Đề tài Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học cây lược vàng Callisia Fragrans họ Thài Lài - Commelinaceae (Phần 1)

Nội dung text: Đề tài Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học cây lược vàng Callisia Fragrans họ Thài Lài - Commelinaceae (Phần 1)

1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ĐỀ TÀI NCKH CẤP TRƯỜNG Khảo sát sơ bộ thành phần hĩa học cây lược vàng Callisia Fragrans họ Thài Lài - Commelinaceae MÃ SỐ: T2010 - 72 TCHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: NGUYỄN THỊ BẠCH LÊ S K C 0 0 3 2 0 1 THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, 2011
2. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT TP.HCM 0O0 BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG KHẢO SÁT SƠ BỘ THÀNH PHẦN HĨA HỌC CÂY LƯỢC VÀNG CALLISIA FRAGRANS – HỌ THÀI LÀI – COMMELINACEAE MÃ SỐ : T2010-72 CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI : NGUYỄN THỊ BẠCH LÊ Thành Phố Hồ Chí Minh – Năm 2011
3. MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU 1 PHẦN 1 : TỔNG QUAN 3 1.1.Giới thiệu về cây lƣợc vàng 3 1.2.Những nghiên cứu về cây lƣợc vàng 4 1.3. Tổng quan về các phƣơng pháp sắc ký 6 1.3.1.Sắc ký cột (column chromatography) 6 1.3.2.Sắc ký bản mỏng 7 PHẦN 2 : THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 2.1. Hĩa chất và dụng cụ 8 2.2. Thu hái và xử lý nguyên liệu 8 2.3. Khảo sát sơ bộ thành phần hĩa học cây lƣợc vàng 8 2.4. Thử nghiệm hoạt tính sinh học 14 PHẦN 3 : KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 16 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC
4. TĨM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG Tên đề tài : KHẢO SÁT SƠ BỘ THÀNH PHẦN HĨA HỌC CÂY LƢỢC VÀNG CALLISIA FRAGRANS, HỌ THÀI LÀI – COMMELINACEAE Mã số đề tài : T2010 – 72 Chủ nhiệm đề tài : Nguyễn Thị Bạch Lê Tel : 0903753720 Email : ntble@hcmute.edu.vn Cơ quan chủ trì đề tài : Trƣờng Đại học Sƣ Phạm Kỹ thuật TP.HCM Thời gian thực hiện : 6/2010 – 4/2011 1. Mục tiêu Khảo sát sơ bộ thành phần hĩa học cây lƣợc vàng Callisa Fragrans, Họ Thài Lài (Commelinaceae) Cụ thể : - Điều chế các loại cao từ lá cây lƣợc vàng : cao ether dầu hỏa, cao acetat etyl, cao etanol - Khảo sát sơ bộ thành phần hĩa học của các loại cao này bằng các thuốc thử biệt tính. - Thử nghiệm hoạt tính sinh học trên cao Acetat etyl và cao ether dầu hỏa. 2. Nội dung chính - Điều chế các cao bằng phƣơng pháp ngâm dầm với các dung mơi cĩ độ phân cực tăng dần : ether dầu hỏa, acetat etyl, etanol. Thu hồi dung mơi bằng máy cơ quay chân khơng.
5. - Thử nghiệm các cao trên với các thuốc thử cho các hợp chất steroid, flavonoid, Limonoid, Alkaloid - Thử nghiệm cao Acetat etyl và cao ether dầu hỏa trên các chủng vi khuẩn nhƣ : Staphylococcus aureus, Salmonella enteritidis, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Bacilus subtilis 3. Kết quả chính đạt được - Thu đƣợc 3 loại cao: cao ether dầu hỏa, cao acetat etyl, cao etanol - Kết quả khảo sát sơ bộ thành phần hĩa học : Cao ether dầu hỏa chứa chất béo gồm dầu béo và sáp Cao acetat etyl chứa một ít sterol và nhiều flavonoid Cao etanol chứa đƣờng khử, lƣợng nhỏ tanin, một ít flavonoid và amin - Kết quả thử nghiệm hoạt tính sinh học trên cao acetat etyl : cao AcEt trích từ lá cây lược vàng có tác dụng diệt khuẩn đối với vi khuẩn Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa và Bacilus subtilis - Kết quả thử nghiệm hoạt tính sinh học trên cao ether dầu hỏa : cao ehter dầu hỏa trích từ lá cây lược vàng có tác dụng diệt khuẩn yếu đối với vi khuẩn Staphylococcus aureus . 4. Địa chỉ ứng dụng Kết quả nghiên cứu đƣợc chuyển tải trong bài báo chuyên ngành, nhằm cung cấp thơng tin về thành phần hĩa học cây lƣợc vàng Callisa fragans giúp những nhà nghiên cứu trên cùng lĩnh vực cĩ định hƣớng trong nghiên cứu về cây lƣợc vàng. Và kết quả này cịn làm định hƣớng nghiên cứu tiếp theo cho đề tài này là trích ly cơ lập những chất cĩ mặt trong cây đã khảo sát đƣợc.
6. INFORMATION ON RESEARCH RESULT 1. General information Project title : CHEMICAL STUDY ON CALLISA FRAGANS – COMMELINACEAE. Code number : T2010-72 Coordinator : NGUYỄN THỊ BẠCH LÊ Implementing institution : University of Technical Education, HCM city Duration : from Jun 2010 to Apr 2011 2. Objecttive(s) - Chemical study on Callisa fragans through out three liquids : petroleum ether, ethyl acetat, ethanol. - Bioactive test on ethyl acetat extract. 3. Research result: - Extraction 3 residue : petroleum ether, ethyl acetat, ethanol. - Chemical study on these extract: Petroleum ether residue containing a large of lipid Ethyl acetat residue containing many flavonoids Ethanol residue containing saccharides, and flavonoids - Ethyl acetat ectract shows antimicrobial activitives on some bacteria lives : Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Bacilus subtilis 4. Effects, transfer alternatives of research result and applicability The result of this research will be published on an article to send the knowledge of the Callisa fragans for the researchers who are working on the same field.
7. BÁO CÁO ĐỀ TÀI NCKH CẤP TRƯỜNG MỞ ĐẦU Việt Nam là nước cĩ hơn 12.000 loại cây cỏ, trong đĩ cĩ rất nhiều dược liệu quý. Thêm vào đĩ, nền y học cổ truyền (YHCT) của nước ta được xếp vào tốp mạnh của thế giới. Tuy nhiên, so với các nước cĩ nền YHCT hàng đầu thế giới thì nền YHCT của nước ta cịn một khoảng cách lớn. Nếu khơng được sự đầu tư phát triển một cách tương xứng thì khoảng cách đĩ càng được nới rộng, thậm chí cĩ nguy cơ tụt hậu và quan trọng nhất là khơng phát huy được thế mạnh của YHCT để chăm sĩc và bảo vệ sức khỏe người dân. Do đĩ tơi chọn hướng nghiên cứu hĩa dược để tìm những hoạt chất cĩ hoạt tính sinh học từ các cây thuốc được sử dụng trong dân gian nhằm cung cấp những bằng chứng khoa học trong việc sử dụng các cây thuốc đĩ trong YHCT, đồng thời tìm mối liên hệ giữa YHCT và y học hiện đại. Cây lược vàng cĩ tên khoa học là Callisia Fragrans – họ Thài lài Commelinaceae. Việc sử dụng cây Lược vàng làm thuốc mới chỉ được cơng bố ở Nga theo bài viết của tác giả Vladimir-Ogarkov đăng trên tạp chí sức khỏe và đời sống của Nga. Cây Lược vàng được dùng để chữa bệnh đường dạ dày ruột, túi mật, lá lách và cả bệnh hen phế quản, dị ứng và ung thư. Các chế phẩm thuốc từ Lược vàng cũng cĩ hiệu quả làm ngừng đau, trừ ngứa, làm liền sẹo, bỏng, chấn thương và gãy xương. Tính cấp thiết của đề tài nghiên cứu Từ những năm giữa thế kỷ 20, một số nhà khoa học Mỹ và Canada đã phát hiện: những lồi cây thuộc họ Commelinaceae (trong đĩ cĩ cây lược vàng), chứa nhiều loại hoạt chất sinh học, cĩ khả năng kiềm chế sự phát triển của các khối u. Ở Nga, các nghiên cứu về thành phần hĩa học và tác dụng dược lý của lược vàng được tiến hành tại Đại học Y khoa thành phố Irkyt, từ những năm 80, thế kỷ trước, dưới sự chỉ đạo của GS. Semenov, một nhà khoa học rất nổi tiếng. Kết quả nghiên cứu nhiều năm ở Irkyt cho thấy: Trong cây lược vàng cĩ một số hoạt chất sinh học 1
8. BÁO CÁO ĐỀ TÀI NCKH CẤP TRƯỜNG thuộc nhĩm flavonoid và steroid thực vật. Ngồi ra, trong cây cịn cĩ sắt, đồng, crơm những nguyên tố cĩ tác dụng quan trọng đối với hoạt động sống của cơ thể. Hai chất thuộc nhĩm flavonoid được phát hiện là: kercitin và kempferol. Lvercitin cĩ hoạt tính giống như vitamin P và là chất chống oxy hĩa, cĩ tác dụng lợi tiểu và chống co giật. Cĩ thể sử dụng trong điều trị dị ứng, chảy máu nội tạng, viêm thận, viêm khớp, cũng như một số bệnh tim mạch, mắt và nhiễm trùng, Kempferol cĩ tác dụng làm tăng độ bền của mạch máu, an thần, chống viêm, lợi tiểu mạnh – giúp cơ thể bài tiết các chất độc hại ra ngồi. Cĩ thể sử dụng để chữa trị các bệnh nhiễm khuẩn, bệnh dị ứng, rối loạn chức năng bài tiết nước tiểu. Các steroid cĩ trong thực vật được gọi là các phytosterol. Chúng cĩ hoạt tính tương tự nội tiết tố sinh dục, cịn cĩ tác dụng diệt khuẩn, chống xơ vữa động mạch và kiềm chế sự phát triển của các khối u. Cĩ thể ứng dụng trong điều trị một số dạng ung thư, cũng như các bệnh tuyến tiền liệt, bệnh nội tiết và rối loạn chuyển hĩa. Ở Việt Nam, đặc biệt ở Thanh Hĩa, nhiều người ở câu lạc bộ Hàm Rồng đã sử dụng cây Lược vàng để chữa rất nhiều bệnh theo kinh nghiệm dân gian Nga như: viêm họng, viêm phế quản, tê liệt chân tay, đau lưng, khớp, bướu cổ di chứng não, tim mạch, huyết áp và xơ vữa động mạch, u nang buồng trứng Tuy nhiên, việc chữa trị cũng chỉ theo kinh nghiêm dân gian, chưa cĩ một nghiên cứu cụ thể để xác định thành phần hĩa học chủ yếu cũng như dược tính của cây lược vàng trồng ở Việt Nam . Do đĩ, chúng tơi quyết định chọn đề tài để khảo sát tồn diện cây lược vàng nhằm cung cấp những bằng chứng khoa học cho việc sử dụng cây này một cách hiệu quả , phục vụ tốt cho cộng đồng. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu - Đối tượng nghiên cứu là cây lược vàng, thu hái tại xã Phước Thạnh, huyện Đất Đỏ, tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu. - Phạm vi nghiên cứu : khảo sát thành phần hĩa học tồn cây, và thử nghiệm hoạt tính sinh học trên các loại cao và các hợp chất ly trích được. 2
9. BÁO CÁO ĐỀ TÀI NCKH CẤP TRƯỜNG PHẦN 1 TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu về cây lược vàng[1] Cây lượt vàng (hay cịn gọi là ria vàng) cĩ tên khoa học là Callisa fragrans, họ Thài Lài (Commmelinaceae) Mơ tả : Cây thảo, sống lâu năm. Thân đứng cao từ 15 – 40 cm, cĩ thân bị ngang trên mặt dất. Thân chia đốt và cĩ nhánh. Đốt ở phía thân dài từ 1-2cm, ở nhánh cĩ thể dài tới 10cm. Lá đơn , mọc so le, phiến lá thuơn hình ngọn giáo, dài 15-20cm, rộng 4-6cm, bề mặt nhẵn, mặt trên xanh đậm hơn mặt dưới, mọng nước. Bẹ lá ơm khít lấy thân. Mép lá nguyên , thường cĩ màu vàng khi lá già. Lá thường cĩ màu tím ở những cây cĩ nhiều ánh sáng. Gân lá song song. Hoa hợp thành xim, sắp xếp ở ngọn một trục dài và cong thành chùm. Cụm hoa khơng cuống, gồm 6-12 bơng hoa. Hoa màu trắng, cĩ cuống, cuống hoa dài 1mm. Lá bắc ngồi cụm hoa hình vỏ trấu, kích cỡ 1cm x 1cm, màu vàng. Lá bắc của hoa hình lịng thuyển, kích thước 1,5mm x 3mm, phần dưới trắng, phần trên xanh, mép 3
10. BÁO CÁO ĐỀ TÀI NCKH CẤP TRƯỜNG nguyên, cĩ lơng mịn phía dưới. Tràng 3, hình trứng, kích thước 1mm x 2,5mm, màu trắng , mép nguyên. Nhị 6, rời, chỉ nhị dài khoảng 1,5mm, phần dưới dính với cánh hoa, bao phấn hình hạt đậu, đính vào hai bên trung đới. Bầu trên, 3 ơ, cao khoảng 0,5mm, vịi nhụy hình trụ, dài khoảng 1,5mm, núm nhụy hình chổi. Thành phẩn hĩa học : các lipid gồm triacylglycerid, sulfolipid, digalactosylglycerid. Các acid béo : paraffinic, olefinic. Các sắc tố: caroten, chlorofyl, phytosterol. Các flavonoid : quercetin, kaempferol isoorientin (3’,4’,5’,7’-tetrahydroxyflavone-6-C-β-D-glucopyranosid) Các vitamin PP, B2 và các nguyên tố vi lượng : Fe, Cr, Ni, Cu. 1.2. Những nghiên cứu về cây lược vàng[2,6,7] Các nhà khoa học tại Trường Đại Học Bách Khoa Hà Nội và Viện Hĩa học các Hợp chất Thiên nhiên Viện Khoa học và Cơng Nghệ Việt Nam đã phân lập thành cơng hợp chất flavon C-glucosid, isoorientin[2], ginsenoside và L-tryptophan là những hợp chất cĩ rất nhiều hoạt tính sinh học đáng chú ý trong lĩnh vực làm thuốc, thực phẩm chức năng Hợp chất isoorientin (3’,4’,5’,7’tetrahydoxyflavone-6-C-β-D-glucopyranosid) là một flavon cĩ mặt trong một số lồi thực vật bậc cao. Nhiều nghiên cứu[6] đã cho thấy hợp chất này thể hiện nhiều hoạt tính sinh học cĩ giá trị trong các thử nghiệm in vitro và in vivo, bao gồm hoạt tính chống oxi hĩa, kháng viêm, kháng sinh, bảo vệ gan, hạ đường huyết. Một nghiên cứu trên 4
11. BÁO CÁO ĐỀ TÀI NCKH CẤP TRƯỜNG chuột cho thấy isoorientin được hấp thụ kém qua đường ruột nhưng lại được chuyển hĩa thành các sản phẩm khác nhờ vi sinh vật đường ruột, đồng thời, thời gian lưu giữ trong ruột khá dài (khoảng 12h) đủ để hợp chất này thể hiện các tác dụng sinh học. Trước đĩ, nghiên cứu của Hatori và các cộng sự đã chứng minh rằng isoorientin chuyển hĩa thành các dẫn xuất 6-C-glucosyleriodictyol, eriodictyol, luteotin, acid 3,4-dihydroxyphenylpropionic và phloroglucinol khi được ủ kị khí với các vi sinh vật đường ruột. Giống như các chất thuộc nhĩm flavonoid, hoạt tính chống oxi hĩa của isoorientin thể hiện rõ rệt trong các nghiên cứu trên hệ DPPH và lipid peroxid với giá trị IC50 khá thấp (9-10µM). Khả năng chống oxi hĩa này được chứng minh do isoorientin kích thích sự hoạt hĩa của yếu tố phiên mã Nrf2, từ đĩ thức đẩy quá trình tổng hợp các gene liên quan đến khả năng chống oxi hĩa như NAD(P)H: quinone oxidoreductase 1 (NQO-1), hemeoxigenase 1 (HO-1), periaxin (PRX). Hoạt tính cống viêm của isoorientin cũng được nghiên cứu khá chi tiết trong thời gian gần đây. Năm 2004, Kupeli[7] và cộng sự đã thử nghiệm tác dụng chống viêm của isoorientin trên chuột nhắt gây viêm bằng carrageenan. Kết quả cho thấy, với liều 30mg/kg thể trọng, isoorientin làm giảm đến hơn 40% thể tích khối viêm mà hồn tồn khơng gây độc cho dạ dày. Trong một thí nghiệm khác, isoorientin ở liều 25mg/kg thể trọng làm giảm đến 57% tế bào bạch cầu và 40% hoạt tính myeloperoxidase trên mơ hình chuột nhắt gây viêm bằng carrageenan. Nghiên cứu của Odontuya và cộng sự cũng cho thấy isoorientin cĩ khả năng ức chế quá trình tổng hợp thromoxan B2, một sản phẩm chuyển hĩa của acid arachidonic cĩ liên quan trực tiếp đến quá trình viêm và tự miễn. Một hoạt tính đáng quan tâm khác của isoorientin là những tác dụng liên quan đến bệnh tiểu đường. Cĩ khá nhiều nghiên cứu chứng tỏ isoorientin khá khả năng làm hạ đường huyết, giảm mỡ máu. Thí nghiệm trên mơ hình chuột gây tiểu đường bằng streptozotocin cho thấy cao chiết nước và butanol từ lá cây Cecropia obtusifolia chứa isoorientin cĩ tác dụng làm giảm đường huyết sau khi cho uống 3h. Sau đĩ, với thí nghiệm tương tự, Sezik và cộng sự đã chứng minh isoorientin 5
12. BÁO CÁO ĐỀ TÀI NCKH CẤP TRƯỜNG với liều 15m/kg thể trọng làm giảm đáng kể lượng đường glucose trong máu trong vịng 5-15 ngày. Tuy nhiên, một nghiên cứu khác, isoorientin lại khơng tác dụng đến α-glucosidase, một enzym đĩng vai trị quan trọng trong quá trình chuyển hĩa glucose. Hợp chất isoorientin thể hiện hoạt tính kháng sinh yếu trên các chủng vi khuẩn và nấm với giá trị MIC trong khoảng 100-200 µg/mL. Trong một số nghiên cứu, mặc dù dịch chiết các mẫu thực vật chứa isoorientin ức chế mạnh sự phát triển các chủng vi sinh vật kiểm định, nhưng khi được phân lập ra, hoạt tính của isoorientin lại cĩ giá trị thấp hơn dịch chiết ban đầu. Ngồi những hoạt tính sinh học kể trên, isoorientin cịn thể hiện nhiều tác dụng khác như bảo vệ gan, thận, chống tụ máu, ức chế enzym acetylcholinesterase và butyrylchlolinesterase vốn cĩ liên quan đến các bệnh về thần kinh. 1.3. Tổng quan về các phương pháp sắc ký 1.3.1. Sắc ký cột (column chromatography)[3,4] Sự sắc ký là một phương pháp vật lý để tách một hỗn hợp nhiều loại hợp chất ra riêng thành từng loại đơn chất, dựa vào tính ái lực khác nhau của những loại hợp chất đĩ đối với một hệ thống (hệ thống gồm 2 pha : một pha động và một pha tĩnh). Sắc ký cột hở được tiến hành ở điều kiện áp suất khí quyển. Pha tĩnh thường là những hạt cĩ kích thước tương đối lớn (50-150µm) được nạp trong một cột bằng thủy tinh. Mẫu chất cần phân tách được đặt ở phần trên đầu cột, phía trên pha tĩnh (cĩ một lớp bơng thủy tinh che chở để lớp mặt khơng bị xáo trộn), bình chứa dung mơi giải ly được đặt phía trên cao. Dung mơi giải ly ra khỏi cột ở phần bên dưới cột được hứng vào những lọ nhỏ đặt ngay dưới ống dẫn ra của cột. Trong sắc ký cột với pha tĩnh là silica gel loại thường, hợp chất khơng phân cực được giải ly ra khỏi cột trước, hợp chất phân cực được giải ly ra sau. Với hai phân tử khơng phân cực, phân tử cĩ trọng lượng phân tử lớn sẽ cĩ tính phân cực mạnh hơn phân tử kia, nĩ bị pha tĩnh giữ lại trong cột nên di chuyển ra khỏi cột 6
13. BÁO CÁO ĐỀ TÀI NCKH CẤP TRƯỜNG chậm hơn so với phân tử nhỏ và cũng cĩ khi nĩ cịn ở lại trong cột lâu hơn so với vài phân tử tuy cĩ tính phân cực nhưng cĩ trọng lượng phân tử nhỏ. 1.3.2. Sắc ký bản mỏng[3] Sắc ký lớp mỏng cịn gọi là sắc ký phẳng (planar chromatography), dựa chủ yếu vào hiện tượng hấp thu, trong đĩ, pha động là một dung mơi hoặc hỗn hợp dung mơi, di chuyển ngang qua một pha tĩnh là một chất hấp thu trơ, ví dụ như silica gel hoặc oxid alumin. Pha tĩnh này được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên một nền phẳng như tấm kiếng, tấm nhơm hoặc tấm plastic. Do chất hấp thu được tráng thành một lớp mỏng nên phương pháp này gọi là sắc ký lớp mỏng. - Bình sắc ký : một chậu, lọ, hũ, bằng thủy tinh, hình dạng đa dạng, cĩ nắp đậy. - Pha tĩnh : một lớp mỏng khoảng 0,25mm của một loại chất hấp thu được tráng mỏng, đều, phủ lên nền phẳng. - Mẫu cần phân tích: thường là hỗn hợp gồm nhiều hợp chất với độ phân cực khác nhau. Sử dụng khoảng 1microlit dung dịch mẫu với nồng độ pha lỗng 2-5%, nhờ một vi quản để chấm mẫu thành một điểm gọn trên pha tĩnh ở vị trí phía trên cao hơn một chút so với mặt thống của chất lỏng đang chứa trong bình. - Pha động : dung mơi, hoặc hỗn hợp hai dung mơi di chuyển chậm dọc theo tấm lớp mỏng và lơi kéo mẫu chất theo nĩ. Dung mơi di chuyển lên cao nhờ tính mao quản. Mỗi thành phần của chất mẫu sẽ di chuyển với vận tốc khác nhau đi phía sau mực của dung mơi. Vận tốc di chuyển này tùy thuộc vào các lực tương tác tĩnh điện mà pha tĩnh muốn níu giữ các mẫu chất ở lại pha tĩnh (hiện tượng hấp thu của pha tĩnh) và tùy thuộc vào độ hĩa tan của mẫu chất trong dung mơi. Với chất hấp thu là silics gel hoặc alumin, các hợp chất kém phân cực sẽ di chuyển nhanh và các hợp chất rất phân cực sẽ di chuyển chậm. 7