Công nghệ Enzyme – Protein

Nội dung text: Công nghệ Enzyme – Protein

1. Công nghệ Enzyme – Protein 1 Công nghệ Enzyme – Protein
2. Công nghệ Enzyme – Protein 2 Mục lục PHẦN I CÔNG NGHỆ ENZYME 3 Chương 1 Những khái niệm cơ bản về enzyme 7 1.1. Định nghĩa enzyme 7 1.2. Thành phần cấu tạo của enzyme 7 1.3. Trung tâm hoạt động của enzyme 14 1.3.1. Trung tâm hoạt động của enzyme đơn cấu tử 7 1.3.2. Trung tâm hoạt động của enzyme đa cấu tử 8 1.3.3. Vai trò của các nhóm trung tâm hoạt động 9 1.3.4. Sự tạo thành trung tâm hoạt động 12 1.4. Tính đặc hiệu của enzyme 16 1.4.1. Khái niệm chung 7 1.4.2. Các hình thức đặc hiệu 8 1.4.2.1 Đặc hiệu kiểu phản ứng 9 1.4.2.2 Đặc hiệu cơ chất 12 1.5. Cơ chế tác dụng của enzyme 17 Chương 2 Động học enzyme 19 2.1. Ý nghĩa của việc nghiên cứu động học enzyme 19 2.2. Động học các phản ứng enzyme 21
3. Công nghệ Enzyme – Protein 3 2.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme 21 2.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất 26 2.2.3. Ảnh hưởng của chất kìm hãm 28 2.2.3.1 Các chất kìm hãm không thuận nghịch 9 2.2.3.2 Các chất kìm hãm thuận nghịch 12 2.2.4. Ảnh hưởng của chất hoạt hóa 38 2.2.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ 39 2.2.6. Ảnh hưởng của pH 38 Chương 3 Cách gọi tên và phân loại enzyme 44 3.1. Cách gọi tên enzyme 44 3.2. Phân loại enzyme 44 3.2.1. Các lớp enzyme 44 3.2.2. Các phản ứng enzyme 46 3.2.2.1 Lớp enzyme oxydoreductase 51 3.2.2.2 Lớp enzyme transferase 51 3.2.2.3 Lớp enzyme hydrolase 3.2.2.4 Lớp enzyme lyase 3.2.2.5 Lớp enzyme isomerase 3.2.2.6 Lớp enzyme ligase Chương 4 Phương pháp nghiên cứu enzyme 52 4.1. Những nguyên tắc chung khi nghiên cứu enzyme 52 4.2. Tách và làm sạch (tinh chế) enzyme 53 4.2.1. Nguồn nguyên liệu 38 4.2.1.1 Nguồn thực vật
4. Công nghệ Enzyme – Protein 4 4.2.1.2 Nguồn động vật 4.2.1.3 Nguồn vi sinh vật 4.2.2. Thu hồi chế phẩm enzyme 39 4.3. Hoạt độ enzyme 54 4.3.1. Phương pháp xác định hoạt độ enzyme 56 4.3.2. Đơn vị hoạt độ enzyme 57 Chương 5 Sinh học enzyme 64 5.1. Điều hòa hoạt tính enzyme 64 5.2. Điều hòa sinh tổng hợp enzyme 64 5.2.1. Điều hòa theo kiểu đóng mở gen tác động 64 5.2.2. Điều hòa tương tác giữa RNA – polymerase với gen 64 promotor Chương 6 Công nghệ enzyme và ứng dụng 69 6.1. Công nghệ enzyme 69 6.1.1. Enzyme với công nghệ sinh học 111 6.1.2. Enzyme không tan 112 6.2. Ứng dụng 69 6.2.1. Ứng dụng trong y dược 111 6.2.2. Ứng dụng trong hóa học 112 6.2.3. Ứng dụng trong công nghiệp 113 6.2.4. Ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm 111 6.2.5. Ứng dụng trong công nghiệp dệt 112 6.2.6. Ứng dụng trong công nghiệp thuộc da 113 6.2.7. Ứng dụng trong nông nghiệp
5. Công nghệ Enzyme – Protein 5 Chương 1 NHỮNG KHÁI NIỆM CƠ BẢN VỀ ENZYME 1.1. Định nghĩa enzyme Trong các phản ứng hóa học, nếu ta cho thêm vào phản ứng một chất nào đó phản ứng sẽ xảy ra với tốc độ tăng hàng chục lần. Chất cho thêm vào này được gọi là chất xúc tác. Trong các phản ứng sinh học (các phản ứng xảy ra trong cơ thể sinh vật) cũng có chất làm tăng các phản ứng, chất đó được gọi là enzyme. Enzyme được các cơ thể sinh vật sinh tổng hợp nên và tham gia các phản ứng hóa học trong cơ thể. Enzyme là một chất hữu cơ, trong khi đó các chất xúc tác hóa học thường là chất vô cơ. Sau này, các nhà khoa học xác định chúng là protein. Như vậy enzyme là một protein có khả năng tham gia xúc tác các phản ứng hóa học trong và ngoài cơ thể. Ưu điểm cơ bản của enzyme khi tham gia các phản ứng sinh hóa có thể tóm tắt như sau: - Enzyme có thể tham gia hàng loạt các phản ứng trong chuỗi phản ứng sinh hóa để giải phóng hoàn toàn năng lượng hóa học có trong vật chất.
6. Công nghệ Enzyme – Protein 6 - Enzyme có thể tham gia những phản ứng độc lập nhờ khả năng chuyển hóa rất cao. - Enzyme có thể tạo ra những phản ứng dây chuyền. Khi đó sản phẩm phản ứng đầu sẽ là nguyên liệu hay cơ chất cho những phản ứng tiếp theo. - Trong các phản ứng enzyme, sự tiêu hao năng lượng thường rất ít. - Enzyme luôn luôn được tổng hợp trong tế bào của sinh vật. Số lượng enzyme được tổng hợp rất lớn và luôn luôn tương ứng với số lượng các phản ứng xảy ra trong cơ thể. Các phản ứng xảy ra trong cơ thể luôn luôn có sự tham gia xúc tác bởi enzyme. - Có nhiều enzyme không bị mất đi sau phản ứng. Enzyme học là khoa học nghiên cứu những chất xúc tác sinh học có bản chất protein. Hay nói cách khác, enzyme học là khoa học nghiên cứu những tính chất chung, điều kiện, cơ chế tác dụng và tính đặc hiệu của các enzyme. 1.2. Thành phần cấu tạo của enzyme Enzyme là những protein có phân tử lượng từ 20.000 đến 1.000.000 dalton (có kích thước nhỏ nhất là Ribonuclease 12.700 dalton) Enzyme được cấu tạo từ các L – α – axitamin kết hợp với nhau bởi liên kết peptit. Dưới tác dụng của các peptithydrolase, axit hoặc kiềm các enzyme bị thủy phân hoàn toàn tạo thành các L – α – axitamin. Trong nhiều truờng hợp ngoài axit amin còn thu được những thành phần khác, người ta chia thành hai nhóm:  Nhóm enzyme đơn cấu tử (enzym đơn giản): enzyme chỉ được cấu tạo một thành phần hóa học duy nhất là protein.  Nhóm enzyme đa cấu tử (enzym phức tạp): enzyme có hai thành phần: - Phần protein được gọi là feron hay apoenzyme. Apoenzyme thường quyết định tính đặc hiệu cao của enzyme và làm tăng hoạt tính xúc tác của coenzyme. - Phần không phải protein gọi là nhóm ngoại “agon”: như ion kim loại, vitamin, glutation dạng khử, nucleotide và dẫn xuất este phosphat của monosacaride, Trường hợp khi nhóm ngoại tách khỏi phần “apoenzyme” (khi cho thẩm tích qua màng bán thấm) và có thể tồn tại độc lập thì những agon đó còn có tên riêng là coenzyme. Phần agon quyết định kiểu phản ứng mà enzyme xúc tác, trực
7. Công nghệ Enzyme – Protein 7 tiếp tham gia trong phản ứng và làm tăng độ bền của apoenzyme đối với các yếu tố gây biến tính. Đa số enzyme thuộc loại enzyme đa cấu tử. Hiện nay người ta cũng đã xác định được rằng phần lớn các enzyme trong tế bào là những protein có cấu trúc bậc bốn. Ở những điều kiện xác định, phân tử của chúng có thể phân ly thuận nghịch tạo thành các phần dưới đơn vị (protome), khi đó hoạt độ enzyme bị giảm hoặc bị mất hoàn toàn. Ở những điều kiện thích hợp các phần dưới đơn vị lại có thể kết hợp lại với nhau và hoạt độ xúc tác của enzyme được phục hồi. 1.3. Trung tâm hoạt động của enzyme Trong quá trình xúc tác, chỉ một phần rất nhỏ của phân tử enzyme tham gia kết hợp đặc hiệu với cơ chất, phần đó được gọi là trung tâm hoạt động của enzyme. Trung tâm của enzyme được tạo nên do một số axit amin đảm trách. Các axit amin khác trong protein không tham gia gắn với cơ chất mà chỉ làm nhiệm vụ như một chiếc khung cấu trúc không gian của chiếc khung đó. 1.3.1. Trung tâm hoạt động của enzyme đơn cấu tử Trung tâm hoạt động của các enzyme đơn cấu tử thường bao gồm một tổ hợp các nhóm định chức của axit amin không tham gia tạo thành trục chính của sợi polypeptit. Các nhóm chức của axit amin thường gặp trong trung tâm hoạt động của enzyme là: - Nhóm SH (sunfidryl) của Cysteine - Nhóm  - NH2 (amin) của Lysine - Nhóm OH (Hydroxyl) của Serine, Threonine và Tyrosine - Nhóm COOH (Cacboxyl) của axit Glutamic, Aspactic - Vòng imidazol của Histidine - Vòng indol của Tryptophan - Nhóm guanilic của Acginine Khi tạo thành trung tâm hoạt động các nhóm này phải ở vị trí gần nhau và được định hướng trong không gian sao
8. Công nghệ Enzyme – Protein 8 cho chúng có thể tương tác với nhau trong quá trình phản ứng. Ví dụ, Trung tâm hoạt động của Colinesteraza bao gồm các nhóm: -OH của serine, tyrosine, -COOH của glutamic, imidazolit của histidine. Hình 1.1 : Trung tâm hoạt động của enzym colinesteraza Các trung tâm hoạt động có thể hình thành dễ dàng khi các nhóm chức ở gần nhau trên Apoenzyme. Nhưng có khi chúng ở xa nhau thì phải hoạt hóa bằng cách cắt đi một đoạn peptide nào đó, chúng xích lại gần nhau và tạo thành trung tâm hoạt động. Ví dụ, Tripxinogen là trạng thái không hoạt động, nhưng khi dưới tác dụng của enzyme Enterokinaza thì 6 axit amin bị loại ra, các nhóm chức lúc này xích lại gần và trung tâm hoạt động được dễ dàng. 1.3.2. Trung tâm hoạt động của enzyme đa cấu tử Trung tâm hoạt động của các enzyme đa cấu tử thường bao gồm nhóm ngoại (vitamin, ion kim loại ) và các nhóm định chức của các axit amin ở phần apoenzyme. Các kim loại thường gặp trong trung tâm hoạt động của enzyme là những kim loại hóa trị 2: Fe, Co, Mn, Zn, Cu các kim loại này có thể trực tiếp tham gia trong phản ứng xúc tác, liên kết bền với các phân tử enzyme. Enzyme bị mất hoạt động sau khi loại bỏ ion kim loại, tuy nhiên hoạt động có thể được phục hồi lại hoàn toàn ngay sau khi thêm ion kim loại vốn có trong phân tử của nó. Một số enzyme có thể được tái hoạt hóa dưới tác dụng của các ion kim loại khác. Tuy nhiên sự thay thế này thường làm thay đổi hoạt độ và tính đặc hiệu của enzyme. 1.3.3. Vai trò của các nhóm trung tâm hoạt động Dựa vào vai trò của trung tâm hoạt động các nhóm chức năng có thể phân thành các nhóm sau đây: - Các nhóm xúc tác: là những nhóm trực tiếp tham gia trong phản ứng kết hợp với phần phân tử cơ chất bị chuyển hóa, kết hợp với cofacto. - Các nhóm tiếp xúc: kết hợp với phần cơ chất không bị chuyển hóa có vai trò tương tự dây neo buộc cơ chất lại.
9. Công nghệ Enzyme – Protein 9 - Các gốc cấu tạo hay cố định: không trực tiếp kết hợp với cơ chất, nhưng tương tác với các nhóm xúc tác và tiếp xúc, cố định các gốc này trong những vị trí không gian nhất định và giữ chúng ở trạng thái hoạt động xúc tác. Sự liên hệ giữa trung tâm hoạt động với phần còn lại của cơ chất được thực hiện qua gốc này. 1.3.4. Sự tạo thành trung tâm hoạt động Theo quan niệm của Fisher thì trung tâm hoạt động của enzyme vốn có cấu trúc không gian tương ứng với cấu trúc của phân tử cơ chất cũng giống như ổ khóa tương ứng với chìa khóa. (Hình a) Hình 1.2 Mô hình Fisher (a) và mô hình Koshland (b) Từ đó có thể suy ra rằng enzyme có hình thể tương đối vững chắc, cố định, kết hợp với cơ chất như một khuôn nào đó. Tuy nhiên dần dần người ta thấy quan niệm của Fisher đã không giải thích thỏa đáng được nhiều dẫn liệu thực nghiệm. Đến năm 1958, Kosland đã đề ra thuyết “tương ứng cảm ứng” cho rằng phân tử enzyme cũng như trung tâm hoạt động của nó không có cấu tạo rắn chắc mà có tính mềm dẻo, cấu hình không gian của nó có thể thay đổi khi tiếp xúc với cơ chất Theo Kosland thì trong phân tử enzyme có sẵn các nhóm định chức của trung tâm hoạt động nhưng chúng chưa được sắp xếp ở dạng thích hợp cho hoạt động xúc tác. Khi tương tác với cơ chất, các nhóm định chức ở phần trung tâm hoạt động của phân tử enzyme sẽ thay đổi vị trí không gian tạo thành hình thể khớp với hình thể cơ chất (Hình b). Trong trường hợp này cơ chất và enzyme có sự tương tác yếu. Do đó, chúng rất dễ bị cắt đứt trong quá trình phản ứng để giải phóng enzyme và sản phẩm phản ứng.
10. Công nghệ Enzyme – Protein 10 Các chất có cùng kiểu cấu trúc với cơ chất thực nhưng có sự thay đổi ở một phần nào đó trong phân tử có thể vẫn kết hợp với enzyme nhưng tạo thành phức chất không hoạt động vì các nhóm định chức của trung tâm hoạt động không được định hướng đúng đắn. Ở những enzyme alosteric (enzym dị lập thể, enzym điều hòa) còn có trung tâm dị lập thể (trung tâm điều hòa). Các trung tâm này có khả năng tương tác với cơ chất khác. Các cơ chất tương tác với trung tâm này gọi là chất điều hòa alosteric. Khi trung tâm điều hòa này tương tác với chất điều hòa alosteric sẽ làm thay đổi cấu trúc không gian của trung tâm hoạt động. Do đó hoạt tính xúc tác của enzyme sẽ bị thay đổi theo. Nếu quá trình này làm tăng hoạt tính của enzyme thì chất điều hòa alosteric này gọi là chất điều hòa dương. Ngược lại, nếu quá trình này làm giảm hoạt tính của enzyme thì chất điều hòa alosteric này gọi là chất điều hòa âm. Chất điều hòa này hoàn toàn không bị biến đổi khi chúng tương tác với enzyme. 1.4. Tính đặc hiệu của enzyme 1.4.1. Khái niệm chung Tính đặc hiệu cao của enzyme là một trong những khác biệt chủ yếu giữa enzyme với các chất xúc tác khác. Mỗi enzyme chỉ có khả năng xúc tác cho sự chuyển hóa một hay một số chất nhất định theo một kiểu phản ứng nhất định. Sự tác dụng có tính lựa chọn cao này gọi là tính đặc hiệu hoặc tính chuyên hóa của enzyme. 1.4.2. Các hình thức đặc hiệu Có thể phân biệt hai kiểu đặc hiệu: đặc hiệu kiểu phản ứng và đặc hiệu cơ chất. 1.4.2.1 Đặc hiệu kiểu phản ứng Đặc hiệu này thể hiện ở chỗ mỗi enzyme chỉ có thể xúc tác cho một trong các kiểu phản ứng chuyển hóa một chất nhất định. Ví dụ, amino axit có khả năng xảy ra phản ứng khử carboxyl, phản ứng khử amin bằng cách oxy hóa và phản ứng vận chuyển nhóm amin, vì vậy mỗi phản ứng ấy cần có một enzyme đặc hiệu tương ứng xúc tác theo thứ tự là decarboxylase, aminoacid oxydase và aminotransferase.
11. Công nghệ Enzyme – Protein 11 1.4.2.2 Đặc hiệu cơ chất Mỗi một cơ chất có một loại enzyme tương tác tương ứng. Các enzyme có thể phân biệt được những cơ chất mà nó sẽ tác dụng. Mức độ đặc hiệu của các enzyme không giống nhau, người ta thường phân biệt thành các mức sau:  Đặc hiệu tuyệt đối Enzyme chỉ tác dụng trên một cơ chất nhất định và hầu như không có tác dụng với chất nào khác. Ví dụ, urease hầu như chỉ tác dụng với ure, thủy phân nó thành khí cacbonic và amoniac: Tuy nhiên, ure cũng tác dụng được với các chất khác có cấu trúc gần giống ure (hydroxyure) nhưng với vận tốc bé hơn 120 lần. Các enzyme khác như arginase, glucooxydase cũng thuộc loại có tính đặc hiệu tuyệt đối, vì arginase chỉ xúc tác thủy phân L- arginin tạo thành L-ornitin và ure mà không tác dụng lên este metylic của arginin. Những enzym có tính đặc hiệu tuyệt đối thường được dùng để định lượng chính xác cơ chất của nó.  Đặc hiệu nhóm tương đối Enzyme có khả năng tác dụng lên một kiểu liên kết hóa học nhất định trong phân tử cơ chất mà không phụ thuộc vào cấu tạo của các phần tham gia tạo thành mối liên kết đó. Ví dụ, lipase có khả năng thủy phân được tất cả các mối liên kết este. Aminopeptidase có thể xúc tác thủy phân nhiều peptide  Đặc hiệu nhóm Enzyme có khả năng tác dụng lên một kiểu liên kết hóa học nhất định với điều kiện một trong hai phần tham gia tạo thành liên kết phải có cấu tạo xác định
12. Công nghệ Enzyme – Protein 12 Ví dụ, cacboxypeptidaza có khả năng phân cắt liên kết peptide gần nhóm cacb cacboxypeptidaza oxyl R – C – N – CH - COOH RCOOH + H2N – CH - COOH tự O H R’ R’ do.  Đặc hiệu quang học (đặc hiệu lập thể) Enzyme chỉ tác dụng với một trong hai dạng đồng phân quang học của các chất. Ví dụ, phản ứng khử nước của axit malic để tạo thành axit fumaric dưới tác dụng của fumarathydratase chỉ xảy ra đối với axit L - malic mà không tác dụng lên D - malic axit Enzyme cũng thể hiện tính đặc hiệu lên một dạng đồng phân hình học cis hoặc trans. Ví dụ, enzyme fumarathydratase chỉ tác dụng lên dạng trans của axit fumaric mà không tác dụng lên dạng cis để tạo thành axit L – malic Trong tự nhiên cũng có các enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển hóa tương hổ giữa các cặp đồng phân không gian tương ứng. Ví dụ, lactatracemase của vi khuẩn xúc tác cho phản ứng chuyển hóa lẫn nhau giữa axit D - và L – lactic, aldo - 1 - epimerase xúc tác cho phản ứng đồng phân hóa - D - glucose thành  - D – Glucose, v.v Các enzyme này có vai trò quan trọng
13. Công nghệ Enzyme – Protein 13 khi sản xuất các chất dinh dưỡng bằng phương pháp hóa học, vì chúng có thể chuyển các chất từ dạng cơ thể không thể sử dụng được thành dạng có thể hấp thụ. Enzyme còn có khả năng phân biệt được 2 gốc đối xứng trong phân tử giống nhau hoàn toàn về mặt hóa học. Ví dụ, hai nhóm - CH2OH trong phân tử glycerin, glycerophosphatkinase xúc tác cho phản ứng chuyển vị gốc phosphate từ ATP đến C3 của glycerin (chứ không phải C1). 1.5. Cơ chế tác dụng của enzyme Trong phản ứng có sự xúc tác của enzyme, nhờ sự tạo thành phức hợp trung gian enzyme cơ chất mà cơ chất được hoạt hóa. Khi cơ chất kết hợp vào enzyme, do kết quả của sự cực hóa, sự chuyển dịch của các electron và sự biến dạng của các liên kết tham gia trực tiếp vào phản ứng dẫn tới làm thay đổi động năng cũng như thế năng, kết quả là làm cho phân tử cơ chất trở nên hoạt động hơn, nhờ đó tham gia phản ứng dễ dàng. Năng lượng hoạt hóa khi có xúc tác enzyme không những nhỏ hơn rất nhiều so với trường hợp không có xúc tác mà cũng nhỏ hơn so với cả trường hợp có chất xúc tác thông thường. Ví dụ, trong phản ứng phân hủy H 2O2 thành H2O và O2 nếu không có chất xúc tác thì năng lượng hoạt hóa là 18 Kcal/mol, nếu có chất xúc tác là platin thì năng lượng hoạt hóa là 11,7 Kcal/mol, còn nếu có enzyme catalase xúc tác thì năng lượng hoạt hóa chỉ còn 5,5 Kcal/mol. Sự tạo thành phức hợp enzyme cơ chất và sự biến đổi phức hợp này thành sản phẩm, giải phóng enzyme tự do thường trải qua ba giai đoạn theo sơ đồ sau: E + S ES P + E Trong đó E là enzyme, S là cơ chất (Substrate), ES là phức hợp enzyme - cơ chất, P là sản phẩm (Product)
14. Công nghệ Enzyme – Protein 14 - Giai đoạn thứ nhất: enzyme kết hợp với cơ chất bằng liên kết yếu tạo thành phức hợp enzyme - cơ chất (ES) không bền, phản ứng này xảy ra rất nhanh và đòi hỏi năng lượng hoạt hóa thấp; - Giai đoạn thứ hai: xảy ra sự biến đổi cơ chất dẫn tới sự kéo căng và phá vỡ các liên kết đồng hóa trị tham gia phản ứng; - Giai đoạn thứ ba: tạo thành sản phẩm, còn enzyme được giải phóng ra dưới dạng tự do. Các loại liên kết chủ yếu được tạo thành giữa E và S trong phức hợp ES là các tương tác: - Tương tác tĩnh điện (liên kết ion, liên kết muối, cầu muối, cặp ion): Liên kết này được tạo thành giữa nhóm tích điện của cơ chất (S) với nhóm tích điện trai sdaaus trong phân tử enzym (E). - Liên kết hydro: Liên kết này được tạo thành theo kiểu A – H B, trong đó hydro kết hợp với A bằng liên kết cộng hóa trị, đồng thời tạo liên kết yếu với B. Liên kết này được tạo thành khi khoảng cách giữa A và B là 3A0 . - Tương tác VanderWaals: Tương tác này yếu hơn tương tác tĩnh điện và liên kết hydro. Tương tác này thể hiện rất rõ khi nhiều nguyên tử của cơ chất có thể đồng thời tiếp cận với nhiều nguyên tử của enzym. Nó chỉ xảy ra khi có sự ăn khớp về cấu trúc không gian giữa cơ chất và enzym. Mỗi loại liên kết đòi hỏi những điều kiện khác nhau và chịu ảnh hưởng khác nhau khi có nước. Chương 2 ĐỘNG HỌC ENZYME 2.1. Ý nghĩa của việc nghiên cứu động học enzyme Nghiên cứu động học enzyme là nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố nồng độ cơ chất, enzyme, pH môi trường, nhiệt độ, các chất kìm hãm đến tốc độ phản ứng do enzyme xúc tác. Việc nghiên cứu động học enzyme sẽ cho ta biết được các vấn đề sau đây: - Có thể biết được cơ chế phân tử của sự tác động của enzyme. - Cho phép ta hiểu biết được mối quan hệ về mặt lượng của quá trình enzyme.
15. Công nghệ Enzyme – Protein 15 - Thấy được vai trò quan trọng cả về mặt lý luận lẫn thực tiễn: khi lựa chọn các đơn vị hoạt động enzyme người ta cần phải biết những điều kiện tốt nhất đối với hoạt động của enzyme, cũng như cần phải biết được các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của chúng. - Là điều kiện cần thiết để thực hiện tốt các bước tinh chế enzyme, vì người ta cần phải kiểm tra về mặt lượng bằng cách xác định có hệ thống hoạt động của chế phẩm enzyme trong các giai đoạn tinh chế. 2.2. Động học các phản ứng enzyme 2.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme Trong điều kiện thừa cơ chất, nghĩa là [S] >>[E] thì vận tốc phản ứng phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ enzyme. Đường biểu diễn có dạng: tốc độ phản ứng v= K[E] có dạng y=ax Khi thừa cơ chất thì khi nồng độ enzyme tăng vận tốc tăng. Khi nồng độ enzyme bão hòa với nồng độ cơ chất thì nồng độ enzyme tăng vận tốc không thay đổi. Hình 2.1. Sự phụ thuộc của vận tốc phản ứng vào [E] 2.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất [S] Giả sử phản ứng chỉ có một cơ chất S và tạo thành sản phẩm P, phản ứng xảy ra như sau: Gọi v1 là vận tốc của phản ứng tạo thành phức chất ES. Gọi v-1 là vận tốc của phản ứng phân ly phức chất ES tạo thành E và S. Gọi v2 là vận tốc của phản ứng tạo thành E và P Với k1, k -1, k2 là hằng số vận tốc của các phản ứng tương ứng
16. Công nghệ Enzyme – Protein 16 v1 = k1[E][S] v-1 = k -1[ES] v2 = k2[ES] Khi hệ thống đạt trạng thái cân bằng ta có: v1 = v-1 + v2 Hay k1[E][S] = k -1[ES] + k2[ES] k 1[E][S] = (k -1 + k2)[ES] (2) Gọi E0 là nồng độ enzym ban đầu: [E0] = [E] + [ES] => [E] = [E0] - [ES] (3) Thay trị số [E] từ (3) vào (2) ta có: (k -1 + k2)[ES] = k1([E0] - [ES])[S] k1 [E0] [S] [E0] [S] [ES] = = k -1 + k2 + k1[S] k -1 + k2 + [S] k1 Nếu đặt Km= k-1+k2/ k1 (Km: gọi là hằng số Michalis Menten) Ta có: [E0][S] [ES] = Km + [S] Mặt khác vận tốc phản ứng enzym còn được tính theo phản ứng tạo ra sản phẩm P: v = k2[ES] Thay [ES] bằng giá trị ở trên ta thu được: k2[E0][S] v = (4) Km + [S]
17. Công nghệ Enzyme – Protein 17 Qua đây ta thấy nồng độ enzyme càng cao thì vận tốc phản ứng enzyme càng lớn. Do đó vận tốc đạt cực đại khi toàn bộ enzyme liên kết với cơ chất, nghĩa là: Vmax = k2[E0] Thay vào phương trình (4) ta được: [S] v = Vmax (5) Km + [S] Phương trình (5) gọi là phương trình Michelis - Menten Km gọi là hằng số Michelis Menten đặc trưng cho mỗi enzyme. Km đặc trưng cho ái lực của enzyme với cơ chất, Km có trị số càng nhỏ thì ái lực của enzyme với cơ chất càng lớn, nghĩa là vận tốc của phản ứng do enzyme xúc tác càng lớn. Hình 2.2. Biến thiên vận tốc phản ứng theo nồng độ cơ chất Khi tăng [S] thì V phản ứng tăng, tăng [S] đến một giá trị nào đó thì V đạt đến giá trị Vmax và sẽ không tăng nữa nếu ta vẫn tiếp tục tăng [S]. Khi Km = [S] thì V0 =1/2 Vmax Để thuận tiện hơn Lineweaver và Burk (1934), trên cơ sở của phương trình (5) đã nghịch đảo để biến thành dạng đường thẳng y = ax+b, nó có ý nghĩa lớn đối với việc nghiên cứu kìm hãm enzyme.
18. Công nghệ Enzyme – Protein 18 Hình 2.3. Sự phụ thuộc của vận tốc phản ứng vào nồng độ cơ chất theo Lineweaver - Burk Tính chất phổ biến của phương trình Michelis – Menten thể hiện ở chỗ nó không chỉ dùng trong trường hợp đơn giản như đã nói ở trên (một cơ chất S tạo thành một sản phẩm P) mà nó cũng đúng trong những trường hợp phức tạp hơn, phản ứng gồm hai hay nhiều cơ chất tạo thành nhiều sản phẩm 2.2.3. Ảnh hưởng của chất kìm hãm (inhibitior) Chất kìm hãm là chất có khả năng làm giảm hoạt tính hoặc làm ngưng hoạt tính của enzyme. Nó có thể là những ion, các phân tử vô cơ, hữu cơ, và cả protein. Cơ chế kìm hãm của các chất kìm hãm có thể là thuận nghịch hoặc không thuận nghịch 2.2.3.1. Các chất kìm hãm không thuận nghịch Chất kìm hãm (I) kết hợp với enzyme (E) tạo thành phức chất Enzyme – chất kìm hãm (EI) theo phản ứng sau: K1 E + I EI K2 Nếu K2 = 0 phức chất EI hoàn toàn không phân ly. Sự kìm hãm ở đây là không thuận nghịch.
19. Công nghệ Enzyme – Protein 19 Dưới tác dụng của các chất kìm hãm không thuận nghịch, mức độ kìm hãm tăng theo thời gian tác dụng, nếu nồng độ chất kìm hãm đủ lớn để bão hòa enzyme thì cuối cùng phản ứng enzyme sẽ ngừng hoàn toàn. Hơn nữa khi loại bỏ chất kìm hãm hoạt tính của enzyme cũng không được phục hồi. 2.2.3.2. Các chất kìm hãm thuận nghịch Phản ứng giữa enzyme và chất kìm hãm sẽ nhanh chóng đạt được trạng thái cân bằng. Dưới tác dụng của chất kìm hãm thuận nghịch, hoạt tính của enzyme có thể được phục hồi sau khi loại bỏ chất kìm hãm. Các chất kìm hãm có thể tác dụng với enzyme theo các cách khác nhau:  Kìm hãm cạnh tranh (Competitive inhibition) Các chất kìm hãm cạnh tranh là những chất có cấu trúc tương tự cấu trúc của cơ chất. Do đó, chúng có khả năng kết hợp với trung tâm hoạt động của enzyme. Chúng chiếm vị trí của cơ chất trong trung tâm hoạt động, kết quả là enzym không thể kết hợp được với cơ chất để tạo thành phức ES. Ví dụ, Malonic (HOOC – CH2 – COOH) là chất kìm hãm cạnh tranh của enzyme succinatdehydrogenaza, vì nó cấu tạo gần giống với cơ chất succinic (HOOC – CH 2 – CH2 - COOH) Hình 2.4. Kiểu kìm hãm cạnh tranh (competitive inhibition) Khi cơ chất dư thừa, nồng độ chất kìm hãm thấp thì có thể loại bỏ tác dụng của chất kìm hãm, còn nồng độ cơ chất thấp và nồng độ chất kìm hãm cao thì lại có tác dụng kìm hãm hoàn toàn.
20. Công nghệ Enzyme – Protein 20 Hình 2.5. Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ cơ chất theo Lineweaver – Burk khi có kìm hãm cạnh tranh Như vậy ta thấy khi có sự cạnh tranh, hằng số K m sẽ tăng lên, do đó làm giảm ái lực của enzym và cơ chất Trường hợp đặc biệt của kìm hãm cạnh tranh là kìm hãm bằng sản phẩm và xảy ra khi một sản phẩm phản ứng tác dụng trở lại enzyme và choán vị trí hoạt động ở phân tử enzyme.  Kìm hãm phi cạnh tranh (Uncompetitive inhibition) Đặc trưng của kiểu kìm hãm này là chất kìm hãm chỉ kết hợp với phức chất ES mà không kết hợp với enzyme tự do.
21. Công nghệ Enzyme – Protein 21 Hình 2.6. Kiểu kìm hãm phi cạnh tranh Tác dụng kìm hãm không bị loại trừ khi tăng nồng độ cơ chất. Kiểu kìm hãm này thường gặp đối với phản ứng nhiều cơ chất trong đó có sự tạo thành nhiều phức chất trung gian khác nhau. Hình 2.7. Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ cơ chất theo Lineweaver – Burk khi có kìm hãm phi cạnh tranh  Kìm hãm hỗn tạp (Mixed inhibition) Chất kìm hãm kết hợp với enzyme ở chỗ khác với trung tâm hoạt động, làm thay đổi dạng không gian của phân tử enzyme theo hướng không có lợi cho hoạt động xúc tác của nó, do đó làm giảm vận độ phản ứng. Vì vậy sau khi kết hợp với chất kìm hãm này, enzyme vẫn có thể tiếp tục kết hợp với cơ chất tạo thành phức chất. Hình 2.8. Kiểu kìm hãm hỗn tạp
22. Công nghệ Enzyme – Protein 22 Ngoài ra, chất kìm hãm không những kết hợp với enzyme tự do mà còn kết hợp với cả phức hợp ES tạo thành phức hợp EIS không tạo được sản phẩm P. Mức độ kìm hãm chỉ phụ thuộc vào nồng độ chất kìm hãm mà không phụ thuộc vào nồng độ cơ chất. Tốc độ cực đại đo được khi không có mặt chất kìm hãm là cao hơn khi có mặt chất kìm hãm. Giá trị Km thay đổi không giống như trong trường hợp cạnh tranh. Tương tự như trên ta có phương trình : Hình 2.9. Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ cơ chất theo Lineweaver – Burk khi có kìm hãm hỗn tạp Các giá trị , ’ được định nghĩa như trên. Trường hợp = ’ gọi là kìm hãm không cạnh tranh (noncompetitive).
23. Công nghệ Enzyme – Protein 23 Hình 2.10. Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ cơ chất theo Lineweaver – Burk khi có kìm hãm không cạnh tranh Bảng 2.1. Ảnh hưởng của kiểu kìm hãm lên Vmax và Km Trường hợp kìm hãm enzyme bằng nồng độ cao của cơ chất gọi là “kìm hãm cơ chất” như kìm hãm urease khi nồng độ ure cao. Nguyên nhân của những hiện tượng này còn chưa được biết rõ. Đó có thể là: - Tồn tại nhiều trung tâm kết hợp với cơ chất bằng các ái lực khác nhau. Khi nồng độ cơ chất thấp thì enzyme có thể chỉ kết hợp với một phân tử cơ chất, còn khi ở nồng độ cơ chất cao nó kết hợp với nhiều cơ chất dẫn đến hình thành phức hợp ES không hoạt động. - Cơ chất cũng có thể được kết hợp nhờ những vị trí đặc biệt của enzyme. Đó là một nhóm enzyme quan trọng (enzyme dị lập thể) bên cạnh trung tâm xúc tác còn có trung tâm điểu chỉnh. - Cơ chất có thể kết hợp với một chất hoạt hóa và bằng cách này nó tách khỏi E - Cơ chất có thể choán chổ (ngăn cản) một cofactor hay một coenzyme.
24. Công nghệ Enzyme – Protein 24 - Cơ chất có thể ảnh hưởng đến ion lực của môi trường và qua đó làm mất đi tính chuyên hóa của enzyme. 2.2.4. Ảnh hưởng của chất hoạt hóa (activator) Là chất làm tăng khả năng xúc tác của enzyme, thường có bản chất hóa học khác nhau có thể là các anion, các ion kim loại nằm ở ô thứ 11 đến ô thứ 55 của Bảng tuần hoàn Mendeleev, các chất hữu cơ có cấu trúc hóa học khác nhau như các vitamin tan trong nước. Ví dụ, Tác dụng của anion clo, brom, iot đến hoạt độ của α – amilaza động vật; tác dụng của một số ion kim loại như Mn2+, Zn+, đối với hoạt độ của các proteaza. Tuy nhiên tác dụng hoạt hóa chỉ giới hạn ở những nồng độ xác định, vượt quá giới hạn này có thể làm giảm hoạt tính enzyme. 2.2.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ Theo quy luật của các phản ứng hóa học thông thường, vận tốc phản ứng enzyme càng tăng khi nhiệt độ tăng, nhưng vì enzyme có bản chất là protein do đó khi tăng nhiệt độ tới một giới hạn nào đó thì vận tốc phản ứng enzyme sẽ bị giảm do sự biến tính của protein. Nhiệt độ ứng với vận tốc cực đại gọi là nhiệt độ tối thích, thường ở trong khoảng từ 40-600C. Tuy nhiên, mỗi enzyme có một nhiệt độ tối thích khác nhau, nó phụ thuộc vào nhiều yếu tố như nguồn enzyme, cơ chất, pH môi trường, thời gian phản ứng Nhiệt độ mà enzyme bị mất hoàn toàn hoạt tính xúc tác gọi là nhiệt tới hạn thường vào khoảng 700C. Ở nhiệt độ tới hạn enzyme bị biến tính, ít ki có khả năng phục hồi. Ngược lại, ở nhiệt độ dưới 0 0C hoạt tính của enzyme tuy bị giảm nhưng lại có thể tăng lên khi đưa về nhiệt độ bình thường.
25. Công nghệ Enzyme – Protein 25 Hình 2.11. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến vận tốc phản ứng enzym 2.2.6. Ảnh hưởng của pH pH có ảnh hưởng lớn tới vận tốc phản ứng enzyme, mỗi enzyme chỉ hoạt động thích hợp nhất ở một pH xác định gọi là pH tối thích của enzyme. Ví dụ, pH opt của tripxin là 5-9; của Pepxin là 1,8-2,2 Cùng một loại enzyme nhưng thu từ các nguồn khác nhau cũng có pH tối thích khác nhau. Hình 2.12. Ảnh hưởng pH đến vận tốc phản ứng enzym pH có ảnh hưởng rất lớn đến trạng thái ion hóa của các nhóm chức trong trung tâm hoạt động của enzyme, trạng thái ion hóa của cơ chất và phức chất ES. Ngoài các yếu tố chính đã nêu trên, hoạt tính của enzyme còn phụ thuộc vào những yếu tố khác: ánh sáng (đặc biệt là tia tử ngoại), sóng siêu âm, tia bức xạ, Trong hệ thống sống, hoạt tính enzyme còn phụ thuộc vào giai đoạn sinh trưởng phát triển.
26. Công nghệ Enzyme – Protein 26 Chương 3 Cách gọi tên và phân loại enzyme 3.1. Cách gọi tên enzyme Theo qui ước quốc tế - tên gọi hệ thống của enzyme thường gồm hai phần: - Phần thứ nhất chỉ tên cơ chất (nếu có nhiều cơ chất thì tên các cơ chất cách nhau bằng dấu hai chấm) - Phần thứ hai chỉ tên kiểu phản ứng mà enzyme xúc tác, cộng thêm đuôi “ase” hoặc “aza”. Hai phần trên cách nhau bằng một dấu nối ngang. Ví dụ, tên enzyme xúc tác sự oxy hóa glycolat thành axit glyoxylic có tên là: glycolat:oxy-oxydoreductase. Nếu phản ứng bao gồm hai sự chuyển hóa tương hỗ thì ngườ ta còn thêm sau phâng thứ hai của tên gọi một phần tương ứng trong dấu ngoặc. Ví dụ, enzyme xúc tác oxy hóa axit amin trong phản ứng: COOH COOH H2N CH + O2 C = O + NH3 + H2O R R L - axitamin có tên gọi là L – axitamin : oxydoreductase (deamin) Ngoài ra hiện nay còn dùng tên thông dụng như amilase, papain, pepsin, Ví dụ enzyme xúc tác cho sự thủy phân ure (carbamid) có: có tên hệ thống là: Carbamid – amidohydrodase, tên thông dụng: urease 3.2. Phân loại enzyme 3.2.1 Các lớp enzyme
27. Công nghệ Enzyme – Protein 27 Dựa vào tính đặc hiệu phản ứng của enzyme, Hội hóa sinh quốc tế (IUB) đã thống nhất phân loại enzyme thành sáu lớp, đánh số từ 1 đến 6. Các số thứ tự này là cố định cho mỗi lớp. 1. Oxydoreductase: Các enzyme xúc tác cho phản ứng oxy hóa - khử, gồm các nhóm enzyme: dehydrogenase, reductase, oxydase, oxygenase, peroxydase, catalase, Trong các phản ứng do chúng xúc tác xảy ta sự vận chuyển hydrogen, sự chuyển electron, sự oxy hóa bởi oxy phân tử, bởi hydrogen peroxide hoặc bởi các chất oxy hóa khác. 2. Transferase: Các enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển gốc, chuyển nhóm hóa học từ chất này sang chất khác. Ví dụ, enzym acyltransferase, glucosyltransferase, aminotransferase, phosphattransferase, cacboxytransferase. 3. Hydrolase: Các enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân các hợp chất hữu cơ như: amylase, protease, peptidase, lipase. 4. Lyase: Các enzyme xúc tác cho phản ứng phân cắt một nhóm nào đó ra khỏi hợp chất mà không cần nước, hoặc loại nước của phân tử tạo thành nối đôi, hoặc kết hợp nước vào nối đôi. Ví dụ, hydratase, aldolase, decarboxylase. 5. Isomerase: Các enzyme xúc tác cho phản ứng biến đổi lẫn nhau của các loại đồng phân hóa hình học, quang học (izomerase) và chuyển vị nội phân (mutase) Ví dụ, phospho-glyxerat mutase, glucosophosphate isomerase (chuyển hóa aldose thành xetose), 6. Ligase (synthetase) Các enzyme xúc tác cho phản ứng tổng hợp chất hữu cơ nhờ năng lượng từ các hợp chất cao năng. Ví dụ, glutamin synthetase
28. Công nghệ Enzyme – Protein 28 Mỗi lớp lại chia thành nhiều tổ. Mỗi tổ lại chia thành nhiều nhóm. Do đó, trong bảng phân loại đứng trước tên enzym thường có bốn con số: + số thứ nhất chỉ lớp + số thứ hai chỉ tổ + số thứ ba chỉ nhóm + số thứ tư chỉ rõ số bậc thứ tự của enzyme Ví dụ, enzyme xúc tác cho phản ứng: Ethanol + NAD+ acetaldehyde + NADH + H+ có tên gọi là alcohol dehydrogenase (ADH), tên quốc tế theo khóa phân loại là: Alcohol: NAD oxydoreductase (EC 1.1.1.1), trong đó: - mã số 1 đầu tiên biểu thị tên lớp enzyme là oxydoreductase (lớp 1) - mã số 1 thứ hai biểu thị tổ 1: tác dụng lên nhóm CH - OH của các chất cho - mã số 1 thứ ba biểu thị nhóm 1: chất nhận là NAD hay NADP - mã số 1 cuối cùng chỉ số thứ tự của enzyme. Sau tên của enzyme là số của nó theo danh sách các enzyme do tiểu ban về enzyme đề ra (enzyme commission, EC). 3.2.2 Các phản ứng enzyme 3.2.2.1 Lớp enzyme oxydoreductase Lớp enzyme này gồm 14 lớp phụ, xúc tác cho các phản ứng oxy hóa khử. Phản ứng oxy hóa tương ứng với sự tách điện tử ra khỏi cơ chất, phản ứng khử là phản ứng thu nhận điện tử và thường đi kèm với nhau. Quá trình tổng quát có thể biểu thị như sau: Trong đó: +A Kh là cơ chất A ở dạng khử + Aox là cơ chất A ở dạng oxy hóa + e là điện tử, Box là cơ chất B ở dạng oxy hóa +B Kh là cơ chất B ở dạng khử.
29. Công nghệ Enzyme – Protein 29 Các enzyme thuộc lớp này là những enzyme 2 thành phần có các coenzyme như NAD+, NADP+, FMN, FAD, hem  Dehydrogenase: xúc tác cho phản ứng tách H trực tiếp từ cơ chất và chuyển đến NAD+, NADP+, FMN, FAD.  Oxydase: xúc tác cho quá trình chuyển điện tử đến oxy do đó hoạt hóa oxy làm cho nó có khả năng kết hợp với proton có trong môi trường.  Oxygenase: xúc tác cho phản ứng kết hợp trực tiếp oxy vào phân tử của hợp chất hữu cơ (thường là các chất có vòng thơm). Có thể phân biệt hai loại: oxygenase và hydroxylase + Oxygenase xúc tác cho phản ứng kết hợp toàn bộ phân tử oxy + Hydroxylase chỉ kết hợp một nửa phân tử oxy (thường ở dạng OH) vào hợp chất hữu cơ.  Peroxydase: các peroxydase điển hình và catalase có coenzyme là hem, xúc tác cho phản ứng oxy hóa các chất hữu cơ khi có H2O2. 3.2.2.2 Lớp enzyme transferase Lớp này gồm tám lớp phụ. Các enzyme lớp này cũng là những protein phức tạp, bản chất hóa học của các coenzyme rất khác nhau, tùy theo bản chất của nhóm được chuyển vị như các nhóm monocarbon, nhóm alkyl, nhóm glucosyl, các nhóm có phosphore, các nhóm chứa lưu huỳnh. Ví dụ: Trong đó: + A - R là cơ chất A có mang nhóm R + B - R là cơ chất B có mang nhóm R.  Acyltransferase: xúc tác cho phản ứng chuyển nhóm acyl thường là thông qua coenzyme A, tạo thành phức CoAS ~ acyl.  Glucosyltransferase: xúc tác cho phản ứng vận chuyển gốc đường (hexose, pentose) từ chất cho đến các chất nhận khác nhau, thường gặp nhất là nhóm OH của một gốc saccharide khác hoặc các gốc phosphate, nguyên tử N của nhân vòng.
30. Công nghệ Enzyme – Protein 30  Aminotransferase: các enzyme này có coenzyme là pyridoxal phosphate xúc tác cho phản ứng chuyển vị nhóm amin. Các phản ứng quan trọng như chuyển thuận nghịch nhóm amin của amino acid đến - cetoacid.  Phosphotransferase: xúc tác cho phản ứng vận chuyển gốc phosphoryl thường có sự tham gia của ATP với ý nghĩa như một chất cho. Gốc phosphate được chuyển từ ATP (hoặc có thể là NTP) đến nhóm hydroxyl của alcol hoặc saccharide. Các enzyme này thường có tiếp vị ngữ “kinase”. Ví dụ, hexokinase xúc tác cho phản ứng sau: ATP + D – hexose = ADP + D – glucose – 6 - P 3.2.2.3 Lớp enzyme hydrolase Lớp enzyme này bao gồm 10 lớp phụ, xúc tác cho phản ứng thủy phân. Phản ứng này làm đứt liên kết đồng hóa trị giữa hai nguyên tử của cơ chất gắn các phần tử của phân tử H2O vào các hóa trị được tạo nên do sự đứt liên kết kể trên. Có thể được biểu thị như sau: Các phản ứng do enzyme lớp này xúc tác luôn có nước tham gia. Đặc điểm khác là các hydrolase thường không cần coenzyme cho hoạt động xúc tác của chúng.  Amylase: xúc tác cho quá trình thủy phân tinh bột, glycogen và các polysaccharide tương tự. Có 3 loại amylase khác nhau về tính đặc hiệu tác dụng đối với liên kết glucoside và một số tính chất khác. + - amylase phân giải các liên kết 1,4 - glucoside ở giữa chuỗi mạch polysaccharide, vì vậy cũng gọi là “endo - amylase” tạo thành các dextrin phân tử thấp. + - amylase xúc tác phản ứng thủy phân liên kết 1,4 - glucoside kể từ đầu không khử tạo thành chủ yếu là maltose và dextrin phân tử lớn. + Glucoamylase xúc tác cho phản ứng thủy phân các liên kết 1,4 - 1,6 - glucoside bắt đầu từ đầu không khử của chuỗi polysaccharide. Sản phẩm chủ yếu được tạo thành dưới tác dụng của enzyme này là glucose và dextrin.  Peptide hydrolase: xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết peptide tạo thành peptide phân tử thấp, axitamin. Các peptide hydrolase khác nhau có tính đặc hiệu
31. Công nghệ Enzyme – Protein 31 khác nhau đối với liên kết peptide. Một số enzyme phân giải các liên kết peptide ở giữa chuỗi mạch polypeptide gọi là endopeptide hydrolase hay proteinase (pepsine, trypsin, chimotrypsin ); một số khác lại thủy phân các liên kết ở đầu mút của chuỗi mạch, gọi là exopeptide hydrolase hay peptidase.  Lipase: xúc tác cho phản ứng thủy phân triacylglycerol (dầu thực vật, mỡ động vật) tạo thành các acid béo tự do và glycerol (thủy phân lần lượt từng liên kết este) 3.2.2.4 Lớp enzyme lyase Lớp enzyme này gồm 5 lớp phụ, tác động vào các liên kết C - C, C - O, C - N, C - S, C - Halogen. Có thể biểu thị như sau:  Pyruvat decarboxylase: xúc tác cho phản ứng loại CO2 khỏi phân tử axit pyruvic, tạo thành aldehyde tương ứng là acetaldehyde. Coenzyme của nó là thiamine pyrophosphase.  Fumarathydratase: xúc tác cho phản ứng tách thuận nghịch phân tử H 2O khỏi axit malic, tạo thành axit fumaric (có một nối đôi) 3.2.2.5 Lớp enzyme isomerase Lớp enzyme gồm 5 lớp phụ, trong quá trình này có sự sắp xếp lại trong phân tử cơ chất. Có thể biểu thị như sau:  UDP - glucose - 4 – epimerase: xúc tác cho sự chuyển hóa tương hỗ phức tạp giữa galactose và glucose, tức là làm xoay nhóm OH xung quanh nguyên tử carbon ở vị trí thứ tư của đường galactose. Enzyme có coenzyme NAD+, xúc tác cho phản ứng:
32. Công nghệ Enzyme – Protein 32 3.2.2.6 Lớp enzyme ligase Lớp enzyme này có 4 lớp phụ và chúng thường tạo nên các liên kết C - O, C - S, C - N, C - C. Các enzyme ligase xúc tác cho việc tạo thành aminoacyl - tRNA từ amino acid và tRNA ở giai đoạn đầu tiên trong sự sinh tổng hợp protein. Ngoài ra chúng còn xúc tác cho sự sinh tổng hợp amiono axit, tạo ra những dẫn chất acyl - CoA  Pyruvatcarboxylase: xúc tác cho phản ứng carboxyl hóa axit pyruvic acid tạo thành axit oxaloacetic. Enzyme này có chứa nhóm phụ là biotin, cần acetyl - CoA và Mg++ cho phản ứng xúc tác. Chương 4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ENZYME 4.1. Những nguyên tắc chung khi nghiên cứu enzyme Enzyme là những chất xúc tác sinh học có bản chất protein và rất không ổn định. Trong những điều kiện bất lợi, chúng không bền, dễ bị biến tính và mất hoạt độ. Do đó, khi nghiên cứu enzyme cần chú ý tránh những điều kiện sau: - Đa số enzyme hoạt động được ở vùng pH trung tính hoặc gần như trung tính (pH = 7 2). Vì vậy các yếu tố axit mạnh, kiềm mạnh dễ gây biến tính enzyme.
33. Công nghệ Enzyme – Protein 33 - Khi điều chỉnh pH của dung dịch đệm có chứa enzyme cần phải thêm từ từ và rất thận trọng các axit hoặc kiềm nên tiến hành ở 00C. - Những ion kim loại nặng như chì, đồng, thủy ngân và các điều kiện về nhiệt độ cao cũng thường làm mất hoạt độ enzyme. - Khi tách và làm sạch enzyme, cần tiến hành ở nhiệt độ thấp, thường từ 0 0C đến 50C. Đối với các enzyme không bền thì được tiến hành ở nhiệt độ thấp hơn (từ - 0 0 5 C đến - 20 C). Người ta hay sử dụng các hỗn hợp lạnh như nước đá với CO 2 hoặc nước đá với muối NaCl, hoặc thậm chí dùng cả hỗn hợp nước đá với axit sulfuric đậm đặc Bảng 4.1. Hỗn hợp làm lạnh Thành phần hỗn hợp Tỷ lệ Nhiệt độ đạt được Nước đá: muối 100:33 (3:1) - 21,30C 0 Nước đá: H2SO4 đậm 100: 25 - 20,0 C đặc (4:1) - Tránh tạo bọt vì nhiều enzyme bị biến tính (mất hoạt tính) ở mặt phân cách hai pha nước và khí. Do vậy, người ta thường rót dung dịch enzyme theo thành ống thủy tinh và không được lắc. - Khi cắt, thái, xay nhỏ các mẫu thực vật và động vật (lá cây, thịt, các cơ quan nội tạng ) không dùng các dụng cụ dao kéo, dụng cụ xay đã han rỉ để tránh tác dụng của các ion kim loại nặng như (Cu, Pb, Fe ) mà nên dùng dụng cụ inox. - Khi dùng các dung môi hữu cơ như aceton, alcol để kết tủa enzyme cần tiến hành ở nhiệt độ thấp. - Tách kết tủa enzyme bằng cách ly tâm lạnh tốt hơn lọc lạnh vì tiến hành nhanh hơn, và cần thực hiện thí nghiệm liên tục, không ngắt quãng để tránh giảm hoạt độ của enzyme. - Khi tiến hành xác định hoạt độ của các enzyme, nếu đã xác định trong khoảng nhiệt độ nào thì tất cả các thành phần của hỗn hợp phản ứng phải được giữ ở
34. Công nghệ Enzyme – Protein 34 nhiệt độ ấy (dùng máy ổn định nhiệt). Khi hỗn hợp phản ứng đã đạt được nhiệt độ cần thiết thì mới tiến hành đo và pH cần giữ ổn định, chính xác. - Để đảm bảo kết quả tin cậy, tránh sai số nhiều, phải lấy thật chính xác lượng dịch enzyme, thường dùng các loại micropipette. - Trong khi thí nghiệm cần chú ý tránh đánh rơi enzyme vào dung dịch nghiên cứu. Ví dụ, đang làm thí nghiệm với amylase chẳng hạn thì không nói chuyện nhiều. - Khi đã có chế phẩm enzyme, cần bảo quản chúng ở nhiệt độ thấp, giữ các kết tủa ở dạng huyền phù trong dung dịch ammoni sulphate bão hòa và lấy chế phẩm ra bằng cách ly tâm. - Sấy khô chế phẩm enzyme ở điều kiện chân không hoặc dùng phương pháp đông khô. 4.2. Tách và làm sạch (tinh chế) enzyme 4.2.1 Nguồn nguyên liệu Enzyme có trong tất cả các cơ thể động vật, thực vật và vi sinh vật. Một số nguyên liệu thường dùng làm nguồn nguyên liệu để tách enzyme như: 4.2.1.1 Nguồn thực vật Enzyme hay có mặt ở các cơ quan dự trữ như hạt, củ, quả, lá. Cơ quan dự trữ giàu chất gì thì nhiều enzyme chuyển hóa chất ấy. - Hạt thầu dầu (tách lipase) - Hạt đậu tương (tách enzyme urease). - Hạt lúa, thóc đại mạch nảy mầm (tách - amylase) - Củ khoai lang (tách  - amylase) - Nhựa đu đủ xanh (tách papain) - Các bộ phận (lá, thân, quả) cây dứa ( tách bromelain) - Dịch ép thân và lá cây Ficus (tách fixin) 4.2.1.2 Nguồn động vật Trong tất cả các nguyên liệu có nguồn gốc động vật thì tuyến tụy, màng nhầy dạ dày, tim, gan, lá lách dùng để tách enzyme rất thuận lợi. - Tụy tạng giàu enzyme nhất có thể dùng để tách trypsine, amylase, lipase, protease, ribonuclease và một số enzyme khác.
35. Công nghệ Enzyme – Protein 35 - Từ ngăn tư của dạ dày bê nghé có thể thu nhận chế phẩm renin để làm đông sữa trong sản xuất fomat. Người ta cũng sản xuất pepsin từ dạ dày động vật. Nhưng khác với pepsin, renin có khả năng đông tụ sữa cao mà không thủy phân sâu sắc casein. Renin là chế phẩm enzyme có giá trị lớn trong công nghiệp Nguyên liệu động vật dùng để tách enzyme phải tươi tốt lấy ngay sau khi động vật vùa bị giết chết hoặc bảo quản ở nhiệt độ 200C 4.2.1.3 Nguồn vi sinh vật Vi sinh vật thường dùng để sản xuất chế phẩm enzyme gồm nhiều loài thuộc Aspergillus, Bacillus, Penicillium, Clostridium, Streptomyces và một số loài nấm men. Trong các nguồn nguyên liệu, vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất để sản xuất enzyme ở quy mô lớn dùng trong công nghiệp. Dùng nguồn vi sinh vật có những lợi ích chính như sau: - Có thể chủ động về nguồn nguyên liệu. - Chu kỳ sinh trưởng của vi sinh vật ngắn (từ 16 - 100 giờ) do đó có thể thu hoạch hàng trăm lần trong năm. - Enzyme vi sinh vật có hoạt tính rất mạnh, vượt xa các sinh vật khác. Vì vậy chỉ cần một lượng nhỏ enzyme có thể chuyển hóa một lượng lớn cơ chất. - Có thể điều khiển sự tổng hợp enzyme dễ dàng hơn các nguồn nguyên liệu khác để tăng lượng enzyme được tổng hợp hoặc tổng hợp định hướng enzyme. - Giá thành thấp vì môi trường nuôi cấy vi sinh vật tương đối đơn giản, rẻ tiền, Tuy nhiên cần lưu ý một số vi sinh vật có khả năng sinh độc tố, vì vậy cần có biện pháp xử lý thích hợp. Để sản xuất các chế phẩm enzyme từ vi sinh vật bao gồm các giai đoạn chủ yếu sau: - Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống: người ta tiến hành phân lập từ môi trường nhiên hoặc gây đột biến bằng các phương pháp sinh học, lý, hóa học để tạo chủng có khả năng siêu tổng hợp enzyme. - Lựa chọn môi trường nuôi cấy vì thành phần môi trường dinh dưỡng có ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng và tổng hợp enzyme của vi sinh vật
36. Công nghệ Enzyme – Protein 36 - Nuôi cấy vi sinh vật: có hai phương pháp nuôi cấy khác nhau về nguyên tắc + Phương pháp nuôi cấy bề mặt: vi sinh vật phát triển và bao phủ trên bề mặt môi trường dinh dưỡng rắn, đã được làm ẩm và vô trùng. Chế phẩm thu được ở dạng rắn - thô. + Phương pháp nuôi cấy bề sâu: vi sinh vật phát triển trong môi trường lỏng có sục khí và khuấy đảo liên tục, thu được canh trường lỏng - dạng thô. - Tách và tinh chế enzyme: để thu chế phẩm tinh khiết 4.2.2 Thu hồi chế phẩm enzyme Enzyme có mặt trong mọi tế bào cơ thể sống. Các enzyme có thể tiết ra ngoài môi trường (enzyme ngoại bào) hoặc cư trú bên trong tế bào (enzyme nội bào)  Đối với enzyme nội bào: muốn chiết rút enzyme ra khỏi tế bào cần: - Phá vỡ cấu trúc tế bào bằng nhiều phương pháp như cơ học (nghiền với bột thủy tinh hoặc cát thạch anh, làm đồng hóa bằng thiết bị đồng hóa), dùng tác dụng của sóng siêu âm, của các dung môi hữu cơ (butanol, aceton, glycerin, ethyl acetate ) - Sau đó, enzyme được chiết bằng các dung môi khác nhau như nước cất, dung dịch đệm thích hợp, dung dịch muối trung tính - Trong dịch chiết, ngoài enzyme còn có các protein tạp và nhiều chất khác, để loại bỏ chúng phải sử dụng phối hợp nhiều biện pháp khác nhau. + Để loại bỏ muối khoáng và các tạp chất có phân tử lượng thấp (các loại đường ) thường dùng các phương pháp thẩm tích đối nước hay đối các dung dịch đệm loãng (cách làm: cho dung dịch enzyme vào túi colodion hoặc cellophane (thông thường người ta dùng cellophane tốt hơn), sau đó đặt cả túi vào nước cất hoặc dung dịch đệm pha loãng (như đệm phosphate có pH = 7, nồng độ 0,01M chẳng hạn). Màng cellophane là màng bán thấm, có kích thước lỗ cho các chất có phân tử nhỏ xuyên và đi qua vào các dung dịch đệm loãng theo định luật khuếch tán. Còn lại trong màng là các chất protein có phân tử lớn) (Hình 4.1) hoặc bằng cách lọc qua gel sephadex.
37. Công nghệ Enzyme – Protein 37 + Để loại bỏ các protein tạp (protein cấu trúc, protein trơ) và các tạp chất có phân tử lượng cao khác, thường dùng kết hợp các phương pháp khác nhau: phương pháp biến tính chọn lọc nhờ tác dụng của nhiệt độ hoặc pH của môi trường, phương pháp kết tủa phân đoạn bằng muối trung tính hoặc các dung môi hữu cơ, các phương pháp sắc ký (sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion), điện di, phương pháp lọc gel. Phương pháp biến tính chọn lọc nhờ tác dụng của nhiệt hoặc pH của môi trường chỉ dùng đối với trường hợp các enzyme bền với nhiệt hoặc bền với acid. Dịch enzyme được giữ ở 50 - 70 0C hay ở pH = 5 trong một thời gian xác định sau đó protein đã bị biến tính được loại bỏ bằng cách lọc hoặc ly tâm. Hình 4.1. Thẩm tích để loại muối (NH4)2SO4 trong kết quả protein  Đối với enzyme ngoại bào: để thu dịch enzyme thường tách sinh khối và các chất cặn bã ra khỏi canh trường bằng ly tâm hoặc lọc ép với việc sử dụng thêm các chất trợ lọc (diatomit, than hoạt tính ) hoặc các chất tạo kết tủa khi cần thiết (CaCl2 + (NH4)2SO4  CaSO4, chất này dễ dàng bị lắng cặn kéo theo sinh khối nên giúp cho quá trình lọc sẽ dễ dàng hơn) Cho đến nay vẫn chưa tìm được phương pháp tách và làm sạch chung cho các enzyme. Khi cần tách và làm sạch một enzyme nào đó cần chọn và phối hợp các phương pháp khác nhau để xây dựng một phương pháp phù hợp nhất. Trong quá trình chiết rút, cần chú ý: - Phải chiết rút và tiến hành kết tủa enzyme ở nhiệt độ thấp (từ 3 đến 50C) - Các thao tác thí nghiệm phải nhanh
38. Công nghệ Enzyme – Protein 38 - Dùng chất điện ly thích hợp: (NaCl, ZnCl2, CaCl2) phụ thuộc vào phương pháp dùng khi chiết rút. Ví dụ, dùng máy nung thì cả ba chất trên đều có tác dụng, nếu chỉ để lắng thì chỉ NaCl có tác dụng. -Ở động, thực vật, còn có ảnh hưởng của chất màu đến việc làm sạch hoặc xác định hoạt độ enzyme. Vì vậy, người ta cho thêm vào chất khử để loại màu. Ví dụ: + Màu của hemoglobin ở hồng cầu hoặc của chlorophyll và một số chất màu khác ở lá có thể bị loại trừ bởi hỗn hợp ethanol, chloroform với tỷ lệ thích hợp. + Hoạt độ enzyme superoxide dismutase (SOD) - một enzyme chống ôxy hóa có thể xác định sau khi đã loại màu khỏi dịch chiết enzyme. +Ở các mẫu từ động vật có sắc tố melanin màu nâu thường loại màu trên cột nhựa trao đổi ion bằng cách cho dịch enzyme qua cột hoặc lắc. Khi qua cột, chất màu bị giữ lại và enzyme không bị giữ. Người ta hay dùng DEAE - cellulose (Diethylamino ethyl - cellulose) hoặc than hoạt tính. Trong quá trình này phải chú ý kiểm tra pH. Sau khi loại màu cần kiểm tra lại hoạt độ của enzyme. Sau khi làm sạch cần sấy khô các chế phẩm enzyme (sấy chân không ở nhiệt độ thấp hoặc sấy thăng hoa) để có thể sử dụng lâu dài. Bằng các phương pháp làm sạch khác nhau có thể thu được các chế phẩm enzyme có hoạt tính cao hơn nhiều so với chế phẩm ban đầu. Việc thu chế phẩm enzyme tinh khiết và nhất là ở dạng tinh thể rất khó khăn và tốn kém do đó các chế phẩm enzyme loại này chỉ được dùng trong học và trong mục đích nghiên cứu như xác định khối lượng phân tử enzyme, nghiên cứu về cấu trúc enzyme 4.3. Hoạt độ enzyme 4.3.1. Phương pháp xác định hoạt độ enzyme
39. Công nghệ Enzyme – Protein 39 Trong enzyme học, người ta không định lượng enzyme một cách trực tiếp mà thường xác định gián tiếp thông qua xác định mức độ hoạt động (hoạt độ) của enzyme. Trong phán ứng có enzyme xúc tác, sự hoạt động của enzyme được biểu hiện bằng cách làm thay đổi các tính chất vật lý, hóa lý cũng như tính chất hóa học của hỗn hợp phản ứng. Theo dõi những biến đổi đó có thể biết được chính xác mức độ hoạt động của enzyme thông qua xác định cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm được tạo thành trong phản ứng. Về nguyên tắc, có thể chia ra ba nhóm phương pháp sau: - Đo lượng cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm được tạo thành trong một thời gian nhất định ứng với một nồng độ enzyme xác định. - Đo thời gian cần thiết để thu được một lượng biến thiên nhất định của cơ chất hay sản phẩm với một nồng độ enzyme nhất định. - Chọn nồng độ enzyme như thế nào để trong một thời gian nhất định thu được sự biến thiên nhất định về cơ chất hay sản phẩm. 4.3.2. Đơn vị hoạt độ enzyme - Đơn vị hoạt độ enzyme (U) là lượng enzyme có khả năng xúc tác làm chuyển hóa một micromol (1mol) cơ chất sau một phút ở điều kiện tiêu chuẩn. 1 U = 1mol cơ chất (10-6 mol)/ phút. - Katal (Kat) là lượng enzyme có khả năng xúc tác làm chuyển hóa 1 mol cơ chất sau một giây ở điều kiện tiêu chuẩn. 1 Kat = 1 mol cơ chất/giây 1 UI = 10-6/60 Kat = 16,67 nKat (nanoKat) Đối với chế phẩm enzyme, ngoài việc xác định mức độ hoạt động còn cần phải đánh giá độ sạch của nó. Đại lượng đặc trưng cho độ sạch của chế phẩm enzyme là hoạt độ riêng. - Hoạt độ riêng của một chế phẩm enzyme là số đơn vị UI (hoặc số đơn vị Katal) ứng với 1 ml dung dịch hoặc 1mg protein (nếu là bột khô) của chế phẩm enzyme. Ví dụ: + một dung dịch enzyme chứa 10 UI (hoặc 166,7 nKat) trong 1ml
40. Công nghệ Enzyme – Protein 40 + hoặc một bột enzyme chứa 10 UI (hoặc 166,7 nKat) trong 1mg protein Khi đã biết khối lượng phân tử của enzyme thì có thể tính hoạt độ riêng phân tử. - Hoạt độ riêng phân tử là số phân tử cơ chất được chuyển hóa bởi một phân tử enzyme trong một đơn vị thời gian. Như vậy, hoạt độ riêng phân tử chính là khả năng xúc tác của enzyme nghĩa là hoạt độ phân tử càng cao thì khả năng xúc tác càng lớn. Khi xác định hoạt độ enzyme cần chú ý một số điểm sau: - Nồng độ cơ chất trong phản ứng phải ở trong một giới hạn thích hợp đủ thừa để bão hòa enzyme nhưng không quá cao để đến mức kìm hãm enzyme - Với những enzyme cần có chất hoạt hóa hoặc chất làm bền thì phải cho các chất này vào enzyme trước khi cho cơ chất vào hỗn hợp phản ứng - Xác định hoạt độ cần tiến hành ở pH thích hợp và cố định - Nhiệt độ phải thấp hơn nhiệt độ tối ưu của enzyme để đề phòng tác dụng kìm hãm enzyme do nhiệt độ cao - Thời gian xác định hoạt độ thường từ 5 đến 30 phút, có thể kéo dài 24 giờ nếu hoạt độ của enzyme quá thấp. Trong trường hợp này cần phải cho thêm vào dung dịch các chất diệt vi sinh vật và tránh dùng những dung dịch đệm thuận lợi cho sự phát triển của vi sinh vật
41. Công nghệ Enzyme – Protein 41 Chương 5 SINH HỌC ENZYME Trong quá trình trao đổi chất của tế bào sinh vật xảy ra hai quá trình điều hòa: - Điều hòa hoạt độ của enzyme - Điều hòa sinh tổng hợp enzyme 5.1. Điều hòa hoạt tính enzyme Điều hòa hoạt tính enzyme chính là sự điều hòa bởi các chất kìm hãm và các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme. Trong cơ chế điều hòa enzyme thường nói đến hiện tượng ức chế ngược chính là một loại cơ chế điều hòa dị lập thể mà thông thường sản phẩm cuối cùng của quá trình phản ứng là chất điều hòa dị lập thể âm. Do đó hiện tượng ức chế ngược được gọi là ức chế dị lập thể. Khi enzyme cần có tác dụng hoạt hóa của một chất điều hòa dương để chuyển thành dạng enzyme hoạt động thì hiện tượng đó được gọi là sự hoạt hóa dị lập thể. Ức chế dị lập thể là nguyên tắc rất phổ biến đối với các quá trình chuyển hóa và có các đặc điểm sau đây: - Cơ chế ức chế ngược xảy ra ở các chuỗi phản ứng dẫn đến sự tổng hợp một chất nào đó (chất này được dùng để tổng hợp các đại phân tử như các amino axit isoleucine và histidine được dùng để tổng hợp protein, nucleotide) - Sản phẩm cuối cùng có tác dụng ức chế dị lập thể. - Sản phẩm cuối cùng thường chỉ tác dụng đặc hiệu và trực tiếp lên enzyme đầu tiên là enzyme dị lập thể. - Sản phẩm cuối cùng (chất ức chế ngược) có cấu trúc hóa học khác với cơ chất của phản ứng mà nó ức chế, vì vậy tác dụng ức chế của nó không phải do cạnh
42. Công nghệ Enzyme – Protein 42 tranh với cơ chất đó, mà do nó làm thay đổi cấu dạng không gian của enzyme khiến enzyme không tiếp nhận được cơ chất. (Hình 5.1) Hình 5.1. Hiệu ứng dị lập thể âm Trong đó: + a. Enzyme (E) tiếp nhận cơ chất (S) + b. Yếu tố dị lập thể A gắn vào trung tâm dị lập thể, cấu trúc enzyme (trung tâm hoạt động của enzyme) thay đổi và không tiếp nhận được cơ chất; hoạt độ giảm. Cơ chế ức chế ngược có thể được biểu thị theo sơ đồ sau: Như vậy, mỗi khi sản phẩm cuối cùng Z được tổng hợp tăng lên vượt quá nhu cầu của tế bào thì nó ức chế enzyme đầu tiên E1 khiến cho phản ứng đầu tiên A B giảm đi và do đó, mặc dù các enzyme sau là E 2, E3 không bị ức chế (vẫn có khả năng hoạt động bình thường), nhưng chúng không có các cơ chất B, C để chuyển hóa, kết quả là toàn chuỗi phản ứng bị giảm sút, sự tổng hợp sản phẩm cuối cùng Z giảm đi. Khi tế bào thiếu chất Z, enzyme E 1 không bị ức chế nên phản ứng đầu tiên và cả chuỗi phản ứng lại xảy ra, kết quả là sự tổng hợp các chất Z tăng lên đáp ứng nhu cầu của tế bào. Ví dụ, ở E.Coli isoleucine là sản phẩm chuyển hóa cuối cùng của chuỗi phản ứng chuyển hóa của threonine; phản ứng đầu tiên của chuỗi phản ứng do enzyme dị lập thể threonine dehydratase xúc tác, khi lượng isoleucine tăng cao (do được tổng hợp nhiều) thì nó ức chế enzyme của phản ứng đầu tiên đó theo cơ chế dị lập thể (hình 5.2)
43. Công nghệ Enzyme – Protein 43 Hình 5.2. Sự ức chế threonine dehydratase bởi Isoleucine theo cơ chế ức chế ngược, (-): ức chế. 5.2. Điều hòa sinh tổng hợp enzyme Sự điều hòa số lượng enzyme trong tế bào có thể thực hiện theo các cơ chế điều hòa chính như sau: 5.1.1 Điều hòa theo kiểu đóng mở gen tác động (operator) – Hiện tượng trấn áp và cảm ứng sinh tổng hợp enzyme  Hiện tượng trấn áp (ức chế): (repression): là làm giảm quá trình sinh tổng hợp enzyme do sản phẩm cuối cùng của quá trình phản ứng tạo ra. - Hiện tượng này thường gặp đối với các enzyme xúc tác cho quá trình sinh tổng hợp một chiều như quá trình sinh tổng hợp axit amin, nucleotit Ví dụ, Khi thêm một axit amin nào đó vào môi trường nuôi cấy vi khuẩn thì tế bào không cần phải tổng hợp axit amin này nữa do đó sẽ đình chỉ quá trình sinh tổng hợp các enzyme cần xúc tác cho các phản ứng dẫn đến sự tạo thành axit amin đó. Các enzyme này chỉ được tổng hợp trở lại khi có nhu cầu nghĩa là khi nồng độ của axit amin tương ứng bị giảm xuống. - Đối hệ thống phân nhánh nghĩa là quá trình dẫn đến việc tạo thành các sản phẩm cuối cùng khác nhau từ một chất chung ban đầu thì cơ chế trấn áp có thể thực hiện theo các cách khác nhau. Ví dụ, Phản ứng đầu tiên của quá trình sinh tổng hợp các axit amin: lizin, methionin, treonin đều do enzyme aspactokinase xúc tác. Enzyme này có ba dạng izoenzyme, ký hiệu al, am, at. Quá trình sinh tổng hợp izoenzyme al bị trấn áp bởi nồng độ của lizin, am sẽ bị trấn áp bởi nồng độ của methionin. Riêng đối với izoenzyme at thì treonin vừa là sản phẩm cuối cùng của quá trình tổng hợp axit amin, vừa là nguyên liệu
44. Công nghệ Enzyme – Protein 44 ban đầu để sinh tổng hợp izoloxin. Do đó, quá trình sinh tổng hợp at chỉ bị trấn áp khi cả hai sản phẩm treonin, izoloxin đều đạt nồng độ cao vượt quá nhu cầu của tế bào. Hiện nay, các nhà khoa học cho rằng cơ chế trấn áp trong trường hợp này do aminoaxit – tRNA tạo ra.  Hiện tượng cảm ứng: là làm tăng lượng enzyme có trong tế bào. Chất cảm ứng được xem như một chất nền (bộ khung C) để sinh tổng hợp enzyme, có thể là những sản phẩm trung gian của quá trình biến đổi các chất hoặc nhiều cơ chất của enzyme. Trong số các enzyme do vi sinh vật tổng hợp, có một số enzyme bình thường chỉ được tổng hợp với một lượng rất ít, nhưng hàm lượng của chúng có thể tăng lên rất nhiều lần, khi thêm một số chất nhất định vào môi trường nuôi cấy. Hiện tượng này gọi là hiện tượng cảm ứng; enzyme này là enzyme cảm ứng; chất gây nên hiệu quả này gọi chất cảm ứng. Các enzyme cảm ứng thường là những enzyme xúc tác cho quá trình phân giải như proteinase, amylase, pectinase, xenlulase Ví dụ, sinh tổng hợp -galactosidase ở tế bào E.Coli, khi nuôi cấy E.Coli trong môi trường có glucose và glixerin, vi khuẩn chỉ tổng hợp được khoảng 10 phân tử - galactosidase trên một tế bào. Nếu chuyển sang môi trường có chứa lactose thì nguồn cacbon duy nhất thì hàm lượng này tăng lên đến gần 1000 lần Sự cảm ứng thường có tính chất dây chuyền. Trong hệ thống bao gồm nhiều phản ứng, cơ chất đầu tiên của hệ thống có thể cảm ứng quá trình tổng hợp tất cả các enzyme xúc tác cho quá trình chuyển hóa nó. Cơ chế này được thực hiện như sau: trước hết, chất cảm ứng sẽ làm tăng quá trình tổng hợp enzyme đầu tiên, sau đó sản phẩm của phản ứng này lại cảm ứng tổng hợp enzyme thứ hai để phân hủy nó, tiếp theo sản phẩm thứ hai lại cảm ứng tổng hợp enzyme thứ ba Ví dụ, histidin có tác dụng cảm ứng hàng loạt các enzyme xúc tác cho quá trình chuyển hóa nó thành axit glutamic.  Cơ chế điều hòa theo kiểu trấn áp và cảm ứng a. Zacob và Monod đã đề ra mô hình giải thích cơ chế của hiện tượng trấn áp và cảm ứng dựa trên cơ sở di truyền.
45. Công nghệ Enzyme – Protein 45 Phân tử DNA trong nhiễm sắc thể được chia ra nhiều loại gen khác nhau. Trong đó có những gen quan trọng như sau: - Gen cấu trúc (ký hiệu S1, S2,S3): Gen này đảm nhận tổng hợp protein enzyme. Các gen cấu trúc được sắp xếp liền nhau trên DNA và có khả năng điều khiển sự tổng hợp một loại protein hay enzyme nhất định. - Gen tác động (operator, ký hiệu O): nằm cạnh gen cấu trúc, đảm bảo cho quá trình sao chép mã ở gen cấu trúc theo cơ chế “đóng mở”. Quá trình sao chép mã chỉ có thể tiến hành khi gen operator ở trạng thái “mở” (không kết hợp với một chất nào cả) và ngừng lại khi nó bị “đóng” (kết hợp với một chất đặc biệt gọi là chất trấn áp) - Gen khởi động (promotor, ký hiệu P): đứng trước gen operator, là đoạn DNA mà RNA-polymerase sẽ kết hợp và bắt đầu sao chép các gen cấu trúc - Gen điều hòa (regulator, ký hiệu R): gen này mã hóa cho một protein đặc biệt gọi là chất trấn áp (repressor). Chất trấn áp có vai trò “đóng mở” gen operator. Do đó gen điều hòa có thể kiểm tra quá trình sao chép gen cấu trúc thông qua chất trấn áp này. b. Trong trường hợp điều hòa sinh tổng hợp enzyme theo cơ chế trấn áp: - Do gen điều hòa còn ở dạng không hoạt động (aporepressor) chưa có khả năng kết hợp với gen operator nên quá trình sao chép các gen cấu trúc tiến hành bình thường - Các enzyme được tổng hợp xúc tác các phản ứng tạo thành sản phẩm cuối cùng. -Sản phẩm cuối cùng này có khả năng kết hợp và hoạt hóa aporepressor - Aporepressor hoạt hóa sẽ kết hợp với operator ngăn cản quá trình sao chép các gen cấu trúc làm ngừng việc tổng hợp RNAtt tương ứng do đó đình chỉ quá trình sinh tổng hợp các enzyme tương ứng. Trong trường hợp này sản phẩm cuối cùng được coi như một chất trấn áp (corepressor) (Hình 8.5) - Khi nồng độ sản phẩm giảm xuống thấp, aporepressor trở nên mất hoạt tính và tách ra khỏi gen operator, làm cho sự truyền đạt những thông tin cấu trúc trở lại hoạt động bình thường, và như vậy sự tổng hợp enzyme được phụ hồi.
46. Công nghệ Enzyme – Protein 46  Không có corepressor (sản phẩm cuối cùng)  Có corepressor: Hình5.2. Cơ chế trấn áp sinh tổng hợp enzyme bởi sản phẩm cuối cùng c. Đối với trường hợp cảm ứng - Khi không có mặt chất cảm ứng, chất trấn áp repressor được tổng hợp đã ở trạng thái hoạt động. Nó kết hợp với operator, quá trình sao chép mã của gen cấu trúc bị bao vây nên các enzyme tương ứng không được tổng - Khi có mặt chất cảm ứng, chất trấn áp bị mất hoạt động tách khỏi gen operator và quá trình sao chép mã bắt đầu. Kết quả làm tăng lượng enzyme được tổng hợp
47. Công nghệ Enzyme – Protein 47  Không có chất cảm ứng  Có chất cảm ứng Hình 5.3. Cơ chế điều hòa cảm ứng sinh tổng hợp enzyme Trong đó: + A, B, C, D cơ chất và các sản phẩm của chuỗi phản ứng do enzyme E1, E2, E3 xúc tác + AP: RNA - polymerase. 5.1.2 Điều hòa tương tác giữa RNA – polymerase với gen promotor Quá trình tổng hợp một số enzyme cảm ứng xúc tác cho quá trình phân giải không chỉ chịu tác động bởi cơ chế cảm ứng mà còn chịu tác động bởi nhiều cơ chế
48. Công nghệ Enzyme – Protein 48 khác, trong đó có tác động của AMP vòng gọi là “trấn áp phân giải”. AMP v có tác dụng kích thích quá trình sao chép mã của các operon phân giải Tác dụng kích thích của AMP v đối với quá trình sao chép được thực hiện nhờ một protein đặc biệt làm trung gian gọi là protein nhân AMP hay còn gọi là protein hoạt hóa gen phân giải., viết tắt CAP Khi AMPv kết hợp với CAP tạo thành phức có tác dụng hoạt hóa gen promotor làm cho RNA-polymerase dễ dàng kết hợp với chúng để bắt đầu sao chép mã. Như vậy, AMTv có tác dụng làm tăng quá trình sao chép. Glucose và một số đường khác khi cho thêm vào môi trường nuôi cấy vi khuẩn sẽ làm giảm quá trình sinh tổng nhiều enzyme cảm ứng, ngay cả khi có chất cảm ứng trong môi trường. Hiện tượng này gọi là hiệu ứng glucose
49. Công nghệ Enzyme – Protein 49 Chương 6 CÔNG NGHỆ ENZYME VÀ ỨNG DỤNG 6.1. Công nghệ enzyme 6.1.1 Enzyme với công nghệ sinh học Enzyme được xem như là một kỹ thuật quan trọng của công nghệ sinh học do có các chức năng sau: - Enzyme là chất xúc tác cho mọi biến đổi vật chất trong công nghệ sinh học. - Enzyme và nhiều hoạt chất sinh học khác là sản phẩm của công nghệ sinh học. Chúng có thể dùng làm công cụ mới của công nghệ sinh học, hay sử dụng trong các lãnh vực khác . - Enzyme được xem là thuốc thử có tính chuyên hóa cao mà không có enzyme thì các quá trình công nghệ sinh học không thể tối ưu hóa được 6.1.2 Enzyme không tan Sử dụng enzyme không tan có một số ưu điểm sau: -Một lượng enzyme sử dụng lặp đi lặp lại nhiều lần trong một thời gian dài - Enzyme không lẫn vào trong sản phẩm do đó tránh được ảnh hưởng không tốt đến sản phẩm - Dùng enzyme không tan có thể ngừng nhanh chóng phản ứng khi cần thiết bằng cách tách ra khỏi cơ chất Để tạo ra enzyme không tan có nhiều phương pháp khác nhau như: - Phương pháp hấp phụ vật lí: là phương pháp hấp phụ lên bề mặt chất mang. Chất mang như cám, than hoạt tính, bột thủy tinh Nhược điểm của phương pháp là enzyme dễ hòa tan trở lại, độ liên kết lỏng lẻo, khi chịu tác động lực ion lớn dễ bị nhả ra. - Phương pháp đưa enzyme vào khuôn gel: enzyme dễ định vị trong gel, mạng lưới chất trùng hợp càng nhỏ enzyme sẽ được giữ chặt hơn. Đây là cách được dùng khá phổ biến. - Phương pháp cộng hóa trị của enzyme và chất mang: dựa vào ái lực giữa enzyme và chất mang để tạo phức giữa enzyme - chất mang bằng liên kết cộng hóa trị. Đây cũng là phương pháp được dùng phổ biến.
50. Công nghệ Enzyme – Protein 50 6.2. Ứng dụng Hiện nay, việc sản xuất chế phẩm enzyme các loại đã và đang phát triển mạnh mẽ trên qui mô công nghiệp. Thực tế đã có hàng nghìn chế phẩm enzyme bán trên thị trường thế giới, các chế phẩm này đã được khai thác và tinh chế có mức độ tinh khiết theo tiêu chuẩn công nghiệp và ứng dụng. Các chế phẩm enzyme phổ biến như amylase, protease, catalase, cellulase, lipase, glucoseoxydase Chế phẩm enzyme không chỉ được ứng dụng trong y học mà còn được ứng dụng trong nhiều lãnh vực công nghiệp khác nhau, trong nông nghiệp, trong hóa học "ý nghĩa của việc sử dụng enzyme trong các lĩnh vực thực tế không kém so với ý nghĩa của việc sử dụng năng lượng nguyên tử". 6.2.1 Ứng dụng trong y dược Enzyme có một vị trí quan trọng trong y học. Đặc biệt là các phương pháp định lượng và định tính enzyme trong hóa học lâm sàng và phòng thí nghiệm chẩn đoán. Do đó, hiện nay trong y học đã xuất hiện lĩnh vực mới gọi là chẩn đoán enzyme, có nhiệm vụ: - Phân tích xác định nồng độ cơ chất như glucose, ure, cholesterol với sự hổ trợ của enzyme . - Xác định hoạt tính xúc tác của enzyme trong mẫu sinh vật. - Xác định nồng độ cơ chất với sự hổ trợ của thuốc thử enzyme đánh dấu. Dùng enzyme để định lượng các chất, phục vụ công việc xét nghiệm chẩn đoán bệnh, ví dụ dùng để kiểm tra glucose nước tiểu, urease để định lượng ure Dùng enzyme làm thuốc ví dụ protease làm thuốc tắc nghẽn tim mạch, tiêu mủ vết thương, làm thông đường hô hấp, chống viêm, làm thuốc tăng tiêu hóa protein, thành phần của các loại thuốc dùng trong da liễu và mỹ phẩm Trong y học các protease cũng được dùng để sản xuất môi trường dinh dưỡng để nuôi cấy vi sinh vật sản xuất ra kháng sinh, chất kháng độc Ngoài ra người ta còn dùng enzyme protease để cô đặc và tinh chế các huyết thanh kháng độc để chửa bệnh.
51. Công nghệ Enzyme – Protein 51 Amylase được sử dụng phối hợp với coenzyme A, cytocrom C, ATP, carboxylase để chế thuốc điều trị bệnh tim mạch, bệnh thần kinh, phối hợp với enzyme thủy phân để chữa bệnh thiếu enzyme tiêu hóa. 6.2.2 Ứng dụng trong hóa học Cho đến nay, việc ứng dụng enzyme trong hóa học là do enzyme có cảm ứng cao đối với nhiệt độ, pH và những thay đổi khác của môi trường. Một trong những ứng dụng chế phẩm enzyme đáng được chú ý nhất trong thời gian gần đây là dùng chất mang để gắn phức enzyme xúc tác cho phản ứng nhiều bước. Ví dụ tổng hợp glutathion, acid béo, alcaloid, sản xuất hormone Cũng bằng cách tạo phức, người ta gắn vi sinh vật để sử dụng trong công nghệ xử lý nước thải, sản xuất alcohol, amino axit Trong nghiên cứu cấu trúc hóa học, người ta cũng sử dụng enzyme, ví dụ dùng protease để nghiên cứu cấu trúc protein, dùng endonuclease để nghiên cứu cấu trúc nucleic acid Dùng làm thuốc thử trong hóa phân tích. 6.2.3 Ứng dụng trong công nghiệp Việc sử dụng enzyme trong công nghiệp là đa dạng, phong phú và đã đạt được nhiều kết quả to lớn. Ví dụ: - Dùng protease trong các lĩnh vực: công nghiệp thịt, công nghiệp chế biến cá, công nghiệp chế biến sữa, công nghiệp bánh mì, bánh kẹo, công nghiệp bia, công nghiệp sản xuất sữa khô và bột trứng, công nghiệp hương phẩm và mỹ phẩm, công nghiệp dệt, công nghiệp da, công nghiệp phim ảnh, công nghiệp y học -Với amylase đã được dùng trong sản xuất bánh mì, công nghiệp bánh kẹo, công nghiệp rượu, sản xuất bia, sản xuất mật,glucose, sản xuất các sản phẩm rau, chế biến thức ăn cho trẻ con, sản xuất các mặt hàng từ quả, sản xuất nước ngọt, công nghiệp dệt, công nghiệp giấy Nhưng ở đây chúng ta chỉ đề cập đến việc ứng dụng chế phẩm enzyme trong một số lĩnh vực.
52. Công nghệ Enzyme – Protein 52 6.2.4 Ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm  Protease với công nghiệp thực phẩm: Việc sử dụng trong chế biến làm mềm thịt là ứng dụng có tính truyền thống. Nhân dân ta từ rất lâu đã dùng thơm để nấu canh thịt bò; dùng rau sống là chuối chát, vả kết hợp thức ăn nhiều thịt; đu đủ trong chống táo bón mà thực chất là sử dụng papain, bromelain, fixin. Người Nga còn dùng protease từ hạt đậu tương nảy mầm để làm mềm thịt. Ngoài khả năng phân giải để làm mềm thịt, tạo thức ăn dễ tiêu hóa, công nghệ sản xuất các loại dịch thủy phân giàu protein đã được áp dụng một cách có hiệu quả tính năng của protease. Enzyme là một công cụ để chế biến các phế liệu của công nghiệp thực phẩm thành thức ăn cho người và vật nuôi. Người ta còn khai thác tính đông tụ như của renin, pepsin vào công nghiệp thực phẩm như trong sản xuất phomat.  Pectinase với công nghiệp thực phẩm: Pectinase đã được dùng trong một số ngành công nghiệp thực phẩm sau: -Sản xuất rượu vang. -Sản xuất nước quả và nước uống không có rượu. -Sản xuất các mặt hàng từ quả: quả cô đặc, mứt. -Sản xuất nước giải khát. -Sản xuất cà phê. Chế phẩm pectinase được sử dụng trong sản xuất nước quả từ các nguyên liệu quả nghiền hay để làm trong nước quả ép. Bởi vì khi có pectin thì khối quả nghiền sẽ có trạng thái keo, do đó khi ép dịch quả không thóat ra được. Nhờ pectinase mà nước quả trong suốt, dễ lọc, hiệu suất tăng. Pectinase còn góp phần chiết rút các chất màu, tanin và các chất hòa tan khác, do đó làm tăng chất lượng của thành phẩm. Những nghiên cứu khi ép nho có xử lý bằng pectinase không những làm tăng hiệu suất mà còn làm tăng màu sắc.
53. Công nghệ Enzyme – Protein 53 Trong sản xuất mứt nhừ, mứt đông nhờ pectinase mà dịch quả có nồng độ đậm đặc hơn.  Cellulase với công nghiệp thực phẩm: Cellulose là thành phần cơ bản của tế bào thực vật, vì vậy nó có mặt trong mọi loại rau quả cũng như trong các nguyên liệu, phế liệu của các ngành trồng trọt và lâm nghiệp. Nhưng người và động vật không có khả năng phân giải cellulose. Nó chỉ có giá trị làm tăng tiêu hóa, nhưng với lượng lớn nó trở nên vô ích hay cản trở tiêu hóa. Chế phẩm cellulase thường dùng để: -Tăng chất lượng thực phẩm và thức ăn gia súc. -Tăng hiệu suất trích ly các chất từ nguyên liệu thực vật. Ứng dụng trước tiên của cellulase đối với chế biến thực phẩm là dùng nó để tăng độ hấp thu, nâng cao phẩm chất về vị và làm mềm nhiều loại thực phẩm thực vật. Đặc biệt là đối với thức ăn cho trẻ con và nói chung chất lượng thực phẩm được tăng lên. Một số nước đã dùng cellulase để xử lý các loại rau quả như bắp cải, hành, cà rốt, khoai tây, táo và lương thực như gạo. Người ta còn xử lý cả chè, các loại tảo biển Trong sản xuất bia, dưới tác dụng của cellulase hay phức hệ citase trong đó có cellulase, thành tế bào của hạt đại mạch bị phá hủy tạo điều kiện tốt cho tác động của protease và đường hóa. Trong sản xuất agar-agar, tác dụng của chế phẩm cellulase sẽ làm tăng chất lượng agar-agar hơn so với phương pháp dùng acid để phá vở thành tế bào. Đặt biệt là việc sử dụng chế phẩm cellulase để tận thu các phế liệu thực vật đem thủy phân, dùng làm thức ăn gia súc và công nghệ lên men. Những ứng dụng của cellulase trong công nghiệp thực phẩm đã có kết quả rất tốt. Tuy nhiên hạn chế lớn nhất là rất khó thu được chế phẩm có cellulase hoạt độ cao.  Amylase với công nghiệp thực phẩm: Chế phẩm amylase đã được dùng phổ biến trong một số lĩnh vực của công nghiệp thực phẩm như sản xuất bánh mì, glucose, rượu , bia
54. Công nghệ Enzyme – Protein 54 Trong sản xuất bánh mì, chế phẩm amylase đã làm thay đổi hoàn tòan chất lượng của bánh mì cả hương vị, màu sắc, độ xốp Chế phẩm amylase sạch cho chất lượng bánh mì tốt hơn ở dạng phức hợp với protease. Trong sản xuất bánh kẹo người ta thường dùng maltose là sản phẩm thủy phân tinh bột bằng amylase và glucose bằng glucoamylase. Chính glucoamylase, là yếu tố làm tăng hiệu suất trong sản xuất rượu. Trong sản xuất bia, viêc sử dụng amylase có trong các hạt nảy mầm thay thế malt đã góp phần đáng kể trong việc giảm giá thành. 6.2.5 Ứng dụng trong công nghiệp dệt Trong công nghiệp dệt, chế phẩm amylase được dùng để rũ hồ vải trước khi tẩy trắng và nhuộm. Amylase có tác dụng làm vải mềm, có khả năng nhúng ướt, tẩy trắng và bắt màu tôt. Rũ hồ bằng enzyme không những nhanh, không hại vải, độ mao dẫn tốt mà còn đảm bảo vệ sinh, do đó tăng được năng suất lao động. Trong sản xuất tơ tằm, người ta dùng protease để làm sạch sợi tơ. Với công đoạn xử lý bằng enzyme sau khi xử lý bằng dung dịch xà phòng sẽ giúp lụa có tính đàn hồi tốt, bắt màu đồng đều và dễ trang trí trên lụa. 6.2.6 Ứng dụng trong công nghiệp thuộc da Trong công nghiệp da, enzyme protease được dùng để làm mềm da, làm sạch da, rút ngắn thời gian, tránh ô nhiễm môi trường. Việc xử lý đã được tiến hành bằng cách ngâm da trong dung dịch enzyme, hay phết dịch enzyme lên bề mặt da. Enzyme sẽ tách các chất nhờn và làm đứt một số liên kết trong phân tử collagen làm cho da mềm hơn. Thực tế cho thấy khi xử lý da bằng chế phẩm protease từ vi sinh vật có thể rút ngắn thời gian làm mềm và tách lông xuống nhiều lần. Điều quan trọng là chất lượng lông tốt hơn khi cắt. So với phương pháp hóa học thì việc xử lý bằng enzyme có số lượng lông tăng 20-30%. Lông không cần xử lý thêm sau khi ngâm trong dịch enzyme. 6.2.7 Ứng dụng trong nông nghiệp Có thể sử dụng các loại chế phẩm enzyme khác nhau để chuyển hóa các phế liệu, đặc biệt là các phế liệu nông nghiệp cải tạo đất phục vụ nông nghiệp.
55. Công nghệ Enzyme – Protein 55 Ở Nhật hằng năm đã sản xuất hàng vạn tấn chế phẩm cellulase các loại để dùng trong nông nghiệp. Có chế phẩm chứa cả cellulase, hemicellulase, protease và amylase. Công nghệ này khá phổ biến ở nhiều quốc gia. Ở nước ta việc dùng enzyme vi sinh vật góp phần trong sản xuất phân hữu cơ đang được khai thác để thay thế cho phân hóa học. Tóm lại, có thể nói rằng, việc nghiên cứu ứng dụng các chế phẩm enzyme ngày càng được chú trọng ở các lĩnh vực khác nhau. Trong 20 năm cuối thế kỷ XX và các năm đầu của thế kỷ XXI các enzyme khác nhau đã được ứng dụng. Ở Việt Nam bước đầu đã có nhiều nghiên cứu ứng dụng các enzyme trong chế biến nông sản, thực phẩm, nhất là trong lĩnh vực sản xuất bia, rượu, chế biến tinh bột (Viện công nghiệp thực phẩm, Viện công nghệ sinh học – công nghệ thực phẩm, Đại học Bách khoa Hà Nội ). Việc nghiên cứu các enzyme phục vụ nông nghiệp, công nghiệp cũng được quan tâm và có các kết quả đáng khích lệ. Ví dụ, chế phẩm enzyme mới ra đời phục vụ nông nghiệp E2001 có tác dụng tăng độ phì nhiêu đất, tăng năng suất cây trồng. Đã có các nghiên cứu ứng dụng protease trong sản xuất rượu bia, rút ngắn thời kỳ lên men cũng như sản xuất nước mắm ngắn ngày bằng công nghệ enzyme protease. Enzyme amylase cũng được nghiên cứu ứng dụng rộng rãi trong sản xuất đường bột, maltodextrin, nha glucose, siro, glucose – fructose ở quy mô công nghiệp.
56. Công nghệ Enzyme – Protein 56 Chương 7 CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT PROTEIN 7.1. Mục đích yêu cầu Từ những hiểu biết về kiến thức rất cơ bản về bản chất, ý nghĩa của protein, cùng với các phương pháp chiết rút, tách tinh sạch protein thông thường qua các chương đã được giới thiệu ở trên, trong chương này chúng tôi muốn giới thiệu công nghệ sản xuất một số protein từ các nguồn nguyên liệu khác nhau. Trong đó ưu tiên đề cập đến sản xuất một số loại protein tái tổ hợp. Qua chương này yều cầu sinh viên nắm được nguyên tắc chung và các bước chính của một quy trình sản xuất, trước khi đi vào những vấn đề cụ thể chúng ta cần tìm hiểu thêm một số vấn đề sau đây: 7.1.1. Ý nghĩa của protein đối với quá trình sinh học Như chúng ta đã biết, mọi sinh vật tồn tại được nhờ luôn gắn với điều kiện của môi trường thông qua quá trình trao đổi chất. Quá trình trao đổi chất bao gồm nhiều khâu chuyển hoá trung gian, mỗi chuyển hoá trung gian là một mắt xích của các quá trình đồng hoá và dị hoá. Trong các quá trình sinh học đó, ngoài các chất glucid và lipid thì protein và các sản phẩm thứ cấp của nó đóng vai trò hết sức quan trọng, tạo nên một chu trình trao đổi chất và năng lượng cho cơ thể. Ngày nay người ta biết được 10 10- 1012 loại protein khác nhau ở các dạng cơ thể sống trên trái đất. Mặc dù trong cơ thể, về cơ bản protein đóng vai trò là các thành phần cấu tạo của chất nguyên sinh và là thành phần cấu tạo chức năng của các enzyme và một số hormon, nhưng các sản phẩm phân giải của chúng vẫn được sử dụng làm chất liệu tổng hợp nhiều chất khác nhau và đặc biệt là việc cung cấp nguồn năng lượng cho cơ thể. Vì kết quả của việc phân giải amino acid tạo thành CO2, NH3, amin, cetoacid và hàng loạt trường hợp còn tạo ra những chất khá phức tạp thuộc các nhóm hợp chất hữu cơ khác nhau. Đặc biệt trong các sản phẩm đó phải kể đến các quá trình khử amin hoá oxy hoá, các amino acid được chuyển thành acid carboxylic và cung cấp hydrogen theo phản ứng chung sau đây:
57. Công nghệ Enzyme – Protein 57 Ví dụ: Khi oxy hoá proline tạo thành pyroline-carboxylic, chất này có thể phân giải theo con đường tạo thành aldehytglutamic, sau đó chuyển thành acid glutamic hoặc ornithine để cung cấp hydrogen. Bên cạnh đó proline cũng có thể oxy hoá dần dần để tạo thành hydrogenxy-proline, sau một số biến đổi để tạo thành sản phẩm tham gia trong chu trình Kreb để cung cấp ATP. Tóm lại, sự phân giải protein tiếp đến là các amino acid là các phản ứng cung cấp năng lượng cho các quá trình sinh học. Từ chỗ cung cấp hydrogen xuất phát từ nhiều loại cơ chất tạo thành một phức hệ trong trao đổi chất, tựu trung ở các cơ chất, cuối cùng dều nhường hydrogen cho chuỗi hô hấp tế bào để tạo thành các phân tử ATP- nguồn dữ trữ năng lượng cho mọi hoạt động sống của sinh vật. 7.1.2. Nhu cầu khoa học và xã hội đối với protein Protein là hợp phần chủ yếu quyết định toàn bộ các đặc trưng của khẩu phần thức ăn, chỉ trên nền tảng protein cao thì tính chất sinh học của các cấu tử khác mới thể hiện đầy đủ. Khi thiếu protein trong chế độ ăn hàng ngày sẽ dẫn đến nhiều biểu hiện xấu cho sức khoẻ như suy dinh dưỡng, sút cân mau, chậm lớn ở trẻ em, giảm khả năng miễn dịch chống đở của cơ thể với một số bệnh. Thiếu protein sẽ gây ảnh hưởng xấu đến hoạt động bình thường của nhiều cơ quan chức năng như gan, tuyến nội tiết và hệ thần kinh v.v Thiếu protein sẽ làm thay đổi thành phần hoá học và cấu tạo hình thái của xương như lượng calci giảm, lượng magie tăng cao. Do đó, mức protein cao chất lượng tốt (protein chứa đủ amino acid không thay thế) là cần thiết trong thức ăn của mọi lứa tuổi. Theo các báo cáo của UNO và FAO từ năm1972, người ta đi đến kết luận rằng việc sản xuất protein của thế giới hoàn toàn đáp ứng nhu cầu của dân số hiện tại trong thời gian đó. Tuy nhiên 2/3 protein sản xuất ra lại chỉ được tiêu thụ bởi 1/3 dân số thế giới. Tốc độ sinh đẻ ở các nước đang phát triển lớn gấp đôi so với các nước phát triển và theo tính toán ở năm 2000 dân số thế giới đã đạt khoảng 7000 triệu người, như vậy nhu cầu của protein cũng phải tăng
58. Công nghệ Enzyme – Protein 58 gấp đôi so với năm 1972. Ngoài ra ở những nước phát triển có mức sống cao, các thức ăn hỗn hợp dành cho động vật cũng đòi hỏi chứa các nguồn protein có chất lượng cao để sản xuất ra trứng, gia cầm, bò, lợn đủ tiêu chuẩn. Các thức ăn này phải thoả mãn hoàn toàn các nhu cầu dinh dưỡng của động vật và thường là 10- 30% protein tính theo trọng lượng. Ngoài nhu cầu protein làm thức ăn cho người và chăn nuôi thì trong lĩnh vực y dược, sự hiểu biết về bệnh học ở mức độ phân tử đang phát triển nhanh chóng, nhu cầu sử dụng các chế phẩm từ protein để nghiên cứu chữa bệnh cho người và động vật ngày càng tăng. Ngày nay người ta có thể sản xuất các thuốc men quý hiếm từ protein như các hormon sinh trưởng, hormon chống tiểu đường là insulin, các globulin miễn dịch, các yếu tố đông máu, các kích thích tố sinh trưởng hồng cầu, các kháng thể đơn dòng, các loại vaccine v.v bằng con đường công nghệ gene có thể vừa tạo ra sản phẩm tự nhiên, vừa hạ giá thành, lại có thể tạo ra một lượng lớn nhanh chóng mà trước đây bằng con đường tách chiết hay tổng hợp hoá học không bao giờ đáp ứng kịp nhu cầu trong chẩn đoán và điều trị các bệnh. Hiện nay nhiều công ty tranh nhau để sản xuất các sản phẩm này theo phương pháp kỹ thuật DNA tái tổ hợp (recombinant DNA technology) đã mang lại những lợi nhuận khổng lồ hàng nghìn triệu đô la mỗi năm. Chẳng hạn loại protein albumin huyết thanh người (HSA) được được tách ra từ máu người cho và được dùng để điều trị trong bệnh mất huyết tương, thay thế chất lỏng điều trị bỏng, sốc chấn thương hay một số trường hợp bệnh nhân bị phẫu thuật. Loại này trên thế giới mỗi năm tiêu thụ khoảng 300 tấn và thu riêng khoản này tới 1000 triệu đô la mỗi năm. 7.1.3. Tình hình nghiên cứu và sản xuất protein có hoạt tính sinh học Insulin là protein hormone kết tinh đầu tiên (Abel, 1925); enzyme đầu tiên được kết tinh là urease (Summer, 1926). Người ta tiếp tục đi sâu vào nghiên cứu cấu trúc và chức phận của protein cũng như mối liên quan giữa chúng. Với công trình nghiên cứu của nhà sinh hoá học người Mỹ J.H. Northrop kết tinh được pepsin (1930), tripsin (1932) và chymotripsin (1935) và một số công trình khác người ta càng hiểu rõ hoạt tính sinh học của các loại enzyme này. Đến năm 1953, Sanger đã xác định được cấu trúc bâc1 của insulin gồm có 51 amino acid; tiếp đó Hirs, Stein More và cộng sự (1960) đã xác định được cấu trúc bậc 1 của enzyme ribonuclease
59. Công nghệ Enzyme – Protein 59 gồm 121 amino acid; cũng năm đó Braunitzer đã xác định được hemoglobin người gồm 4 chuỗi polypeptide, hai chuỗi - mỗi chuỗi141 amino acid và hai chuỗi - mỗi chuỗi 146 amino acid và hàng chục các protein khác như cytocrom, papain v.v Mặc dù từ năm 1953 lần đầu tiên Du Vigneaud tổng hợp được các hormon peptide oxytocin và vasopressin bằng phương pháp hoá học và chỉ 10 năm sau (1963) Trung quốc, Mỹ và Tây Đức đã tổng hợp được insulin theo mẫu cấu trúc bậc 1 của Sanger đưa ra; 1969 tổng hợp được ribonuclease và 1970 tổng hợp được protein sinh trưởng. Từ đó con người bước vào giai đoạn tổng hợp nhân tạo các protein một chất có tầm quan trong bậc nhất đối với sự sống. Trong những thập niên 70 việc tách chiết và nghiên cứu chức năng các protein có hoạt động sinh lý, đặc biệt trong lĩnh vực về tính kháng khuẩn của peptide diễn ra mạnh mẽ như: vai trò bảo vệ của các cationic protein trong các hạt bào tương (Zeya, 1971; 1975); protein BPI (bacterial permeability inducing factor) tách từ bào tương bạch cầu trung tính của bệnh nhân bị bệnh ung thư bạch cầu tuỷ mãn tính. Tính chất cũng như trình tự amino acid của protein này đã được xác định bởi các công trình của Pohl (1990) và Morgan (1991). Vào năm 1993-1996 Shafer công bố nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của một loại peptide tổng hợp hoá học dựa trên cấu trúc bậc nhất của cathepsin G, ông còn cho biết thêm rằng peptide được tổng hợp từ các dạng D-amino acid và dạng L-amino acid có hoạt tính kháng khuẩn tương đương. Bên cạnh việc tách chiết và nghiên cứu các protein có hoạt tính sinh học trong tự nhiên và bằng tổng hợp hoá học, ngày nay với kỹ thuật di truyền hiện đại các nhà nghiên cứu đã xây dựng được phương pháp mới để thu nhận các peptide có hoạt tính sinh học cao nhằm chăm sóc và bảo vệ sức khoẻ cộng đồng. Dựa trên tình tự các amino acid đã được xác định từ các peptide tách chiết ngoài tự nhiên hoặc các peptide đã được tổng hợp theo phương pháp hoá học, các nhà nghiên cứu đã tổng hợp các đoạn oligonucleotide hoặc tách và nhân các gene mã hoá các peptide tự nhiên bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction), sau đó tạo các vector tái tổ hợp và biến nạp vào các tế bào để thu nhận các sản phẩm tái tổ hợp có hoạt tính mong muốn. Mục đích sau đó tạo các chủng sản xuất để thu nhận sản phẩm ở mức độ pilot. Đây là phương pháp mới, song cũng có những kết quả đáng khích lệ và đang được tiến hành ở nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới.
60. Công nghệ Enzyme – Protein 60 Thành tựu nổi bật nhất trong lĩnh vực sản xuất protein tái tổ hợp là các loại vaccine như phòng chống viêm gan B, sốt xuất huyết, bệnh đậu mùa v.v cho con người và nhiều loại vaccine cho động, thực vật mà chúng tôi sẽ giới thiệu lồng ghép trong các mục về sản xuất vaccine ở phần dưới. Vaccine được coi là phương thức hữu nghiệm nhất phòng chống và làm giảm phần lớn tỷ lệ mắc và chết do các đại dịch rủi ro đưa đến. Vì những lý do khác nhau, không có một quốc gia nào có được sự cung ứng vaccine ngay từ đầu đại dịch mà thường là nhiều tháng sau đó. Nền sản xuất vaccine lớn mang tính chất thương mại muốn có vaccine cũng phải có tới 3-6 tháng sau đại dịch virus bùng nổ. Gần đây, người ta thường nói nhiều đến cúm gia cầm, khả năng sản xuất các vaccine cúm được tập trung nhiều ở châu Âu và Bắc Mỹ. Năng lực sản xuất hiện nay ước tính 300 triệu liều vaccine tam liên (ba thành phần) trong một năm, khả năng này còn kém xa với nhu cầu tăng lên trong đại dịch. Tổ chức y tế thế giới (WHO), qua mạng lưới đặc biệt các phòng thí nghiệm cúm đã quan sát liên tục sự diễn biến của virus H5N1 từ khi ca nhiễm đầu tiên trên người ở Hong Kong năm 1997. Các phòng thí nghiệm này chuẩn bị chủng vaccine nguyên bản (đầu tiên), nó đang được chứng minh trong một kỹ nghệ như một “gốc giống” để phát triển vaccine. Các phòng thí nghiệm này đã hướng dẫn việc phân tích cấu trúc phân tử của virus, bảo đảm giúp đỡ công việc phát triển vaccine tiến triển. Một phần việc quan trọng là đã khám phá ra sự đột biến của virus trong năm 2005. Vài trong số 10 nước có các cơ sở sản xuất vaccine nội địa, hiện đang tiến hành phát triển một vaccine cho đại dịch. Một vài nơi trong số các dự án phát triển vaccine đại dịch đã tiến đến giai đoạn thử nghiệm lâm sàng, mong có thời gian ngắn nhất của thử nghiện lâm sàng đối với các vaccine dự tuyển khác nhau. Một công ty cho biết sẽ báo cáo kết quả thử nghiệm lâm sàng với WHO vào đầu tháng 12 năm 2005. Hiện tại chưa đưa ra được một công thức vaccine cúm có hiệu quả và kinh tế về việc sử dụng hàm lượng kháng nguyên-thành phần kháng nguyên của vaccine kích thích đáp ứng miễn dịch. Bởi vậy những cuộc thử lâm sàng diễn ra với cách kiểm chứng các công thức vaccine khác nhau, kể cả chất hấp phụ. Chất này tăng cường
61. Công nghệ Enzyme – Protein 61 đáp ứng miễn dịch, và về lý thuyết thì nó có thể cho phép bảo vệ thích hợp ở mức hàm lượng kháng nguyên thấp. Xu hướng này cũng đang tiến hành. Như chúng ta đã biết, vaccine thì cần cho một đại dịch thực sự đang tới gần, mà việc sản xuất thương mại thì không thể bắt đầu khi một đại dịch virus bùng nổ. Bởi vậy, WHO đã khuyến khích về mặt kỹ nghệ và nhưng cơ quan có thẩm quyền đưa ra những quy trình nhanh chóng cho việc cấp giấy phép và sử dụng vaccine đại dịch. Việc này WHO đã thực hiện. Ngoài ra, WHO đang sử dụng diễn đàn Quốc tế cổ vũ cộng đồng quốc tế tìm kiếm nhiều cách tăng khả năng sản xuất và bảo đảm rằng các nước đang phát triển có được một vaccine hiệu quả trong một nổ lực có thể được về giá cả. Tuy nhiên, theo xu hướng hiện tại hầu hết các nước đang phát triển sẽ chưa có vaccine dùng trong thời điểm bắt đầu đại dịch mà chỉ có được trong thời gian xảy ra đại dịch Ở Việt nam ta, trong những thập niên vừa qua tình hình nghiên cứu và sản xuất các chất protein có hoạt tính sinh học cũng đã thu được những kết quả đáng kể. Nhiều công trình nghiên cứu phân lập và tách chiết các protein có hoạt tính sinh học đã được công bố. Tuy nhiên, hầu hết các công trình chỉ đề cập đến việc điều tra trong tự nhiên, nghiên cứu cấu trúc, chức năng và ứng dụng, mà chưa đề cập nhiều đến sản xuất các loại protein đó. Mặc dù không nhiều nhưng cũng đã có những ghi nhận bước đầu như việc sản xuất thành công một số loại vaccine phòng bệnh của Viên vệ sinh dịch tễ Trung ương như vaccine virus viên gan B(kháng nguyên bề mặt- HbsAg), vaccine phòng viêm não Nhật bản, vaccine virus dại (kháng nguyên G)v.v Gần đây nhất (2003), bằng kỹ thuật di truyền nhóm tác giả Lê Trần Bình (Viện công nghệ sinh học-TTKH & CNQG) đã thu nhận được một loại peptide tái tổ hợp có hoạt tính kháng khuẩn và một loại protein khác có tên gọi là melittin (loại protein có trong nọc ong dùng để điều trị bệnh nhiễm khuẩn và làm tan các khối u). 7.2. Sản xuất protein bằng con đường vi sinh vật Ngay từ thời cổ xưa vi sinh vật vật đã được con người sử dụng để chế biến và sản xuất thực phẩm, nó là một bộ phận trong khẩu phần ăn của con người và các loài vật nuôi. Ngày nay việc sản xuất protein từ nguồn vi sinh vật không chỉ còn là mục đích chỉ sử dụng để làm thức ăn đơn thuần, mà còn được sử dụng cho nhiều mục
62. Công nghệ Enzyme – Protein 62 đích khác nhau nữa như sản xuất các loại hormon, các peptide kháng sinh và các chất miễn dịch v.v Về nguyên tắc chung: để sản xuất protein từ vi sinh vật, tuỳ theo mục đích riêng để sử dụng loại vi sinh vật (giống) và môi trường nuôi cấy (lên men) thích hợp, nhằm tạo điều kiện thuận lợi cho vi sinh vật tổng hợp tối đa lượng các loại protein mong muốn. Để thu nhận chế phẩm protein từ vi sinh vật, việc tách chiết được tiến hành như việc chiết xuất các protein khác. Dưới đây xin được giới thiệu công nghệ sản xuất một số protein bằng con đường vi sinh vật: 7.2.1. Sản xuất protein đơn bào 7.2.1.1. Khái quát chung về sản xuất protein đơn bào. Protein đơn bào (SCP- Single Cell Protein), là tên gọi theo quy ước để chỉ vật chất tế bào vi sinh vật được sử dụng làm thức ăn cho người và động vật. Thuật ngữ này thật ra không chính xác hoàn toàn, vì lượng sản phẩm tao ra không phải là một protein thuần khiết mà là các tế bào được xử lý thuộc nhiều loại vi sinh vật khác nhau, cả đa bào lẫn đơn bào và bao gồm vi khuẩn, nấm men nấm sợi và tảo. So với sản xuất các nguồn protein truyền thống sản xuất SCP có nhiều ưu thế sau đây: - Tốc độ sinh sản cao. - Hàm lượng protein cao(30- 80% tính theo trọng lượng khô). - Có thể dùng các nguồn carbon khác nhau (mà một số vẫn được coi là chất phế thải). - Các chủng có năng suất cao và thành phần tốt: dễ kiếm, dễ chọn. - Diện tích sản xuất không lớn, cho sản lượng cao (trừ tảo). - Không phụ thuộc vào mùa vụ, khí hậu. 7.2.1.2. Quy trình sản xuất SCP. Quy trình để sản xuất SCP bao gồm các bước chính sau đây: - Chuẩn bị nguồn C, thường là phải qua một tổ hợp xử lý vật lý và hoá học. - Chuẩn bị môi trường thích hợp chứa nguồn C và các nguồn N, P và các chất dinh dưỡng khác.
63. Công nghệ Enzyme – Protein 63 - Ngăn ngừa sự nhiễm tạp của môi trường hoặc thiết bị sản xuất. - Cấy vi sinh vật mong muốn. - Tách sinh khối tế bào vi sinh vật khỏi môi trường đã tiêu dùng. - Hậu xử lý sinh khối tinh khiết hay là không. 7.2.1.3. Những vấn đề cần lưu ý trong sản xuất SCP. Nuôi cấy Dù là lên men diễn ra dưới điều kiện vô trùng hoặc điều kiện sạch đều cần phải có biện pháp để tránh tạp nhiễm như: đun nóng hoặc lọc các thành phần môi trường và khử trùng thiết bị lên men; khác với tảo, các quá trình sản xuất SCP đều cần thông khí mạnh; nhiệt tạo ra phải có hệ thống làm lạnh. Thu hồi sinh khối Nấm men và vi khuẩn thường được thu hồi bằng ly tâm (vi khuẩn cần năng lượng ly tâm cao hơn), trong nhiều trường hợp cần cả nhân tố vón cục (kết bông/ kết cụm). Các vi sinh vật ở dạng sợi có thể thu hồi nhờ ly tâm vắt (lọc vắt), giá thành sẽ rẻ hơn. Phải loại bớt càng nhiều nước trước khi làm khô để tránh tốn kém trừ những nơi có thể phơi nắng và sử dụng lao động giá rẻ, tuy nhiên sản phẩm sẽ có chất lượng thấp. Tuỳ thuộc vào loại cơ chất và loại sản phẩm, sinh khối cần được hậu xử lý để loại các thành phần cơ chất hay thường gặp hơn là làm giảm hàm lượng các chất không mong muốn (ví dụ acid nucleic) hoặc thậm chí để tách riêng phần protein. Một nhược điểm quan trọng của SCP là thường chứa hàm lượng acid nucleic cao, đặc biệt là ở vi khuẩn, nấm men và nấm sợi. Nếu các loại SCP dùng để làm thức ăn cho người thì là cả vấn đề, bởi vì con người thiếu enzyme uricase xúc tác cho sự oxy hoá acid uric thành allantoin hoà tan hơn. Ăn nhiều các dẫn xuất purine sẽ làm tăng hàm lượng acid uric trong máu, acid này kết tủa sẽ tạo thành tinh thể trong các khớp và đóng góp vào việc tạo nên các viên sỏi trong đường tiết niệu. Theo Edozien(1970) hàng ngày một người chỉ nên ăn 20 gam nấm men (tính theo trọng lượng khô). Đã có những phương pháp đề ra nhằm làm giảm hàm lượng acid nucleic trong SCP. Nhưng thường thì các phương pháp xử lý ấy sẽ dẫn đến làm giảm giá trị sinh học của protein đơn bào. Các phương pháp chính là: - Thuỷ phân bằng kiềm
64. Công nghệ Enzyme – Protein 64 - Chiết bằng hoá chất. - Điều khiển về sinh trưởng và sinh lý tế bào. - Hoạt hoá RNA ase (bằng xử lý nhiệt ngắn). Đề phòng để không loại ra khỏi môi trường ngoài những số lượng lớn vi sinh vật kể cả dạng chết lẫn dạng sống. Khi dịch thải có hàm lượng BOD (Biologycal Organic Demand) cao thì cần phải xử lý để tránh ô nhiễm môi trường. Sau khi xử lý môi trường có thể tái sử dụng, việc này nhằm đồng thời hai mục đích là giảm lượng nước mới cần thiết và giảm giá thành. Theo tính toán, nhu cầu nước cần sử dụng là 18- 45 x 106 lít cho một nhà máy sản xuất 100.000 tấn SCP/ năm. Tuyển chọn vi sinh vật. Một vi sinh vật được sử dụng cho mục đích sản xuất SCP làm nguồn thức ăn protein cho người hoặc động vật cần phải có một số đặc điểm là: - Không gây bệnh động thực vật và người. - Có giá trị dinh dưỡng cao. - Được chấp nhận như là một loại thực phẩm hoặc thức ăn gia súc. - Không chứa các độc tố. - Giá thành sản xuất thấp (nghĩa là phụ thuộc vào tốc độ sinh trưởng; sản lượng; hàm lượng protein; có đòi hỏi bổ sung chất dinh dưỡng hay không; có ưu thế phát triển chọn lọc trên môi trường sản xuất; dễ tách và dễ làm khô) và cụ thể với từng loại vi sinh vật như sau: a) Đối với tảo. Ở tảo người ta thường dùng ba chi để sản xuất SCP là: Chlorella, Spirulina và Scenedesmus chúng có thể có phương thức sinh dưỡng là quang hợp, hoá tổng hợp hoặc là dị dưỡng. Phương pháp hay dùng là phương pháp quang hợp. Trong trường hợp này nhân tố giới hạn là ánh sáng, vì vậy kinh tế nhất là dùng các hồ hở dưới ánh sáng mặt trời. Tuy nhiên khi tiến hành nuôi tảo ở các hệ thống có quy mô lớn thì khó có thể giử được các điều kiện vô trùng với giá thành thấp và trong trường hợp này nguy cơ nhiễm tạp là nghiêm trọng. Mặt khác, mật độ tế bào khi nuôi tảo thường thấp (ở các hệ thống nuôi lớn chỉ thu được 1-2 gam/lít tính theo trọng lượng khô) để
65. Công nghệ Enzyme – Protein 65 có thể đạt được điều kiện chiếu sáng tốt, song điều này sẽ dẫn đến chi phí tốn kém hơn khi thu hoạch. Riêng tảo Spirulina có thể thu hoạch kinh tế hơn nhờ biện pháp lọc hoặc vớt. Thành phần các cao phân tử của tảo thay đổi rất nhiều phụ thuộc vào các điều kiện sinh trưởng. Hàm lượng protein thô (N x 6,25) có thể chiếm tới 60%, thành phần các amino acid cân đối, riêng amino acid chứa lưu huỳnh thấp. Tảo chứa nhiều sắc tố, một ưu điểm khi được dùng làm thức ăn gia súc, song lại không tốt cho dinh dưỡng của người. Hiện nay SCP của ba chi tảo nói trên có thể dùng làm thực phẩm cho người tuy nhiên với một tỷ lệ thấp. Riêng Spirulina từ lâu vẫn được coi là nguồn dinh dưỡng protein lý tưởng và rẻ tiền ở Mehico và vùng bờ bắc hồ Tchad của châu Phi, tảo này ngoài hàm lượng protein cao còn chứa nhiều nguyên tố vi lượng và rất giàu vitamin B12 ( gấp 4 lần so với gan bò). Ở đó họ có thể vớt spirulina từ các thuỷ vực tự nhiên. b) Đối với vi khuẩn. Vi khuẩn có thể được dùng để sản xuất SCP, tuy nhiên cần chú ý một số ưu và nhược điểm sau đây: - Tốc độ sinh trưởng nhanh. - Dùng được nhiều loại cơ chất. - pH cần giữ ở 5-7, nếu không sẽ có nguy cơ bị nhiễm vi khuẩn gây bệnh. - Thu hồi bằng li tâm khó. - Hàm lượng protein thô có thể rất cao ( tới 80%) song hàm lượng bình thường của các acid nucleic đặc biệt là RNA cũng cao (tới 20%) và cần phải được loại bỏ. - Thành phần amino acid cân đối nhưng hàm lượng amino acid chứa S hơi thấp. - Khi dùng các vi khuẩn gram âm để sản xuất SCP cần lưu ý khả năng sản sinh độc tố của chúng. c) Đối với nấm men Nấm men đã được sử dụng để sản xuất SCP với quy mô lớn từ lâu, đặc biệt là việc sử dụng các loài trong những chi như Saccharomyces, Torulopsis và Cadida.
66. Công nghệ Enzyme – Protein 66 Tuy nhiên cũng như vi khuẩn việc sản xuất SCP từ nấm men cần lưu ý các đặc điểm là: - Thường tốc độ sinh trưởng của nấm men tương đối cao nhưng không bằng các chủng vi khuẩn sinh trưởng nhanh nhất. - pH trong lên men thường giữ pH ở 3-5, điều này tạo điều kiện thuận lợi cho việc làm giảm nguy cơ nhiễm trùng. - Có thể thu hoạch bằng biện pháp ly tâm liên tục. - Hàm lượng protein nằm vào khoảng 50- 60%, tuy nhiên hàm lượng acid nucleic có thể lên tới 15%, vì vậy cần phải tiến hành các biện pháp để làm giảm lượng acid nucleic. - Thành phần amino acid cân đối nhưng so với vi khuẩn thì hàm lượng các amino acid chứa lưu huỳnh còn thấp hơn. Để sử dụng cần phải bổ sung thêm methionine. - Giàu các vitamin nhóm B. d) Đối với nấm sợi. Khi chọn giống nấm sợi để sản xuất SCP trước hết cần lưu ý có nhiều loài mang độc tố, chúng thường xuyên đe dọa tính mạng mà đặc biệt gây ung thư cho con người. Ngày nay người ta đã tìm được trên 20 loại hoạt tính khác nhau các độc tố ở nấm sợi So với vi khuẩn và nấm men, nấm sợi thường có tốc độ sinh trưởng chậm hơn. Gần đây người ta đã phân lập được các chủng có tốc độ sinh trưởng gần bằng nấm men và nấm sợi có một số đặc điểm sau: - Giới hạn thích hợp cho sinh trưởng khá rộng (từ 3- 8), tuy nhiên trong sản xuất cần giử pH < 5 để tránh nhiễm khuẩn. Việc nhiễm nấm men thường hay xẩy ra nếu môi trường không được khử trùng tốt. - Khi nuôi cấy chìm nấm sợi thường tạo thành các đám sợi, điều này có ưu điểm là làm cho việc thu hoạch dễ dàng, nhưng lại có nhược điểm là hạn chế sự phân bố đồng đều không khí trong toàn bộ hệ sợi.
67. Công nghệ Enzyme – Protein 67 - Hàm lượng protein thô nằm trong khoảng 50- 55%, song khi sinh trưởng nhanh hàm lượng acid nucleic sẽ cao (RNA tới 15%). - Thành phần amino acid của nấm sợi cân đối, tuy nhiên các amino acid chứa lưu huỳnh cũng có mặt ở nồng độ thấp. 7.2.2. Tổng hợp các hormon bằng vi sinh vật Cách đây khoảng 60 năm về trước, các nhà khoa học mới biết cách sử dụng nấm để chế tạo thuốc kháng sinh penicillin và chế tạo các loại thuốc kháng sinh khác được sử dụng rộng rãi hiện nay. Hơn 20 năm trước đây đã diễn ra một cuộc đột phá thực sự mang lại lợi ích to lớn cho con người đặc biệt trong lĩnh vực y dược. Lúc đó, các nhà khoa học đã biết cách đưa gen người vào phân tử ADN của vi khuẩn và tế bào động vật, rồi buộc chúng phải sản sinh ra một loại protein có tác dụng chữa bệnh. Sản phẩm đầu tiên của phương pháp đó là insulin (một loại hormon chống bệnh đái tháo đường) được Hãng Eli Lilly&Co phát minh năm 1982 thông qua vi khuẩn biến tính gen E. coli. Ngày nay đã có hơn 130 dược chất sinh học đã được chính thức công nhận bởi Tổng cục kiểm soát tân dược của Mỹ và được sử dụng trong y học. Ở đây đa số khối lượng hàng bán đi thuộc các loại dược phẩm như erythropoetin, interferon, hormon tăng trưởng và insulin con người của một số hãng sản xuất đứng đầu thế giới . 7.2.2.1. Sinh tổng hợp insulin bằng E. coli. Trước đây insulin được tách từ tuyến tuỵ của bò, lợn đôi khi gây dị ứng cho người. Trong cơ thể insulin được tổng hợp dưới dạng proinsulin gồm có ba chuỗi polypeptide là A, B và C. Khi chuyển thành insulin thì chuỗi C đã được loại bỏ. Bằng kỹ thuật tái tổ hợp DNA, người ta chuyển gene mã hoá insulin vào vi khuẩn, và khi được nuôi cấy trong môi trường thích hợp, vi khuẩn E. coli sẽ sinh tổng hợp tạo ra loại peptide này. Quy trình sản xuất theo phương pháp này có thể tóm tắt gồm các bước cơ bản sau đây: - Chuẩn bị đoạn oligonucleotide mã hoá cho insulin: dựa vào trình tự và cấu trúc của các amino acid của insulin gồm có 51 amino acid và 2 chuối polypeptide A