›
›

Chọn lọc giống nhờ marker phân tử DNA

ppt 60 trang phuongnguyen 60
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Chọn lọc giống nhờ marker phân tử DNA", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pptchon_loc_giong_nho_marker_phan_tu_dna.ppt

Nội dung text: Chọn lọc giống nhờ marker phân tử DNA

  1. CHƯƠNG VI CHỌN LỌC GiỐNG NHỜ MARKER PHÂN TỬ DNA
  2. Các khái niệm cơ bản Việc phát minh ra máy chu kỳ nhiệt (thermocycler) và sử dụng DNA polymerase có khả năng chịu đựng một phổ khá rộng về nhiệt độ như Taq đã giúp cho Kary Mullis đoạt giải Nobel 1993. PCR (polymerase chain reaction) phản ứng chuổi polymerase bao gồm: 1- Biến dây đôi thành dây đơn 2- Phản ứng của primer gắn vào dây chuổi mã trên dây template (gọi là tiến trình annealing) để có phân tử DNA mới. 3- Kéo dài dây mới nhờ primer (extension)
  3. Các khái niệm cơ bản Sự phát triển và phân lập DNA polimerase có tính ổn định rất cao đối với nhiệt độ, từ một vi khuẩn có tính chịu nhiệt là Taq cho phép chúng ta có thể tổng hợp dây DNA mới có tính chất lặp đi, lặp lại nhiều lần Số lượng khyếch đại tăng theo hàm số mũ Một polimerase của DNA và bốn deoxy (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) được dùng để khuếch đại một đoạn chuyên tính nào đó của DNA
  4. Taq (Thermus aquaticus) • Taq là vi khuẩn có tính chịu nhiệt • Nếu nồng độ Taq quá cao, những sản phẩm không chuyên tính có thể nhảy vào làm sai lệch kết quả. • Nếu nồng độ Taq quá thấp, chúng ta sẽ không có đủ số lượng men để xúc tác tạo ra sản phẩm PCR theo ý muốn
  5. Deoxynucleotide triphosphate • Hàm lượng deoxynucleotide trong khoảng 20 đến 200mM cho kết quả ổn định, trung thực, và chuyên tính. • Bốn dNTP được xử lý sao cho nồng độ chúng tương đương nhau, để giảm thiểu tối đa hiện tượng sai biệt do kết hợp sai mã di truyền nào đó.
  6. Magnesium chloride Nồng độ Mg2+ có thể ảnh hưởng đến : • Quá trình anneling của primer. • Nhiệt độ để tháo dây thành dây đơn. • Sự chuyên tính của sản phẩm PCR. • Hoạt động của enzym và sự trung thực của kết quả. PCR sẽ cần một hàm lượng Mg từ 0,5 đến 2,5mM ứng với hàm lượng tổng số dNTP đã cho.
  7. Cặp mồi primer RAPD: Chiều dài ngắn 10-16 mer Ti thể, microsatellite dài 20-24 mer Nồng độ cao không những không cần thiết mà tạo ra bất lợi, vì quá thừa primer, dẫn đến sự hình thành hiện tượng primer dimers, và hiện tượng priming nhằm
  8. Nhiệt độ annealing Td = 4 (G + C) + 2 (A + T) đối với primer có khoảng 20 oligonucleotide Số base càng ít, nhiệt độ càng thấp, và ngược lại
  9. Phản ứng dung dịch đệm Tính chất quyết định là nồng độ Mg2+, kể cả về tác dụng chuyên biệt và kết quả PCR Nồng độ của Mg2+ sẽ làm cho phân tử DNA dây đôi ổn định hơn, và ngăn ngừa sự biến chất hoàn toàn (sự mở dây đẻ cho dây đơn) của sản phẩm trong mỗi chu kỳ, làm cho kết quả PCR ít đi.
  10. Phản ứng dung dịch đệm Lượng dư thừa Mg2+ còn làm cho hiện tượng anneling giả xảy ra thêm ổn định hơn, tại những vị trí không đúng của dây đơn, cho ra những sản phẩm không mong muốn với số lượng khá lớn, nhưng mức độ chuyên tính rất thấp. nồng độ Mg2+ quá thấp (<0,5 µM), nó sẽ làm xấu đi quá trình extension (kéo dài chuỗi mã đối lập với dây gốc), trong đó Mg2+ đóng vai co-factor của Taq polimerase.
  11. DNA template Khi khuyếch đại vùng mục tiêu từ dây đơn DNA, số lượng của template được tính toán trên cơ sở mol. Phép tính này giúp chúng ta xác định số lượng DNA cần phải có, số chu kỳ để tổng hợp ra DNA với số lượng mong muốn.
  12. Tỉ lệ giữa primer : template • Nếu tỉ lệ này quá cao, hiện tượng primer- dimers sẽ xuất hiện, giống như trường hợp mẫu DNA quá loãng. nếu tỉ lệ này quá nhỏ, kết quả sản phẩm PCR không nhiều. • Hầu hết các trường hợp áp dụng PCR, đều dùng một nồng độ primer để tránh hiện tượng primer-dimers.
  13. Thiết kế primer • Nhiệt độ khác nhau giữa cặp mồi xuôi và ngược không quá 3oC. • Tỉ lệ GC trên 50%. • Chiều dài của mỗi primer là 18 bp và 24 bp. • Cặp mồi không tận cùng GC. • Dựa vào chương trình phần mêm để thiết kế.
  14. Ứng dụng các CNSH trong Thủy sản. Ph¬ng ph¸p Random Amplified Polymorphism DNA RAPD: DNA ®a h×nh khuyÕch ®¹i ngÉu nhiªn Ph¬ng ph¸p Restriction Fragment Length Polymorphism RFLP: §a h×nh chiÒu dµi ph©n ®o¹n c¾t h¹n chÕ Ph¬ng ph¸p microsatellite: §a h×nh vÒ sè ph©n ®o¹n nucleotide ng¾n (2-6) lÆp l¹i ë mét locus microsatellite Ph¬ng ph¸p Amplified Fragment Length Polymorphism AFLP: §a h×nh chiÒu dµi ph©n ®o¹n khuyÕch ®¹i Ph¬ng ph¸p Single Nucleotide Polymorphism SNP: §a h×nh nucleotide ®¬n
  15. Microsatellite §a h×nh vÒ sè ph©n ®o¹n nucleotide ng¾n (2-6) lÆp l¹i ë mét locus Phương pháp kinh điển - Ly trích DNA - Cắt với enzyme hạn chế - Nối kết và chuyển đổi - Nuôi cấy khuẩn lạc - Hybridise - Phân lập plasmid - Chạy trình tự - Thiết kế primer
  16. ISOLATION, CHARACTERISATION, AND AMPLIFICATION OF MICROSATELLITE MARKERS: PROTOCOL BREAKDOWN STRUCTURE DOT-BLOT: microsatellite presence/density (Facultative) •Extract DNA Cloning vector •Cut DNA with SAU 3A (cut with BAM HI) •Size-select fragments (400-900 pb) low insert size poor Ligate ligation efficiency non-optimal Transform colony density competent cells Test-Spread: Transformed cell density Average insert size (PCR) •Spread ligation mix on Petri dishes •Replate two series of colonies on grid Petri dishes
  17. Serie 1 Serie 2 too few Store at 4°C Lift colonies onto Nylon membrane positive clones Test-membrane: Hybridise and estimate positive clone density Label oligonucleotide probes with Entire membrane set: digoxigenine •Hybridisation •Locate and ID positive clones •Mark colour intensity •Estimate insert sizes of positive clones (PCR) •Store clone collection at -80°C Select positive clones with appropriate colour intensity and insert size •Isolate plasmid (Miniprep) •Tests: non-radioactive PCR •Sequence inserts + •Tests: radioactive PCR •Select PCR primers •Estimate level of variability Use microsatellite markers routinely
  18. Các phương pháp khác Randomly amplified microsatellites (RAM) • Sử dụng 5’anchor primer với trình tự CT, GA, ATG, TG, GATA • PCR • Cloning với TA cloning kit (Invitrogen, USA). • Cấy khuẩn lac • Ly trích plasmid • Chay trình tự • Thiết kế primer
  19. Các phương pháp khác Random hybridizing microsatellites (RAHM) • RAPD PCR • Hybridise • Cloning với TA cloning kit (Invitrogen, USA). • Cấy khuẩn lạc • Ly trích plasmid • Chạy trình tự • Thiết kế primer
  20. Thiết kế primer • Nhiệt độ Tm (melting temperature) khác nhau giữa primer forward và reverse không quá 30C. • GC của primers là 50%. • Chiều dài của primers từ 18 bp and 24 bp. • Tận cùng của primer không nên là GGG, CCC, TTT, AAA hoặc T
  21. Ty thể • Ly trích DNA • PCR với primer co trình tự của các gen trên ty thể. • Điện di • Chạy trình tự • Phân tích số liệu
  22. Tổng thể của ty thể
  23. RAPD DNA ®a h×nh khuyÕch ®¹i ngÉu nhiªn • Ly trích DNA • PCR dùng các primer ngắn (9-12) • Điện di • Phân tích các băng • RAPD phần mềm để phân tích tính đa hình
  24. øng dông trong NTTS thÕ giíi: • Ph©n lo¹i gièng loµi, b¶o tån quü gen (Capili ctv.; Sodsuk & ctv.) • §¸nh gi¸ ®a d¹ng di truyÒn (Austin ctv., Sodsuk & ctv.) • BiÕn dÞ quÇn thÓ, vËt liÖu ban ®Çu chän gièng (Moore, Kate ctv., Piamsak & ctv.) • Ph¸t hiÖn t¸c nh©n g©y bÖnh (Lo & ctv.;Lightner & ctv.; Fegan, Flegel & ctv.) • QTLs (Hulata & ctv.;) • §iÒu khiÓn giíi tÝnh (Brenden & ctv.; Kanokporn; Piamsak & ctv.)) • ChuyÓn cÊy gen (Hew & ctv.; Maclean & ctv.; Zhu & ctv.)
  25. Nghiªn có øng dông ë níc ta: • Ph©n biÖt gièng loµi, b¶o tån quü gen: - Kh¸c biÖt l¬n miÒn b¾c-miÒn nam: EST3 ë l¬n miÒn nam - ChÐp Tr¾ng ViÖt nam kh¸c chÐp Hung, Vµng Indonesia vÒ kiÓu Transferring: AB, BB, BD, CC vµ DD.
  26. Nghiªn có øng dông ë níc ta (Tuấn, 2004) • VËt liÖu chän gièng c¸ Tra: - Ph©n tÝch biÕn dÞ RAPD (31 primer), mtDNA- RFLP (20 enzyme giíi h¹n), microsattlite (10 primer ®Æc trng c¸ tra) - Ph©n tÝch trªn 4 quÇn ®µn c¸ tra: 3 quÇn ®µn tr¹i gièng,1 quÇn ®µn tù nhiªn - KÕt qu¶: + C¸c quÇn ®µn cã ®a d¹ng di truyÒn cao + QuÇn ®µn tù nhiªn ®a d¹ng h¬n c¶.
  27. Nghiªn có øng dông ë níc ta: (Tuấn, 2004) • VËt liÖu chän gièng t«m só: - Ph©n tÝch biÕn dÞ RAPD (4 primer), mtDNA-RFLP (15 enzyme giíi h¹n), microsattlite (8 primer) - Ph©n tÝch trªn 3 quÇn ®µn t«m só: miÒn trung, nam Bé vµ nhËp néi - KÕt qu¶: + C¸c quÇn ®µn cã ®a d¹ng di truyÒn cao + T¬ng ®ång gi÷a t«m miÒn trung vµ nam bé cao + Khi t¹o vËt liÖu chän gièng nªn sö dông c¶ t«m nhËp néi
  28. Nghiªn có øng dông ë níc ta • Di truyÒn giíi tÝnh: - Lª §×nh L¬ng, TrÇn Mai Thiªn & CTV. 2001 - Trªn t«m cµng xanh - RAPD dïng måi OPN15 - Kh«ng thÊy band ®Æc trng t«m ®ùc, t«m c¸i.
  29. Nghiªn có øng dông ë níc ta: • Ph¸t hiÖn t¸c nh©n g©y bÖnh t«m: - Ph¸t hiÖn sím virus g©y bÖnh ®èm tr¾ng, ®Çu vµng t«m só - Ph¸t hiÖn ®ång thêi nhiÒu t¸c nh©n g©y bÖnh - §a h×nh virus g©y bÖnh: t¬ng ®ång cao vÒ tr×nh tù nucleotide ë virus g©y bÖnh ®èm tr¾ng trªn t«m nu«i t¹i c¸c vïng kh¸c nhau • T¹o kh¸ng thÓ phßng bÖnh: - T¹o kh¸ng thÓ lßng ®á trøng phßng bÖnh ë t«m só
  30. Nghiªn có øng dông ë níc ta • Trî gióp chän gièng sinh trëng c¸ tra: - Ph©n tÝch ®a h×nh AFLP, sö dung 69 cÆp måi - Ph©n tÝch trªn 2 nhãm c¸ kÝch thíc lín vµ kÝch thíc nhá - Sè b¨ng cã ®é chªnh lÖch >50%: 4 - Sè b¨ng chªnh lÖch >50% t¸i lÆp ®îc: 3 - Gi¶i tr×nh tù 3 b¨ng t¸i lÆp: AFLP1, AFLP2 & AFLP3
  31. Nghiªn có øng dông ë níc ta • Trî gióp chän gièng sinh trëng c¸ tra: AFLP1, ®¹i diÖn nhãm c¸ nhá, cã ®é dµi 113bp. 3’- GATGAGTCCTGAGTAACAACTACATAAACATGACGTCCATGATTCACGTGTGAAATTTAC TCGTGATTTTCAGACACTTCAGATGTTACGCCTGGTGAATTGGTACGCAGTCA -5’. AFLP2, ®¹i diÖn nhãm c¸ nhá, cã ®é dµi 123bp. 3’- TGACTGCGTACCAATTCAGGCATGNATGACGAAGAGCGAGACCATCTCTACACTGTCCAT GAGCTCCTTAGAGGTAAGGCTATAGTTTATAAGGCTGTATATTAAGTTACTCAGGACTCA TCA –5’. AFLP3, ®¹i diÖn nhãm c¸ lín, cã ®é dµi 723bp. 3’- GACTGCGTACCAATTCAAGAGCCGAATTCCAGCTCACTGGCGGCCGTTACTAGAGGATCCGAGCTCGGTACCAAGCTTGGCGTAATCATG GTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGC CTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATC GGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCG AGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGGAGCTAAAGGCCAGC AAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAA GTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCNTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCC GCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCATTCNGGTAGGTCGT – 5’
  32. Nghiªn có øng dông ë níc ta • Trî gióp chän gièng sinh trëng c¸ tra: Marker Nhãm c¸ lín Nhãm c¸ Chªnh lÖch nhá 2 nhãm AFLP1 38%(40/106) 73%(73/100) 35% AFLP2 37,5%(39/10 71%(71/100) 33,5% 4) AFLP3 96% 94%(94/100) 2,0 (100/104)
  33. Nghiªn có øng dông ë níc ta: • Trî gióp chän gièng sinh trëng c¸ tra: - Gi¶i tr×nh tù Intron 1 ë gen ®iÒu khiÓn GH - So s¸nh ®ét biÕn nucleotide ë 2 nhãm c¸ lín, c¸ nhá - §a h×nh RFLP víi AlwNI, BsmAI vµ MboII - C¸ lín c¾t BsmAI: 95%(118/124) - C¸ nhá kh«ng c¾t BsmAI: 78% (92/118)
  34. Nghiªn có øng dông ë níc ta: • Trî gióp chän gièng mµu thÞt c¸ tra: - Ph©n tÝch RAPD: 10 primer - mtDNA-RFLP: 16 enzyme giíi h¹n - Microsattlite: 10 primer ®Æc trng c¸ tra - Kh¸c biÖt vÒ tÇn sè, kh«ng thÊy chØ thÞ ®Æc trng theo mµu thÞt.
  35. Nghiªn có øng dông ë níc ta • Trî gióp chän gièng sinh trëng t«m só: - Ph©n tÝch AFLP trªn 2 nhãm t«m só lín vµ nhá - Sö dông 20 tæ hîp måi - X¸c ®Þnh c¸c band ®Æc trng, kh¸c biÖt gi÷a 2 nhãm t«m cã kÝch th- íc kh¸c nhau
  36. MiÒn B¾c MiÒn Nam Clonorchis sinensis Opisthorchis viverrini
  37. INFECTION RATE OF CLONORCHIS SINENSIS AND OPISTHORCHIS VIVERRINI Bắc Việt nam 1. Ha Giang: 0,6% 2. Thanh Hoa:11% 3. Hoa Binh: 5% 4. Ha Tay: 16% 5. Ninh Binh: 20-30% 6. Ha Nam: 3% 7. Nam Dinh: 3-37% 8. Thai Binh: 0,2% 9. Hai Phong: 13,1% 10. Bac Giang: 16,3% 11. Nghe An: 0,9% Nam Việt nam: 12. Da Nang: 0,3% 13. Binh Dinh: 11,9 % 14. Phu Yen: 36,9 % 15. Dak Lak: 7,6 % (H×nh th¸i häc: NIMPE; QIMPE; X¸c ®Þnh ph©n tö: IBT)
  38. C¸ ao nhµ s½n cã cho mãn gái
  39. ChÕ biÕn gái b»ng c¸ch th¸i nhá
  40. NhËu vµ thãi quen ¨n gái c¸ phæ biÕn ë nhiÒu ®Þa ph¬ng
  41. Gen ở nhân và ở ty thể trong tế bào Nuclear genome Only one copy in an animal cell Linear chromosomes double-stranded DNA hundreds of megabase pairs (Mb) located in nucleus Mitochondrial genome Many copies (hundreds) dispersed in a cell; located in cytoplasm Circular double-stranded DNA 13-20 Kb (animals); up to 40 Kb (plants) 12-13 protein encoding genes Products involve in ATP production 22 tRNAs and 2 ribosomal RNAs
  42. Vïng ®Þa lý dù ®o¸n cã sù tån t¹i cña c¶ 2 loµi C. sinensis vµ O. viverrini ë ViÖt Nam C. sinensis Qu¶ng B×nh Qu¶ng TrÞ Thõa Thiªn HuÕ O. viverrini
  43. Objectives • To construct protocol to analyze genetic divergences of snakeheads using RAPD technique. • To detect genetic variation among snakehead species in Malaysia including C. marulioides, C. melasoma, C. lucius, C. gachua, C. micropeltes, C. striatus. • To detect genetic populations of snakehead (C. striatus) in Eastern (Terengganu), Western North (Perlis), Center (Perak) and South (Johor) of Peninsular Malaysia.
  44. Material and Method
  45. Material and Method
  46. Results and Discussions Flesh was preserved in ethanol 95% 1. Cut up 25mg + 180l buffer ATL. + add 20l proteinase K, incubating at 550 2. Add 200l buffer AL and incubate at 700C for 10 min. 3. Pipette into the DNeasy mini column. Centrifuge at 6000 x g for 1 min. 4. Add 500 l buffer AW1 and centrifuge for 1 min. at 6000 x g for 1 min. 5. Add 500l buffer AW2, centrifuge for 3 min. 6. Pipet 200l buffer AE. Incubate at RT for 1 min., centrifuge for 1min. at 6000 x g.
  47. Results and Discussions Reactions:25 l reaction mixture containing 1X PCR buffer (Biotools), 5 mM MgCl2, 5 pmoles primer, 0.2 mM dNTP (Biotools), 1 unit of Taq polymerase (Biotools), and 25 ng of genomic DNA Amplify: 5 min. initial denaturation at 940C 35 cycles of 1 min. denaturation at 940C, 1 min low stringency annealing at 360C, 1.5 min primer extension at 720C. Final extension for 5 min at 720C. 7 l of PCR + 3 l dye loaded in 1.7% agarose gel and electrophoressed at 55V in 1X TBE buffer for 2hrs. Stained in ethidium bromide for 30 min and washed in distilled water for 15 min
  48. Results and Discussions DNA patterns of 6 snakehead species amplified by OPA3. Lane M: DNA ladder 100bp, 1-5: Channa striata, 6-10: C.marulioides, 11-15: C.lucius, 16-20: C.gachua, 21-25: C.micropeltes, 26-30: C.melasoma M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 M 1000bp M 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 M 1000bp
  49. Results and Discussions Population Perlis Perak T’ganu Johore Perlis 0.000 Perak 0.1425 0.000 T’ganu 0.1171 0.1341 0.000 Johore 0.2256 0.2325 0.2761 0.000
  50. Results and Discussions Population Perlis Perak Terengganu Johore Genetic distances (D’ij) among snakehead populations
  51. Results and Discussions Species C.str C.mel C.gac C.mic C.mar C.luc C.striata 0.000 C.melasoma 0.152 0.000 C.gachua 0.2025 0.1856 0.000 C.micropeltes 0.4521 0.5682 0.5925 0.000 C.marulioides 0.4892 0.5862 0.4852 0.4685 0.000 C.lucius 0.7563 0.7524 0.7253 0.6924 0.6542 0.000
  52. Results and Discussions Species C.striata C.melasoma C.gachua C.micropeltes C.marulioides C.lucius Genetic distances (D’ij) among snakehead populations
  53. Materials and Methods DNA patterns of 6 snakehead species amplified by 16rRNA. Lane M: GeneRuler 100bp DNA ladder, 1-4: Channa striata, 5-8: C.marulioides, 9-12: C.lucius, 13- 26: C.gachua, 17-20: C.micropeltes, 21-24: C.melasoma M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 M 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 M 500bp
  54. Results 16S rRNA sequence of Channa striata
  55. Results CLUSTAL W (1.81) multiple sequence alignment 300bp LUC TTGGACGAGGTTTATACTACGGCTCCTACCTGTACAAAGAGACATGAAA-CATTGGA-GT MEL TCGGACGAGGCCTATATTACGGCTCCTACCTGTACAAAGAAACATGAAA-CATTGGT-GT STR TCGGACGAGGACTATACTACGGCTCCTACCTATATAAAGAAACATGAAA-CATCGGT-GT GAC TTGGACGAGGCCTGTACTACGGCTCCTATCTCTATAAAGAGACATGAAA-TGTCGGC-GT MAR TCGGCCGAGGCCTATACTATGGCTCCTACCTTTACAAAGAAACATGAAA-CATCGGC-GT MIC TCGGCCGAGGACTATACTACGGCTCCTACCTTTACAAAGAAACATGAAA-CATCGGC-GT 400bp LUC AATCCTCCTCCTACTAGTTATAATAACCGCTTTCGTAGGTTATGT-TCTTCCC MEL AATCCTCCTTCTCCTAGTCATAATAACCGCTTTCGTAGGCTATGT-TCTACCA STR AATTCTTCTCCTACTAGTTATAATAACCGCCTTTGTAGGTTATGT-ATTACCC GAC CGTAATACTTCTTCTAGTTATAATGACTGCTTTCGTAGGGTACGT-CCTACCC MAR AATCCTTCTGCTACTAGTCATAATAACCGCCTTTGTGGGGTACGT-CCTGCCC MIC AATCCTACTGCTTCTAGTCATAATAACTGCTTTCGTAGGGTACGT-TCTCCCC
  56. Results Transition/transversion ratio versus corrected (Kimura 2-parameter) genetic distance.
  57. Results C.lucius 91/89/92 C.gachua 85/82/87 C.striatus C.melasoma 81/79/84 95/95/95 C.marulioides C.micropeltes Phylogenetic relationships of 16S rRNA gene for snakehead species in Malaysia. Bootstrap is given at each node for neighbor joining/maximum likelihood/ maximum parsimony algorithm