Các phương pháp định lượng vi khuẩn

Nội dung text: Các phương pháp định lượng vi khuẩn

1. 3.1: Cơ sở lý luận của phương pháp cố định tiêu bản và nhuộm tế bào: Nhuộm vi khuẩn quan sát dưới kính hiển vi quang học là phương pháp không thể thiếu được trong quá trình xét nghiệm vi khuẩn.
2.  Thành tế bào (Cell wall) Thành tế bào còn gọi là vách tế bào, chiếm 10-40% trọng lượng khô của tế bào, độ dày thành tế bào vi khuẩn Gram âm là 10 nm Gram dương là 14-18 nm. Thành tế bào là lớp cấu trúc ngoài cùng, có độ rắn chắc nhất định để duy trì hình dạng tế bào, có khả năng bảo vệ tế bào đối với một số điều kiện bất lợi.
3.  Nồng độ đường muối bên trong tế bào thường cao hơn bên ngoài tế bào (áp suất thẩm thấu tương đương với dung dịch glucose 10-20%) do đó tế bào hấp thu khá nhiều nước từ bên ngoài vào. Nếu không có thành tế bào vững chắc thì tế bào sẽ bị phá vỡ. Thành tế bào vi khuẩn G- và G+ có sự sai khác về thành phần cấu tạo như sau:
4. Thành phần Tỷ lệ % đối với khối lượng khô của thành tế bào vi khuẩn G+ G- Peptidoglycan 30-95 5-20 Acidteicoic Có 0 Lipid Hầu như không 20 Protein O hoặc ít Cao
5. Vách vi khuẩn Gram dương có thành phần cấu tạo cơ bản là pepidoglycan (PG) hoặc còn gọi là glucopeptit, murein, chiếm 95 % trọng lượng khô của thành, tạo ra một màng polime xốp, không hòa tan và rất bền vững, bao quanh tế bào thành mạng lưới. Cấu trúc của PG gồm 3 thành phần: N- acetylglucozamin, N- acetylmuramic và galactozamin. Thành tế bào vi khuẩn Gram dương chứa PG đầy đủ 4 lớp (chiếm >50% trọng lượng khô của thành). Ngoài ra còn thấy thành phần acid teichoic (là các polime của glycerol và ribitol photphat), gắn với PG hay màng tế bào.
6.  Vách vi khuẩn Gram âm có thành tế bào với cấu trúc phức tạp, ngoài cùng là 2 lớp lipopolysaccharit có đan xen với các phân tử protein. Các protein này đã được chứng minh là có khả năng chống lại sự tấn công của các vi khuẩn khác. Thành tế bào cho phép các chất dinh dưỡng đi qua nhưng lại có thể ngăn cản sự xâm nhập của một số chất có hại đối với tế bào (thuốc nhuộm, chất kháng sinh, muối kim loại nặng, một số enzym phân giải )
7.  Tính chất nhuộm màu của vsv là khả năng của chúng có thể giữ lại các chất có màu (thuốc nhuộm). Tính chất đó có mối liên hệ chặt chẽ với thành phần hoá học và các tính chất hoá-lý. Màu và khả năng của các chất nhuộm (chromogene) được xác định bởi các nhóm hữu cơ trong phân tử của nó. Các nhóm này tham gia vào các mối liên kết hoá học với các gốc khác nhau trong thành phần hoá học của vsv và được giữ lại, biến đổi màu của vsv. Các chromogene khi phân cực và tạo thành các cation hay anion có màu. Trong thực tế vsv học người ta sử dụng fucsin, Crystal violet, Xanh metylen tham gia nhuộm màu là các nhóm amin. Trong các thuốc nhuộm khác, tính chất này được thực hiện bởi các nhóm OH-
8.  Khi vsv có chứa các phức chất của protein, nucleoproteid có tính acid, vsv bắt màu mạnh với thuốc nhuộm có tính kiềm. Chính vì vậy, vsv trong giai đoạn phát triển, với hàm lượng nucleoproteid cao rất dễ bắt màu.  Các tế bào sống bắt màu yếu, vì các dung dịch có màu khó đi qua thành tế bào. Đó là lý do tại sao người ta thường tiêu diệt vsv và cố định tiêu bản bằng nhiệt hoặc hoá chất.  Các bào tử của vsv, đặc biệt là của một số vi khuẩn rất khó nhuộm màu. Người ta phải nung nóng tiêu bản và sử dụng thuốc nhuộm ở nồng độ cao (đậm đặc hơn).
9.  Nguyên tắc nhuộm Gram : - Dựa trên khả năng bắt màu của tế bào chất và màng tế bào với thuốc nhuộm tím kết tinh và iôt mà hình thành nên hai loại phức chất khác nhau. - Loại phức chất thứ nhất vẫn giữ nguyên màu của thuốc nhuộm nên không bị rửa trôi khi xử lý bằng cồn. Vi sinh vật có phức chất này thuộc loại gram dương. - Loại phức chất thứ hai không còn giữ được màu của thuốc nhuộm nên mất màu khi xử lý bằng cồn và bắt màu của thuốc nhuộm bổ sung. Vi sinh vật có phức chất này thuộc loại gram âm.
10.  3.2. Phương pháp làm tiêu bản nhuộm và soi kính hiển vi quang học Khi quan sát mẫu vật qua kính hiển vi quang học, phần lớn cơ cấu bên trong của vsv có chiết suất gần bằng nhau cho nên rất khó phân biệt được. Để có thể quan sát dễ dàng hơn chúng ta phải nhuộm màu tiêu bản. Phần lớn màu nhuộm trong vi sinh vật là các muối và được phân làm hai nhóm: nhóm màu acid gồm các muối mà ion mang màu là anion (mang điện tích -), và các nhóm base có
11. ion mang màu là các cation (mang điện tích dương). Một số màu thuốc nhuộm chỉ bao phủ mặt ngoài mẫu vật, được nhuộm do quá trình hấp thu hoặc nó tan hay kết tủa chung quanh vật được nhuộm. Nhuộm đơn: là phương pháp nhuộm màu chỉ sử dụng một loại thuốc nhuộm, các loại thuốc nhuộm thường dùng là methylene blue, crystal violet, fuchsin
12.  +Phương pháp nhuộm Gram Đầu tiên cố định tiêu bản trên ngọn lửa đèn cồn, nhuộm màu qua 4 bước: -Thuốc đầu tiên là dung dịch tím tinh thể (Crystal violet) trong khoảng 1 phút. Rửa bằng nước. -Nhuộm tiếp bằng dung dịch lugol (dung dịch cồn Iot 1%) trong 1phút, rửa lại bằng nước. -Phủ lên vết bôi dung dịch tẩy màu (metanol 95% aceton 1:1) hoặc cồn 96 0 trong khoảng 20 giây đến 1 phút, rửa bằng nước, -Cuối cùng nhỏ lên vết bôi dung dịch fuchsin (đỏ tía) hay safranin (đỏ vàng) để 1 phút, rửa nước, để khô tự nhiên sau đó soi dưới kính hiển vi. Nhóm vi khuẩn Gram dương có đặc tính không bị dung môi hữu cơ tẩy phức chất màu giữa tím tinh thể và Iod. Kết quả cuối cùng sẽ bắt màu tím. Nhóm vi khuẩn Gram âm bị dung môi hữu cơ tẩy phức chất màu giữa tím tinh thể và Iod, do đó sẽ bắt màu thuốc nhuộm bổ sung, kết quả bắt màu đỏ hồng.
13. 1. Nhuộm Gram (phương pháp Hucker cải tiến)  Vật liệu, hoá chất:  · Dung dịch Tím kết tinh (Crystal violet):  2g tím kết tinh hoà tan trong 20 ml etanol 95%  0,8 g ammon oxalat hoà tan trong 80 ml nước cất  Trộn hai dịch nói trên lại với nhau, giữ 48 giờ rồi lọc. Bảo quản trong lọ tối, sử dụng vài tháng.  · Dung dịch Iod:  Hoà tan 1 g Iod (Iodine) trong 3-5ml nước cất, thêm 2g KI (Kali iodide), khuấy cho tan hết, thêm nước cất cho đủ 300ml. Bảo quản trong lọ tối.  · Dung dịch tẩy màu:  Etanol 95% hoặc trộn hỗn hợp 70ml etanol 95% với 30ml aceton.  · Dung dịch nhuộm bổ sung:  Chuẩn bị sẵn dung dịch Safranin 2,5%, trước khi dùng pha với nước cất theo tỷ lệ 1:5 (vol/vol) để có dung dịch 0,5%.
14.  Các bước tiến hành: · Chuẩn bị vết bôi: dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ thạch (sau khi cấy 24 giờ) hoà vào 1 giọt nước cất ở giữa phiến kính, làm khô trong không khí. · Cố định tế bào: hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần. · Nhuộm bằng dung dịch Tím kết tinh trong 1 phút, rửa nước, thấm khô. · Nhuộm lại bằng dung dịch Iod trong 1 phút, rửa nước, thấm khô. · Nhỏ dịch tẩy màu, giữ khoảng 30 giây (cho đến khi vừa thấy mất màu), rửa nước, thấm khô. · Nhuộm bổ sung bằng dung dịch Safranin trong 2-3 phút, rửa nước, để khô trong không khí. · Soi kính: dùng vật kính dầu 100´.  Kết quả: Vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím, Gram (-) bắt màu đỏ.
15. Các bước tiến hành nhuộm Gram và ví dụ minh hoạ kết quả.
16. 2. Nhuộm tiên mao  Vật liệu, hoá chất: · Dung dịch A:  Acid tannic 5 g  FeCl3 1,5 g  Formalin 2 ml  NaOH 1% 1 ml  Nước cất 100 ml · Dung dịch B: 2 g AgNO3 hoà tan trong 100 ml nước cất, lấy 10 ml dể riêng. Nhỏ dung dịch NH4OH đậm đặc vào 90 ml còn lại, thấy hình thành tủa rất đặc, tiếp tục nhỏ NH4OH vào cho đến khi tan hết tủa. Lấy 10ml AgNO3 đã bỏ ra ban đầu nhỏ từ từ vào dung dịch, thấy xuất hiện váng mỏng, tiếp tục nhỏ vào cho đến khi vừa tan hết váng thì thôi. · Chuẩn bị phiến kính: rửa thật sạch, ngâm trong cồn, đốt cháy hết cồn rồi mới sử dụng.
17.  Các bước tiến hành: · Dùng que cấy vô trùng lấy vi khuẩn từ mặt thạch (mới cấy 18-24 giờ) hoà vào 1 giọt nước cất đặt giữa phiến kính, để nghiêng cho chảy về một phía, làm khô trong không khí. · Cố định tế bào: hơ nhanh trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần. · Nhỏ dịch A lên vết bôi, giữ 10 phút, rửa bằng nước cất. · Dùng dịch B cho chảy qua để loại hết nước. Nhuộm bằng dịch B trong 30-60 giây. Hơ nóng, để nguội rồi rửa lại bằng nước cất. · Soi kính: dùng vật kính dầu 100´.  Kết quả: Tế bào vi khuẩn bắt màu nâu thẫm, tiên mao bắt màu nâu.
18. 3. Phương pháp nhuộm âm bản  Vật liệu, hoá chất: · Mực tàu · Metanol · Dung dịch safranin 0,5%  Các bước tiến hành: · Lấy vi khuẩn hoà vào giọt nước trên phiến kính. · Nhỏ thêm 1 giọt mực tàu, trộn đều. Dùng cạnh lamen dàn mỏng vết bôi, làm khô trong không khí. · Cố định vết bôi bằng cách nhỏ metanol lên vết bôi, giữ trong 1 phút. · Thêm dần dần dung dịch Safranin 0,5% lên vết bôi để rửa metanol, sau đó giữ trong 30 giây để nhuộm lại, rửa nước, thấm khô. · Soi kính: dùng vật kính dầu 100´.  Kết quả: Nền vi trường màu đen, tế bào màu đỏ, vỏ nhầy màu hồng.
19. 4. Phương pháp Đỏ Congo  Vật liệu, hoá chất: · Dung dịch Đỏ Congo (Congo red) 2% trong nước · Dung dịch gelatin 0,01-0,1% trong nước · Dung dịch HCl 1% · Hỗn hợp 30 ml dung dịch Xanh metylen bão hoà (khoảng 2%) trộn với 100 ml dung dịch KOH 0,01%.  Các bước tiến hành: · Nhỏ 1 giọt dung dịch Đỏ Congo và 1 giọt dung dịch gelatin lên phiến kính sạch. · Lấy vi khuẩn trộn đều với 2 giọt nói trên để làm vết bôi, để khô trong không khí · Nhỏ dung dịch HCl lên để rửa, phiến kính có màu xanh. · Rửa bằng nước để loại bỏ dung dịch HCl. · Nhuộm lại bằng Xanh metylen trong 1 phút, rửa nước, hong khô. · Soi kính: dùng vật kính dầu 100´.  Kết quả: Nền vi trường màu xanh, tế bào màu đỏ, vỏ nhầy không màu
20. 5. Nhuộm thành tế bào  Vật liệu, hoá chất: · Dung dịch acid tannic 5% · Dung dịch Tím kết tinh 0,2%  Các bước tiến hành: · Làm vết bôi vi khuẩn · Nhuộm bằng dung dịch acid tannic trong 5 phút, rửa nước. · Nhuộm bằng dung dịch Tím kết tinh trong 3-5 phút, rửa nước, thấm khô. · Soi kính: dùng vật kính dầu 100´  Kết quả: · Thành tế bào bắt màu tím, tế bào chất màu tím nhạt.
21. Các phương pháp định lượng vi khuẩn 3.2. Phương pháp đếm. Có rất nhiều phương pháp đếm số lượng vi khuẩn, tùy theo mục đích, phương tiện, tùy loài vsv mà có thể sử dụng các phương pháp khác nhau. Sau đây là một số phương pháp phổ biến.  1. Đếm trực tiếp dưới kính hiển vi  Sử dụng buồng đếm (Bürker, Neubauer, Thomas) để đếm tế bào vi khuẩn.
22. Nguyên tắc chung: Đếm số lượng tế bào vsv có trong một đơn vị thể tích của phòng đếm, từ đó suy ra số lượng tế bào có trong 1ml dung dịch, nhân với độ pha loãng để biết số tế bào có trong dung dịch ban đầu.  Buồng đếm Neubauer: Là một phiến kính đặc biệt, trên bề mặt chia thành các ô vuông nhỏ, cạnh ô vuông nhỏ là 1/20mm, khoảng cách giữa phiến kính và lá kính 0,1 mm. Ta nhỏ lên buồng để đếm một giọt huyền phù chứa vi khuẩn muốn đếm, đậy lá kính lại khi đó ta có thể tích mỗi ô nhỏ là: 1/10 x 1/20 x 1/20mm3=1/4000mm3.  Gọi độ pha loãng của dung dịch vi khuẩn cần đếm là K, trung bình số vi khuẩn trên mỗi ô nhỏ là A (ta đếm vài ô lớn, sau đó lấy trung bình số vi khuẩn trên mỗi ô nhỏ), khi đó số vi khuẩn có trong 1ml dung dịch là N:  N=A x 4 x 106 x K (số tế bào/1ml)  Phương pháp này cho kết quả nhanh, tuy nhiên không thể phân biệt được tế bào vi khuẩn sống và tế bào vi khuẩn chết. Hơn nữa tế bào vi khuẩn rất bé nên việc đếm dưới kính hiển vi là không dễ dàng. (Phương pháp này chủ yếu áp dụng cho những tế bào không cần nhuộm màu).
23. Đếm vi khuẩn đã nhuộm: Nhỏ một thể tích nhất định của huyền phù muốn đếm lên một diện tích nhất định trên phiến kính, cố định và nhuộm màu, thường là với xanh metylen hoặc với màu phù hợp với vi khuẩn ấy. Sau đó, đếm số lượng tế bào trên một đơn vị diện tích.  2. Đếm số tế bào sống (khuẩn lạc trên đĩa thạch)  Phương pháp pha loãng  Dùng dung dịch cần đếm vi khuẩn pha loãng ở các độ liên tiếp nhau, theo cơ số 10, thông thường lấy vi khuẩn đã pha loãng ở ba nồng độ liên tiếp thích hợp với từng loại vi khuẩn. Đảm bảo có thể đếm được khuẩn lạc, ít nhất là có hai ống có thể nhìn thấy khuẩn lạc.  Đếm số khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch (cfu-colony forming units). Khi có số khuẩn lạc ta tính toán như sau:  Số lượng tế bào/ml = a x K: V a: số khuẩn lạc trung bình trên mỗi đĩa thạch có cùng độ pha loãng V: Thể tích dịch cấy trên mỗi đĩa thạch (ml) K: độ pha loãng tương ứng của dịch được cấy. Phương pháp này nó cho phép đếm được số tế bào sống có trong 1ml dung dịch.
24. Pha loãng mẫu Ống nuôi cấy ban đầu (ống gốc) Pha loãng 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 Độ pha loãng 101 102 103 104 105 Độ pha loãng cuối
25. 1ml 1ml 1ml 1ml 100 10-1 10-2 10-3 10-4 1ml Đem ủ 456 178 19
26. 1ml 1ml 1ml 100 10-1 10-2 10-3 1ml Đem ủ Đọc kết quả
27. - Phương pháp ước đoán số lượng vi sinh bằng kỹ thuật MPN (Most Probable Number): Phương pháp MPN là phương pháp có thể thay thế phương pháp đếm khuẩn lạc để xác định mật độ vi sinh vật trong mẫu, phương pháp này được dựa trên nguyên tắc xác suất thống kê sự phân bố vi sinh vật trong các độ pha loãng khác nhau của mẫu. Mỗi độ pha loãng được nuôi cấy lặp lại nhiều lần trong các môi trường lỏng đã được chọn, thông thường phải cấy lặp lại từ 3-10 lần tại mỗi nồng độ pha loãng. Các độ pha loãng được tiến hành sao cho trong các lần lặp lại có một số lần cho dấu hiệu dương tính và một số lần cho dấu hiệu âm tính. Số lần lặp lại cho dấu hiệu dương tính và âm tính được ghi nhận để đối chiếu với bảng thống kê sẽ được giá trị ước đoán số lượng vi sinh vật trong mẫu. Qui trình MPN cho giá trị số lượng vi sinh vật trong mẫu có ý nghĩa thống kê theo xác suất phân bố vi sinh vật trong mẫu khi sử dụng một số lần lặp lại, vì thế khoảng tin cậy là rất lớn.
28. Phương pháp MPN để định lượng vi sinh vật cho đến nay đã có nhiều cải tiến cho phép tiến hành qui trình dễ dàng và tốn ít sức lao động hơn và cho giá trị chính xác cao hơn. Trong nhiều trường hợp qui trình MPN được thiết lập sao cho gia tăng số lượng lần lặp cho kết quả dương tính bằng tín hiệu phát triển của vi sinh vật. Trong một số trường hợp khác, qui trình được thiết lập có nhiều thử nghiệm khẳng định sau khi các lần lặp lại ở các độ pha loãng cho tín hiệu phát triển của vi sinh vật như phát hiện protein hay một emzym nào đó. Các thử nghiệm sau này cho kết quả dương tính thì các lần lặp lại ban đầu mới được khẳng định là dương tính. Cũng giống như qui trình đếm khuẩn lạc, qui trình MPN cũng được sử dụng các môi trường chọn lọc, không chọn lọc hay môi trường phân biệt.
29. Cũng giống như qui trình đếm đĩa, trong phương pháp MPN, môi trường và nồng độ nuôi cấy cũng được điều chỉnh để chọn lọc cho một nhóm vi sinh vật hay phân biệt các nhóm vi sinh vật này với các nhóm vi sinh vật khác với các đặc điểm mong muốn, rỏ ràng rằng sự kết hợp giữa điều kiện nuôi cấy và môi trường cũng có thể định lượng những nhóm vi sinh vật đặc biệt nào đó theo định nghĩa cụ thể. Mỗi qui trình phải được chọn lọc một cách cụ thể và cẩn thận để có thể thu được kết quả một cách chính xác.
30. thực chất con số MPN biểu diển số lượng vi sinh vật trong mẫu là số lượng trung bình sau các lần lặp lại. Nếu số lượng vi sinh vật trong mẫu lớn thì sự khác biệt của các mẫu giữa các lần lặp lại là nhỏ, kết quả riêng lẻ của tất cả các lần lặp gần với kết quả trung bình. Nếu số lượng vi sinh vật trong mẫu nhỏ, sự khác biệt này sẽ lớn. Nếu trong một mẫu chất lỏng chứa 100 vi sinh vật/100 ml, thì trong 10 ml mẫu sẽ chứa trung bình 10 tế bào. Dĩ nhiên có một số phần mẫu nhiều hơn 10 tế bào, thậm chí có những phần mẫu có thể chứa 20 tế bào trong 10ml mẫu và một số phần mẫu chứa ít hơn. Nếu tất cả các phần mẫu trên được nuôi cấy trong môi trường và điều kiện thích hợp, các vi sinh vật trong mẫu sẽ phát triển và cho tín hiệu dương tính.
31. Tương tự như vậy, 1 ml sẽ chứa trung bình 1 tế bào vi sinh vật, như vậy có những lần lấy sẽ có 2 hay 3 tế bào và có những lần lấy sẽ không có tế bào nào. Nếu các lần hút này được nuôi cấy trong môi trường và điều kiện thích hợp sẽ thu được những ống nghiệm cho kết quả dương tính và những ống cho kết quả âm tính. Nếu hút 0,1 ml thì sau 10 lần hút mới có khả năng nhận được 1 lần hút có 1 tế bào, như vậy hầu hết các lần nuôi cấy khi lấy 0,1 ml thì đều cho kết quả âm tính.
32. Có thể tính toán con số chắc chắn số lượng vi sinh vật trong 100ml mẫu bằng sự kết hợp các kết quả nhận được từ các chuỗi cấy như trên. Bảng giá trị MPN khi sử dụng hệ thống cấy với các dãy 5 ống 10ml, 5 ống 1ml và 5 ống 0.1ml đã được tính sẵn và dùng cho phân tích các mẫu nước hay các mẫu đã pha loãng. Cho đến nay có rất nhiều bảng giá trị MPN được sử dụng với độ chính xác và các khoảng tin cậy khác nhau và được sử dụng cho các mục đích khác nhau. Phương pháp MPN được dùng chủ yếu để phân tích Coliforms và các vi sinh vật khác khi chúng phát triển trong môi trường nuôi cấy lỏng cho các tín hiệu dễ dàng nhận dạng như sinh hơi, làm đục môi trường chọn lọc, thay đổi pH môi trường
33. ĐỊNH LƯỢNG F. COLIFORM BẰNG PP MPN 1ml 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 10-1 1ml 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 10-2 10ml LSB 1ml 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 10-3
34. ĐỊNH LƯỢNG F. COLIFORM BẰNG PP MPN 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.1 1.2 1.5 2.2 2.3 Endo/EMB 10ml EC 2.2 3.3 1.1 1.2 Indol Kết quả 2,0,0 → MPN =4.5
35. 3. Sử dụng màng lọc vi khuẩn Trường hợp dung dịch cần đếm có mật độ vi khuẩn thấp như kiểm tra vi khuẩn có trong bia, các loại nước uống. Cho một lượng lớn dung dịch cần kiểm tra qua màng lọc sau đó đặt màng lọc lên nuôi cấy trên đĩa thạch, căn cứ vào lượng dung dịch đem lọc và số khuẩn lạc trên mỗi màng lọc ta suy ra số lượng vi khuẩn có trong một đơn vị thể tích. Phương pháp này cho chúng ta kết quả gần đúng, chứ không cho số chính xác. Phương pháp này cho phép đếm số tế bào sống, không đếm được tế bào chết, sai số thường lớn, do đó phải thực hiện hai ba lần và lấy trị số trung bình, để giảm bớt sai số.  4. Phương pháp đo độ đục của huyền phù vi khuẩn Đo bằng quang phổ kế Nguyên tắc: Dùng chùm tia sáng đơn sắc chiếu xuyên qua huyền phù chứa vi sinh vật muốn đo, vi sinh vật làm phân tán bớt chùm tia sáng nhiều hoặc ít tùy thuộc vào số lượng của chúng trong huyền phù. Số tia sáng còn lại khi xuyên qua huyền phù sẽ kích thích một tế bào quang điện.
36. Tùy theo cường độ còn lại của chùm tia sáng mà tế bào quang điện nhận được,một cây kim di động và chỉ số phần trăm tia sáng bị phân tán trên bảng chỉ thị (phương pháp này cho ta biết số lượng vi khuẩn chết và sống). Nếu dịch đem đếm không chứa vi sinh vật nào cả thì tất cả ánh sáng xuyên qua và kích thích tế bào quang điện tối đa, ta điều chỉnh cho kim chỉ ở số 100. Đưa huyền phù cần đo vào. Vì có một số vi sinh vật trong huyền phù nên một số tia sáng bị phân tán đi. Chỉ còn lại một số ít xuyên qua được, so sánh với bảng chuẩn sẽ biết được mật số trong huyền phù. Chỉ tiến hành đo độ đục các mẫu mà ở đó vi sinh vật sinh trưởng làm đục đồng đều môi trường nuôi cấy, không tạo thành váng, khối. Chúng ta có thể áp dụng phương pháp này đối chiếu với phương pháp đếm trực tiếp để lập một bảng chuẩn cho từng loại vi sinh vật. Ngày nay trên cơ sở nguyên lý này người ta chế tạo ra các loại máy quang phổ kế khác nhau.  5. Dùng máy đếm điện tử: với máy đếm loại này có thể đếm hàng ngàn tế bào trong vòng vài giây. Nguyên tắc là vi sinh vật được đưa qua tia sáng của mắt điện tử, vi sinh vật cản tia sáng và ghi dấu hiệu trên bộ đếm của máy.
37. 6. Kỹ thuật định lượng bằng đo vi lượng calorie (Microcalorimetry) Phương pháp này sử dụng những thiết bị rất nhạy để đo nhiệt lượng rất nhỏ sinh ra trong quá trình trao đổi chất của vi sinh vật. Qua đó có thể định lượng cá thể trong mẫu bằng cách đo lượng nhiệt tạo ra hoặc xác định thời gian lượng nhiệt sinh ra đến ngưỡng đo. Phương pháp này còn dùng để định danh vi sinh vật bằng cách đo nhiệt lượng tạo ra của vi sinh vật đó trên những nền cơ chất khác nhau.
38. Một số ứng dụng trong thực tế: Các ứng dụng trong thực tế về nguyên tắc dựa trên các cơ sở lý thuyết đã được nghiên cứu trong Chương 1. Tùy thuộc vào đối tượng vsv và yêu cầu, điều kiện cụ thể người ta áp dụng các test khác nhau để đạt được mục đích của mình. Trong công nghệ sản xuất Bia, người ta thường kiểm tra sự có mặt của các dòng nấm men dại (wild yeast), vi khuẩn (bacteria), vi nấm (Mycota)
39. Test nhiệt: Để tách nấm men thuần chủng và một số chủng nấm men dại có thể sử dụng sự khác nhau về khả năng chịu nhiệt của chúng. Nấm men dại chịu nhiệt tốt hơn. Trên cơ sở này người ta nâng nhiệt độ hỗn hợp lên 53 độ C trong khoảng thời gian 10 phút. Nấm men thuần chủng sẽ chết, còn các dòng Saccharomyces diastaticus, Pichia, Turolopsis, Candida sẽ còn sống được.
40. Để thuận tiện trong thao tác thực tế người ta thường sử dụng các phương pháp nuôi cấy trên môi trường đặc hiệu: 1- Môi trường Actidion stock solution 2- Universal Beer Agar 3- ABP solution 4- Taylor`Cu medium 5- Plate Count Agar 6- Tergital 7 Agar
41.  Kiểm hèm lạnh: Mẫu: dịch đường lấy tại van lấy mẫu sau máy lạnh nhanh, yêu cầu sử dụng cồn 70 độ đảm bảo các điều kiện vô trùng Định kỳ: 1 lần/tuần Môi trường nuôi cấy: UAB Lượng mẫu cần thiết: 0,1 ml Phương pháp nuôi cấy: Trải mẫu mỏng trên bề mặt môi trường. Điều kiện nuôi cấy: Hiếu khí Thời gian nuôi cấy: 3 ngày Nhiệt độ nuôi cấy: 27 độ C Kết quả: Đếm số lượng khuẩn lạc xuất hiện tính cho 1 ml mẫu
42.  Kiểm dịch đang lên men a/ Wort bacteria Mẫu: dịch bia đang lên men Định kỳ: 1 lần/tuần Môi trường nuôi cấy: UAB + Actidion Lượng mẫu cần thiết: 0,1 ml Phương pháp nuôi cấy: Trải mẫu mỏng trên bề mặt môi trường. Điều kiện nuôi cấy: Hiếu khí Thời gian nuôi cấy: 3 ngày Nhiệt độ nuôi cấy: 27 độ C Kết quả: Đếm số lượng khuẩn lạc xuất hiện tính cho 1 ml mẫu
43. b/ Lactic acid Bacteria Mẫu: dịch bia đang lên men Định kỳ: 1 lần/tuần Môi trường nuôi cấy: UAB + ABP Lượng mẫu cần thiết: 0,1 ml Phương pháp nuôi cấy: Trải mẫu mỏng trên bề mặt môi trường. Điều kiện nuôi cấy: Kỵ khí Thời gian nuôi cấy: 7 ngày Nhiệt độ nuôi cấy: 27 độ C Kết quả: Đếm số lượng khuẩn lạc xuất hiện tính cho 1 ml mẫu
44. c/ Wild Yeast. Mẫu: dịch bia đang lên men Định kỳ: 1 lần/tuần Môi trường nuôi cấy: Taylor`Cu Lượng mẫu cần thiết: 0,1 ml Phương pháp nuôi cấy: Trải mẫu mỏng trên bề mặt môi trường. Điều kiện nuôi cấy: Kỵ khí Thời gian nuôi cấy: 4 ngày Nhiệt độ nuôi cấy: 27 độ C Kết quả: Đếm số lượng khuẩn lạc xuất hiện tính cho 1 ml mẫu
45.  Kiểm tổng số vsv trong nước - Môi trường nuôi cấy: Plate Count Agar - Lượng mẫu cần thiết: Lọc qua phễu INOX đã đặt màng 100 ml mẫu - Phương pháp nuôi cấy: Chuyển màng vào hộp Petri có môi trường Plate count Agar, nuôi cấy hiếu khí - Thời gian nuôi cấy: 48 h - Nhiệt độ nuôi cấy: 37 độ C - Kết quả: Đếm số lượng khuẩn lạc xuất hiện tính cho 1 ml mẫu
46.  Kiểm Coliform trong nước - Môi trường nuôi cấy: Tergitol 7 Agar - Lượng mẫu cần thiết: Lọc qua phễu INOX đã đặt màng 100 ml mẫu - Phương pháp nuôi cấy: Chuyển màng vào hộp Petri có môi trường Tergitol 7 Agar, nuôi cấy hiếu khí - Thời gian nuôi cấy: 24 h - Nhiệt độ nuôi cấy: 37 độ C - Kết quả: Đếm số lượng khuẩn lạc xuất hiện tính cho 1 ml mẫu