Biến đổi trên gen COX-1 ty thể ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng

Nội dung text: Biến đổi trên gen COX-1 ty thể ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng

1. Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 32, Số 2 (2016) 17-25 Biến đổi trên gen COX-1 ty thể ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng Phạm Thị Bích, Lê Thị Quỳnh Thơ, Trịnh Hồng Thái* Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN, 334 Nguyễn Trãi, Thanh Xuân, Hà Nội, Việt Nam Tóm tắt Nghiên cứu đã được thực hiện để sàng lọc các biến đổi trên gen COX-1 ty thể ở 86 cặp mẫu mô, 9 mẫu máu của bệnh nhân ung thư đại trực tràng (UTĐTT) và 67 mẫu máu của người khỏe mạnh làm đối chứng. Sử dụng phương pháp giải trình tự ADN khuếch đại từ gen COX-1 ty thể ở 25 mẫu mô UTĐTT, chúng tôi đã phát hiện được 4/17 biến đổi làm thay đổi axit amin, trong đó có biến đổi C6340T. Tiếp đó, biến đổi C6340T được phân tích bằng phương pháp PCR-RFLP trên các mẫu nghiên cứu còn lại. Kết hợp hai phương pháp giải trình tự và PCR-RFLP đã xác định được biến đổi C6340T ở cả dạng đồng tế bào chất và dị tế bào chất trên mô u và lân cận u, trong khi đó không xác định được biến đổi này trên mẫu máu của bệnh nhân ung thư và máu đối chứng. Mức độ biến đổi C6340T ở mô u của 2 bệnh nhân UTĐTT được xác định với tỷ lệ khá cao (từ khoảng 80% trở lên). Biến đổi C6340T là dạng đột biến sôma và là yếu tố có xu hướng làm tăng nguy cơ của bệnh đối với những người mang biến đổi này. Nhận ngày 16 tháng 10 năm 2015, Chỉnh sửa ngày 07 tháng 11 năm 2015, Chấp nhận đăng ngày 05 tháng 12 năm 2016 Từ khóa: Gen COX-1 ty thể, biến đổi C6340T, PCR -RFLP, giải trình tự, ung thư đại trực tràng. 1. Mở đầu * biến trong hệ gen ty thể thường tồn tại ở dạng dị tế bào chất (bản sao bị đột biến và bản sao Ty thể là bào quan có mặt ở tế bào chất của dạng không đột biến tồn tại cùng nhau trong hầu hết các tế bào nhân chuẩn với số lượng một tế bào). Đa số đột biến gây hại tồn tại ở hàng trăm, hàng ngàn bản sao trong mỗi tế bào, dạng dị tế bào chất [2, 3]. Lượng ADN ty thể có hệ gen riêng và nhân bản độc lập với hệ gen đột biến trong một tế bào được gọi là mức độ dị nhân. Vai trò của ty thể là bộ máy sản xuất tế bào chất, đây là một yếu tố để đánh giá mức năng lượng cho tế bào, tham gia vào cơ chế độ ảnh hưởng đến bệnh. chết theo chu trình của tế bào và quá trình lão Mối liên quan giữa rối loạn chức năng của hóa. Khác với hệ gen nhân, hệ gen ty thể không ty thể và ung thư đã được Warburg đầu tiên đưa có protein histone, cơ chế sửa chữa còn đơn ra vào năm 1930, sau đó có một loạt các nghiên giản và ở gần nơi phát sinh các gốc tự do của cứu khác đã xác định được rằng đột biến ADN chuỗi hô hấp tế bào nên dễ bị đột biến so với hệ ty thể có liên quan đến nhiều loại ung thư khác gen nhân. Do đó, hệ gen ty thể có sự tiến hóa nhau như ung thư vú, buồng trứng, tuyến giáp, nhanh hơn hệ gen nhân khoảng 17 lần [1]. Đột dạ dày, đại trực tràng [4]. Tùy vào mức độ nghiêm trọng của đột biến mà vai trò của nó đối ___ với bệnh ung thư được chia thành hai nhóm: (1) * Tác giả liên hệ. ĐT: 84-4-38582798 Email: thaith@vnu.edu.vn đột biến nghiêm trọng làm ức chế quá trình 17
2. 18 P.T. Bích và nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 32, Số 2 (2016) 17-25 OXPHOS (oxidative phosphorylation) tăng sản 2. Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu xuất các gốc tự do và thúc đẩy sự tăng sinh tế bào khối u (2) đột biến nhẹ hơn có thể cho phép 2.1. Nguyên liệu các khối u thích ứng với môi trường mới [5]. 86 cặp mẫu mô (gồm mô u và mô lân cận u Gen COX-1 ty thể (còn được gọi là gen - lấy cách trung tâm khối u 5-10 cm) của 86 COXI, MT-CO1) có kích thước 1552bp từ vị trí bệnh nhân UTĐTT trong đó 9 bệnh nhân có base 5904 đến 7455 trên hệ gen ty thể. Gen cung cấp kèm theo mẫu máu đến điều trị tại COX-1 ty thể mã hóa cho protein cytochrome c Bệnh viện K và Bệnh viện Việt Đức Hà Nội từ oxidase I (MTCO1) là một tiểu phần thuộc năm 2012 đến 2015. Tiêu chuẩn lựa chọn mẫu phức hệ hô hấp IV (cytochrome c oxidase) đóng ung thư là những mẫu được lấy từ các bệnh vai trò quan trọng trong hô hấp tế bào [6]. nhân có kết quả giải phẫu bệnh sau phẫu thuật Protein cytochrome c oxidase I (P00395) có hai là ung thư biểu mô tuyến, dạng ung thư nguyên vùng chính là vùng xuyên màng và vùng nằm phát (được xác định tại Khoa giải phẫu bệnh trong chất nền ty thể. Chức năng của protein của bệnh viện). MTCO1 tham gia vào quá trình vận chuyển 67 mẫu máu của người khỏe mạnh do Viện điện tử trong hô hấp tế bào [7]. Sự thay đổi ở Huyết học và Truyền máu Trung ương cung cấp cấp độ gen khiến protein MTCO1 có thể bị được dùng làm đối chứng. thay đổi và ảnh hưởng đến quá trình vận chuyển điện tử trong chuỗi hô hấp từ đó làm ảnh hưởng 2.2. Phương pháp nghiên cứu đến quá trình sản xuất năng lượng cho tế bào, tăng quá trình phát sinh các gốc tự do, ảnh Tách chiết ADN tổng số hưởng đến chức năng cơ thể. Đặc biệt một số Sử dụng kit tách chiết ADN Mini Kit đột biến trên gen COX-1 ty thể đã được tìm (QIAGEN, Đức) và GeneJET Mini Kit thấy trên một số bệnh ở người bao gồm cả bệnh (Thermo Scientific, Mỹ) để tách chiết ADN ung thư trong đó có UTĐTT [8]. Vì vậy, việc tổng số từ mẫu mô và mẫu máu. Các bước tách điều tra biến đổi của gen COX-1 ty thể là cần chiết được tiến hành theo đúng quy trình của thiết để đánh giá các biến đổi trên gen, đồng nhà sản xuất. Nồng độ ADN tổng số được đo thời có thể hỗ trợ hiệu quả trong chẩn đoán và bằng máy quang phổ NanoDrop 2000c điều trị bệnh UTĐTT. (Thermoscientific, Mỹ) và bảo quản ở -200C. Trên thế giới, ung thư đại trực tràng là một Thiết kế mồi nhân gen COX-1 trong những loại ung thư phổ biến với tỷ lệ mắc Sử dụng chương trình Primer-BLAST thuộc mới và tỷ lệ tử vong cao. Tại Việt Nam, NCBI (Mỹ), trình tự ADN ty thể chuẩn UTĐTT xếp thứ 4 ở nam giới, xếp thứ 5 ở nữ (NC_012920.1) để thiết kế các cặp mồi cho giới về tỷ lệ mắc mới và tử vong, căn bệnh này phản ứng PCR dùng cho việc sàng lọc các biến đang có xu hướng trẻ hóa [9]. Tuy nhiên, đổi thuộc gen COX-1 ty thể bằng phương pháp UTĐTT là loại ung thư có tiên lượng tốt nếu giải trình tự và PCR-RFLP. được chẩn đoán và điều trị khi còn ở giai đoạn Giải trình tự ADN sớm [10]. Các biến đổi trên ADN ty thể ở bệnh Toàn bộ gen COX-1 ty thể được nhân lên nhân UTĐTT đã xác định được trên nhiều gen với cặp mồi (5851F; 7595R), sản phẩm PCR khác nhau như gen ND1, ND3, COX-1, COX-2, được tinh sạch bằng kit ExoSAP-IT® PCR vùng Dloop và một số gen khác [4]. Tại Việt Product Cleanup (Affymetrix, Mỹ) và giải trình nam, cho đến nay, chúng tôi chưa thấy có công tự trực tiếp theo nguyên lý của Sanger. Trình tự bố nào về các biến đổi trên gen COX-1 ty thể ở cặp mồi gồm: mồi xuôi 5’- CTT TAG ATT bệnh nhân UTĐTT, vì vậy nghiên cứu này được TAC AGT CCA ATG CTT -3’, mồi ngược: 5’- thực hiện để sàng lọc và đánh giá mối liên quan CAT GTG CCA TTA AGA TAT ATA GGA T - của các biến đổi trên gen COX-1 ty thể với bệnh 3’. Thành phần PCR bao gồm: OneTaq Hot UTĐTT. Start 2X Master Mix (NEB, Mỹ); 200nM mồi
3. P.T. Bích và nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 32, Số 2 (2016) 17-25 19 xuôi và mồi ngược; 2 ng/µl ADN khuôn, sau đó các băng: 161bp đại diện cho những bản sao bổ sung H2O đến 12.5µl. Chu trình nhiệt gồm ADN mang biến đổi tại ví trí 6340 - có mật độ các bước: biến tính ở 940C trong 30 giây, điểm ảnh là b, băng 128bp đại diện cho những khuếch đại 35 chu kỳ (940C: 30 giây, 600C: 30 bản sao ADN không mang biến đổi tại vị trí giây, 680C: 130 giây), 680C: 5 phút. Kết quả 6340 - có mật độ điểm ảnh c. Như vậy: giải trình tự được so sánh với trình tự ADN ty Tỷ lệ % đột biến = [b/(b+c)]*100 thể chuẩn (NC_012920.1) bằng chương trình Phân tích thống kê BLAST trên NCBI. Dùng tỷ số chênh odd ratio (OR) để đánh PCR - RFLP giá nguy cơ của biến đổi C6340T đối với Trình tự cặp mồi (6221F; 6381R) gồm: mồi bệnh UTĐTT. So sánh giữa nhóm bệnh và xuôi 5’-TCC CTC TCT CCT ACT CCTGTT C nhóm đối chứng. -3’, mồi ngược: 5’-CTA AGA TAG AGG AGA CAC CTG CTA -3’. Chu trình nhiệt và thành phần của phản ứng PCR với cặp mồi (6221F; 3. Kết quả và thảo luận 6381R) tương tự như đối với cặp mồi (5851F; 7595R) chỉ thay đổi thời gian kéo dài chuỗi 3.1. Các biến đổi trên gen COX-1 ty thể ADN là 560C trong 15 giây. Sản phẩm PCR 161bp được cắt bằng enzyme BccI với trình tự Đoạn ADN dài 1745bp chứa toàn bộ gen nhận biết 5’- CCATC(N4)↓ 3’ (Neb, Mỹ) COX-1 ty thể đã được khuếch đại thành công theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Trong trường trên 25 mẫu mô u của 25 bệnh nhân UTĐTT hợp 6340C (trường hợp không biến đổi), bằng cặp mồi (5851F; 7595R). Sản phẩm PCR enzyme BccI có một vị trí nhận biết và cắt đoạn sau đó được tinh sạch và giải trình tự trực tiếp. ADN ở một vị trí và tạo thành 2 đoạn có kích Sử dụng chương trình BLAST trên NCBI và thước là 128bp, 33bp. Trong trường hợp 6340T phần mềm Bioedit để so sánh và đọc trình tự (có biến đổi), enzyme BccI không có vị trí nhận ADN. Kết quả PCR, giải trình tự được minh biết trên đoạn ADN 161bp vì vậy enzyme họa trong hình 1 và hình 2. không cắt, nên kích thước đoạn ADN có biến Từ hình 1 nhận thấy sản phẩm PCR cho đổi sau khi cắt có kích thước bằng kích thước băng rõ nét, không xuất hiện băng phụ, băng lạ. sản phẩm PCR- 161bp. Sản phẩm PCR-RFLP Kích thước băng khoảng 1745bp đúng theo tính được điện di kiểm tra trên gel polyacylamide toán lý thuyết. Giếng đối chứng âm không lên 10% và nhuộm ethidium bromide. băng. Như vậy, với cặp mồi 5851F - 7595R, Định lượng mức độ dị tế bào chất bằng chúng tôi đã khuếch đại thành công đoạn ADN phần mềm Image J chứa toàn bộ gen COX-1 ty thể phục vụ cho việc xác định trình tự gen. Sản phẩm cắt bằng enzyme giới hạn của Trong 25 mẫu được giải trình tự, chúng tôi những mẫu có biến đổi C6340T ở dạng dị tế đã xác định được 17 biến đổi, trong đó có 4 bào chất được điện di trên gel polyacrylamide biến đổi làm thay đổi axit amin (C6340T; 10%, chụp ảnh và phân tích hình ảnh bằng phần T6253T; A7299G; T6455C) (hình 2) và 13 biến mềm Image J. đổi ở dạng đồng nghĩa (bảng 1). Một điều đặc Sử dụng phần mềm ImageJ để đo mật độ biệt là trong số các biến đổi đồng nghĩa, biến điểm ảnh: Sản phẩm sau khi cắt bằng enzyme đổi C7028T là biến đổi xuất hiện với tần suất trong trường hợp biến đổi không hoàn toàn gồm cao (24/25 mẫu).
4. 20 P.T. Bích và nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 32, Số 2 (2016) 17-25 Hình 2. Một số vị trí biến đổi trên gen Hình 1. Ảnh điện di sản phẩm PCR với cặp mồi COX-1 ty thể. (5851F, 7595R) (gel agarose 1%). A, B: biến đổi T6253C, C6340T/C Giếng M: Thang chuẩn 1kb, Giếng 2-7: Sản phẩm PCR mô u (dạng dị tế bào chất) - mẫu #17401, tương ứng của 6 bệnh nhân: #4120, #8619, #17401, #19563, C: biến đổi C6455T- mẫu #17180; #37047, #40557, Giếng 7: Đối chứng âm D: biến đổi A7299G - mẫu #3753 Bảng 1. Các vị trí biến đổi trên gen COX-1 ty thể ở 25 mẫu UTĐTT STT Vị trí Loại Thay đổi Số lượng mẫu Tần suất Công bố biến đổi biến đổi axit amin có biến đổi (%) trên MITOMAP 1 6253 T>C M117T 1 4 + 2 6338 A>G L-L 1 4 + 3 6340 C>T T 146I 1 4 + 4 6392 T>C N-N 3 12 + 5 6445 C>T T181M 1 4 + 6 6455 C>T F-F 2 8 + 7 6515 T>C A-A 1 4 + 8 6752 A>G L-L 1 4 + 9 6800 C>T V-V 3 12 + 10 6884 C>T L-L 4 16 + 11 6932 A>G G-G 1 4 + 12 6960 C>T L-L 1 4 + 13 6962 G>A L-L 3 12 + 14 7028 C>T A-A 24 96 + 15 7196 C>A L-L 2 8 + 16 7250 A>G T-T 1 4 + 17 7299 A>G M466V 1 4 + Ghi chú: +: Đã có công bố Kết quả bảng 1 cho thấy phần lớn các biến biến đổi C6340T là biến đổi làm thay đổi axit đổi xác định được đều ở dạng đồng nghĩa amin và có liên quan đến bệnh ung thư [8]. Vì (13/17 trường hợp). Các dạng biến đổi hay gặp vậy, chúng tôi đã tiến hành sàng lọc biến đổi là dạng biến đổi C>T (7/17 trường hợp), tiếp đó C6340T bằng phương pháp PCR-RFLP trên 61 là A>G (5/17 trường hợp). cặp mẫu gồm mô u và lân cận u của 61 bệnh nhân UTĐTT khác, 67 mẫu máu đối chứng, 9 3.2. Tần suất biến đổi C6340T trong các mẫu mẫu máu của bệnh nhân UTĐTT để xác định nghiên cứu tần suất của biến đổi và đánh giá mối liên quan Kết quả đọc trình tự toàn bộ gen COX-1 ty với bệnh. Kết quả PCR-RFLP được minh họa thể trên 25 bệnh nhân UTĐTT đã xác định được trên hình 3.
5. P.T. Bích và nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 32, Số 2 (2016) 17-25 21 chất, giếng (-) đối chứng âm sản phẩm PCR được thay bằng H2O trong phản ứng cắt. Kết quả điện di ở hình 3 cho thấy: sản phẩm PCR (giếng 1, 3, 5) có kích tương ứng 161bp, các băng rõ, không có băng phụ, chứng tỏ cặp mồi (6221F; 6381R) được thiết kế là đặc hiệu. Sản phẩm cắt enzyme của bệnh nhân #16689 (giếng 2, 4, 6) cho thấy ở mô lân cận u xuất hiện biến đổi ở dạng không đồng nhất, ở mô u biến đổi hoàn toàn, Hình 3. Ảnh điện di sản phẩm PCR được cắt bằng enzyme BccI trên mô u, lân cận u, mẫu máu của ở mẫu máu không xuất hiện biến đổi. Như vậy, bệnh nhân UTĐTT (gel polyacrylamide 10%). biến đổi C6340T xuất hiện ở mô u, lân cận u nhưng không xuất hiện trên mô máu ở cùng một Giếng M: Thang ADN chuẩn 50bp. Giếng bệnh nhân. Trên cơ sở phân tích này chứng tỏ (+): Đối chứng dương là sản phẩm cắt enzyme biến đổi C6340T là dạng đột biến sôma. (mẫu có biến đổi tại vị trí 6340 ở dạng dị tế bào Để đánh giá nguy cơ của biến đổi C6340T chất được khẳng định bằng giải trình tự); cặp đối với bệnh UTĐTT, tần suất dạng biến đổi giếng (1, 2); (3, 4); (5, 6) là sản phẩm PCR và C6340T được tính toán theo nhóm bệnh và sản phẩm cắt bằng enzyme tương ứng của mô nhóm đối chứng. Tần suất dạng biến đổi ở mô lân cận u (dạng dị tế bào chất), mô u (dạng biến của bệnh nhân UTĐTT là 3.48% có xu hướng đổi hoàn toàn) mẫu máu (dạng không biến đổi) cao hơn so với máu đối chứng và máu bệnh của bệnh nhân #16689, giếng 7 sản phẩm cắt (0%), tuy nhiên chưa tìm thấy khác biệt có ý của mô u bệnh nhân #17401 dạng dị tế bào nghĩa thống kê (P>0.05) (bảng 2). Bảng 2. Phân bố của biến đổi T6340C và nguy cơ của bệnh UTĐTT Tần suất T6340C Loại mô OR (CI 95%) P 6340T, % (n) 6340C, % (n) Mô của bệnh nhân UTĐTT, % (n) 3.48(3) 96.52(83) 5.65 0.25 Máu đối chứng, % (n) 0(0) 100(67) (0.28-111.69) Ghi chú: n: Số bệnh nhân 3.3. Xác định mức độ dị tế bào chất của biến u. Tuy nhiên, mức độ biến đổi trên mô u và mô đổi C6340T lân cận u có sự khác biệt rất lớn. Ở mô lân cận u, trên bản gel điện di băng 161bp đại diện cho Để đánh giá mức độ dị tế bào chất, những những bản sao mang đột biến mờ hơn so với mẫu có biến đổi không hoàn toàn ở vị trí 6340 băng 128bp đại diện cho bản sao không mang sẽ được điện di lặp lại trên 2 giếng thuộc cùng đột biến (giếng 2, 3 hình 4A; giếng 1, 2 hình một bản gel, điện di lặp lại 2 lần sau đó chụp 4B). Tính trung bình, tỷ lệ phần trăm dạng ảnh và phân tích định lượng bằng phần mềm 6340T của bệnh nhân #17401 trên mô lân cận u phân tích hình ảnh Image J. Ở hình 4A điện di và mô u tương ứng là 16.2% và 79.8%. Ở mô sản phẩm cắt enzyme có kèm theo sản phẩm lân cận u của bệnh nhân #16689, biến đổi tại vị PCR với lượng tương đương. Mức độ dị tế bào trí 6340 không hoàn toàn với tỷ lệ dạng 6340T chất được xác định theo công thức nêu ở phần là 89.7% trong khi đó ở mô u của bệnh nhân phương pháp. Kết quả điện di, phân tích hình này là dạng biến đổi hoàn toàn (dạng 6340T ảnh được minh họa theo hình 4, bảng 3. chiếm 100%). Trên cơ sở kết quả phân tích này Từ kết quả phân tích hình 4, bảng 3 nhận có thể thấy rằng số bản sao ADN ty thể dạng thấy ở bệnh nhân #17401 có hiện tượng biến 6340T trên mô u cao hơn so với mô lân cận u. đổi không hoàn toàn trên cả mô u và mô lân cận
6. 22 P.T. Bích và nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 32, Số 2 (2016) 17-25 J Hình 4. Hình ảnh điện di trên gel polyacrylamid 10 % và phân tích định lượng bằng phần mềm Image J ở những bệnh nhânbiến đổi không hoàn toàn tại vị trí 6340. A) Kết quả điện di và phân tích hình ảnh lần thí nghiệm 1: Giếng 1, 4, 7 là sản phẩm PCR, các giếng (2,3); (5,6); (8,9) là sản phẩm cắt của các mẫu #17401LCU (lân cận u), #17401U (mô U), #16689LCU tương ứng. B) Kết quả điện di và phân tích hình ảnh lần thí nghiệm 2: Giếng 1, 2: mẫu #17401 LCU; giếng 3,4: mẫu #17401U; giếng 5, 6: mẫu #16689LCU. Các đỉnh đảo ngược a,b,c,d (thu được từ phân tích ImageJ) tương ứng với băng sản phẩm PCR trước cắt (a) và sau khi cắt với enzyme (b, c, d). Bảng 3. Mức độ đột biến C6340T được phân tích bằng phần mềm Image J Diện tích băng Diện tích băng Tỷ lệ đột biến Mã bệnh nhân Số lần lặp lại 161bp 128bp (%) 17401 LCU 2 356.33 1842.37 16.2 17401U 2 3,831.49 1687.79 79.8 16689LCU 2 4806.33 548.59 89.7 l 4. Thảo luận Trên đối tượng ung thư đại trực tràng (UTĐTT), trong nghiên cứu của Chihara và cs Theo dữ liệu thống kê trên ngân hàng gen ty (2011) trên 10 dòng tế bào UTĐTT, bằng thể Mitomap, có nhiều biến đổi trên gen COX-1 phương pháp PCR-RFLP và giải trình tự sản ty thể đã được xác định trên nhiều bệnh ung thư phẩm PCR từ 28 cặp mồi thiết kế gối lên nhau khác nhau như ung thư vú, ung thư tiền liệt đã tìm được nhiều biến đổi trong đó có biến đổi tuyến, ung thư đại trực tràng [11-16]. Có một trên gen COX-1. Biến đổi tại vị trí 6709 trên số biến đổi trên gen COX-1 ty thể gây ra những gen COX-1 là biến đổi không đồng nghĩa làm hậu quả nghiêm trọng làm thay đổi cấu trúc, thay đổi nucleotit G thành A, làm thay đổi axit chức năng của phân tử protein. amin G thành E tại vị trí 269. Biến đổi này làm
7. P.T. Bích và nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 32, Số 2 (2016) 17-25 23 thay đổi cấu trúc xoắn α của protein MTCO1 tính bảo thủ rất cao dẫn đến làm suy yếu quá thuộc vùng xuyên màng, vì vậy có thể ảnh trình oxy hóa của cytochrome c trong phức hệ hưởng đến chức năng của phân tử protein này. IV. Kết quả của nghiên cứu này cũng chỉ ra Ngoài ra, kết quả giải trình tự còn chỉ ra một số rằng một số đột biến trên gen COX-1 có thể là biến đổi khác trên gen COX-1 như tại vị trí nguyên nhân gây bệnh ung thư [16]. 5973 - biến đổi G thành A, làm thay đổi axit Như vậy, theo các nghiên cứu đã được công amin A24T, và biến đổi tại vị trí 6146 không bố thì một số biến đổi trên gen COX-1 có ảnh làm thay đổi axit amin [14]. Cũng trên đối hưởng đến sự biểu hiện của một số bệnh trong tượng ung thư đại trực tràng trong nghiên cứu đó có bệnh ung thư. Vì vậy, sàng lọc các biến của Greaves và cs (2006) đã tìm thấy đột biến đổi trên gen COX-1 ty thể có thể trở thành tại vị trí 6277 làm biến đổi nucleotit từ A thành hướng nghiên cứu tiềm năng giúp hỗ trợ cho G trên gen COX-1 đây là dạng biến đổi không chẩn đoán bệnh. đồng nghĩa và dẫn đến sự thay đổi axit amin Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến G125A. Một điều đáng quan tâm là axit amin hành sàng lọc các biến đổi trên gen COX-1 ở 86 Glycine (G) tại vị trí 125 có tính bảo thủ rất cao bệnh nhân UTĐTT. Kết quả đã xác định được 4 trong suốt quá trình tiến hóa vì vậy rất có khả vị trí biến đổi làm thay đổi axit amin T6253C, năng biến đổi này là nguyên nhân của sự thiếu hụt C6340T, C6445T, A7229G. Cho tới nay, cả cytochrome c oxidase. Ngoài ra, biến đổi tại vị trí bốn biến đổi trên điều đã được công bố trên cơ 7275 làm biến đổi nucleotit từ T thành C làm thay sở dữ liệu ngân hàng gen ty thể. Tuy nhiên, cả đổi axit amin từ Serine thành pronine tại vị trí 458 bốn biến đổi này chưa được công bố trên đối của phân tử protein MTCO1 cũng đã được xác tượng bệnh nhân UTĐTT, vì vậy kết quả định trong một bệnh nhân khác [17]. nghiên cứu của chúng tôi đã góp phần cung cấp Trên đối tượng bệnh nhân ung thư vú người thêm thông tin về một số biến đổi trên gen Ấn Độ, trong nghiên cứu của Ghatak và cs COX-1 ty thể ở bệnh nhân UTĐTT tại Việt (2014) đã xác định được tổng số 20 biến đổi Nam. Trong 4 biến đổi này, thì có 2 biến đổi trên gen COX-1 ty thể. Những biến đổi này đều làm thay đổi axit amin thuộc chuỗi xoắn α dẫn đến thay đổi những axit amin có tính chất xuyên màng trong ty thể (biến đổi T6253C, bảo thủ cao trong đó có biến đổi làm thay đổi A7299G), hai biến đổi mã hóa cho axit amin cấu truc bậc 2 của phân tử protein. Sự biến đổi thuộc vùng chất nền ty thể (C6340T, C6445T) không đồng nghĩa xảy ra ở gen COX-1 cao hơn [7]. Tuy nhiên, vai trò của những biến đổi này so với các vùng khác trên ADN ty thể ở bệnh vẫn chưa được nghiên cứu rõ. nhân ung thư vú người Ấn Độ. Mặt khác các Biến đổi C6340T được xác định là dạng đột biến đổi lại được sàng lọc trên mẫu máu vì vậy biến sôma và tồn tại cả ở dạng biến đổi đồng tế nó sẽ đơn giản cho việc lấy mẫu để phân tích. bào chất và dị tế bào chất trên những mẫu khác Như vậy, các biến đổi trên gen COX-1 có thể nhau. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng trở thành một chỉ thị sinh học tiềm năng hỗ trợ hoàn toàn phù hợp với các công bố trước đó về cho chẩn đoán bệnh ung thư vú [11]. sự phổ biến của đột biến sôma trên ADN ty thể Biến đổi trên gen COX-1 ty thể cũng đã và tính không đồng nhất của các đột biến gây được xác định trên bệnh ung thư tuyến tiền liệt. bệnh [2, 18]. Trong nghiên cứu của Arnold và cs (2013) đã Vai trò của đột biến trên ADN ty thể đối xác định được một đột biến sai nghĩa tại vị trí với sự biểu hiện lâm sàng của bệnh phụ thuộc 6124 trên gen COX-1 dẫn đến thay đổi nucleotit vào nhiều yếu tố như: Mức độ dị tế bào chất từ T thành C, biến đổi ở trạng thái heteroplasmy của đột biến, các mô khác nhau có mức độ nhạy T6124C ở gen COX-1 ty thể làm thay đổi axit cảm khác nhau, trong đó mô não là nhạy cảm amin từ Methionine - một axit amin không phân nhất với các khiếm khuyết của ADN ty thể tiếp cực thành Threonine là một một axit amin phân đến là tim, mô cơ, thận và hệ tiết niệu. Tỷ lệ cực. Mặt khác, Methionine là một axit amin có bản sao ty thể đột biến phải đạt đến ngưỡng thì
8. 24 P.T. Bích và nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 32, Số 2 (2016) 17-25 mới gây ra kiểu hình lâm sàng của bệnh. homoplasmic, mitochondrial DNA mutation Ngưỡng biểu hiện của đột biến thay đổi phụ promotes tumorigenesis via alteration in reactive thuộc từng loại đột biến và từng loại mô [19]. oxygen species generation and apoptosis, Hum Mol Genet 18(9) (2009) 1578. Trong nghiên cứu này, chúng tôi cũng tiến hành [4] A. Chatterjee, E. Mambo, D. Sidransky, xác định mức độ dị tế bào chất của biến đổi Mitochondrial DNA mutations in human cancer, C6340T trên ba mẫu và xác định được mức độ Oncogene 25(34) (2006) 4663. của đột biến lần lượt là 16.2%, 79.8% và 89.7% [5] M. Brandon, P.Baldi, D.C. Wallace, và nhận thấy, tỷ lệ phần trăm đột biến trên mô u Mitochondrial mutations in cancer, Oncogene 25 cao hơn trên mô lân cận u. (2006) 4647. [6] S. Anderson, A.T. Bankier, B.G. Barrell, Sequence and organization of the human mitochondrial genome, Nature 290(5806) (1981) 457. 5. Kết luận [7] Chúng tôi đã xác định thấy 17 biến đổi trên [8] A human mitochondrial genome database (2016). gen COX-1 ty thể ở bệnh nhân UTĐTT, trong [9] (2016). đó có 4 biến đổi làm thay đổi axit amin. Biến [10] American Cancer Society. Colorectal Cancer đổi C6340T là dạng đột biến sôma và là một facts and figures: 2014-2016. yếu tố làm tăng nguy cơ gây bệnh. Biến đổi [11] S. Ghatak, D. Lallawmzuali, Lalmawia, R. C6340T xác định được ở cả dạng đồng tế bào Sapkota, J. Zothanpuia, L. Pautu, R.B. N. chất và dị tế bào chất với mức độ đột biến ở mô Muthuku maran, S. Kumar, Mitochondrial D- u khá cao (từ khoảng 80% trở lên). Loop and cytochrome oxidase C subunit I polymorphisms among the breast cancer patients of Mizoram, Northeast India Curr Genet 60(3) (2014) 201. Lời cảm ơn [12] J.A. Petros, A.K. Baumann, E. Ruiz-Pesini, M.B. Amin, C.Q. Sun, J. Hall, S. Lim, M.M. Công trình được hoàn thành từ nguồn kinh Issa, W.D. Flanders, S.H Hosseini, F.F. phí của Đề tài QG.15.05. Quy trình và các thủ Marshall, D.C. Wallace, mtDNA mutations tục lấy mẫu được sự giúp đỡ từ các bác sỹ, y tá increase tumorigenicity in prostate cance, Proc của Bệnh viện K, Bệnh viện Việt Đức - Hà Nội Natl Acad Sci USA 102(3) (2005) 719. và Viện Huyết học và Truyền máu Trung ương. [13] I. Namslauer, P. Brzezinski, Mitochondrial DNA mutation linked to colon cancer results in proton leaks in cytochrome c oxidase, Proc Natl Acad Sci USA 106(9) (2009) 3402. Tài liệu tham khảo [14] N. Chihara, T. Amo, A. Tokunaga, R. Yuzuriha, A.M. Wolf, S. Asoh, H. Suzuki, E.U. Chida, S. [1] N. Neckelmann, K. Li, R.P. Ohta, Mitochondrial Wade, R.Shuster D.C. Wallace, cDNA DNA alterations in colorectal cancer cell lines, J sequence of a human skeletal muscle ADP/ATP Nippon Med Sch. 78(1) (2011); 13. translocator: Lack of a leader peptide, [15] B.G. Heerd, H.K.Halsey, L.H. Augenlicht, divergence from a fibroblast translocator cDNA Expres sion of mitochondrial cytochrome and coevolution with mitochondrial DNA genes, c oxidase In human colonic cell differentia Proc Natl Acad Sci USA 84(21) (1987) 7580. on, transformation, and risk for colonic cancer, [2] Y. Goto, I. Nonaka, S. Horai, Mutation in the Cancer Res 50(5) (1990) 1596. tRNA(Leu)(UUR) gene associated with the [16] R.S. Arnold, Q. Sun, C.Q. Sun, An inherited MELASsubgroup of mitochondrial encephalomyo heteroplasmic mutation in mitochondrial gene C pathies, Nature 348(6302) (1990) 651. OI in patients with prostate cancer altersreactive [3] J.S. Park, L.K. Sharma, H. Li, R. Xiang, D. oxygen, reactive nitrogen and pro lifer ation, Holstein, J. Wu, J. Lechleiter, S.L. Naylor, J.J. Biomed Res Int 2013: 239257, doi: Deng, J. Lu, Y. Bai, A heteroplasmic, not 10.1155/2013/239257.
9. P.T. Bích và nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 32, Số 2 (2016) 17-25 25 [17] L.C. Greaves, S.L. Preston, J. Tadous mutations in human ovarian carcinomas, Cancer Mitochondri al DNA mutations are established Res 61(16) (2001) 5998. in human colonic stem cells and mutated clones [19] D.C. Wallace, D. Chalkia, Mitochondrial DNA expand bycrypt fission, Proc Natl Acad Sci USA genetics and the heteroplasmy conundrum in 103(3): (2006) 714 evolution and disease, Cold Spring Harb [18] V.W. Liu, H.H. Shi, A.N. Cheung, High Perspect Biol 5(11) (2013), doi: 10.1101. incidence of somatic mitochondrial DNA Alterations of Mitochondrial COX-1 Gene in Vietnamese Colorectal Cancer Patients Pham Thi Bich, Le Thi Quynh Tho, Trinh Hong Thai VNU University of Science, 334 Nguyen Trai, Thanh Xuan, Hanoi, Vietnam Abstract: This study aimed to screen alterations of mitochondrial COX-1 gene (mtCOX-1 gene) in 86 pairs of tissue samples (tumor and adjacent tumor tissues), 9 blood samples from Vietnamese colorectal cancer patients and 67 samples of blood donor used as controls. 17 alterations of mtCOX-1 gene in 25 tumor tissue samples were detected by using DNA sequencing method. Four detected alterations including C6340T were involved in amino acid substitutions. Then, the C6340T alteration was confirmed by PCR-RFLP method. Combining two methods (DNA sequencing and PCR-RFLP), the C6340T alteration was detected in both homoplasmy and heteroplasmy tissue samples but was not detected in blood samples. Heteroplasmy level of the C6340T alteration in two CRC patients was high (about ≥ 80% ). The C6340T alteration was determined to be a somatic mutation and a tendency to increase risk of CRC in the patients harbouring the C6340T alteration. Keywords: Mitochondrial COX-1 gene, C6340T alteration, DNA sequencing, colorectal cancer.