Dòng hóa và biểu hiện enzyme carbapenemase KPC-2 tái tổ hợp trong tế bào chất của E. coli

Nội dung text: Dòng hóa và biểu hiện enzyme carbapenemase KPC-2 tái tổ hợp trong tế bào chất của E. coli

1. TAÏP CHÍ PHAÙT TRIEÅN KH&CN, TAÄP 19, SOÁ T2- 2016 Dòng hóa và biểu hiện enzyme carbapenemase KPC-2 tái tổ hợp trong tế bào chất của E. coli Trần Nhật Phương Huỳnh Thị Kim Phương Phan Thị Phượng Trang Trần Linh Thước Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM Phạm Hùng Vân Công ty Nam Khoa, Đại Học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh (Bài nhận ngày 12 tháng 08 năm 2015, nhận đăng ngày 14 tháng 04 năm 2016) TÓM TẮT Cơ chế đề kháng kháng sinh carbapenem E. coli BL21 và hoạt tính của enzyme được kiểm thuộc nhóm β-lactam phổ biến nhất ở Klebsiella tra thông qua theo dõi khả năng sinh trưởng pneumoniae là tiết ra enzyme KPC (Klebsiella trong môi trường nuôi cấy có bổ sung kháng sinh pneumoniae Carbapenemase). Các chủng tiết ertapenem 4 µg/mL. Khả năng cảm ứng biểu hiện enzyme này thường biểu hiện ở nhiều mức độ enzyme KPC-2 dạng nội bào cũng được kiểm tra khác nhau và cần phải có sự phối hợp với các bằng kỹ thuật điện di SDS-PAGE. Protein tái tổ yếu tố khác như mất porin hay cùng biểu hiện với hợp được gấp cuộn và tan một nửa so với tổng số các enzyme đề kháng kháng sinh phổ rộng protein tái tổ hợp tạo ra ở nhiệt độ 23 oC. Protein (ESBL) thì mới có khả năng biểu hiện mức độ đề tái tổ hợp được thu nhận thành công từ phân kháng cao. Để tìm hiểu rõ hơn sự biểu hiện của đoạn tan bằng sắc ký ái lực với cột Histrap-HP. enzyme này trong cơ chế đề kháng carbapenem Phân đoạn protein sau khi tinh sạch được xác và để phục vụ nghiên cứu ứng dụng trong việc định khối lượng phân tử bằng phân tích LC-MS phát hiện nhanh vi sinh vật đề kháng ESBL, gene cho thấy KPC-2 thu nhận được có trọng lượng mã hóa enzyme KPC-2 từ hai chủng K. phân tử 28,8 kDa, đúng với dự đoán và có độ tinh pneumoniae phân lập từ mẫu bệnh phẩm được sạch cao. Nghiên cứu này là tiền đề cho các tạo dòng vào plasmid pET28a. Các plasmid tái tổ nghiên cứu cơ bản và ứng dụng tiếp theo của hợp mang gene kpc-2 được biến nạp vào tế bào KPC-2. Từ khóa: KPC-2, carbapenem, tạo dòng, tái tổ hợp, pET28a, pHT2008 MỞ ĐẦU Carbapenem là kháng sinh có phổ kháng nên bởi các vi khuẩn gram âm đề kháng đa kháng khuẩn rộng nhất và có hoạt tính ổn định đối với sinh [7]. Ngay khi được sử dụng rộng rãi trong các vi khuẩn tiết enzyme AmpC β-lactamase và điều trị, nhiều trường hợp đề kháng kháng các enzyme đề kháng kháng sinh phổ rộng ESBL. sinh này đã được công bố chủ yếu qua trung Do vậy, kháng sinh này được xem là nguồn dự gian plasmid mang gene mã hóa cho enzyme phòng trong điều trị các bệnh nhiễm khuẩn gây thủy phân carbapenem là carbapenemase. Trang 27
2. Science & Technology Development, Vol 19, No.T2-2016 Carbapenemase chủ yếu được phát hiện trong pneumoniae thực hiện trên imipenem và những năm gần đây ở K. pneumoniae gọi là K. meropenem nhưng không đặc hiệu cho pneumoniae Carbapenemase (KPC) [3]. ertapenem, đặc biệt là khi có thêm cơ chế tiết KPC được phát hiện lần đầu tiên tại Hoa Kỳ enzyme AmpC -lactamase. Phương pháp đo vào năm 2001 trên K. pneumoniae phân lập từ quang phổ cũng là một phương pháp hay được sử mẫu bệnh phẩm [4] và đã lan truyền đến rất nhiều dụng để phát hiện hoạt tính carbapenemase quốc gia khác trên toàn thế giới. Mặc dù được nhưng cần kỹ thuật viên có kỹ năng, thời gian lâu phát hiện chủ yếu ở K. pneumoniae, enzyme này và không phân biệt được là KPC hay loại khác. cũng đã được phát hiện ở Salmonella enterica, K. Tương tự, các phương pháp sinh học phân tử oxytoca, Enterobacter cloacae, E. coli và được cho là phương pháp tối ưu để phát hiện các Pseudomonas aeruginosa, chứng tỏ gene đề gene mã hóa cho các carbapenemase nhưng cần kháng kháng sinh nói chung và gene kpc nói có thiết bị hiện đại và nhân viên phải được đào riêng có khả năng lan truyền và phát tán rất tạo. Vì vậy, cần một phương pháp để xác định và nhanh giữa các chủng cùng hay khác loài. Ngoài phát hiện nhanh và đơn giản carbapenemase ra sự biểu hiện tính kháng của KPC đối với KPC. Việc phát hiện nhanh các vi khuẩn mang kháng sinh carbapenem còn phụ thuộc vào sự tác gene kpc đề kháng carbapenem là một vấn đề cần động cộng gộp của các enzyme có hoạt tính thiết trong việc đưa đúng phát đồ điều trị, giảm kháng các loại kháng sinh khác nhau. Do vậy, có chi phí cho bệnh nhân, giảm tỷ lệ tử vong. Bên trường hợp giá trị nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) cạnh đó, việc xác định nhanh cũng giúp nhanh của nhiều chủng K. pneumoniae mang gene mã chóng cách ly bệnh nhân nhiễm các tác nhân này hóa cho enzyme KPC thấp hơn giá trị biện luận nhằm tránh việc lây lan ra môi trường bệnh viện được khuyến cáo bởi CLSI dẫn đến việc trả kết và cộng đồng. Nghiên cứu này nhằm tìm hiểu quả sai [6]. khả năng biểu hiện gene mã hóa cho enzyme KPC hiện diện ở K. pneumoniae trên các mẫu Tại Việt Nam, gene mã hóa cho bệnh phẩm phân lập được tại các bệnh viện ở carbapenemase được phát hiện lần đầu tiên vào Việt Nam. Kết quả nghiên cứu là tiền đề cho các năm 2010 và đã có sự gia tăng đáng kể, chủ yếu bước nghiên cứu tiếp theo trong việc phát triển vẫn là KPC-2 và NDM-1 [5, 8]. Đến nay, chưa có phương pháp phát hiện nhanh các chủng vi khuẩn nghiên cứu nào trên diện rộng và chi tiết về sự đề sinh enzyme đề kháng kháng sinh carbapenem kháng carbapenem do tiết enzyme KPC, cũng bằng ELISA và western blot nhằm rút ngắn thời như chưa có thông tin về hoạt tính và mức độ gian xét nghiệm để có thể đưa ra phát đồ điều trị biểu hiện của enzyme này trong hiện tượng đề chính xác nhất đối với các chủng mang gene kpc kháng carbapenem. Hiện nay, có nhiều phương đề kháng carbapenem. pháp xác định hoạt tính carbapenemase KPC trong chẩn đoán như phương pháp Hodge cải VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP biên phát hiện enzyme carbapenemase ở các Vật liệu chủng sản xuất enzyme này, nhưng phương pháp Hai chủng K. pneumoniae KLP02 và KLP03 này cần thời gian đủ để các chủng mọc và biểu đề kháng carbapenem mang gene mã hóa cho hiện, cần sử dụng chủng chuẩn theo khuyến cáo, carbapenemase KPC-2 phân lập từ mẫu bệnh đồng thời độ nhạy và độ đặc hiệu cũng phụ thuộc phẩm được sử dụng trong nghiên cứu này. Các vào kỹ năng kỹ thuật viên xét nghiệm. Phương chủng chuẩn chứng âm K. pneumoniae ATCC pháp phát hiện với chất ức chế là boronic acid BAA 1706, chứng dương K. pneumoniae ATCC được cho là chuyên biệt cho enzyme KPC ở K. BAA 1705 được sử dụng để làm đối chứng và Trang 28
3. TAÏP CHÍ PHAÙT TRIEÅN KH&CN, TAÄP 19, SOÁ T2- 2016 kiểm tra chất lượng kết quả thí nghiệm. Chủng vi Biotech) và các enzyme cắt hạn chế NcoI, EcoRI, khuẩn khả nạp E. coli OmniMax (Invitrogen) SmaI (Fermentas) được sử dụng trong khuếch đại được sử dụng để tạo dòng và chủng vi khuẩn E. và tạo dòng các gene mục tiêu vào plasmid coli BL21 (Invitrogen) được sử dụng để biểu hiện pET28a (+). gene kpc-02. Các bộ kít thông dụng trong nghiên cứu sinh Các đĩa kháng sinh có nồng độ: imipenem 10 học phân tử được cung cấp bởi nhà cung cấp µg/mL, meropenem 10 µg/mL, ertapenem 10 Qiagen, HT Biotech và NK Biotek. µg/mL, colistin 10 µg/mL, doxicycline 30 Plasmid pET28a (+) (Novagen) được sử µg/mL, rifampin 5 µg/mL, ciprofloxacin 5 dụng để tạo dòng các gene mã hóa cho enzyme µg/mL, ampicillin 10 µg/mL, amoxicillin/ KPC-2. clavulanic acid 20/10 µg/mL, ceftriaxon 30 Trình tự DNA bộ gene của K. pneumoniae µg/mL, cefotaxime 30 µg/mL, ceftazidime 30 subsp. pneumoniae strain 354 plasmid KPC-2 µg/mL, amikacin 30 µg/mL và cefoxitin 30 gene, complete cds; GenBank: KJ151293.1 được µg/mL được sử dụng trong thử nghiệm độ nhạy dùng để thiết kế mồi dùng trong nghiên cứu. kháng sinh của các chủng. Danh sách các mồi sử dụng được trình bày trong Các enzyme Pfu DNA polymerase, T4 DNA Bảng 1. ligase (Fermentas), Tag DNA polymerase (HT Bảng 1. Danh sách các mồi được thiết kế sử dụng trong nghiên cứu STT Tên mồi Trình tự mồi từ 5’ đến 3’ Mô tả Nhân bản gene kpc-2 1 ON1709 AGGAGATATACCATGGAACCATTCGCTAAACTCGAACAG và PCR khuẩn lạc GACGGAGCTCGAATTCTTAGTGATGATGATGATGATGCTGCCCGTTGA 2 ON1714 Nhân bản gene kpc-2 CGCCCAATC 3 ON1461 GGTGATGTCGGCGATATAGGC Giải trình tự PCR khuẩn lạc và giải 4 ON1462 CCGTTTAGAGGCCCCAAGG trình tự Sơ đồ vị trí bắt cặp mồi trên plasmid trong phản ứng PCR khuẩn lạc được mô tả trên Hình 1. Hình 1. Sơ đồ vị trí bắt cặp mồi trên plasmid Phương pháp nghiên cứu 37 oC trong 18 giờ và đường kính vòng vô khuẩn Độ nhạy kháng sinh và MIC của các chủng được đánh giá theo tiêu chuẩn của Clinical and nghiên cứu Laboratory Standards Institute [2]. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của các kháng sinh Phương pháp Kirby Bauer được sử dụng để carbapenem được thực hiện bằng đĩa NKMIC- xác định độ nhạy kháng sinh của các chủng được MDA [1]. cấy trên môi trường Mueller Hinton Agar, ủ ở Trang 29
4. Science & Technology Development, Vol 19, No.T2-2016 Tách chiết plasmid và nhân bản gene mã hóa cho DNA chính là DNA của tế bào E. coli mọc trên carbapenemase KPC-2 đĩa môi trường sau biến nạp. Phản ứng PCR được DNA plasmid của các chủng nghiên cứu thực hiện bởi enzyme Taq DNA polymerase (HT được tách chiết bằng kít tách chiết plasmid biotech) với các mồi đặc hiệu ON1709 và QuickLyse Miniprep Kit (QIAGEN), được tinh ON1462 (Bảng 1). Sản phẩm PCR có kích thước sạch và dùng làm khuôn cho phản ứng PCR thu dự đoán là 979 bp. Các khuẩn lạc E. coli nhận gene mục tiêu. OmniMAX mang plasmid tái tổ hợp dương tính với phản ứng PCR khuẩn lạc được tách chiết Các đoạn gene mã hóa cho protein KPC-2 plasmid giải trình tự vùng gene kpc-2 với cặp mồi được ký hiệu là kpc-2 được thu nhận bằng ON1461 và ON1462 (Bảng 1). phương pháp PCR với cặp mồi ON1709 và ON1714 (Bảng 1) trên khuôn là DNA plasmid đã Biểu hiện protein KPC-2 tái tổ hợp được tách chiết từ các chủng trên. Phản ứng PCR Biến nạp các plasmid tái tổ hợp vào chủng được thực hiện trong thể tích 100 µL bao gồm 10 biểu hiện E. coli BL21 bằng phương pháp hóa µL các dNTP (2 mM); 10 µL đệm PCR (10X); 2 biến nạp. Các chủng mang plasmid tái tổ hợp µL DNA khuôn từ plasmid ở nồng độ 100 ng/µL; được cấy hoạt hóa qua đêm trên 5 mL môi trường 2,5 µL mỗi mồi ON1709 và ON1714 (10 pmol); LB có bổ sung kanamycin và được cấy chuyền 2,5 µL enzyme Pfu DNA polymerase sang ống nghiệm chứa 10 mL môi trường LB có (Fermentas) và 61,5 µL nước cất. Chu kỳ nhiệt bổ sung kanamycin sao cho OD600nm đạt 0,1. o o cho phản ứng PCR bao gồm 94 C trong 5 phút, Nuôi cấy lắc ở 37 C đến khi giá trị OD600nm đạt 30 chu kỳ ba giai đoạn 94 oC trong 30 giây, 55 oC 0.8 và cảm ứng biểu hiện bằng IPTG ở nồng độ trong 30 giây và 72 oC trong 2 phút; cuối cùng là 0,5 mM trong 2 giờ. o một chu kỳ 72 C trong 10 phút. Sản phẩm Kiểm tra sự biểu hiện của protein tái tổ hợp khuếch đại được phân tích trên gel agarose 1,5 %. thông qua tính đề kháng carbapenem bằng cách Tạo plasmid tái tổ hợp cho phép biểu hiện trong cấy chuyền 10 µL dịch nuôi cấy đã cảm ứng bằng tế bào chất IPTG sang môi trường LB có bổ sung kanamycin Sản phẩm khuếch đại gene kpc-2 được xử lý và IPTG cùng với kháng sinh ertapenem ở nồng với enzyme cắt giới hạn NcoI và EcoRI được nối độ 4 µg/mL (được tính là thời điểm T = 0 giờ). vào plasmid pET28a đã mở vòng với chính 2 Nuôi cấy lắc và đọc kết quả sau 2 giờ (T = 2 giờ) enzyme đó bằng enzyme T4 DNA ligase ở OD600nm. (Fermentas) để tạo plasmid được ký hiệu là Tương tự, tế bào vi khuẩn cũng được nuôi pHT2008. Vùng cấu trúc gene trong plasmid cấy trên môi trường LB có bổ sung kanamycin và pHT2008 là T7 Promoter-kpc-2-His-tag. cảm ứng biểu hiện bằng IPTG 0,5 mM ở 23 oC Sản phẩm nối được biến nạp vào tế bào khả trong 6 giờ. Tế bào vi khuẩn được thu nhận sau 6 nạp E. coli OmniMAX theo phương pháp hóa giờ nuôi cấy cảm ứng. Sau đó, tiến hành phân biến nạp và được trải lên đĩa thạch LB có chứa tích khả năng biểu hiện bằng phương pháp SDS- kanamycin 30 μg/mL, ủ 37 oC qua đêm. PAGE. Các khuẩn lạc mọc trên môi trường LB-Agar Tế bào vi khuẩn được phá vỡ bằng phương có chứa kanamycin được chọn để thực hiện phản pháp sóng siêu âm để kiểm tra khả năng biểu ứng PCR khuẩn lạc nhằm sàng lọc vector hiện gene và tính hòa tan của protein dung hợp pHT2008 với thành phần phản ứng tương tự như trên gel SDS-PAGE. phản ứng khuếch đại gene kpc-2 nhưng khuôn Trang 30
5. TAÏP CHÍ PHAÙT TRIEÅN KH&CN, TAÄP 19, SOÁ T2- 2016 Phân đoạn tan của protein được tinh chế Xác định khối lượng phân tử bằng LC-MS bằng sắc ký ái lực thông qua cột Histrap HP 5 Protein KPC-2 sau khi tinh sạch được pha mL (GE healthcare). Sinh khối vi khuẩn sau khi loãng về nồng độ 1 mg/mL và gửi phân tích LC- lên men được huyền phù trong 150 mL dung dịch MS tại Phòng thí nghiệm Phân tích Trung tâm, đệm ly giải chứa 30 mM Tris-HCl pH 8,0, 500 Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG- mM NaCl, 10 % glycerol, 10 mM imidazole, 1 HCM. Kết quả được xử lý bằng phần mềm mg/mL DnaseI và 1 mM PMSF. Ly giải tế bào Bruker Compass Data Analysis 4.0. bằng sóng siêu âm, biên độ sóng (Amplitude) 70 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN % trong 10 chu kì, mỗi chu kì gồm 10 giây phá Độ nhạy kháng sinh và MIC của các chủng và 20 giây nghỉ. Ly tâm 13000 g trong 20 phút ở nghiên cứu 4 oC thu nhận phần dịch nổi. Phần dịch nổi này Cả hai chủng dùng trong nghiên cứu đều có được cho chảy qua cột Histrap HP 5 mL (GE MIC với imipenem, meropenem và ertapenem healthcare). Rửa cột bằng đệm ly giải với thể tích tương tự nhau và đều rất cao so với tiêu chuẩn gấp 3 lần thể tích dịch protein qua cột và dung ly được đề nghị bởi CLSI, lên đến 32 µg/mL. Các protein mục tiêu bám trên cột bằng dung dịch chủng đều đề kháng ampicillin, các chứa 30 mM Tris-HCl pH 8,0, 500 mM NaCl, 10 cephalosporin, kháng sinh phối hợp với chất ức % glycerol và 40-250 mM imidazole. Độ tinh chế β-lactamase, aminglycoside, tetracycline, và sạch của protein sau khi dung ly khỏi cột được chỉ còn nhạy cảm với kháng sinh polypeptide là phân tích trên SDS-PAGE. colistin được thể hiện trong Bảng 2. Bảng 2. Độ nhạy kháng sinh và MIC của các chủng trong nghiên cứu MIC (mg/mL) Độ nhạy kháng sinh (mm)/ kết quả theo CLSI ID IM ME EN IM ME EN CO DX RF CI AM AC CX CT CZ AK CN KLP 16 16 32 16 12 12 12 10 0 0 0 0 0 0 10 13 12 02 R R R R R R S R R R R R R R R R R KLP 16 8 32 17 14 12 12 10 0 0 0 0 0 10 0 0 0 03 R R R R R R S R R R R R R R R R R IM: imipenem, ME: meropenem, EN: ertapenem, CO: colistin, DX: doxycycline, RF: Rifamicine, CI: ciprofloxacin, AM: Ampicillin, AC: Ampicillin/ Clavulanic acid, CX: ceftriaxone, CT: cefotaxim, CZ: ceftazidim, AK: amikacin, CN: cefoxitin, CLSI: Clinical and Laboratory Standard Institute, R: Kháng, S: Nhạy. Tách chiết plasmid và nhân bản gene mã hóa này là chính xác với kết quả dự đoán. Sản phẩm KPC-2 khuếch đại từ đoạn gene này có kích thước là 841 Kết quả phân tích đoạn gene kpc-2 mã hóa bp (Hình 2) tương đương với kết quả PCR nhân cho enzyme KPC-2 bằng phương pháp PCR trên bản gene kpc-2 từ khuôn plasmid tách từ chủng khuôn là DNA plasmid tách chiết từ hai chủng chuẩn 1705 (Hình 2, 1705). trên cho thấy mồi thiết kế để thu nhận đoạn gene Trang 31
6. Science & Technology Development, Vol 19, No.T2-2016 có kích thước dự đoán khoảng 979 bp. Kết quả điện di trên gel agarose 1 % trên Hình 3 cho thấy sản phẩm khuếch đại đoạn gene kpc-2 là một vạch có kích thước như dự đoán. Hình 2. Kết quả điện di trên gel agarose sản phẩm nhân bản gene mã hóa KPC-2, có kích thước 841 bp. M: thang DNA; KPL02, KPL03, 1705 (+): sản phẩm PCR nhân gene kpc-2 từ DNA plasmid tách lần lượt từ chủng KPL02, KPL03 và 1705 (+). Tạo plasmid tái tổ hợp pHT2008 Hình 3. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc của Các sản phẩm PCR nhân gene kpc-2 và chủng mang plasmid tái tổ hợp pHT2008 có chứa trình tự kpc-2 từ các chủng vi khuẩn KPL-02, KPL-03 và plasmid pET28a (+) được xử lý bằng enzyme cắt 1705 giới hạn NcoI/EcoRI để tạo ra các plasmid tái tổ hợp pHT2008 có mang gene mã hóa KPC-2. Các Chọn khuẩn lạc 1, 5 và 10 để tách chiết khuẩn lạc mọc trên môi trường LB-kanamycine plasmid và giải trình tự đoạn DNA được chèn với được sàng lọc bằng phản ứng PCR khuẩn lạc cặp mồi ON1461 và ON1462, kết quả so sánh nhằm chọn các dòng biến nạp đúng plasmid mục cho thấy có sự tương đồng 100 % so với trình tự tiêu là pHT2008 với đoạn DNA được khuếch đại lý thuyết của gene kpc-2 (Hình 4). Hình 4. Kết quả phân tích trình tự của plasmid tái tổ hợp pHT2008 Trang 32
7. TAÏP CHÍ PHAÙT TRIEÅN KH&CN, TAÄP 19, SOÁ T2- 2016 Như vậy, chúng tôi đã dòng hóa thành công Biểu hiện protein KPC-2 plasmid pHT2008 mang gene kpc-2 từ các chủng Việc biểu hiện protein có hoạt tính của K. pneumoniae chuẩn (+) ATCC BAA 1705 và enzyme KPC-2 tái tổ hợp được kiểm tra thông hai chủng phân lập từ mẫu bệnh phẩm là K. qua khả năng kháng ertapenem, bằng việc khảo pneumoniae KLP02 và KLP03 được ký hiệu lần sát khả năng sinh trưởng của các chủng E. coli lượt là pHT2008-1705, pHT2008-KLP02 và BL21 có mang plasmid tái tổ hợp pHT2008 và pHT2008-KLP03. Đại diện plasmid pHT2008 có chủng mang plasmid gốc pET28a (làm đối chứng sơ đồ như Hình 5. âm) trên môi trường chứa kháng sinh ertapenem. Kết quả khảo sát giá trị OD600nm sau 2 h nuôi cấy như Bảng 3. Giá trị OD600nm cho thấy chủng E. coli BL21 có mang plasmid chứa gene mã hóa cho KPC-2 có khả năng tăng trưởng tốt trên môi trường chứa kháng sinh ertapenem. Trong khi mẫu đối chứng âm là chủng E. coli BL21 có mang plasmid pET28 a (+) không chứa gene mã hóa KPC-2 thì không tăng trưởng được mà còn giảm giá trị OD600nm. Như vậy gene kpc-2 có khả năng biểu hiện thành enzyme trong tế bào E. coli Hình 5. Sơ đồ cấu trúc plasmid pHT2008 và có hoạt tính phân cắt kháng sinh ertapenem. Bảng 3. Khảo sát hoạt tính kháng ertapenem của enzyme KPC-2 thông qua kiểm tra mật độ tế bào OD / kháng sinh ertapenem 4 µg/mL E. coli BL21 mang plasmid 600nm Trước khi bổ sung (T=0 h) Sau khi bổ sung (T=2 h) pHT2008-1705 2,31 3,49 pHT2008-02KPL 2,25 3,27 pHT2008-03KPL 2,43 3,65 pET28a 2,46 0,59 Kết quả khảo sát sự tăng trưởng của vi sinh vật trong môi trường có kháng sinh ertapenem chứng tỏ các chủng E. coli có mang plasmid tái tổ hợp pHT2008 có hiện tượng đề kháng với kháng sinh ertapenem ở nồng độ 4 µg/mL hay nói cách khác, thí nghiệm này đã khẳng định gene đề kháng kháng sinh carbapenem kpc-2 được tạo dòng từ các vi khuẩn K. pneumoniae đề kháng carbapenem phân lập trên các mẫu bệnh phẩm tại Việt Nam chính là tác nhân góp phần Hình 6. Kết quả kiểm tra cảm ứng biểu hiện KPC-2 gây nên hiện tượng đề kháng carbapenem ở các với IPTG. M: thang protein chuẩn; ĐC: chủng đối chủng này. Kết quả này được xác nhận khi phân chứng (-) mang plasmid pET28a; (-) IPTG: E. coli tích trên SDS-PAGE (Hình 6). mang plasmid tái tổ hợp pHT2008-kpc-2 không được cảm ứng với IPTG; 02KLP, 03KLP và 1705: E. coli mang plasmid tái tổ hợp pHT2008-kpc-2 lần lượt từ các chủng 02KLP, 03KLP và 1705 được cảm ứng bằng 0,5 mM IPTG. Trang 33
8. Science & Technology Development, Vol 19, No.T2-2016 Phân tích SDS-PAGE trên Hình 6 cho thấy, ở đối chứng dương 1705. Kết quả kiểm tra tính tan các giếng pHT2008-02KPL, 03KPL, và 1705 đều của protein tái tổ hợp KPC-2 trên Hình 7A cho xuất hiện một vạch protein đậm có kích thước thấy protein mục tiêu hiện diện trong cả pha tủa khoảng 29 kDa, kích thước này hoàn toàn phù (P) và pha tan (S). Tuy nhiên, lượng protein hiện hợp với kích thước dự đoán của protein đích là điện trong pha tan cũng còn khá cao nên có thể 29,5 kDa. Trong khi đó, mẫu đối chứng là chủng sử dụng protein trong pha tan để tiếp tục tinh chế E. coli BL21 mang plasmid gốc pET28a không protein tái tổ hợp trong quy trình tinh chế protein cho vạch protein tương ứng. Tương tự vậy, đối theo phương pháp sắc ký ái lực. Do mức độ biểu với mẫu có mang plasmid chứa gene kpc-2 nhưng hiện và tính tan của protein KPL là như nhau không cảm ứng bằng IPTG thì vạch protein mục giữa hai chủng mang plasmid pHT2008-03KPL tiêu cũng có hiện diện nhưng rất mảnh. Như vậy, và pHT2008-1705, thêm vào đó trình tự gene mức độ biểu hiện protein KPC-2 từ 3 chủng chứa kpc-2 giữa ba chủng là như nhau nên trong gene kpc của 02KPL, 03KPL và 1705 là như nghiên cứu này chỉ chọn chủng mang plasmid nhau. Do vậy, trong thí nghiệm kiểm tra tính tan pHT2008-03KPL để tinh chế protein KPC-2. của protein chỉ tiến hành trên mẫu 03KPL và mẫu Hình 7. Kết quả điện di SDS-PAGE trên gel polyacrylamide 12 %. (A) Kiểm tra tính tan của protein KPC-2 được biểu hiện trong tế bào chất của tế bào E. coli mang plasmid tái tổ hợp pHT2008-KLP03 và pHT2008-1705; (B) Kiểm tra độ tinh sạch của protein sau khi tinh chế protein bằng sắc ký ái lực. M: Thang protein chuẩn, T: protein tổng số, P: protein tủa và S: protein hòa tan, E: các phân đoạn dung ly qua cột để thu nhận protein. Kết quả tinh chế protein KPC-2 trên Hình 7B Xác định khối lượng phân tử của protein KPC-2 cho thấy các phân đoạn dung ly rất tinh sạch, chỉ Các phân đoạn sau cột chứa protein KPC-2 còn duy nhất một vạch protein mục tiêu với kích mục tiêu được đồng nhất với nhau, sau đó pha thước khoảng 29 kDa. Như vậy, protein KPC-2 loãng về nồng độ 1 mg/mL và phân tích LC-MS. đã được tinh chế với mức độ tinh sạch rất cao, Kết quả cho thấy chỉ có 1 cấu tử protein duy nhất protein này có thể được sử dụng cho các mục với khối lượng phân tử khoảng 28.819 Da (tương đích nghiên cứu tiếp theo như việc sử dụng làm ứng với khối lượng protein KPC-2 trong tự kháng nguyên để gây đáp ứng miễn dịch trên nhiên) (Hình 8) và không thấy các sản phẩm phụ. chuột và thỏ nhằm sản xuất kháng thể. Điều này khẳng định protein KPC-2 đã được tinh chế thành công với độ tinh sạch cao và có trọng lượng phân tử chính xác. Trang 34
9. TAÏP CHÍ PHAÙT TRIEÅN KH&CN, TAÄP 19, SOÁ T2- 2016 Hình 8. Kết quả phân tích LC-MS của phân đoạn protein KPC-2 tái tổ hợp sau khi tinh sạch KẾT LUẬN Kết quả nghiên cứu đã tạo dòng thành công ái lực. Protein này sẽ được sử dụng như một tế bào E. coli có mang plasmid tái tổ hợp chứa kháng nguyên gây đáp ứng miễn dịch trên chuột gene mã hóa cho carbapenemase kpc-2, các gene tạo ra kháng thể phục vụ cho các nghiên cứu kpc-2 từ 2 chủng vi khuẩn 02KPL, 03KPL đã kiểm chứng, phát hiện vi sinh vật sinh ESBL. phân lập ở Việt Nam có sự tương đồng 100 % so Lời cảm ơn: Báo cáo này là một phần trong với chủng chuẩn 1705 và có mức độ biểu hiện đề tài của NCS. Trần Nhật Phương “Nghiên cứu của gene là như nhau. Protein KPC-2 có trọng đặc điểm sinh học phân tử của Klebsiella pneumoniae đề kháng carbapenem qua cơ chế lượng phân tử 28,8 kDa và có hoạt tính phân cắt KPC”. Các thí nghiệm được thực hiện tại Trung ertapenem. Tuy khả năng tan trong tế bào chất tâm Khoa học và Công nghệ sinh học, Trường của protein này chỉ khoảng 50 % nhưng do Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM. protein được biểu hiện vượt mức nên lượng Huỳnh Thị Kim Phương được hỗ trợ kinh phí NVTX bởi Đại học Quốc gia TP. HCM, Mã số protein tan cũng đủ để tinh chế được protein TX2015-18-07. KPC-2 tinh sạch thông qua phương pháp sắc ký Trang 35
10. Science & Technology Development, Vol 19, No.T2-2016 Clonning and expression of recombinant carbapenemase KPC-2 enzyme in E. coli cytoplasm Tran Nhat Phuong Huynh Thi Kim Phuong Phan Thi Phuong Trang Tran Linh Thuoc University of Science, VNU-HCM Phạm Hùng Vân Nam Khoa Biotek Co. Ltd., Medicine & Pharmacy University of Ho Chi Minh City ABSTRACT Production of KPC-type carbapenemase is recombinant plasmid. Carbapenemase activity in the most common carbapenem resistant the broth culture was checked in LB broth mechanism in Klebsiella pneumoniae. The supplemented with 4 g/mL of ertapenem and the expression level of KPC in these strains is expression induced with IPTG was checked by different and is mostly required other SDS-PAGE method. The results showed that this mechanisms to reach the higher resistant level recombinant vector was capable of effective such as porin lost or co-expression of extended expression of KPC-2 protein in E. coli and this spectrum β-lactamase (ESBL). To better strain could be grown in LB broth supplemented understand the expression of KPC enzyme, the with 4 g/mL of ertapenem. A half of the target KPC-2 encoding genes from clinical isolated K. protein was soluble in the supernatant however it pneumoniae were cloned into pET28a plasmid. could be successfully collected from a Histrap- The recombinant plasmids containing of kpc-2 HP affinity chromatography column. The result gene were subsequently transformed into E. coli of this report is one of resources for further OmniMax and were screened in kanamycine studies and applications of this KPC-2 protein in added LB media to select E. coli possessing of clinical research. Key words: KPC, carbapenem, cloning, recombinant, pET28a, pHT2008 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. P.T. Binh, L.L.B. Ngan, N.T.H. Thuy, P.H. Susceptibility Testing: Twenty Information Van, Develop the kit using the broth micro- Supplement, 30, M100-S20 (2010). dilution method to carry out the MIC [3]. L.M. Deshpande, P.R. Rhomberg, H.S. detecting antibiotic sensitivity testing in the Sader, R.N. Jones, Emergence of serine clinical microbiology laboratory. Proeeding carbapenemases (KPC and SME) among of the 2nd National Conference in Medical clinical strains of Enterobacteriaceae Molecular Biology, 200 – 202. (2010). isolated in the United States medical centers: [2]. Clinical and Laboratory Standard Institute, report from the MYSTIC Program (1999– Performance Standards for Antimicorbial 2005), Diagn. Microbiol. Infect. Dis., 56, 367–372 (2006). Trang 36
11. TAÏP CHÍ PHAÙT TRIEÅN KH&CN, TAÄP 19, SOÁ T2- 2016 [4]. H. Yigit, A.M. Queenan, R.J. Kamile, J.W. [6]. J. Walther-Rasmussen*, N. Hoiby, Class A Biddle, A. ntonio Domenech-Sanchez, S. carbapenemases, Journal of Antimicrobial Alberti, B. Karen, F.C. Tenover, Chemotherapy, 60, 470 – 482 (2007). Carbapenem-resistant strain of Klebsiella [7]. P. Shen, Z. Wei, Y. Jiang, X. Du, S. Ji, Y. oxytoca harboring carbapenem-hydrolyzing Yu, L. Li, Novel genetic environment of the β-Lactamase KPC-2, Antimicrob Agents carbapenem-hydrolysing -lactamase KPC- Chemother, 47, 12, 3881–3889 (2003). 2 among Enterobacteriaceae in China, [5]. H.H. Tran, S. Ehsani, K. Shibayama, M. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Matsui, S. Suzuki, M.B. Nguyen, D.N. Tran, 4333–4338 (2009). V.P. Tran, D.L. Tran, H.T. Nguyen, D.A. [8]. T.N. Phương, P.H. Vân, T.L. Thước, Xác Dang, H.S. Trinh, T.H. Nguyen, H.F.L. định sự hiện diện của gene mã hóa Wertheim, Common isolation of New Delhi carbapenemase KPC-2 ở Klebsiella metallo-beta-lactamase 1-producing pneumoniae kháng kháng sinh carbapenem Enterobacteriaceae in a large surgical phân lập tại Việt Nam, Tạp chí Y học Thực hospital in Vietnam, Eur. J. Clin. Microbiol. hành, Bộ Y Tế, 78, 58 – 62 (2011). Infect. Dis., 34, 1247–1254 (2015). [9]. T.D. Gootz et al., Genetic Organizartion of transposase regions surrouding blaKPC carabapenemase genes on plasmids from Klebsiella strains isolated in a New York city hospital, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 53, 5, 1998 – 2004 (2009). Trang 37