưc) - Mi n d ch thu ưc ch ng - Mi n d ch thu ưc th ng: . Mi n d ch thu ưc th ng t nhiên: là tr ng thái MD thu ưc do kháng th ghép ho c truy n t s a m . 40
40. . Mi n d ch thu ưc th ng nhân t o là MD nh kháng th chuy n t bên ngoài do truy n kháng huy t thanh 1.4. Ch t sinh mi n d ch và kháng nguyên: B t k ỳ m t ch t nào khi ư a vào c ơ th ng v t iu ki n thích hp gây ra áp ng MD u ưc g i là ch t sinh mi n d ch. Bt c ch t nào khi g n v i thành ph n áp ng mi n d ch ( kháng th ho c t bào lympho ho c c hai) u ưc g i là kháng nguyên. ( ngh ĩa là các ch t khi ưa vào c ơ th s kích thích c ơ th t o nên kháng th . Tt c các ch t sinh mi n d ch u là kháng nguyên, song có m t s ch t ưc coi là kháng nguyên nh ưng không gây áp ng MD.Ví d Hapten. Tt c các protein t nhiên c a ng v t , th c v t và vi sinh v t tr ng thái keo u có tính kháng nguyên. Các ch t c th c v t ( abin, robin, crotin, rixin, curxin), các ch t c ng v t ( n c r n, n c ong, nh n ), Mt s polysacarit vi sinh v t, các ph c h p protein v i lipit, protein v i polysacarit c ũng có kh n ăng kích thích c ơ th t o thành kháng th . Dưi tác d ng c a fcmalin hay nhi t , các ngo i c tó b m t c tính nh ưng tính ch t kháng nguyên h u nh ư v n còn gi nguyên. Lúc này ưc gi là anatoxin. Anatoxin ưc dùng ph bi n gây mi n d ch ch ng cho ng ưi ch ng l i các b nh nh ư các b nh B ch h u, u n ván v v. 1.4.1. iu ki n c a m t ch t sinh MD: - Tính l : Ch t ưc g i là kháng nguyên tr ưc h t ph i là m t ch t l i v i cơ th , b i vì bình th ưng c ơ th không áp ng b o v v i các ch t b n thân. Ch t càng l bao nhiêu kh n ăng kích thích t o kháng th càng m nh b y nhiêu. - Kh i l ưng phân t l n: Kháng nguyên có KL phân t > 10000 dalton. N u < 1000 dalton ( penicillin, progesteron, aspirin ) thì không có tính sinh MD. T 1000 d n 6000 dalton ( insulin) có th có ho c không có kh n ăng áp ng MD. - Cu trúc phân t ph c t p: Ch t có c u trúc phân t càng ph c t p thì tính mD càng cao VDb Poly lizin là 1 polyme có KL phân t 3000 dalton, nh ưng không gây áp ng MD vì có c u trúc ơn gi n, trong khi ó Hapten tuy có kh i l ưng phân t nh vf không có tính sinh MD, nh ưng khi g n v i ch t có KL phân t cao ( nh ư protein) l i tr thành m t chát sinh MD. Nh ư vây ch t sinh MD n u không 3 y u t trên thì c n ph i g n v i ch t mang làm t ăng KL phân t ho c có m c ph c t p v c u trúc. 1.4.2. Tính c hi u c a kháng nguyên: 41
41. S liên k t gi a kháng nguyên v i kháng th hay gi a kháng nguyên v i t bào lympho luôn mang tính c hi u cao. Tính c hi u này t ươ ng t nh ư gi a enzim vi c ơ ch t, gh ĩa là kh p v i nhau nh ư khoa v i chìa Kháng th hay t bào lympho không ph i liên k t v i toàn b kháng nguyên mà ch v i m t ph n nh t nh c a kháng nguyên g i là quy t nh kháng nguyên hay là epitop. Kích th ưc c a epitop kho ng 7x12x 35 A0 g m 5-7 axit amin Ph n t ươ ng ng c a nó trên m i kháng th g i là v trí k t h p kháng nguyên hay là paratop. Paratop có kích thưc t ươ ng t Ph n t ươ ng ng v i quy t nh kháng nguyên n m trên t bào lympho g i là th th . Ch ng h n th th c a t bào T là TCR ( T – cell receptor). Mi epitop ch g n c hi u v i m t paratop c a kháng th ho c ho c TCR và ch sinh ra m t dòng kháng th c hi u. M t kháng nguyên có nhi u epitop khác nhau s t o thành nhi u dòng kháng th khác nhau t ươ ng ng v i t ng epitop Tính c hi u trong liên k t gi a kháng th v i kháng nguyên ưc ng d ng thành m t ph ươ ng ti n t m soát các ch t trong nhi u k thu t ch n oán. Các kháng th c hi u i v i m t kháng nguyên mong i có th ưc g n nhãn phóng x hay hu ỳnh quang ho c các enzyme t o màu r i s d ng nh ư các " u dò" tìm ki m kháng nguyên ó. Các ng d ng n i ti ng bao g m immunoblot , ELISA và nhu m hóa mô mi n dch các tiêu b n hi n vi. T c , chính xác và s ơn gi n c a các xét nghi m trên ã thúc y s phát tri n c a các k thu t ch n oán nhanh in vivo các b nh, vi khu n và c các ch t ma túy. Xét nghi m s t ươ ng h p các nhóm máu c ũng trên c ơ s ph n ng kháng nguyên-kháng th . 1.5. Kháng th : Kháng th là các globulin xu t hi n trong máu c a ng v t khi ưa kháng nguyên vào c ơ th , có kh n ăng liên k t c hi u v i kháng nguyên ã kích thích sinh ra nó. Kháng th ưc nh ngh ĩa trên ây g i là kháng th MD ( Ig- Imunnoglobulin) hay kháng th c hi u. Kháng th ch y u tìm th y trong huy t thanh c a ng v t, vì v y huy t thanh ch ưa kháng th c hi u kháng nguyên g i là kháng huy t thanh. Kháng th còn tìm th y trrong các th d ch khác c a c ơ th , nh ư s a. Nh ng kháng th có trong s a hay huy t t ươ ng c a ng ưi và c a ng v t t tr ưc khi có s ti p xúc v i kháng nguyên g i là kháng th t nhiên hay kháng th không c hi u 2. Các t bào tham gia vào h th ng mi n d ch: 42
42. H th ng mi n d ch g m nhi u c ơ quan và nhi u lo i t bào n m rãi rác kh p c ơ th , tác ng qua l i nhau d n n áp ng MD cu i cùng. Ngay c tr ưc khi khái ni m mi n d ch ưc hình thành, nhi u th y thu c c i ã mô t nh ng c ơ quan mà v sau ng ưi ta ch ng minh ưc là thu c h mi n d ch. Các cơ quan chính c a h mi n d ch g m tuy n c, lách , ty x ươ ng , các mch lympho , hch lympho và các mô lympho th c p (nh ư các h ch ami an , V.A. ) và da . Các c ơ quan chính, tuy n c và lách, ã ưc nghiên c u ơn thu n v m t mô h c qua các t thi t. Ngoài ra, có th dùng ph u thu t l y ra các h ch lympho và m t s mô lympho th c p nghiên c u khi b nh nhân còn s ng ( sinh thi t). Nhi u t bào thu c h mi n dch không liên k t v i m t c ơ quan c bi t nào, mà ch tp trung ho c l ưu chuy n gi a nhi u mô trong kh p c ơ th . Trong h th ng MD có 2 lo i t bào chính là: Các t bào lympho và các i th c bào T bào ch ch t tham gia vào áp ng MD là t bào lympho, t ch c có ch a t bào lympho và tham gia vào áp ng MD g i là t ch c lympho. Lympho có ngu n g c t các t bào ngu n, còn g i là t bào g c, không bi t hóa, tu x ươ ng. T t bào ngu n, nhi u dòng t bào có ch c n ăng khác nhau ưc bi t hóa r i sau ó tr i qua m t quá trình thành th c hay chín khi k t h p vi các t ch c chuyên hóa. 3. Tính ch t c a mi n d ch: 3.1. Tính c hi u: Kháng nguyên nào thì kháng th n y. M i kháng nguyên ch có th k t h p v a kh p v i m t lo i kháng th c hi u do chính nó kích thích t o thành. Nó kh p v i nhau nh ư khóa v i chìa. Tính c hi u này do c u trúc b m t các phân t kháng nguyên và kháng th quy t nh. 3.2.Tính ghi nh : Sau khi ti p xúc v i kháng nguyên, c ơ th có th hình thành áp ng mi n d ch nh . N u l n sau có d p ti p xúc v i kháng nguyên thì cơ th s t o m t áp ng mi n d ch nhanh và m nh h ơn di t tác nhân gây bnh 43
43. CH ƯƠ NG 8 CÔNG NGH S N XU T V C XIN 1. Khái ni m v v c-xin 1.1. nh ngh ĩa vacxin: Vc-xin là ch ph m có tính kháng nguyên dùng t o mi n d ch c hi u ch ng, nh m t ăng s c kháng c a c ơ th i v i m t (s ) tác nhân gây b nh c th . Các nghiên c u m i còn m ra h ưng dùng v c-xin iu tr m t s b nh ( vc-xin li u pháp , m t h ưng trong các mi n d ch li u pháp ). Thu t ng v c-xin xu t phát t vaccinia , lo i virus gây bnh u bò nh ưng khi em ch ng cho ng ưi l i giúp ng a ưc bnh u mùa ( ti ng Latinh vacca ngh ĩa là "con bò cái"). Vi c dùng v c-xin phòng b nh g i chung là ch ng ng a hay tiêm phòng ho c tiêm ch ng , m c dù v c- xin không nh ng ưc c y (ch ng), tiêm mà còn có th ưc ưa vào c ơ th qua ưng mi ng. Chun b v c-xin cúm ch ng ng a 1.2. L ch s và h ưng phát tri n c a v ăc-xin Edward Jenner ưc công nh n là ng ưi u tiên dùng v c-xin ng a b nh cho con ng ưi ngay t khi ng ưi ta còn ch ưa bi t b n ch t c a các tác nhân gây b nh (n ăm 1796). Louis Pasteur v i các công trình nghiên c u v vi sinh h c và mi n d ch h c ã m ưng cho nh ng ki n th c hi n i v v c-xin. Vào th k th nh t tr ưc Công nguyên , vua Mithridate VI m i ngày u u ng m t lưng nh c ch t cho c ơ th quen d n nh m ươ ng u v i nguy c ơ b ám sát. Chuy n k r ng cách này ã t ra hi u qu vì v sau, khi Mithridate th t tr n và t sát, li u thu c c ông ta u ng vào ch ng có ép phê gì. Trung Qu c, vào kho ng th k th 10 , các th y lang o giáo ã bí m t dùng mt k thu t phòng bnh u mùa . u mùa là ch ng b nh hi m nghèo, n u không gi t ch t b nh nhân thì nó c ũng l i nh ng v t so r trên mt. Các th y lang ã l y vy s o c a ng ưi b b nh(ch a m m b nh), cho vào m t chi c h p kín r i gi nhi t 44
44. nh t nh trong m t th i gian gi m c tính, sau ó nghi n nh th i vào mũi c a ng ưi kh e ch ưa t ng m c b nh u mùa ng a b nh. Mt ph ươ ng pháp t ươ ng t c ũng ưc dùng Th Nh ĩ K ỳ vào th k 18 . B qua nh ng huy n tho i l loi và không ch c ch n trên, v c-xin u tiên gn v i tên tu i c a Edward Jenner , m t bác s ĩ ng ưi Anh . N ăm 1796 , châu Âu ang có d ch u mùa , Jenner ã th c hi n thành công th nghi m v c-xin ng a căn b nh này. Kinh nghi m dân gian cho th y nh ng nông dân v t s a bò có th b lây bnh u bò, nh ưng sau khi kh i b nh, h tr nên mi n nhi m i v i b nh u mùa. D a vào ó, Jenner chi t l y d ch t các v t u bò trên cánh tay c a cô bnh nhân Sarah Nelmes r i c y d ch này vào cánh tay c a c u bé 8 tu i kh e mnh cùng làng tên là James Phipps. Sau ó Phipps ã có nh ng tri u chng c a bnh u bò. 48 ngày sau, Phipps kh i h n b nh u bò, Jenner li n tiêm ch t có ch a m m b nh u mùa cho Phipps, nh ưng Phipps không h m c c ăn b nh này. Cách làm c a Jenner xét theo các tiêu chu n y c ngày nay th t không n, nh ưng rõ ràng ó là m t hành ng có tính khai phá: a tr ưc ch ng ng a ã kháng ưc b nh. Th i c a Jenner, các virus v n ch ưa ưc khám phá, còn vi khu n tuy ã ưc tìm ra nh ưng vai trò gây b nh c a chúng ch ưa ưc bi t. Th i im 1798, khi Jener công b k t qu thí nghi m c a mình, ng ưi ta ch hình dung là có các "m m b nh" . gây nên s truy n nhi m Sau thí nghi m thành công c a Jenner, ph ươ ng pháp ch ng u ưc tri n khai r ng rãi. Tính n n ăm 1801 , Anh ã có trên 100.000 ng ưi ưc ch ng. Tám m ươ i n ăm sau, Louis Pasteur nghiên c u bnh t khi d ch t ang tàn sát àn gà . Ông c y các vi khu n t trong phòng thí nghi m r i em tiêm cho gà: nh ng con b tiêm ch t s ch. Mùa hè n ăm 1878 , ông chu n b m t bình dung d ch nuôi c y vi khu n dng huy n phù, r i ó, i ngh mát. Khi tr v , ông l i trích l y huy n phù ó em tiêm cho gà. L n này thì b y gà ch b b nh nh r i c àn cùng kh e l i. Pasteur hi u ra r ng khi ông i v ng, ám vi khu n trong huy n phù ó ã b bi n tính, suy y u i. Ông bèn l y vi khu n t (bình th ưng) em tiêm cho nh ng con gà v a tr i qua thí nghi m trên và nh ng con ch ưa h b chích vi khu n. K t qu là nh ng con nào t ng ưc chích vi khu n (bi n tính) thì có kh n ăng kháng l i m m bnh , b n còn l i ch t h t. Qua ó, Pasteur ã xác nh n các gi thuy t c a Jenner và m ưng cho khoa mi n d ch h c hi n i. T ó, ch ng ng a ã y lùi nhi u b nh: tri t tiêu b nh u mùa trên toàn c u, thanh toán g n nh ư hoàn toàn bnh b i li t, gi m áng k các b nh si, bch h u, ho gà , bnh ban ào , th y u, quai b , th ươ ng hàn và un ván v.v. Nguyên t c v n không có gì thay i: gây mi n d ch b ng m t vi khu n ho c virus gi m c l c, ho c v i mt protein c hi u có tính kháng nguyên gây ra m t áp ng mi n d ch , r i t o 45
45. mt trí nh mi n d ch c hi u, t o ra hi u qu kháng cho c ơ th v sau khi tác nhân gây b nh xâm nh p v i y c tính. Ng ưi ta còn h ưng t i tri n v ng dùng v c-xin iu tr m t s b nh còn nan y nh ư ung th ư, AIDS v.v. Tuy nhiên, nhi u b nh v n còn ang thách th c con ng ưi, ch ưa có v c-xin nào hi u qu ng ăn ng a. Trong ó ph i k nhi u b nh do ký sinh trùng (thí d st rét , giun , sán ), vi khu n ( lao ), virus ( cúm , st xu t huy t, AIDS v.v.). M t s lý do có th là các tác nhân gây b nh bi n i th ưng xuyên khi n cho mi n d ch không còn hu hi u ho c th m chí t n công ngay vào h mi n d ch nh ư tr ưng h p c a HIV v.v. (ã có lúc bnh lao ưc y lùi b ng nhi u bi n pháp ph i h p (thu c, v c-xin và các bi n pháp phòng ng a khác), nh ưng s xu t hi n c a AIDS ã làm cho d ch lao có d p bùng phát, nh t là t i các n ưc ang phát tri n.) Ln u tiên trong l ch s , con ng ưi ã thanh toán ưc m t c ăn b nh hi m nghèo. nh ch p n ăm 1977 , Ali Maow Maalin, ng ưi Somalia , ưc xem là bnh nhân cu i cùng m c b nh u mùa * Mt s lo i vacxin ang ưc s d ng Vi t Nam: Trong ch ươ ng trình tiêm ch ng m r ng n ưc ta có 6 loai v ăc-xin ưc trình bày bng b ng d ưi ây: L ch tiêm ch ng các vacxin trong ch ươ ng trình tiêm ch ng m r ng: Li u ưng Tu i tiêm Vacxin lưng tiêm ch ng ch ng 46
46. BCG Trong Sơ sinh (phòng lao) 0,1ml da (th ưng ho c b t k ỳ th i cánh gian nào sau ó tay trái) SABIN 2 U ng Sơ sinh và (phòng b i gi t lúc 2, 3, 4 tháng li t) tu i. Tr < 5 tu i hàng n ăm u ng 2 li u t ăng c ưng cách nhau 1 tháng. DPT Tiêm Lúc 2, 3, 4 (phòng b ch 0,5ml bp (th ưng tháng tu i. Tiêm hu, ho gà, ùi) 1 m ũi t ăng c ưng un ván). sau khi tiêm m ũi th ba 1 n ăm. Dưi Lúc 9 0,5ml da (th ưng tháng tu i Si cánh tay ho c s m trái) nh t sau ó. Ngoài 6 lo i vacxin trong ch ươ ng trình tiêm ch ng m r ng k trên, n ưc ta hi n nay còn có m t s lo i vacxin khác ang ưc s d ng nh ư : vacxin phòng b nh un ván, vacxin phòng b nh t , vacxin phòng b nh th ươ ng hàn, vacxin phòng b nh nhi m khu n do H. influenzae typ b, vacxin phòng b nh viêm màng não do c u khu n màng não nhóm A và C, vacxin phòng b nh d i, vacxin phòng b nh viêm gan virus B, vacxin phòng b nh viêm não Nh t B n. 1. Vacxin phòng b nh un ván : Là lo i vacxin gi i c t . Có 2 lo i: vacxin ch ch a gi i c t u n ván và vacxin ph i h p v i vacxin phòng b ch h u và ho gà (DPT). Gi i c t c a vi khu n un ván ưc h p ph v i phosphat nhôm. 47
47. Vacxin ưc tiêm b p m i m ũi 0,5ml. T o mi n d ch c ơ b n tiêm 2 m ũi cách nhau 1 tháng. Sau 6 n 12 tháng tiêm nh c l i. i v i ph n l a tu i sinh , ngoài 2 m ũi t o mi n d ch c ơ b n, tiêm m ũi th 3 cách m ũi th 2 ít nh t 6 tháng ho c khi có thai, tiêm m ũi th 4 cách m ũi th 3 ít nh t 12 tháng ho c khi có thai l n sau. i v i ph n có thai ch ưa tiêm vacxin u n ván l n nào thì t o mi n d ch c ơ bn b ng 2 m ũi cách nhau 1 tháng, m ũi t ăng c ưng tiêm tr ưc khi sinh ít nh t 1 tháng. 2. Vacxin phòng b nh t : Vacxin phòng b nh t ang dùng n ưc ta là vacxin b t ho t g m sinh typ c in, sinh typ Eltor và c bi n ch ng O139. Vacxin d ng huy n d ch ưa vào c ơ th theo ưng u ng. i t ưng s d ng: m i l a tu i các vùng có d ch t l ưu hành. 3. Vacxin phòng b nh th ươ ng hàn: Có 2 lo i vacxin phòng b nh th ươ ng hàn ang ưc s d ng: Vacxin polysaccharid c a Pháp có tên là Typhim Vi. Vacxin Typhim Vi dùng cho tr trên 2 tu i và ng ưi l n, tiêm d ưi da ho c tiêm b p. Vacxin s ng gi m c l c c a Hàn Qu c có tên là Zerotyph. Vacxin Zerotyph dùng cho tr trên 3 tháng tu i và ng ưi ln, theo ưng u ng. 4. Vacxin phòng nhi m khu n do H. influenzae: ây là lo i vacxin ch t kháng nguyên v c a H.influenzae typ b. Vacxin c a Pháp có tên Act-HiB là lo i vacxin liên kt, thành ph n g m polysaccharid v c a H. influenzae typ b g n v i gi i c t c a vi khu n u n ván. Vacxin này ưc dùng cho tr t 5 tu i tr xu ng theo ưng d ưi da ho c tiêm b p mi m ũi 0,5ml. Tr d ưi 6 tháng tu i tiêm 3 m ũi cách nhau 1 tháng. Tr 6 n 12 tháng tu i tiêm 2 m ũi cách nhau 1 tháng. Tr t 1 n 5 tu i ch tiêm 1 m ũi. 5. Vacxin phòng b nh viêm màng não do c u khu n màng não nhóm A và nhóm C Vacxin này ưc s n xu t t polysaccharid c a c u khu n màng não nhóm A và nhóm C. Vacxin ưc s d ng cho tr t 18 tháng tu i tr lên. Tiêm d ưi da ho c tiêm bp 1 m ũi 0,5ml duy nh t. 6. Vacxin phòng b nh d i: Có 2 lo i vacxin phòng d i: vacxin ch t và vacxin s ng gi m c l c. Vacxin hi n ang ưc s d ng n ưc ta thu c lo i vacxin s ng gi m c l c, vacxin Fuenzalida và vacxin Verorab. Vacxin d i ch tiêm cho ng ưi b ng v t nghi d i c n (xem m c “Cách x lý tr ưng h p b chó nghi d i c n” trong bài “Virus d i”). V i vacxin Fuenzalida, tiêm trong da 6 m ũi cách nh t, m i m ũi 0,1ml cho tr t i 15 tu i, m i m ũi 0,2ml cho ng ưi trên 15 tu i. V i vacxin Verorab, tiêm d ưi da ho c tiêm b p 5 m ũi, m i m ũi 0,5ml vào các ngày 0 (ngày b t u tiêm), 3, 7, 14, 30; tu ỳ ý tiêm nh c l i 1 m ũi 0,5ml vào ngày th 90. 48
48. 7. Vacxin phòng b nh viêm gan virus B Vacxin phòng b nh viêm gan virus B có 2 lo i: vacxin th h 1 ưc s n xu t t kháng nguyên b m t c a virus viêm gan B (HBsAg) có trong huy t t ươ ng ng ưi lành; vacxin th h 2 s n xu t t HBsAg ưc t o ra nh công ngh gen (ADN tái t h p) trên n m men. Vacxin phòng b nh viêm gan virus B ưc tiêm cho các i t ưng có nguy c ơ cao nhi m virus viêm gan B, t tr s ơ sinh n ng ưi tr ưng thành. i v i tr em, tiêm dưi da ho c tiêm b p 3 m ũi cách nhau 1 tháng, m i m ũi 0,5ml, tiêm nh c l i 0,5ml sau m t năm. i v i ng ưi l n, tiêm 3 m ũi m i m ũi 1ml: m ũi th hai cách m ũi th nh t 1 tháng, m ũi th 3 cách m ũi th hai 5 tháng; sau 5 n ăm tiêm nh c l i 1 m ũi 1ml. 8. Vacxin phòng viêm não Nh t B n: Vacxin phòng viêm não Nh t B n thu c lo i vacxin virus b t ho t. Vacxin này ưc tiêm d ưi da, m i m ũi 0,5ml cho tr d ưi 5 tu i, m i m ũi 1ml cho tr t 5 tu i tr lên. t o mi n d ch c ơ b n: tiêm 3 m ũi. Tiêm nh c l i m i n ăm 1 m ũi vùng có d ch. Tiêm nh c l i 4 n ăm 1 m ũi vùng không có d ch. * H ưng phát tri n các vacxin m i: Mt s vacxin m i phòng ch ng các nhi m trùng do vi khu n, virus và ký sinh trùng ã và ang ưc th nghi m nh ư vacxin phòng b nh h i, b nh l tr c khu n, các nhi m trùng do S. pneumoniae, virus Rota, ký sinh trùng s t rét Ng ưi ta cũng hy v ng trong th i gian không xa s có vacxin phòng giang mai, l u và HIV/AIDS. Các vacxin phòng nhi m khu n ưng tiêu hoá ang ưc phát tri n theo hưng nghiên c u s n xu t các vacxin ưa vào c ơ th theo ưng u ng kích thích áp ng mi n d ch t i ch . C ũng theo h ưng kích thích áp ng mi n d ch t i ch , các nhà khoa h c ang nghiên c u các vacxin phòng nhi m trùng ưng hô h p ưa vào cơ th b ng cách khí dung. S ti n b nhanh chóng trong khoa h c k thu t nói chung và trong công ngh sinh h c nói riêng ã t o ra kh n ăng s n xu t các vacxin m i ho c làm cho các vacxin ã có hoàn thi n h ơn. K thu t m i giúp cho s hi u bi t y h ơn vai trò c a các thành ph n kháng nguyên trong quá trình kích thích c ơ th áp ng mi n d ch và nó ã t o ra kh n ăng chi t tách tinh ch nh ng thành ph n h u hi u ưa vào vacxin, v a làm t ăng hi u l c v a làm gi m các ph n ng không mong mu n. Công ngh gen s cho ra i nh ng lo i vacxin nhi u ưu im v ưt xa các vacxin c ũ: r t tinh khi t, ít ph n ng ph , hi u l c t o mi n d ch cao, s n xu t nhanh và giá thành th p. 1.3. Nguyên lý s d ng vacxin S d ng vacxin là ư a vào c ơ th kháng nguyên có ngu n g c t vi sinh v t gây bnh ho c vi sinh v t có c u trúc kháng nguyên gi ng vi sinh v t gây b nh, ã ưc bào ch m b o an toàn c n thi t, làm cho c ơ th t t o ra tình tr ng mi n d ch ch ng l i tác nhân gây b nh. 49
49. Nói m t cách khác: s d ng vacxin là t o mi n d ch ch ng nhân t o. Tình tr ng mi n d ch mà c ơ th có ưc sau khi s d ng vacxin là k t qu c a s áp ng mi n d ch i v i các thành ph n kháng nguyên có trong vacxin. C ơ th luôn luôn áp ng b ng c mi n d ch d ch th (mi n d ch qua trung gian kháng th ) và mi n dch t bào (mi n d ch qua trung gian t bào), nh ưng tu ỳ t ng lo i vacxin, hi u l c b o v có th do mi n d ch d ch th , mi n d ch t bào ho c ph i h p c hai lo i. Ngoài mi n d ch c hi u, vacxin còn có kh n ăng t ăng c ưng c mi n d ch không c hi u nh ư làm t ăng quá trình th c bào nh kháng th óng vai trò là y u t opsonin c hiu, nh lymphokin ho t hoá i th c bào 1.4. C ơ ch ho t ng c a v c-xin H mi n d ch nh n di n v c-xin là v t l nên h y di t chúng và "ghi nh " chúng. V sau, khi tác nhân gây b nh th c th xâm nh p c ơ th , h mi n d ch ã t ư th s n sàng t n công tác nhân gây b nh nhanh chóng h ơn và h u hi u h ơn (b ng cách huy ng nhi u thành ph n c a h mi n d ch, c bi t là ánh th c các t bào lympho nh ). ây chính là các ưu im c a áp ng mi n d ch c hi u. 1.5. c tính c ơ b n c a m t vacxin 1.5.1. An toàn Mt vacxin lý t ưng khi s d ng s không gây b nh, không gây c và không gây ph n ng. Sau khi s n xu t vacxin ph i ưc c ơ quan ki m nh nhà n ưc ki m tra ch t ch v m t vô trùng, thu n khi t và không c. - Vô trùng : Vacxin không ưc nhi m các vi sinh v t khác, nh t là các vi sinh v t gây bnh. - Thu n khi t: Ngoài kháng nguyên ư a vào kích thích c ơ th áp ng mi n d ch ch ng vi sinh v t gây b nh, không ưc l n các thành ph n kháng nguyên khác có th gây ra các ph n ng ph b t l i - Không c: Li u s d ng ph i th p h ơn r t nhi u so v i li u gây c. Tuy nhiên, không có vacxin nào t ưc an toàn tuy t i. V nguyên t c, vacxin ph i m bo an toàn. Song trên th c t không th t ưc m c an toàn tuy t i. T t c các vacxin u có th gây ra ph n ng ph m t s ng ưi. Ph n ng t i ch : Nh ng ph n ng nh th ưng g p sau tiêm ch ng là n ơi tiêm có th h ơi au, mn , h ơi s ưng ho c n i c c nh . Nh ng ph n ng này s m t i nhanh chóng sau mt vài ngày, không c n ph i can thi p gì. N u tiêm ch ng không m b o vô trùng, thì n ơi tiêm ch ng có th b viêm nhi m, làm m . Ph n ng toàn thân: Trong các ph n ng toàn thân, s t hay g p h ơn c , kho ng t 10 n 20 %. S t th ưng h t nhanh sau m t vài ngày. Co gi t có th g p nh ưng v i t l r t th p, kho ng 1 ph n v n, h u h t kh i không l i di ch ng gì. M t s vacxin có th gây ra ph n ng nguy hi m h ơn, trong ó có s c ph n v , tuy nhiên r t hi m g p. 50
50. Khi bàn v nh ng ph n ng do vacxin, r t c n ph i nh n m nh r ng m c nguy hi m do vacxin nh h ơn r t nhi u so v i m c nguy hi m do b nh nhi m trùng tươ ng ng gây ra. Thí d , t l bi n ch ng nguy hi m do b nh ho gà g p hàng tr ăm n hàng nghìn l n ph n ng nguy hi m do vacxin b ch h u - ho gà - u n ván gây ra. Khi cân nh c quy t nh xem m t vacxin nào ó có ưc ưa vào s d ng hay không, c n ph i so sánh gi a m c ph n ng do vacxin và tính nguy hi m c a bnh nhi m trùng t ươ ng ng. 1.5.2. Hi u l c: Vacxin có hi u l c l n là vacxin gây ưc mi n d ch m c cao và t n t i trong m t th i gian dài. Hi u l c gây mi n d ch c a vacxin tr ưc h t ưc ánh giá trên ng v t thí nghi m, sau ó trên th c a. Trên ng v t thí nghi m: Cách th nh t, ánh giá m c áp ng mi n d ch thông qua vi c xác nh hi u giá kháng th ho c xác nh m c d ươ ng tính c a ph n ng da. Cách ánh giá này ch ưa cho bi t hi u l c b o v , m i ch cho bi t m c áp ng mi n d ch c a c ơ th ng v t i v i lo i vacxin th nghi m. Cách th hai, xác nh t l ng v t ã ưc tiêm ch ng s ng sót sau khi th thách b ng vi sinh v t gây b nh. Trên th c a: Dù ã ưc c ơ quan ki m nh nhà n ưc ki m tra và ã ưc ánh giá trên ng v t, tr ưc khi ưa ra tiêm ch ng r ng rãi, vacxin u ph i ưc th nghi m trên th c a (field test): Vacxin ưc tiêm ch ng cho m t c ng ng, theo dõi th ng kê t t c các ph n ng ph và ánh giá kh n ăng b o v khi mùa d ch t i. Ngoài 2 tiêu chu n trên, ch n m t vacxin tiêm ch ng, ng ưi ta còn quan tâm n giá thành và tính thu n l i trong vi c ti n hành tiêm ch ng. 1.5.3. Tính kháng nguyên : Ng ưi ta g i kh n ăng kích thích c ơ th t o thành kháng th là tính kháng nguyên. Tính kháng nguyên có th m nh hay y u. Kháng nguyên m nh là kháng nguyên khi ư a vào c ơ th m t l n ã sinh ra nhi u kháng th , còn kháng nguyên y u là nh ng ch t ph i ưa vào nhi u ho c ph i kèm theo m t tá dưc m i sinh ưc m t ít kháng th 1.5.4. Tính mi n d ch: Vacxin gây mi n d ch b ng m t vi khu n ho c virus gi m c l c, ho c v i m t protein c hi u có tính kháng nguyên gây ra m t áp ng mi n d ch , r i t o m t trí nh mi n d ch c hi u, t o ra hi u qu kháng cho c ơ th v sau khi tác nhân gây bnh xâm nh p v i y c tính . 1.6. Phân lo i v c-xin Vc-xin có th là các virus ho c vi khu n s ng, gi m c l c, khi ưa vào c ơ th không gây b nh ho c gây b nh r t nh . V c-xin c ũng có th là các vi sinh v t b b t ho t, ch t ho c ch là nh ng s n ph m tinh ch t vi sinh v t. 1.6.1. V c xin th h th 1: 51
51. • Vc-xin b t ho t ( v c-xin vi khu n ch t) là các vi sinh v t gây b nh b gi t bng hóa ch t ho c b ng nhi t. Thí d : các v c-xin ch ng cúm , t, dch h ch và viêm gan siêu vi A . Ưu im: An toàn h ơn vì các vi sinh v t không còn kh n ăng ph c h i dng c Nh ưc im: - Tính mi n d ch kém h ơn, h u h t các v c-xin lo i này ch gây áp ng mi n d ch không hoàn toàn và ng n h n, c n ph i tiêm nh c nhi u l n. - t h ơn • Vc-xin vi khu n, virus s ng, gi m c l c là v c-xin ch a toàn b t bào vi khu n ho c vi rus ưc nuôi c y d ưi nh ng iu ki n c bi t nh m làm gi m ho t l c, gi m c tính c h i c a chúng. Ưu im: Có kh n ăng t o áp ng mi n d ch cao do chúng nhân lên theo chu k ỳ th i gian trong c ơ th . V c-xin in hình lo i này th ưng gây ưc áp ng mi n d ch dài h n và là lo i v c-xin ưc ưa chu ng dành cho ng ưi l n kh e m nh. Các v c-xin ng a b nh st vàng , si, bnh ban ào và quai b u thu c lo i này. Vc-xin s ng ng a bnh lao không ph i là dòng vi khu n lao gây b nh, mà là m t dòng lân c n ưc g i là BCG . Nh ưc im: Các v c-xin lo i này có th gây nguy hi m vì chúng có th không n nh và có th tr l i d ng c gây b nh. Ví d , V c-xin b i li t có th gây ch ng bi li t cho tr ưc tiêm ch ng v i t l 3/10 6 (t i M , theo Girard,1985). Tiêm ch ng v c-xin u mùa có th gây viêm não t l 5/10 6 (t i M , theo Girard,1985). • Vc-xin có ngu n g c t c t anatoxin : Ngoài v c xin ch a toàn b t bào vi sinh v t, m t s thành ph n ti t ra c a chúng c ũng có kh n ăng kích thích mi n d ch ã ưc bi t nh ư các c t (toxoid). V c-xin lo i này ch a các c t ã làm b t ho t ( g i là gi i c t hay anatoxin). Các c t ưc ch t o thành sau khi ã ưc v i formalin cho n khi m t c tính. Ví d nh ư vc-xin gi i c t u n ván hay b ch h u. Ph i h p vacxin: Mc ích chính c a vi c ph i h p vacxin là làm gi m b t s m ũi tiêm ch ng ho c làm gi m b t s l n t ch c tiêm ch ng. Có hai lo i ph i h p vacxin: - Tiêm ch ng vacxin ph i h p (tr n các vacxin v i nhau, tiêm ch ng cùng m t l n, cùng m t ưng). - Tiêm ch ng nhi u vacxin riêng bi t trong cùng m t th i gian, có th các v trí khác nhau ho c theo nh ng ưng khác nhau. Ph i h p vacxin ph i m b o gi ưc hi u l c t o mi n d ch và không gây ra tác h i gì. Hi u l c t o mi n d ch i v i m i thành ph n vacxin ít nh t ph i bng 52
52. khi chúng ưc tiêm ch ng riêng r . M t s tr ưng h p khi ph i h p vacxin s t o ra ưc áp ng mi n d ch m nh h ơn. Ng ưc l i có nh ng tr ưng h p ph i h p không h p lý làm gi m hi u l c t o mi n d ch. S ph i h p vacxin h p lý s không làm t ăng t l ph n ng ph . Ngh ĩa là an toàn v n ưc m b o nh ư khi chúng ưc tiêm ch ng riêng r nh ng th i gian khác nhau. 1.6.2. V c xin th h th 2: Vc-xin th h th 2 và th h th ba u là v ăc-xin tái t h p s thay th hoàn toàn v c-xin c in còn ưc g i là subunit v c-xin. ó là lo i v c-xin ch s d ng nh ng antigen c a vi sinh v t (subunit) thích h p nh t kích thích t o áp ng mi n d ch m nh nh t. V i công ngh gen hi n i, các antigen này ưc tng h p b ng cách c t on gen t ng h p nên protein c tr ưng cho vi sinh v t gây b nh, ghép gen này vào b gen c a vi khu n, c a n m men khác hay t bào nuôi c y t o ra protein c hi u cho m m b nh, dùng protein này tiêm ch ng to mi n d ch c hi u. Ưu im c a v c-xin lo i này là: - Kháng nguyên s dùng kích thích mi n d ch ưc phan l p t ph n lành tính, không gây b nh c a vi sinh v t gây b nh, và ưc t ng h p b ng các t bào vi sinh v t hay ng v t ã ưc l p ráp gen, m b o ưc tính an toàn trong s n xu t - Dng v ăc-xin này an toàn vì ít ch t l h ơn và không ch ưa toàn b gen c a vi sinh v t nguyên th y và khhong tái s n xu t trong c ơ th nh n, ít tác d ng ph , kh n ăng mi n d ch cao. - Gi m giá thành s n xu t, vì thay th ưc các công on t ti n bao g m môi tr ưng nuôi c y mô ng v t ho c phôi b ng các môi tr ưng nuôi c y vi sinh vt thông th ưng, t ươ ng i ơn gi n. Ngoài ra không ph i trang b t n kém cho v n m b o tính an toàn cao (ví d v c-xin thông d ng ch ng b nh l mm long móng th ưng có giá thành cao do s n xu t òi h i nhà x ưng ph i an toàn). Giá thành b o qu n và v n chuy n th p nh gi m ưc các yêu c u v làm l nh và ông khô. - Tránh ưc vi c ph i th nghi m tính an toàn trên qui mô l n, vì v c-xin không ch a tác nhân gây b nh Mt in hình c a v c-xin d ng này là v c-xin phòng viêm gan virus B th h II. ó là v c-xin t o b ng cách lây nhi m vius viêm gan B vào t bào ch cho virus s n xu t kháng nguyên. Sau ó tách chi t và gây b t ho t virus t o v c- xin. H n ch là k thu t chi t tách kháng nguyên ph c t p và t n kém. ( ADN tái t h p là ADN lai tìm ưc in-vitro (trong ng nghi m) b ng cách t h p hai ngu n ADN thu c hai loài khác nhau.) 1.6.3. V c xin th h th 3: Là v ăc-xin tái t h p trong ó các antigen c hi u ưc t ng h p t ADN ca vi sinh v t ưc ph i h p v i các tá d ưc làm gia t ăng tính mi n d ch. 53
53. Mi nLà v ăc-xin tái t h p trong ó các antigen c hi u ưc t ng h p t ADN c a vi sinh v t ưc ph i h p v i các tá d ưc làm gia t ăng tính mi n d ch. Mi n dich gia t ăng: là cách làm t ăng m c kháng th vì làm kích thích t bào nh ( stimulating the memory celles). M t s h p ch t có kh n ăng làm gia t ăng hi u qu c a v c-xin vius ho c v c-xin toxoid do làm gia t ăng s kìm ch kháng nguyên trong h th ng b ch huy t. Các ch t này ưc g i là các ch t h tr (Adjuvant). Các ch t h tr : i v i v c-xin toxoid dùng adjuvant g m có aluminum sunfate và aluminum hydroxid, còn i v i v c-xin vius dùng d u vô c ơ và d u ph ng. Cơ ch tác d ng: m t ph n các ch t adjuvant s liên k t v i kháng nguyên và s làm kháng nguyên d b ánh b t b i macrophage, ng th i có th làm cho các lymphocytes nh n di n các kháng nguyên ã liên k t m t cách hi u qu h ơn các kháng nguyên d ng hoà tan Có 3 v n k thu t quan tr ng c n ưc gi i quy t: - Cn ph i nh n bi t ưc antigen c hi u cao có tác d ng kích thích s mi n dch. - Vi c nuôi t bào s ng ph i tái t o l i ưc c u trúc các antigen c n s n xu t. - Kích th ưc c a antigen sau ó ph i ưc t ăng lên thúc y s th c bào và áp ng mi n d ch. Ph ươ ng pháp này dùng t ng h p v c-xin ng a vius viêm gan là m t subunit ch t kháng nguyên b m t (HbsAg), t ng h p trong t bào n m men hay ng v t nuôi c y ã l p ráp gen (Tiollais,1984, Giard, 1985); Ch ph m ã ưc tinh ch , lo i b các protein và các on ADN c a chính t bào ch . V c-xin này có ưu im là không ch t o t máu ng ưi ã nhi m vius nh ư tr ưc ây nên tránh ưc ti p xúc v i máu nhi m HIV.( Vius viêm gan B có v ngoài lypoprotein. Kháng nguyên b m t là protein chính c a v ngoài, ưc phát hi n trong máu ng ưi b nhi m: Vào n ăm 1963, ng ưi ta ã phát hi n trong huy t thanh b nh nhân ưa ch y máu m t kháng th tác dng ưc v i kháng nguyên (virus), n n ăm 1968, nó ưc xác nh là kháng nguyên b m t c a huy t thanh b nh nhânviêm gan B (g i là HbsAg) Mt v c-xin khác là v c-xin s i th hê m i ưc iu ch trung tâm nghiên cu vi sinh h c ng d ng (Porton Down n ưc Anh) v i s h p tác c a tr ưng i h c N Hoàng (Belfast) có ch a hai thành ph n kháng nguyên, m t ng ưng k t t h ng c u và m t protein liên k t, c hai ưc t ng h p b ng k thu t tái t h p ADN. ó còn gi là v c- xin a tr . M t v c-xin khác là v ăc-xin d ch t ưc s n xu t t nh ng genes t o toxin c a vi khu n d ch t ã ưc tri n khai s n xu t t n ăm 1993. 1.6.4. D ng kháng – kháng th v c-xin (Anti-idiotypic vaccines): Mt h ưng m i trong iu ch là dùng các kháng –kháng th làm v c-xin. Kháng – kháng th óng vai trò nhái l i c u trúc c a kháng th ã ưc antigen t vi sinh v t t o thành nh ưng chúng an toàn h ơn. Nguyên t c s n xu t v c-xin này nh ư sau: 54
54. - u tiên s n xu t kháng th ch ng l i kháng nguyên Ab1. Kháng th lo i này gi là diotypic. - Sau ó diotipic ưc tiêm vào thú t o kháng kháng th Ab2 ( g i là anti diotypic Ab2). Trong c u trúc c a kháng- kháng th có ph n trùng v i kháng nguyên. Ab2 bây gi có vai trò nh ư m t antigen xác nh nh ưng ơ n gi n h ơn so v i antigen nguyên th y ban u và ưc dùng làm vacxin. - Cơ th nh n ưc v c-xin ch a Ab2 s áp ng t o kháng th Ab3. - Nu sau ó h mi n d ch ti p xúc v i antigen nguyên thu , Ab3 s ph n ng vi antigen, phá hu ho c làm m t ho t tính c a chúng. Ưu im: - Không ph i tiêm vi sinh v t s ng ho c ch t vào c ơ th . - Vc-xin này chuyên bi t cao vì ch ng l i tr c ti p phàn antigen c tr ưng m t cách chuyên bi t nh t. - Có m t vài kháng nguyên không th kích thích h th ng mi n d ch c a tr s ơ sinh n ưng v ăc-xin lo i này ch a protein có th cho m t áp ng mi n d ch tr em m t cách nhanh chóng - Văc-xin này có th nh n bi t v trí nh n trên t bào. Vì v y có th dùng khoá s t n công c a virus trên t bào. ay c ũng là m t h ưng s n xu t vc-xin kháng HIV. Mt v n quan tr ng trong s n xu t kháng – kháng th v ăc-xin là ngu n idiotipic antibody. Trong ó ngu n kháng th ơn dòng t t bào ng ưi s t t h ơn t t bào chu t. 1.6.5. HUY T THANH MI N DICH Nguyên lý s d ng huy t thanh: S d ng huy t thanh là ư a vào c ơ th kháng th có ngu n g c t ng ưi ho c ng v t, giúp cho c ơ th có ngay kháng th c hi u ch ng l i tác nhân gây b nh. Nói m t cách khác: s d ng huy t thanh là t o mi n d ch th ng nhân t o. Ngu n kháng th : * Bào ch t huy t thanh ng v t: Tr ưc h t ph i gây mi n d ch cho ng v t. u tiên ng v t th ưng ưc tiêm vacxin, sau ó chúng có th ưc tiêm chính vi sinh v t gây b nh kích thích s n xu t kháng th m nh m hơn. Khi hi u giá kháng th trong huy t thanh t m c cao nh t, thì l y máu l y huy t thanh em bào ch . ng v t th ưng ưc dùng trong sn xu t huy t thanh là ng a. Ngày nay, vi c s d ng huy t thanh ng v t gi m i nhi u vì t l gây ra ph n ng cao h ơn h n so v i kháng th ưc s n xu t t huy t thanh ng ưi. * Bào ch t huy t thanh ng ưi: Globulin mi n d ch bình th ưng : Globulin mi n d ch bình th ưng ưc bào ch t huy t thanh ng ưi kho m nh ho c t máu rau thai. Tr ưc ây 55
55. globulin mi n d ch lo i này còn ưc g i là gamaglobulin. Ngày nay m t s n ưc còn có tên là globulin huy t thanh mi n d ch (Immune Serum Globulin). Lo i globulin mi n d ch này m i l n (m ) ưc bào ch t hàng nghìn m u huy t thanh, do ó không có s khác nhau áng k v hi u giá kháng th gi a các l n s n xu t. Kháng th trong globulin mi n d ch bình th ưng ch y u thu c l p IgG. Globulin mi n d ch c hi u: Globulin mi n d ch c hi u ưc bào ch t máu c a nh ng ngưi m c b nh nhi m trùng nào ó ã kh i b nh và h i ph c s c kho , ho c t máu c a nh ng ng ưi kho m nh m i ưc tiêm ch ng t ăng cưng. Trong globulin mi n d ch c hi u, n ng kháng th ch ng l i vi sinh v t, là căn nguyên c a b nh nhi m trùng mà ng ưi cho ã m c ho c ã ưc tiêm ch ng, th ưng cao g p hàng ch c l n trong globulin mi n d ch bình th ưng. Nguyên t c s d ng: Các nguyên t c c ơ b n ph i th c hi n khi s d ng huy t thanh là: • úng i t ưng • úng li u l ưng • úng ưng • phòng phn ng • Ph i h p s d ng vacxin i t ưng: Huy t thanh ưc s d ng nhi u nh t ch a và d phòng các b nh nhi m trùng. Ngoài ra nó còn ưc s d ng cho m t s m c ích khác nh ư iu tr cho nh ng bnh nhân b thi u h t mi n d ch, d ng và d phòng bnh tan máu s ơ sinh. Trong ch a và d phòng b nh nhi m trùng, huy t thanh ch có hi u l c v i nh ng b nh mà c ơ ch b o v ch y u nh mi n d ch d ch th . Kinh in nh t là huy t thanh ch ng u n ván (SAT) và huy t thanh ch ng b ch h u (SAD). Huy t thanh chng ho gà, ch ng s i ưc tiêm cho tr ch ưa ưc tiêm ch ng khi có ti p xúc v i b nh nhân. Huy t thanh ch ng d i ưc tiêm cho nh ng ng ưi b chó d i ho c chó nghi d i cn v i v t th ươ ng n ng ho c g n u. Ngoài ra còn có các huy t thanh ch ng virus viêm gan, virus quai b , rubeon. Globulin mi n d ch còn ưc tiêm cho nh ng b nh nhân viêm ưng hô h p tái phát nhi u l n. Huy t thanh ng ưi bình th ưng ưc tiêm cho tr b thi u h t mi n d ch b m sinh. M t s công trình nghiên c u cho th y r ng globulin mi n d ch có tác d ng iu tr d ng. Vi c s d ng globulin mi n d ch kháng D (Anti-D immune globulin) cho ng ưi m có nhóm máu Rh(-) m i sinh con Rh(+) có tác d ng ng ăn c n s hình thành kháng th kháng Rh và do ó tránh ưc nguy c ơ tan máu s ơ sinh cho a tr sinh l n sau. C ơ ch c a hi n t ưng này là globulin mi n d ch kháng D s phá hu các h ng c u Rh(+) ca a tr xâm nh p vào dòng tu n hoàn c a ng ưi m khi sinh. Do c ơ ch này, vi c tiêm globulin kháng D ch có hi u qu trong kho ng th i gian 72 gi u sau khi sinh. Li u l ưng: 56
56. Li u l ưng huy t thanh s d ng tu ỳ thu c vào tu i và cân n ng c a b nh nhân, trung bình t 0,1 n 1 ml cho 1kg cân n ng, tu ỳ theo lo i huy t thanh và m c ích s dng. Huy t thanh ch ng u n ván ưc tính theo ơn v , trung bình là 250 ơ n v cho mt tr ưng h p. N u v t th ươ ng quá b n ho c tiêm ch m sau 24 gi thì li u l ưng ph i t ăng g p ôi. 3.3. ưng ưa huy t thanh vào c ơ th : Huy t thanh th ưng ưc ưa vào c ơ th b ng ưng tiêm b p. i v i nh ng lo i huy t thanh ã ưc tinh ch t tiêu chu n cao, có th tiêm t ĩnh m ch nh ưng c ũng r t nên h n ch . Tuy t i không tiêm t ĩnh m ch nh ng huy t thanh có ngu n g c t ng vt (dù ã ưc tinh ch !) ho c huy t thanh ng ưi ch ưa t tinh ch cao. phòng ph n ng: Cn ph i th c hi n t t các vi c sau ây ng ăn ng a ph n ng do huy t thanh gây ra: - H i xem b nh nhân ã ưc tiêm huy t thanh l n nào ch ưa. R t th n tr ng khi ph i ch nh tiêm huy t thanh l n th hai vì t l ph n ng cao h ơn nhi u so v i l n th nh t. Vi c quy t nh có tiêm huy t thanh l n th hai hay không tu ỳ thu c vào s cân nh c gi a nguy c ơ m c b nh, tính nguy hi m c a b nh và t l ph n ng c a lo i huy t thanh ưc s d ng. - Làm ph n ng thoát m n (ph n ng Besredka ) tr ưc khi tiêm: Pha loãng huy t thanh 10 l n b ng dung d ch NaCl 0,85%. Tiêm 0,1 ml vào trong da. Sau 30 phút n u n ơi tiêm không m n thì có th tiêm huy t thanh. N u n ơi tiêm m n , nói chung không nên tiêm, tr khi tình tr ng nhi m trùng nhi m c c a b nh nhân òi h i b t bu c ph i tiêm. Trong tr ưng h p ó c n chia nh t ng li u tiêm d n, cách nhau 20 n 30 phút. - Trong quá trình tiêm truy n huy t thanh ph i theo dõi liên t c có th x trí k p th i n u có ph n ng x y ra, c bi t là ph i y các iu ki n x trí s c ph n v. Tiêm vacxin ph i h p: Kháng th do tiêm huy t thanh s phát huy hi u l c ngay sau khi tiêm, nh ưng ch t n t i m t th i gian ng n. Hi u giá kháng th này gi m nhanh trong m y ngày u, sau ó gi m ch m h ơn và s b lo i tr h t sau kho ng 10 n 15 ngày. Hai lý do ca s gi m nhanh chóng này là: kháng th ưc ưa vào c ơ th s ph n ng v i các kháng nguyên vi sinh v t và b c ơ th chuy n hoá gi ng nh ư s ph n c a các protein ngo i lai khác. Vi c tiêm vacxin ph i h p nh m kích thích c ơ th t o ra mi n d ch ch ng thay th cho mi n d ch th ng do tiêm huy t thanh h t hi u l c. 1.7. Kháng th ơn dòng: Mi quy t nh kháng nguyên s kích thích t o thành môt kháng th c hi u. Khi m t kháng nguyên có nhi u quy t nh kháng nguyên ( a giá) s cho m t ph c hp kháng th . Mu n nh n ưc m t kháng th trong ph c h p y thì ph i ti n hành tách tinh khi t. Tuy nhiên ngày nay ng ưi ta có th nh n ưc kháng th tinh khi t 57