Các phương pháp định lượng vi sinh vật

Nội dung text: Các phương pháp định lượng vi sinh vật

1. LOGO CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT
2. CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT Hàm lượng vi sinh vật Là các phương pháp trong mẫu là bao để xác định số nhiêu?? lượng vi sinh vật ở trong mẫu
3. CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG LOGO VI SINH VẬT 1 Phương pháp xác định khối lượng khô 2 Phương pháp đo độ đục 3 Phương pháp đếm trực tiếp 4 Phương pháp đếm khuẩn lạc 5 Phương pháp MPN
4. Đơn vị định lượng Vi sinh vật Tế bào/ml MNP/g Tế bào/g ĐƠN VỊ MPN/ml CFU/ml CFU/g
5. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH KHỐI LƯỢNG KHÔ ❖Định lượng nồng độ tế bào nấm men ❖Được coi là một phương pháp tiêu chuẩn ❖Có thể chuyển đổi kết quả sang các phương pháp khác một cách dễ dàng.
6. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH KHỐI LƯỢNG KHÔ NGUYÊN TẮC PhaseLY TÂM 1 PhaseRỬA 2 PhaseSẤY 3 Rửa bằng dd xút để Sấy đến Thu hồi tách bỏ trọng nấm men các chất lượng trong dịch hữu cơ không đổi bám trên bề mặt
7. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH KHỐI LƯỢNG KHÔ SẤY RỬA -Nhiệt độ 1050C, 24 giờ. LY TÂM - Gạn bỏ nước - Làm nguội trong trong bình hút ẩm - Mẫu cho vào - Chuyển toàn bộ - Cân ống ly tâm tốc độ phần lắng đáy 2000 vòng/ phút, vào đĩa sấy bằng 15 phút cồn - Gạn bỏ nước - Cho bay bớt hơi trong nước trên nồi - Cho NH3 và đun cách thủy nước cất khuấy đều → Ly tâm
8. PHƯƠNG PHÁP ĐO ĐỘ ĐỤC LY TÂM HÒA TAN ĐO ĐỘ ĐỤC Huyền phù Trong nước Máy so màu
9. PHƯƠNG PHÁP ĐẾM TRỰC TIẾP SỐ LƯỢNG TẾ BÀO ĐẾM SỐ LƯỢNG BUỒNG NHUỘM ĐẾM XANH METYLEN
10. Hot Tip ❖NGUYÊN TẮC - Dùng pipet lấy 1 giọt mẫu cho vào khe hở giữa buồng đếm và lá kính - Đếm số lượng tế bào dưới kính hiển vi Vì sao? - Áp dụng chủ yếu đối với nấm men
11. Đếm trực tiếp ĐẾM BUỒNG ĐẾM ĐẾM TRỰC HỒNG CẦU TIẾP BẰNG KÍNH HIỂN VI HUỲNH QUANG
12. NGUYÊN TẮC - BUỒNG ĐẾM Mẫu cần xác A Pha loãng mẫu định ngay, không quá B 30 phút từ Cho mẫu lên buồng khi lấy mẫu. đếm C Quan sát dưới kính hiển vi D Đếm số lượng tế bào
13. Đếm trực tiếp ĐẾM BUỒNG ĐẾM ĐẾM TRỰC HỒNG CẦU TIẾP BẰNG KÍNH HIỂN VI HUỲNH QUANG
14. Đếm trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu ƯU ĐIỂM NHƯỢC ĐIỂM - Cho biết được - Dễ nhầm lẫn số lượng VSV - Độ chính xác không cao - Không thích hợp cho huyền phù có mật độ thấp
15. Các chất nhuộm phát huỳnh quang AODC Acridin cam Loại bỏ sai số do các DAPI tạp chất 4,6-dianidino- 2phenyl-indol FITC Fluorescein Kết quả isothiocyanate phản ánh đúng sinh khối
16. Phương pháp xanh metylen Xác định số TB VSV sống – chết trong mẫu Nhuộm xanh metylen
17. NGUYÊN TẮC – NHUỘM XANH METYLEN - Các tế bào sống có chứa enzyme có khả năng chuyển xanh metylen thành chất không màu Dd xanh metylen đi qua màng tế bào và enzyme của tế bào sống -→ mất màu xanh Các tế bào chết thì enzyme không hoạt động → không làm mất màu xanh → các tế bào bị nhuộm màu xanh
18. Diagram Nhuộm xanh metylen Mất màu xanh Nhuộm màu xanh TẾ BÀO SỐNG TẾ BÀO CHẾT
19. Nhuộm xanh metylen Trộn đều dd xanh metylen với mẫu Biểu thị số lượng TB sống Pha loãng mẫu theo % so với tổng TB có trong mẫu Đếm các tế bào
20. PHƯƠNG PHÁP ĐẾM KHUẨN LẠC Phương Phương pháp nuôi pháp nuôi cấy trên/ cấy trên trong môi màng lọc trường thạch
21. Nuôi cấy trong/trên môi trường thạch Nuôi cấy Trên Trong môi môi trường trường
22. Nuôi cấy trong/trên môi trường thạch - Phát hiện những tế bào VSV còn sống trong mẫu - Phương pháp chuẩn để định lượng vi sinh vật
23. Nuôi cấy trên/trong môi trường thạch KẾT QUẢ 30 – 300 ĐẾM KHUẨN LẠC KHUẨN LẠC NUÔI Ủ CẤY MẪU LÊN MÔI TRƯỜNG PHA LOÃNG MẪU
24. Nuôi cấy trên/trong môi trường thạch 1 KHUẨN LẠC KẾT QUẢ → 1 TẾ BÀO ĐẾM KHUẨN LẠC NUÔI Ủ CẤY MẪU LÊN MÔI TRƯỜNG PHA LOÃNG MẪU
25. 1 ml Dung dịch mẫu đã 45oC pha loãng YGC 10 -15 ml ĩa Đĩa petri vô đ Lắc đều đĩa petri c trùng ợ Để nguội ngư t ậ L Ủ 30oC/3 ngày Đếm số khuẩn lạc và tính kết quả
26. Cho phép xác định sô tế bào sống Định lượng chọn lọc VSV Phương pháp đếm khuẩn lạc
27. Phương pháp cấy trong môi trường thạch Ưu điểm Nhược điểm - Cấy được thể - Không định tích mẫu lớn lượng được những (1ml) VSV quá nhạy với - Xđ được các nhiệt độ VSV cần dung - Không xác định dịch tiếp xúc từ đựoc hình dạng nhiều phía khuẩn lạc nhất - Cho phép đếm định được mật độ - Khó làm thuần VSV cao một dòng vi sinh vật
28. Phương pháp cấy trên môi trường thạch Ưu điểm Nhược điểm - Định lượng được - Chỉ cấy được thể các VSV nhạy với tích mẫu nhỏ nhiệt độ - Cho phép đếm - Có thể nhận được số lượng dạng được khuẩn khuẩn lạc thấp lạc đặc trưng - Dễ làm thuần chủng dòng VSV mục tiêu
29. Hình: Thiết bị hỗ trợ việc đếm khuẩn lạc
30. Nuôi cấy trên màng lọc Kiểm tra nhanh Chất Số lượng lượng VSV VSV Thể tích dịch lớn
31. Nuôi cấy trên màng lọc Đếm khuẩn lạc mọc trên màng lọc Nuôi ủ ở điều kiện thích hợp Đặt màng lọc lên MT dinh dưỡng Tăng sinh VSV trên màng lọc KÍCH THƯƠC LỖ LỌC PHẢI NHỎ HƠN KÍCH THƯỚC CỦA VI SINH VẬT CẦN PHÁT HIỆN
32. Hình: Thiết bị lọc vi sinh vật với 3 vị trí đặt màng lọc
33. PHƯƠNG PHÁP ĐẾM SỐ CÓ XÁC SUẤT LỚN NHẤT (MPN) - Most Probable Number - Định lượng trên kết quả định tính - Đánh giá số lượng VSV theo lượng VSV có xác suất lớn nhất hiện diện trong một đơn vị mẫu phân tích
34. PHƯƠNG PHÁP MPN - 3 độ pha loãng liên tiếp Pha loãng - 3 hoặc 5 lần lặp lại cho mỗi nồng độ mẫu Cấy pha loãng - Tùy thuộc vào từng loại VSV Nuôi ủ - Dương tính (đục, đổi màu, sinh khí, các Kiểm tra phản ứng định tính )
35. ĐỊNH LƯỢNG VI KHUẨN HIẾU KHÍ SINH H2S BẰNG PP MPN 1ml 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 10-1 1ml 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 10-2 5ml Mt pepton + 2ml Na2SO3 25% 1ml 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 10-3
36. Hình 4: Thiết bị đồng nhất mẫu (Stomacher) A B Hình: Ví dụ về kết quả định lượng vi sinh vật bằng phương pháp MPN A: Kết quả số ông dương tính trên loạt 5 ống nghiệm ở 3 độ pha loãng khác nhau là 5:4:1 B: Khi tra bảng MPN, kết quả 5:4:1 cho trị số MPN là 170. Như vậy mật độ vi sinh vật trong mẫu ban đầu là 170 MPN/100ml.