Bài giảng Vi sinh vật đại cương - Nguyễn Xuân Hòa

Nội dung text: Bài giảng Vi sinh vật đại cương - Nguyễn Xuân Hòa

1. Tài liệu về vi sinh vật
2. CHƯƠNG I MỞ ĐẦU (3 tiết) -Giảng viên: BSTY. Nguyễn Xuân Hòa - PGS. TS. Phạm Hồng Sơn. Trường Đại Học Nông Lâm Huế- Khoa Chăn Nuôi –Thú Y-Bộ môn Ký sinh – Truyền nhiễm -Tóm tắt: Chương mở đầu với thời lượng 2 tiết trình bày trong 9 trang với các hình ảnh minh họa nhằm thể hiện các vấn đề chính sau: Đối tượng của vi sinh vật học học đại cương là vi khuẩn, virus, nấm men, nấm mốc tảo và protozoa. Vi sinh vật phân bố rộng rãi trong tự nhiên và ảnh hưởng rất lớn đến đời sống của con người và mọi sinh vật khác. Là môn học đại cương nên người học cần nắm vững đặc điểm hình thái, cấu tạo, tính chất lý hóa của mỗi đối tượng đồng thời nghiên cứu phương pháp để phát triển vi sinh vật có lợi phát triển và tìm cách để ức chế, hạn chế sự phát triển của vi sinh vật có hại trong cuộc sống. Lịch sử nghiên cứu về vi sinh vật được thể hiện qua 4 giai đoạn: trước khi phát minh ra kính hiển vi, kính hiển vi ra đời, Pasteur với các thực nghiệm, giai đoạn sau Pasteur và sinh học hiện đại. Ngày nay con người đã có thể có nhiều nghiên cứu chuyên sâu về vi sinh vật nhờ sự phát triển của sinh học phân tử và các kỹ thuật di truyền hiện đại. - Mục tiêu của chương 1: Chương mở đầu giúp cho sinh viên có cách nhìn tổng quát về lịch sử các giai đoạn phát triển của ngành vi sinh vật học. I. ĐỐI TƯỢNG VÀ NHIỆM VỤ CỦA VI SINH VẬT HỌC 1.1. Đối tượng của vi sinh vật học đại cương Xung quanh chúng ta, ngoài các sinh vật lớn mà chúng ta có thể nhìn thấy được, còn có vô vàn vi sinh vật nhỏ bé, muốn nhìn thấy chúng phải sử dụng kính hiển vi, người ta gọi chúng là vi sinh vật. Môn khoa học nghiên cứu về hoạt động sống của các vi sinh vật được gọi là Vi sinh vật học. Vi sinh vật học phát triển rất nhanh và đã dẫn đến việc hình thành các lĩnh vực khác nhau: vi khuẩn học (Bacteriology), nấm học (Mycology), tảo học (Algology) virus học (Virolory), Việc phân chia các lĩnh vực còn có thể dựa vào phương hướng ứng dụng. Do đó chúng ta thấy hiện nay còn có y sinh vi sinh vật học, vi sinh vật học thú y, vi sinh vật công nghiệp, vi sinh vật học nông nghiệp. [1] Ngay trong vi sinh vật học nông nghiệp cũng có rất nhiều chuyên ngành: vi sinh vật lương thực, vi sinh vật thực phẩm, Mỗi lĩnh vực có đối tượng cụ thể riêng, cần đi sâu. Tuy nhiên ở mức độ nhất định các chuyên ngành trên đều có những điểm cơ bản giống nhau. Vi sinh vật học đại cương, nghiên cứu những quy luật chung nhất về vi sinh vật. Đối tượng nghiên cứu của vi sinh vật học là vi khuẩn, xạ khuẩn (Actinomycetes), virus, Bacteriophage (thể thực khuẩn), nấm, tảo, nguyên sinh động vật. Vi khuẩn: là nhóm vi sinh vật có nhân nguyên thủy, cơ thể đơn bào, sinh sản chủ yếu bằng hình thức trực phân, cơ thể nhỏ bé, muốn quan sát được phải sử dụng kính hiển vi quang học. Virus: là những sinh vật mà kích thước của chúng vô cùng nhỏ bé, ký sinh nội bào tuyệt đối, muốn quan sát chúng phải sử dụng kính hiển vi điện tử. Nấm: trước đây được coi là thực vật bậc thấp nhưng không có diệp lục tố, thường đơn bào, có nhóm giả đa bào, cơ thể phân nhiều nhánh nhưng không có vách ngăn hoặc vách ngăn nhưng chính giữa có lỗ thông, thuộc tế bào nhân thật. Vi sinh vật tuy có kích thước nhỏ bé và có cấu trúc cơ thể tương đối đơn giản nhưng chúng có tốc độ sinh sôi nẩy nở rất nhanh chóng và hoạt động trao đổi chất vô cùng mạnh mẽ. 1
3. Vi sinh vật có thể phân giải hầu hết tất cả các loại chất có trên thế giới, kể cả những chất rất khó phân giải, hoặc những chất gây hại đến nhóm sinh vật khác. Bên cạnh khả năng phân giải, vi sinh vật còn có khả năng tổng hợp nhiều hợp chất hữu cơ phức tạp, trong điều kiện nhiệt độ, áp suất bình thường. 1.2. Sự phân bố của vi sinh vật Vi sinh vật phân bố rộng rãi trong tự nhiên: trong đất, nước, không khí, trên cơ thể các sinh vật khác, trên lương thực, thực phẩm và các loại hàng hóa. Chẳng những thế, sự phân bố của chúng còn theo một hệ sinh thái vô cùng phong phú, đa dạng, từ lạnh đến nống, từ chua đến kiềm, từ háo khí đến kị khí, Do sự phân bố rộng rãi và do hoạt động mạnh mẽ nên vi sinh vật có tác dụng rất lớn trong việc tham gia các vòng tuần hoàn vật chất trên trái đất cũng như tham gia vào các quá trình sản xuất nông nghiệp. Vi sinh vật học đại cương, nghiên cứu những quy luật chung nhất về vi sinh vật. 1.3. Vai trò của vi sinh vật Trong thiên nhiên, vi sinh vật giữ những mắt xích trọng yếu trong sự chu chuyển liên tục và bất diệt của vật chất, nếu không có vi sinh vật hay vì một lý do nào đó mà hoạt động của vi sinh vật bị ngừng trệ dù chỉ trong thời gian ngắn, có thể nó sẽ làm ngưng mọi hoạt động sống trên trái đất. Thật vậy người ta đã tính toán nếu không có vi sinh vật hoạt động để cung cấp CO2 cho khí quyển thì đến một lúc nào đó lượng CO2 sẽ bị cạn kiệt, lúc bây giờ cây xanh không thể quang hợp được, sự sống của các loài sinh vật khác không tiến hành bình thường được, bề mặt trái đất sẽ trở nên lạnh lẽo. [1] Vi sinh vật còn là nhân tố tham gia vào việc giữ gìn tính bền vững của các hệ sinh thái trong tự nhiên. Đối với sản xuất nông nghiệp, vi sinh vật có vai trò rất lớn, vi sinh vật tham gia vào việc phân giải các hợp chất hữu cơ, chuyển hóa các chất khoáng, cố định nitơ phân tử để làm giàu thêm dự trữ nitơ của đất. Trong quá trình sống, vi sinh vật còn sản sinh ra rất nhiều chất có hoạt tính sinh học cao có tác dụng trực tiếp đối với quá trình sinh trưởng, phát triển của cây trồng, vật nuôi. Người ta nhận thấy nếu không có vi sinh vật tiêu thụ các sản phẩm trao đổi chất do cây trồng tiết ra quanh bộ rễ thì một số sản phẩm này sẽ đầu độc trở lại cây trồng. Trong chăn nuôi và ngư nghiệp, vi sinh vật cũng có tác dụng rất to lớn, trong cơ thể của các loài động vật đều có một hệ vi sinh vật rất phong phú, hệ vi sinh vật này giúp cho quá trình đồng hóa các chất dinh dưỡng và thải các chất cặn bã trong quá trình sống. Trong chăn nuôi một vấn đề lớn là làm thế nào để phòng chống được các bệnh truyền nhiễm, môn vi sinh vật thú y đã cùng môn dịch tễ học đã đề ra những biện pháp phòng dịch bệnh của súc vật và một số bệnh có thể lây sang người, như dại, lao, nhiệt thán, Hiện nay vi sinh vật là một môn khoa học mũi nhọn trong cuộc cách mạng sinh học. Nhiều vấn đề quan trọng của sinh học hiện đại như, nguồn gốc sự sống, cơ chế thông tin, cơ chế di truyền, cơ chế điều khiển học và các tổ chức sinh vật học, vi sinh vật học đang có những bước tiến vĩ đại, đang trở thành vũ khí sắc bén trong tay con người để nhằm chinh phục thiên nhiên phục vụ đắc lực cho sản xuất và đời sống. 1.4. Nhiệm vụ của vi sinh vật học đại cương[2] -Nghiên cứu các đặc điểm cơ bản về hình thái, cấu tạo, di truyền, hoạt động sinh lý hóa học, của các nhóm vi sinh vật. -Sự phân bố của vi sinh vật trong tự nhiên và mối quan hệ giữa chúng với môi trường và các sinh vật khác. -Nghiên cứu các biện pháp thích hợp để có thể sử dụng một cách có hiệu quả nhất vi sinh vật có lợi cũng như các biện pháp tích cực nhằm ngăn ngừa các vi sinh vật có hại trong mọi hoạt động của đời sống con người. 2
4. II. KHÁI YẾU VỀ LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN CỦA VI SINH VẬT HỌC Căn cứ vào quá trình phát triển có thể chia vi sinh vật học ra làm 4 giai đoạn phát triển.[3] 2.1. Giai đoạn trước khi phát minh ra kính hiển vi Từ thời thượng cổ người ta đã biết ủ phân, trồng xen cây họ đậu với cây trồng khác, ủ men, nấu rượu, nhưng chưa giải thích được bản chất của các biện pháp. Trong quá trình định canh con người đã thấy được tác hại của bệnh cây. Đối với bệnh ''rỉ sắt'' ở thời Aristote người ta xem như là do tạo hóa gây ra. Ở Hy Lạp bấy giờ người ta cho rằng cây bị bệnh là do đất xấu, phân xấu, gây ra khí hậu không ôn hoà nhưng chủ yếu là do trời đất. Trung Quốc vào thế kỷ thứ nhất trước công nguyên trong quyển ''Ký thắng Chi thư'' đã ghi: muốn cho cây tốt phải dùng phân tằm, không có phân tằm thì dùng phân tằm lẫn tạp cũng được. Trong sách này cũng đã ghi nhận trồng xen cây họ đậu với các loại cây trồng khác. Trong các tài liệu ''Giáp cốt'' của Trung Quốc cách đây 4000 năm đã thấy đề cập đến kỹ thuật nấu rượu. Người ta nhận thấy trong quá trình lên men rượu có sự tham gia của mốc vàng, như vậy vi sinh vật đã được ứng dụng vào sản xuất, phục vụ cuộc sống từ rất lâu, nhưng người ta chưa hiểu được bản chất của vi sinh vật, mãi đến khi kính hiển vi quang học ra đời, những hiểu biết về vi sinh vật dần dần được phát triển, mở ra trước mắt nhân loại một thế giới mới, thế giới của những vi sinh vật vô cùng nhỏ bé nhưng vô cùng phong phú. 2.2. Giai đoạn sau khi phát minh ra kính hiển vi (Phát hiện ra vi sinh vật) Leewenhoek là người đầu tiên phát hiện ra vi sinh vật nhờ phát minh ra kính hiển vi, Ông là một thương nhân buôn vải, muốn tìm hiểu cấu trúc của sợi vải ông đã chế tạo ra các thấu kính và lắp ráp chúng thành một kính hiển vi có độ phóng đại 160 lần, Ông đã quan sát nước ao tù, nước ngâm các chất hữu cơ, bựa răng, Leewenhoek nhận thấy ở đâu cũng có những sinh vật nhỏ bé. Rất ngạc nhiên trước những hiện tượng quan sát được ông viết ''Tôi thấy trong bựa răng của miệng của tôi có rất nhiều sinh vật tý hon hoạt động, chúng nhiều hơn so với vương quốc Hà Lan hợp nhất''. Phát minh của Leewenhoek củng cố quan niệm về khả năng tự hình thành của vi sinh vật. Thời gian này người ta cho rằng sinh vật quan sát được là từ các vật vô sinh, thịt, cá sinh ra dòi và sau đó người ta cho ra đời thuyết tự sinh (hay thuyết ngẫu sinh). A- Kính hiển vi đầu tiên của nhân loại B- Bình cổ ngỗng mà Pasteur đã đánh đổ học thuyết tự sinh 2.3. Giai đoạn vi sinh vật học thực nghiệm với Pasteur Đến thế kỷ XIX cùng với sự phát triển của chủ nghĩa tư bản, các ngành khoa học kỹ thuật nói chung và vi sinh vật học nói riêng, phát triển mạnh mẽ, nhiều nhà khoa học đã quan sát và nghiên cứu về một số vi sinh vật gây bệnh và sáng tạo ra một số phương pháp mới để nghiên cứu về vi sinh vật. Đóng góp cho sự phát triển của vi sinh vật ở giai đoạn này phải kể đến nhà bác học người Pháp Pasteur (1822-1895). Với công trình nghiên cứu của mình ông đã đánh đổ học thuyết tự sinh, nhờ chế tạo ra bình cổ ngỗng. Ông đã chứng minh thuyết tự sinh là không đúng bằng các thí nghiệm sau: TN1: Dùng một cái bình chứa nước thịt đun sôi, để nguội sau một thời gian thì nước thịt đục, quan sát thấy có vi sinh vật. TN2: Tiến hành như thí nghiệm thứ nhất nhưng sau đó ông bịt kín miệng bình lại, để một thời gian nước thịt không bị vẩn đục. Lúc này mọi người phản đối, họ nói không có không khí nên vi sinh vật không phát triển được, chưa thuyết phục được họ ông làm thí nghiệm tiếp theo. 3
5. TN3: Ông uốn cổ bình giống như hình cổ ngỗng kéo dài ra cho thông với không khí, sau khi đun sôi để một thời gian nước thịt không bị đục, khi đó người ta mới công nhận bác bỏ thuyết tự sinh. Pasteur là người đã đề xuất thuyết mầm bệnh, thuyết miễn dịch học, là cơ sở để sản xuất vaccin trong phòng bệnh. Ông đã chứng minh bệnh than ở cừu là do vi khuẩn gây ra và lan truyền từ con bệnh sang con lành và ông đã tiến hành thí nghiệm tiêm phòng vaccin nhiệt thán cho cừu năm 1881, ông chọn 50 con cừu khỏe mạnh, tương đồng, tiêm vaccin cho 25 con còn 25 con không tiêm vaccin, sau đó cường độc thì 25 con không tiêm vaccin bị chết còn 25 con tiêm vaccin sống bình thường. Thời đó hễ bị chó dại cắn là phải chết, rất thương tâm trước cái chết của những người bị chó dại cắn, ông đã lao vào nghiên cứu vaccin phòng và trị bệnh chó dại, thành công đầu tiên là cứu một bé trai thoát khỏi phát bệnh dại. Sau khi thành công đó các nhà hảo tâm đã xây dựng viện Pasteur tại pháp, sau này nhân rộng ra, đây là thành công lớn nhất của Pasteur đối với nhân loại. L. Pasteur tốt nghiệp sinh hóa, ông rất thành công trong nghiên cứu nhưng gia đình ông rất bất hạnh, anh trai và các con của ông đều chết do bệnh tật. Mặc dầu L. Pasteur là người đầu tiên chứng minh cơ sở khoa học của việc chế tạo vaccin nhưng thuật ngữ vaccin lại do một bác sĩ nông thôn người anh Edward Jenner (1749- 1823) đặt ra. Ông là người đầu tiên nghĩ ra phương pháp chủng đậu bằng mủ đậu mùa bò cho người lành, để phòng bệnh đậu mùa, một căn bệnh hết sức nguy hiểm cho tính mạng thời bây giờ. 2.4. Giai đoạn sau Pasteur và vi sinh học hiện đại Tiếp theo sau Pasteur là Koch (Robert Koch 1843-1910), là người có công trong việc phát triển các phương pháp nghiên cứu vi sinh vật. Ông đề ra phương pháp chứng minh một vi sinh vật là nguyên nhân gây ra bệnh truyền nhiễm mà ngày nay mọi nhà nghiên cứu bệnh học phải theo và gọi là quy tắc Koch. Ngày 24-3-1882, Koch công bố công trình khám phá ra vi trùng gây bệnh lao và gọi nó là Mycobacterium tuberculosis, là một bệnh nan y thời đó. Khám phá này mở đường cho việc chữa trị bệnh ngày nay. Kế đó học trò của Koch là Petri (Juliyes Richard Petri, 1852-1921) chế ra các dụng cụ nghiên cứu vi sinh vật mà ngày nay còn dùng tên của ông để đặt cho dụng cụ ấy: đĩa Petri. Ông cũng nêu ra các biện pháp nhuộm màu vi sinh vật. Ivanopxki, 1892 và Beijerrinck, 1896 là những người phát hiện ra virus đầu tiên trên thế giới khi chứng minh vi sinh vật nhỏ hơn vi khuẩn, qua được lọc bằng sứ xốp, là nguyên nhân gây bệnh khảm cây thuốc lá. Ngày nay vi sinh vật đã phát triển rất sâu với hàng trăm nhà bác học có tên tuổi và hàng chục ngàn người tham gia nghiên cứu, các nghiên cứu đã đi sâu vào bản chất của sự sống ở mức độ phân tử và dưới phân tử, đi sâu vào kỹ thuật cấy mô và tháo lắp gen ở vi sinh vật và ứng dụng kỹ thuật tháo lắp này để chữa bệnh cho người, gia súc, cây trồng và đang đi sâu vào để giải quyết bệnh ung thư ở loài người. 4
6. Hooke (1665) láön âáöu tiãn quan saït tháúy tãú baìo Anton van Leewenhoek (1632-1723) 5
7. Louis Pasteur (1822-1895) Robert Koch (1843-1910) 6
8. Alexander Fleming (1881-1955) Watson and Crick (1953) phaït hiãûn ra cáúu truïc cuía DNA 7
9. Klug (1982) phaït hiãûn ra cáúu truïc virus khaím thuäúc laï (TMV) MỘT SỐ MỐC TRONG LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN VI SINH VẬT Năm Tác giả Công trình 1665 Hooke Lần đầu tiên quan sát thấy tế bào (bần) 1673 Van Leewenhoek Lần đầu tiên quan sát thấy vi sinh vật sống 1785 Linaeus Phân loại các sinh vật Lần đấu tiên tiêm chủng (mủ đậu) vaccin để phòng 1798 Jenner bệnh đậu mùa 1835 Bassi Phát hiện ra bệnh nấm của tằm 1840 Semmelweis Phát hiện sốt ở trẻ sơ sinh do nhiễm khuẩn 1853 Debary Phát hiện ra bệnh nấm ở thực vật 1857 Phát hiện quá trình lên men 1864 Pasteur Bác bỏ thuyết tự sinh 1866 Phát hiện phương pháp khử trùng kiểu Pasteur 1867 Lister Đề xuất phương pháp phẫu thuật vô trùng 1870 Abbes Phát hiện ra vật kính dầu 1876 Koch Đề xuất lý thuyết mới về mầm bệnh 1879 Neisser Phát hiện ra lậu cầu 1880 Pasteur Đề xuất các kỹ thuật gây miễn dịch 1881 Koch Đề xuất phương pháp phân lập thuần khiết vi khuẩn Phát hiện ra trực khuẩn nhiệt thán Bacillus anthrracis 1882 Koch và vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculossis Phát hiện ra môi trường đặc nuôi cấy vi sinh vật 1883 Koch Phát hiện ra vi khuẩn tả, đề xuất biện pháp tẩy uế Metchnikoff Đề xuất học thuyết thực bào 1884 Gram Đề xuất phương pháp nhuộm Gram Escherich Phát hiện ra vi khuẩn E. coli 8
10. 1887 Petri Đề xuất nuôi cấy vi sinh vật bằng hộp lồng Von Bering Phát hiện kháng độc tố bạch hầu 1890 Erhlich Đề xuất lý thuyết miễn dịch 1892 Ivanopxki Phát hiện ra virus 1898 Shiga Phát hiện vi khuẩn lị 1910 Erhlich Phát hiện ra xoắn thể giang mai Fleming Khám phá ra Penicillin 1928 Griffith Phát hiện hiện tượng biến nạp 1934 Lancefield Phát hiện kháng nguyên của liên cầu khuẩn 1935 Stanley, Northrup, Summer Phát hiện ra virus kết tinh 1941 Bead and Tatum Đề xuất mối quan hệ giữa gen và enzyme 1943 Delbruck and Luria Sự xâm nhập của virus vào vi khuẩn 1944 Avery, McLeod, McCarty Chứng minh vật chất di truyền là ADN 1946 Lederberg and Tatum Phát hiện hiện tượng tiếp hợp 1953 Watson and Crick Khám phá ra cấu trúc của ADN 1957 Jacob and Monod Phát hiện ra sự điều hòa trong tổng hợp protein 1959 Sterwart Nguyên nhân virus đối với ung thư 1962 Edelman and Porter Phát hiện ra kháng thể 1964 Epstein, Achong, Barr Phát hiện ra virus gây ung thư ở người 1969 Whittaker Đề xuất hệ thống phân loại 5 giới sinh vật Phát hiện ra men Pestrictaza dùng trong kỹ thuật di 1971 Nathans, Smith, Arber truyền 1973 Berg, Boyer, Cohen Đề xuất kỹ thuật di truyền 1975 Dulbeco, Temin, Baltimore Phát hiện ra Transcriptaza ngược Phát hiện ra men Endonucleaza giới hạn Aber, Smith, Nathans 1978 Mithchell Phát hiện ra cơ chế thẩm thấu hóa học 1981 Margulis Đề xuất nguồn gốc tế bào nhân thực 1982 Klug Phát hiện ra cấu trúc của virus khảm thuốc lá 1983 McClintock Phát hiện ra gen nhảy ở ngô 1983 1988 Deisenhofer, Huber, Michel Phát hiện sắc tố quang hợp của vi khuẩn -Câu hỏi ôn tập: 1. Trình bày đối tượng, nhiệm vụ của vi sinh vật học đại cương. 2. Nêu khái yếu về các giai đoạn phát triển của vi sinh vật học. -Tài liệu tham khảo: 1. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2000). Nhà xuất bản giáo dục Hà Nội. 9
11. 2. Biền Văn Minh, Phạm Văn Ty, Kiều Hữu ảnh, Phạm Hồng Sơn, Phạm Ngọc Lan, Nguyễn Thị Thu Thủy (2006). Giáo trình vi sinh vật học. Nhà xuất bản Đại học Huế. 3. Nguyễn Khắc Tuấn(1999). Vi sinh vật học, nhà xuất bản nông nghiệp Hà Nội. -Giải thích thuật ngữ: Actinomycetes (xạ khuẩn): Vi khuẩn hiếu khí, Gram dương có tỷ lệ G+C cao, khuẩn ty phân nhánh, hình thành bào tử vô tính. Bacteriophage (thể thực khuẩn): Virus gây nhiễm ở prokaryota. 10
12. CHƯƠNG II - HÌNH THÁI HỌC VI KHUẨN (9 tiết) -Tên giảng viên: BSTY. Nguyễn Xuân Hòa - PGS. TS. Phạm Hồng Sơn -Tóm tắt: 29 trang và hình ảnh minh họa phục vụ cho 9 tiết giảng chương 2 nhằm giới thiệu một số thiết bị sử dụng trong nghiên cứu vi sinh vật, phương pháp nghiên cứu về hình thái, cấu tạo của vi khuẩn. Chương hai còn giới thiệu một số dạng hình thái phổ biến của vi khuẩn và cấu trúc của tế bào vi khuẩn. -Mục tiêu: thông qua chương hai giúp cho sinh viên nắm được các phương pháp chính trong nghiên cứu vi sinh vật, đồng thời thấy được sự khác nhau cơ bản trong cấu trúc của hai nhóm vi khuẩn Gram âm và Gram dương liên quan đến đời sống con người và thú y. I. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU HÌNH THÁI, KÍCH THƯỚC VÀ CẤU TẠO TẾ BÀO VI KHUẨN Phương tiện nghiên cứu: kính hiển vi quang học, kính hiển vi điện tử, các phương pháp làm tiêu bản soi tươi, nhuộm màu và các máy cần thiết khác. 1. Kính hiển vi quang học thường Kính hiển vi: có nhiều loại như quang học, phản pha, huỳnh quang, soi nổi, Nguyên lý các loại kính hiển vi có cấu tạo giống nhau. Có hai phần chính là phần cơ học và phần quang học. Phần cơ học: bảo đảm cho kính vững chắc và điều khiển được. Phần này cấu tạo gồm chân kính, khay kính, trụ, ống kính, ốc điều chỉnh vĩ cấp, ốc điều chỉnh vi cấp, bàn quay, vật kính và các vít dịch chuyển mẫu vật. Phần quang: hệ thống cung cấp ánh sáng và hệ thống thấu kính phóng đại. + Phần cung cấp ánh sáng: gương, đèn, (hoặc ánh sáng tự nhiên), tụ quang kính, màn chắn. + Hệ thống thấu kính gồm có vật kính, thị kính và khối lăng kính. + Độ phóng đại của kính bằng tích độ phóng đại của vật kính và thị kính + Vật kính có hai loại: khô và dầu, vật kính dầu có độ phóng đại lớn và độ mở hẹp nên người ta cho thêm giọt dầu (nước, glycerin) dưới kính để loại trừ sự khúc xạ ánh sáng giữa vật kính và không khí. 2.Quy tắc sử dụng kính hiển vi -Trước hết phải kiểm tra vị trí của tụ quang kính. Nó phải ở vị trí cao nhất. Màn chắn phải mở. -Vặn ổ quay vật kính để lấy vật kính nhỏ nhất - Nhìn vào thị kính và điều chỉnh gương để có được ánh sáng tốt nhất. -Sau đó nhỏ một giọt dầu lên tiêu bản đặt lên bàn kính. Vặn ổ quay vật kính để lấy vật kính dầu (100) sao cho phần thấu kính ngập trong dầu. Nhìn vào thị kính và điều chỉnh ốc vĩ cấp (quay chậm) để lấy tiêu cự. Điều chỉnh độ tương phản bằng ốc vi cấp. -Sau khi quan sát, quay ổ quay vật kính để lau dầu bằng dung môi thích hợp, thấm trên giấy thấm hoặc vải màn. Hạ tụ quang kính. Đậy kính. Hiện nay còn có kính hiển vi hai ống ngắm, hay kính hiển vi soi nổi, kính hiển vi nền đen, kính hiển vi tương phản cấu tạo hiện đại và phù hợp với mục đích sử dụng. 11
13. 3.Kính hiển vi điện tử Tất cả các bộ phận được đặt trong một trụ kính và tạo chân không bằng một bơm hút. Trong chân không, hoạt động của điện tử không bị cản trở. Các điện tử bắn xuyên qua mẫu vật, được các vật kính và thị kính bằng từ trường làm tản rộng ra (phân kỳ), sau cùng hiện lên màn huỳnh quang có bộ máy chụp ảnh để chụp khi cần. Vi khuẩn là những vi sinh vật đơn bào, chúng có kích thước thay đổi tùy từng loài, chiều dài từ 0,2-20µm chiều ngang 0,2-8µm, vi khuẩn có hình thái riêng đặc tính sinh học riêng, một số loại có khả năng gây bệnh cho người, động vật và thực vật, một số có khả năng tiết ra chất kháng sinh (Bacillus subtillis). Đa số sống hoại sinh trong tự nhiên. Đa số vi khuẩn có hình thái xác định, hình thái này do màng tế bào quyết định, cá biệt một số loại không có màng nên hình thái không xác định. II. Phương pháp làm tiêu bản hiển vi 2.1. Phương pháp làm tiêu bản soi tươi (giọt ép, giọt treo) Tiêu bản giọt ép: Dùng phiến kính sạch đã tẩy mỡ, giỏ lên phiến kính một giọt canh khuẩn hay dung dịch bệnh phẩm, sau đó đậy la men (lá kính) lên, quan sát kính hiển vi quang học. Tiêu bản giọt treo: dùng phiến kính có hốc lõm ở giữa, cho lên giữa la men một giọt canh khuẩn hay dung dịch bệnh phẩm, đậy phiến kính lên, sau đó lật ngược phiến kính sao cho giọt dung dịch treo lơ lửng trong hốc lõm, cho vaselin lên cạnh của la men để chống mất nước. 12
14. Sau khi làm tiêu bản soi tươi, quan sát kính hiển vi quang học có thể biết được hình thái, kích thước, tính chất di động của vi khuẩn, nó cho phép bước đầu phân biệt, nhận dạng được hình thái của vi khuẩn. 2.2. Phương pháp làm tiêu bản nhuộm và soi kính hiển vi quang học Khi quan sát mẫu vật qua kính hiển vi quang học, phần lớn cơ cấu bên trong của vi sinh vật có chiết suất gần bằng nhau cho nên rất khó phân biệt được. Để có thể quan sát dễ dàng hơn chúng ta phải nhuộm màu tiêu bản. Nhuộm vi khuẩn quan sát dưới kính hiển vi quang học là phương pháp không thể thiếu được trong quá trình xét nghiệm vi khuẩn. Phần lớn màu nhuộm trong vi sinh vật là các muối và được phân làm hai nhóm: nhóm màu acid gồm các muối mà ion mang màu là anion (mang điện tích -), và các nhóm base có ion mang màu là các cation (mang điện tích dương). Ví dụ: sodium+ (có tính base), eosinate- (có tính acid). Màu acid vì nó mang màu hợp với một base (NaOH) để cho ra muối màu. Còn màu base vì ion mang màu có tác dụng như một base, phối hợp với một acid (HCl) cho ra muối màu. Một cách tổng quát, màu acid phối hợp chặt với thành phần của tế bào chất của tế bào còn màu base phối hợp (ăn màu) với thành phần của nhân tế bào (có tính acid). Một số màu thuốc nhuộm chỉ bao phủ mặt ngoài mẫu vật, được nhuộm do quá trình hấp thu hoặc nó tan hay kết tủa chung quanh vật được nhuộm. Nhuộm đơn: là phương pháp nhuộm màu chỉ sử dụng một loại thuốc nhuộm, các loại thuốc nhuộm thường dùng là methylene blue, crystal violet, fuchsin, với nấm thường dùng dung dịch Lactophenol cotton blue (nấm bắt màu xanh). Nhuộm Gram: phương pháp này do Hans Christian J. Gram (1853-1938) là phương pháp nhuộm màu kép phổ biến trong nghiên cứu vi khuẩn, thường dùng để nhuộm màu của một số chi vi khuẩn, cũng có những chi không bắt màu. Phương pháp nhuộm màu này cho phép chúng ta chia vi khuẩn ra làm hai nhóm chính, nhóm vi khuẩn Gram âm và nhóm vi khuẩn Gram dương, đây là phương pháp quan trọng trong việc phân loại vi khuẩn.[1] +Phương pháp nhuộm Gram 13
15. Đầu tiên cố định tiêu bản trên ngọn lửa đèn cồn, nhuộm màu qua 4 bước: -Thuốc đầu tiên là dung dịch tím tinh thể (Crystal violet) trong khoảng 1 phút. Rửa bằng nước. -Nhuộm tiếp bằng dung dịch lugol (dung dịch cồn Iot 1%) trong 1phút, rửa lại bằng nước. -Phủ lên vết bôi dung dịch tẩy màu (metanol 95% aceton 1:1) hoặc cồn 960 trong khoảng 20 giây đến 1 phút, rửa bằng nước, -Cuối cùng nhỏ lên vết bôi dung dịch fuchsin (đỏ tía) hay safranin (đỏ vàng) để 1 phút rửa nước, để khô tự nhiên sau đó soi dưới kính hiển vi. Nhóm vi khuẩn Gram dương có đặc tính không bị dung môi hữu cơ tẩy phức chất màu giữa tím tinh thể và Iod. Kết quả cuối cùng sẽ bắt màu tím. Nhóm vi khuẩn Gram âm bị dung môi hữu cơ tẩy phức chất màu giữa tím tinh thể và Iod, do đó sẽ bắt màu thuốc nhuộm bổ sung, kết quả bắt màu đỏ hồng. Bằng nhiều phương pháp kỹ thuật nhuộm khác nhau như phương pháp nhuộm đơn, nhuộm kép. Nhuộm tiên mao: Đường kính của roi vi khuẩn rất nhỏ nên khó quan sát được ở kính hiển vi quang học. Để quan sát được cần nhuộm màu đặc biệt. Nguyên tắc, trước hết phủ lên roi một lớp hóa chất để làm cho roi to ra, hóa chất này giữ màu nhuộm. Hóa chất thường dùng để phủ lên roi có thể là tannic acid, màu nhuộm có thể dùng pararosanniline. 2.3. Phương pháp quan sát dưới kính hiển vi điện tử Để quan sát dưới kính hiển vi điện tử, mẫu vật được cắt lát thành những lát cắt thật mỏng, bề dày dưới 1 µm có thể đạt đến 0,02 µm, mẫu vật cần được nhuộm bằng những chất ngăn cản điện tử để tạo sự tương phản của ảnh trên màn huỳnh quang. Các hóa chất dùng để 14
16. nhuộm mẫu là basic lead citrate, hoặc uranyl acetate 1%, Ảnh do kính hiển vi điện tử cung cấp có thể quan sát trực tiếp, cũng có thể chụp nhờ bộ phận chụp gắn dưới màn huỳnh quang. Qua kính hiển vi điện tử ta có thể thấy rõ được các vi cấu trúc bên trong của vi khuẩn. II. HÌNH THÁI VÀ KÍCH THƯỚC CỦA VI KHUẨN [2] Vi khuẩn (Bacteria) là những vi sinh vật mà cơ thể chỉ gồm một tế bào, chúng có hình dạng và kích thước thay đổi tùy theo từng loại, chiều dài khoảng 1-10 µm chiều ngang khoảng 0,2 - 10 µm. Vi khuẩn có hình thái riêng, đặc tính sinh vật học riêng. Cấu tạo chưa hoàn chỉnh (chưa có nhân thật) một số có khả năng gây bệnh cho người, động vật, và thực vật, một số có khả năng tiết kháng sinh (Bacillus subtillis) đa số sống hoại sinh trong tự nhiên. Dựa vào hình thái bên ngoài của vi khuẩn, người ta chia vi khuẩn ra làm 6 loại hình thái khác nhau: cầu khuẩn, trực khuẩn, cầu trực khuẩn, phẩy khuẩn, xoắn khuẩn, xoắn thể. 2.1. Cầu khuẩn (Coccus) Coccus, số nhiều là cocci, từ chữ Hy Lạp là Kokkys (quả mọng), có nghĩa là loại vi khuẩn này có hình thái giống như quả mọng. Cầu khuẩn là những vi khuẩn có dạng hình cầu, tuy nhiên có loại không thật giống với hình cầu, thường có hình bầu dục như lậu cầu khuẩn Neisseria gonohoeae, bắt màu Gram âm hoặc có dạng hình ngọn lửa nến như Streptococcus pneumoniae, bắt màu Gram dương. Kích thước của cầu khuẩn thay đổi trong khoảng 0,5 - 1 µm (1 µm =10-3 mm). Tùy theo vị trí của mặt phẳng phân cắt và đặc tính rời hay dính nhau sau khi phân cắt mà cầu khuẩn được chia thành các loại sau đây: a- Đơn cầu khuẩn (Micrococcus): Thường đứng riêng rẽ từng tế bào một, đa số sống hoại sinh trong đất, nước, không khí như: M. agillis, M. roseus, M. luteus. b- Song cầu khuẩn (Diplococcus) Cầu khuẩn được phân cắt theo một mặt phẳng xác định và dính với nhau thành từng đôi một, một số loại có khả năng gây bệnh như lậu cầu khuẩn gonococcus. c-Liên cầu khuẩn Cầu khuẩn phân cắt bởi một mặt phẳng xác định và dính với nhau thành một chuỗi dài. Streptococcus lactis vi khuẩn lên men lactic, Streptococcus pyogenes liên cầu khuẩn sinh mủ. Trong chi này còn có loại liên song cầu khuẩn, tức là song cầu khuẩn tập trung từng đôi một thành chuỗi dài. Liên cầu khuẩn có trong đất, nước không khí, ký sinh trên niêm mạc đường tiêu hoá, hô hấp của người và động vật, một số loại có khả năng gây bệnh. Chiều dài của liên cầu phụ thuộc vào môi trường. Trong bệnh phẩm liên cầu xếp thành chuỗi ngắn 6-8 đơn vị, trong môi trường lỏng 10-100 đơn vị, môi trường đặc hình thành chuỗi ngắn. 15
17. d- Tứ cầu khuẩn (Tetracoccus ) Cầu khuẩn phân cắt theo hai mặt phẳng trực giao và sau đó dính với nhau thành từng nhóm 4 tế bào, tứ cầu khuẩn thường sống hoại sinh nhưng cũng có loại gây bệnh cho người và động vật như Tetracoccus homari. e- Bát cầu khuẩn (Sarcina) Cầu khuẩn phân cắt theo 3 mặt phẳng trực giao và tạo thành khối gồm 8, 16 tế bào. Hoại sinh trong không khí như Sarcina urea có khả năng phân giải ure khá mạnh. Sarcina putea, Sarcina aurantica. f- Tụ cầu khuẩn (Staphylococcus) Phân cắt theo các mặt phẳng bất kỳ và dính với nhau thành từng đám như hình chùm nho, hoại sinh hoặc ký sinh gây bệnh cho người và gia súc, nói chung cầu khuẩn không có tiên mao roi nên không có khả năng di động, khi nhuộm màu đa số cầu khuẩn bắt màu Gram dương. Đa số sống hoại sinh một số gây bệnh như Staphylococcus aureus - tụ cầu vàng 2.2. Trực khuẩn (Bacillus, Bacterium) Bacillus (nghĩa rộng)số nhiều là Bacilli, tiếng La Tinh nghĩa là que ngắn. Bacterium (nghĩa hẹp) số nhiều là Bacteriae từ chữ Hy lạp là Bakterion: que ngắn. Trực khuẩn là tên chung để chỉ những vi khuẩn có dạng hình que, hình gậy, kích thước của vi khuẩn khoảng 0,5-1 x 1-4µm, có những chi thường gặp như: 16
18. a- Bacillus (Bac) Là trực khuẩn Gram dương, sống yếm khí tuỳ tiện, sinh nha bào, chiều ngang của nha bào không vượt quá chiều ngang của tế bào vi khuẩn, do đó khi vi khuẩn mang nha bào vẫn không thay đổi hình dạng. Ví dụ: Trực khuẩn gây bệnh nhiệt thán Bacillus anthracis, trực khuẩn cỏ khô Bacillus subtillis. Bacillus subtillis là một trực khuẩn có lợi trong hệ vi khuẩn đường ruột, chúng ức chế sự phát triển các vi sinh vật có hại đối với đường tiêu hoá. b- Bacterium Là trực khuẩn Gram âm, sống hiếu khí tuỳ tiện không sinh nha bào, thường có tiên mao ở xung quanh thân, có nhiều loại Bacterium gây bệnh cho người và gia súc như, Salmonella, Escherichia, Shigella, Proteus. c- Clostridium Là trực khuẩn Gram dương, hình gậy hai đầu tròn kích thước khoảng 0,4 -1 x 3 - 8 µ m, sinh nha bào, chiều ngang của nha bào thường lớn hơn chiều ngang của tế bào vi khuẩn, nên khi mang nha bào vi khuẩn bị biến đổi hình dạng như hình thoi, hình vợt, hình dùi trống. Clostridium là loại vi khuẩn kỵ khí bắt buộc, có nhiều loại gây bệnh cho người và gia súc như: Clostridium tetani, Clostridium chauvoei (ung khí thán), Clostridium pasteurianum (vi khuẩn cố định nitơ). Clostridium tetani nha bào có trong đất và những nơi ẩm ướt dơ bẩn, nha bào tồn tại rất lâu, nếu chúng xâm nhập vào vết thương sẽ phát triển, sinh độc tố thần kinh gây co cứng gọi là bệnh uốn ván. d-Corynebacterium Vi khuẩn không sinh nha bào, có hình dạng và kích thước thay đổi khá nhiều tùy từng giống, khi nhuộm màu vi khuẩn thường tạo thành các đoạn nhỏ bắt màu khác nhau ví dụ: 17
19. Corynebacterium diphtheriae (gây bệnh bạch hầu) bắt màu hai đầu hình quả tạ, Erysipelothrix rhusiopathiae gây bệnh đóng dấu lợn, gây viêm da và tổ chức dưới da. 2.3. Cầu trực khuẩn (Cocco-Bacillus) Là những vi khuẩn trung gian giữa cầu khuẩn và trực khuẩn, vi khuẩn có hình bầu dục, hình trứng, kích thước khoảng 0,25-0,3 x 0,4 -1,5 µm. Một số bắt màu tập trung ở hai đầu (vi khuẩn lưỡng cực). Ví dụ: vi khuẩn gây bệnh tụ huyết trùng: Pasteurella. Vi khuẩn gây sẩy thai truyền nhiễm Brucella. 2.4. Phẩy khuẩn (Vibrio) Là tên chung để chỉ những vi khuẩn hình que uốn cong lên, có hình giống hình dấu phẩy, hình lưỡi liềm, đứng riêng rẽ hay nối với nhau thành hình chữ S hay số 8, có tiên mao. Phần lớn sống hoại sinh, có một số loại gây bệnh như Vibrio cholerae. 2.5. Xoắn thể (Spirillum) Là nhóm vi khuẩn Gram âm hiếu khí hoặc vi hiếu khí, di động, có dạng xoắn, xoắn khuẩn gây bệnh thuộc chi Campylobacter. Trước đây Campylobacter được xếp vào chi Vibrio về sau chúng được xếp vào nhóm Spirillum vì các vi khuẩn này khác biệt với nhóm phẩy khuẩn nhờ số vòng xoắn đầy đủ. Về hình thái xoắn thể khác với nhóm xoắn khuẩn (Spirochaeta) do số vòng xoắn ít hơn, vòng xoắn của xoắn thể không làm cho đường kính cơ thể tăng lên, xoắn thể không có cấu trúc sợi trục chu chất và lớp bao ngoài, vách tế bào cứng và di động mạnh nhờ có lông roi ở cực tế bào. Campylobacter là những vi khuẩn Gram âm, có dạng chữ S hay dấu phẩy, có một lông roi ở một cực hoặc hai cực, di động theo kiểu vặn nút chai, kích thước 0.2-0.8 x 0.5 –5.0 µm nhưng đôi khi có dạng cầu khuẩn, thông thường không có giáp mô, tuy có khi C. jejuni lại thấy có giáp mô. 2.6. Xoắn khuẩn (Spirochaeta) Cấu trúc cơ bản của xoắn khuẩn là màng tế bào chất của tế bào kéo dài được bọc trong một màng phức hợp bên ngoài vách tế bào tạo thành ống tế bào chất, phía ngoài được bao bọc bởi lớp vỏ ngoài hay lớp bao nhầy. Khoảng không gian giữa màng tế bào chất và lớp vỏ ngoài này được gọi là không gian chu chất. Có tiên mao xuất phát từ hai cực tế bào, những sợi tiên mao này hướng vào giữa tế bào. Bắt màu Gram âm, nhưng thường khó bắt màu nên để quan sát xoắn khuẩn thường sử dụng các phương pháp nhuộm nhiễm bạc, hoặc quan sát tiêu bản sống dưới kính hiển vi nền đen. Xoắn khuẩn di động uốn khúc, vặn xoắn, uốn lượn, sinh sản bằng cách phân chắt theo chiều ngang. Leptospira canicola theo nước và thức ăn vào máu, gan, thận gây loạn chức năng của các cơ quan này dẫn đến xuất huyết và vàng da. Điểm so sánh Xoắn thể Xoắn khuẩn Số vòng xoắn Số vòng xoắn ít hơn Số vòng xoắn lớn hơn 2 Đặc điểm vòng Không làm cho đường Làm cho đường kính cơ thể tăng xoắn kính cơ thể tăng lên lên Nhuộm Gram Âm Gram âm, khó bắt màu, nhuộm nhiễm bạc Lông roi ở một cực hoặc ở hai Xuất phát từ hai cực tế bào hướng cực vào giữa Di động Nhờ lông roi ở cực tế Di động uốn khúc, vặn xoắn, uốn 18
20. bào lượn Cấu trúc Không có cấu trúc sợi Có cấu trúc sợi trục chu chất và lớp trục chu chất và lớp bao ngoài bao ngoài, màng tế bào chất kéo dài Có vách tế bào cứng Không có vách cứng, chỉ là lớp màng hay bao nhầy 2.7. Một số nhóm vi khuẩn đặc biệt 2.7.1. Xạ khuẩn [3] Là nhóm vi sinh vật đơn bào, dạng sợi hình tia phóng xạ, có kích thước và cấu trúc tương tự như tế bào vi khuẩn thông thường, đa số sống hiếu khí trong đất, gram dương. Xạ khuẩn có kết cấu tế bào dạng sợi-khuẩn ty, có đường kính trong khoảng 1-1.5 µ. Nuôi cấy trên môi trường đặc có thể phân biệt được ba loại khuẩn ty: -Khuẩn ty cơ chất (ăn sâu vào trong môi trường làm nhiệm vụ hấp thụ chất dinh dưỡng) còn gọi là khuẩn ty dinh dưỡng. -Khuẩn ty trên cơ chất phát triển trên bề mặt môi trường -Khuẩn ty khí sinh mọc lộ ra khỏi bề mặt môi trường. Đôi khi khuẩn ty không có khuẩn ty cơ chất hặc khuẩn ty khí sinh. Khuẩn ty cơ chất hoặc khí sinh thường phân hóa thành các cành bào tử (sinh ra các bào tử theo kiểu kết đoạn và cắt khúc) và chúng tạo thành khuẩn lạc của xạ khuẩn. -Khuẩn lạc xạ khuẩn rắn chắc, bề mặt xù xì, có dạng nhăn. Dạng vòi, dạng nhung tơ hay dạng màng xơ. Khuẩn lạc xạ khuẩn thường có dạng phóng xạ hay dạng đồng tâm đường kính 0.5-10 µ. -Khuẩn lạc xạ khuẩn thường có màu sắc rất đẹp: trắng, đỏ, vàng, nâu, xanh, hồng tím, đây là tiêu chí quan trọng trong định tên xạ khuẩn. Xạ khuẩn phân bố rộng rãi trong tự nhiên và có vai trò quan trọng về nhiều mặt: +Tham gia vào quá trình phân giải mạnh các hợp chất hữu cơ kể cả các chất phức tạp như celluose, kitin, keratin, pectin, linhin, trong đất bùn do đó làm tăng độ phì của đất và góp phần làm cân bằng các thành phần vật chất trong tự nhiên. +Hầu hết các xạ khuẩn thuộc chi Actinomyces có khả năng sinh kháng sinh, nhiều kháng sinh quan trọng hiện nay được chiết suất từ xạ khuẩn như: tetraciclin, streptomycin, chloramphenicol (chất này hiện nay thú y cấm sử dụng), một số kháng sinh sản xuất từ xạ khuẩn có tác dụng diệt côn trùng hay tuyến trùng, +Một số xạ khuẩn có khả năng tổng hợp mạnh các chất sinh học như vitamin nhóm B, một số acid hữu cơ hay các enzyme như proteaza, ammylaza, kitinaza, +Một số xạ khuẩn có thể gây hại cho các vi sinh vật trong đất do nó tiết độc tố phytotoxin. Một số có khả năng gây bệnh cho người, gia súc được gọi chung là bệnh Actinomycose. 2.7.2. Mycoplasma và dạng L của vi khuẩn Năm 1898, Nocar và Roux (Pháp) đã phát hiện thấy Mycoplasma trong bệnh viêm phổi-màng phổi nên được đặt tên là P.P.O (Pleuro pneumonia organisme), nhưng sau đã phân lập thấy các dạng tương tự trong cơ thể dê, cừu, chó,, nên gọi chung là nhóm P.P.L.O (Pleuro pneumonia like organisme nhóm vi sinh vật giống loại gây nên bệnh viêm màng phổi- phổi). 19
21. Hình thái: do chưa có vỏ tế bào nên có hình thái dễ biến đổi như hình hạt nhỏ riêng lẽ hay kết thành đôi hình chuỗi ngắn, hình ovan, hình vòng khuyên, hình sợi hay hình sao. Kích thước nhỏ bé 0.1µm nhỏ hơn vi khuẩn hàng chục lần. Nhiều Mycoplasma chỉ chứa khoảng 1.200 đại phân tử protein. Cấu tạo tế bào chưa hoàn chỉnh, chưa có vỏ tế bào chỉ có màng nguyên sinh chất. Trong tế bào có chứa các hạt ribosom và sợi nhân (thể nhân-nucleoid). Một số đặc điểm chính của Mycoplasma -Sinh sản không theo phương pháp phân cắt do không có mezosome mà bằng cách tương tự như nẩy chồi hoặc phân cắt các đầu sợi thành các thể hình cầu mới. -Khó bắt màu thuốc nhuộm thông thường, phải dùng thuốc nhuộm Gemsa là nhóm Gram âm. -Sống hiếu khí hoặc yếm khí tuỳ tiện, thích hợp ở nhiệt độ 370C và pH 7-8. -Phát triển tốt ở môi trường phôi gà, có thể phát triển trên môi trường nhân tạo chứa hemoglobin, huyết thanh hay xistein. Mycoplasma bị tiêu diệt ở nhiệt độ 45-550C trong 15 phút. Chúng rất mẫn cảm với sự khô cạn, tia tử ngoại và những chất sát trùng nhưng lại không mẫn cảm với Sunfonamit và penicillin, kháng sinh ức chế Mycoplasma như Clotetracillin, Streptomycin và oxitetracillin. Mycoplasma phân bố rộng trong tự nhiên, nhiều loại có thể gây bệnh cho người và gia súc. Gần đây còn thấy Mycoplasma gây bệnh cho cây trồng như Spiroplasma citri gây bệnh héo vàng ở cam, chanh. Các cá thể từ một khuẩn lạc có hình thái rất khác nhau. Dạng L của vi khuẩn hình thành khi tế bào bị mất vách cố định bên ngoài do đột biến trong phòng thí nghiệm. 2.7.3. Rickettsia [5] Rickettsia là nhóm vi sinh vật nhỏ bé (kích thước nhỏ hơn vi khuẩn, lớn hơn virus), có nhiều hình thái, sống ký sinh bắt buộc, được nhà khoa học Mỹ H.T. Rickettsia phát hiện thấy năm 1909 trong máu người mắc bệnh sốt phát ban. Hình thái: hình que ngắn, hình cầu, hình que dài hay hình sợi, kích thước 0.3-5µm. Cấu tạo: Rickettsia có thành tế bào, màng nguyên sinh chất, tế bào chất và thể trung tâm hình sợi (thể nhân). Thành phần hoá học của tế bào 30% protein, lipid trung tính, photpholipid và hydrat carbon, acid nucleic (ADN và ARN ) và một số enzyme nên có thể thực hiện một số quá trình đường phân nhưng do không đủ men cần thiết để thực hiện quá trình sinh tổng hợp protein và đường phân nên Rickettsia phải ký sinh bắt buộc. Một số đặc điểm cơ bản của Rickettsia -Ký sinh tuyệt đối, phát triển tốt trên môi trường phôi gà, chuột lang, nhau thai, thỏ. 20
22. -Tế bào không di động. -Khó bắt màu thuốc nhuộm, phải dùng phương pháp nhuộm đặc biệt như Giemsa, Rickettsia bắt màu Gram âm. -Sinh sản bằng phương pháp phân cắt giống như vi khuẩn -Đề kháng yếu với nhiệt độ cao, 800C chết sau 1 phút, mẫn cảm với sự khô hạn và các chất sát trùng. -Gây bệnh sốt phát ban Rickettsia prowazekii và sốt hồi quy Coxiella burnetii. Trên đây là những hình dạng vi khuẩn thường gặp, ngoài ra trong tự nhiên còn gặp các hình dạng vi khuẩn như: hình khối vuông, khối tam giác, khối hình sao. Chi Beggiatoa saprospira có tế bào nối dài thành hình sợi. Chi Caryophanon có tế bào hình đĩa xếp chồng lên nhau như một xâu các đồng xu. III. CẤU TẠO CỦA TẾ BÀO VI KHUẨN [4] Cấu trúc của tế bào vi khuẩn khác với tế bào của vi sinh vật khác. Dựa vào cấu trúc có thể thấy được sự khác nhau giữa tế bào vi khuẩn và tế bào động thực vật theo bảng sau: 21
23. TT Tế bào động vật và thực vật Tế bào vi khuẩn Không có màng Có màng nhân Một nhiễm sắc thể hình Nhân Nhiều nhiễm sắc thể hình que tròn Có bộ máy phân bào Không có phân bào Thường có lưới nội bào Không có lưới nội bào Có ty thể Không có ty lạp thể có (Mesosom ) Nguy Đôi khi có lục lạp Không có lục lạp ên sinh chất Chuyển động dòng nội bào Không chuyển động dòng nội bào Ribosom 80S gắn vào lưới nội 70 S trong bào quan chất. 70S gắn lưới nội chất Các phân tử Không có glycopeptit màng Có glycopeptit màng nhỏ 3.1. Thành tế bào (Cell wall) Thành tế bào còn gọi là vách tế bào, chiếm 10-40% trọng lượng khô của tế bào, độ dày thành tế bào vi khuẩn Gram âm là 10nm Gram dương là 14-18nm. Thành tế bào là lớp cấu trúc ngoài cùng, có độ rắn chắc nhất định để duy trì hình dạng tế bào, có khả năng bảo vệ tế bào đối với một số điều kiện bất lợi. Nồng độ đường muối bên trong tế bào thường cao hơn bên ngoài tế bào (áp suất thẩm thấu tương đương với dung dịch glucose 10-20%) do đó tế bào hấp thu khá nhiều nước từ bên ngoài vào. Nếu không có thành tế bào vững chắc thì tế bào sẽ bị phá vỡ. Khi thực hiện co nguyên sinh rồi quan sát dưới kính hiển vi, thấy rõ lớp thành tế bào. Quan sát dưới kính hiển vi điện tử thấy rõ hơn. Thành tế bào vi khuẩn G- và G+ có sự sai khác về thành phần cấu tạo như sau: Tỷ lệ % đối với khối lượng khô của thành tế bào vi khuẩn Thành phần G+ G- Peptidogly can 30-95 5-20 Acid Cao 0 teicoic Hầu như không 20 Lipid O hoặc ít Cao Protein Vi khuẩn Gram dương có thành phần cấu tạo cơ bản là pepidoglycan (PG) hoặc còn gọi là glucopeptit, murein, chiếm 95 % trọng lượng khô của thành, tạo ra một màng polime 22
24. xốp, không hòa tan và rất bền vững, bao quanh tế bào thành mạng lưới. Cấu trúc của PG gồm 3 thành phần: N. acetylglucozamin, N. acetylmuramic và galactozamin. Thành tế bào vi khuẩn Gram dương chứa PG đầy đủ 4 lớp (chiếm >50% trọng lượng khô của thành). Ngoài ra còn thấy thành phần acid teichoic (là các polime của glycerol và ribitol photphat), gắn với PG hay màng tế bào. Vi khuẩn Gram âm Vách vi khuẩn Gram âm gồm một màng ngoài và một khoang chu chất chứa 1-2 lớp PG (chiếm 5-10%) trọng lượng khô vách, giữa lớp PG và màng ngoài có cầu nối lipoprotein. Ngoài ra ở màng ngoài còn có thành phần lipopolysaccharit (LPS) và các protein. LPS chiếm 1-50% trọng lượng khô của vách. Phần lipd của LPS là nội độc tố (gây sốt, tiêu chảy, phá hủy hồng cầu) Trong những trường hợp sau đây có thể không quan sát thấy sự có mặt của thành tế bào: 23
25. Thể nguyên sinh (Protoplast): Sau khi dùng lysozyme để phá vỡ thành tế bào hoặc dùng penicillin ức chế sự tổng hợp thành tế bào có thể chỉ tạo ra những tế bào chỉ được bao bọc bởi màng tế bào chất. Thường gặp ở vi khuẩn G +. Thể cầu (tế bào trần, sphaeroplast): là thể nguyên sinh chỉ còn sót lại một phần thành tế bào, thường chỉ gặp ở vi khuẩn G-. Vi khuẩn dạng L: Năm 1935 Viện nghiên cứu dự phòng Lister ở Anh phát hiện ra một dạng đột biến không có thành tế bào ở trực khuẩn Streptobacillus moniliformis. Tế bào của chúng phình to lên và rất mẫn cảm với áp suất thẩm thấu. Nhiều vi khuẩn G -và G+ đều có thể hình thành dạng L. Trước đây người ta hay nhầm lẫn thể nguyên sinh và thể cầu với dạng L. Hiện nay ta chỉ coi dạng L là chủng vi khuẩn không có thành tế bào được sinh ra do đột biến trong phòng thí nghiệm và có thể mang tính di truyền ổn định. Mycoplasma: Một dạng vi khuẩn không có thành tế bào được sinh ra trong quá trình tiến hoá lâu dài của tự nhiên. Thể nguyên sinh và thể cầu có đặc điểm chung là không có thành tế bào, tế bào trở nên có hình cầu, rất mẫn cảm với áp suất thẩm thấu, có thể có tiên mao, nhưng không di động được, không mẫn cảm với thực khuẩn thể, không phân bào được, Thành tế bào có các chức năng chủ yếu sau: -Duy trì hình dạng của tế bào -Duy trì áp suất thẩm thấu bên trong tế bào - Hỗ trợ sự chuyển động của tiên mao - Giúp tế bào đề kháng với các lực tác động bên ngoài - Cần thiết cho quá trình phân cắt bình thường của tế bào - Điều tiết sự xâm nhập của một số chất, ngăn cản sự thất thoát các enzyme, sự xâm nhập của các chất hóa học hoặc enzyme từ bên ngoài gây hại tế bào, như muối mật, enzyme tiêu hóa, lysozim, chất kháng sinh. - Có liên quan mật thiết đến tính kháng nguyên, của vi khuẩn gây bệnh, đặc biệt liên quan đến nội độc tố của vi khuẩn Gram âm. - Có vai trò trong việc bắt màu thuốc nhuộm khi nhuộm Gram. 3.2. Màng tế bào chất [6] Màng tế bào chất còn được gọi là màng tế bào hay màng chất (Cytoplasmic membrane), viết tắt là CM, dày khoảng 7-8 nm. Có cấu tạo 3 lớp: hai lớp phân tử protein (chiếm hơn 50% trọng lượng khô của màng và 10-20% protein tế bào) và một lớp kép photpholipit (20-3% trọng lượng khô của màng) nằm ở giữa, 70-90% lipid của tế bào tâp trung ở photpholipit của màng. Sự phân bố protein và photpholipit ở màng nguyên sinh chất khác nhau ở từng vùng. Sự phân bố đó tạo nên các lỗ hổng trên màng thuận lợi cho sụ vận chuyển. Protein của màng gồm có hai dạng: protein cấu trúcvà enzyme. Enzyme gồm có: permeaza vận chuyển các chất vào tế bào và các enzyme tổng hợp các chất murein, photpholipit, LPS, Hai lớp phosphor lipid (PL), chiếm khoảng 30-40% khối lượng và các protein nằm phía trong, phía ngoài hay xuyên qua màng chiếm 60-70% khối lượng. Mỗi phân tử PL chứa một đầu tích điện hay phân cực (đầu phosphate) và một đuôi không tích điện hay không phân cực (hydrat carbon). Đầu phosphate còn gọi là đầu háu nước, còn đầu hidratcarbon còn gọi là đầu kỵ nước. Hai lớp phân tử PL một lớp có gốc phosphat quay vào trong một lớp có gốc phosphat quay ra ngoài màng làm màng hóa lỏng và cho phép các protein di động tự do. Sự 24
26. hóa lỏng động học này cần thiết cho các chức năng của màng. Cách sắp xếp của PL như vậy gọi là mô hình khảm lỏng. Hầu hết màng tế bào chất của vi khuẩn không chứa các sterol, như cholesterol, do đó không cứng như màng CM của các tế bào có nhân thật. Mycoplasma là nhóm vi khuẩn nhân thật không có thành tế bào. CM có chứa sterol do đó khá vững chắc. CM là hàng rào đối với các phân tử tan trong nước và có tính chọn lọc hơn so với thành tế bào. Tuy vậy CM có chứa các protein đặc biệt gọi là permease, chúng có thể vận chuyển các phân tử nhỏ vào tế bào theo cơ chế thụ động không cần năng lượng hay chủ động, cần năng lượng. CM ở tế bào vi khuẩn là vị trí làm nhiệm vụ hô hấp (tương tự như màng trong có dạng gấp khúc ở ty thể của các tế bào nhân thật). CM có chứa các protein của chuỗi hô hấp và các enzyme tổng hợp ATP. Các vi khuẩn lưu huỳnh màu tía còn chứa bộ máy quang hợp. Ở CM ta gặp các enzyme tham gia tổng hợp lipid màng, PG, acid teicoic, LPS, và còn gặp các polysaccarit đơn giản. CM còn chứa các vị trí gắn với nhiễm sắc thể và plasmid đóng vai trò quan trọng trong việc phân phối các yếu tố di truyền vào các tế bào con. Ở nhiều vi khuẩn, nhất là vi khuẩn G+, CM xâm nhập vào tế bào chất và tạo thành các hệ thống ống gọi là Mesosom. Mesosom nằm gần CM hay đâm sâu vào trong tế bào chất. Sự gấp khúc của CM vào bên trong chỉ gặp ở một số nhóm vi khuẩn quang hợp hay các vi khuẩn có hoạt tính hô hấp cao chẳng hạn như Azotobacter, vi khuẩn nitrate hoá. Do có gấp khúc mà diện tích CM tăng lên một cách đáng kể, thích ứng được hoạt động hô hấp quang hợp ở các nhóm vi khuẩn này. Nhìn chung CM có các chức năng sau -Duy trì áp suất thẩm thấu tế bào. -Khống chế sự vận chuyển, trao đổi ra vào tế bào của các chất dinh dưỡng, các sản phẩm trao đổi chất. -Duy trì một áp suất thẩm thấu bình thường bên trong tế bào. -Là nơi sinh tổng hợp một số thành phần của tế bào như vách, giáp mô, do trong màng có chứa enzyme và ribosom. -Là nơi tiến hành các quá trình photphoril oxy hoá và photphoril quang hợp. -Là nơi tổng hợp nhiều loại enzyme. -Cung cấp năng lượng cho hoạt động của tiên mao -Có quan hệ đến sự phân chia tế bào. 3.3. Tế bào chất (Cytoplasm) Tế bào chất toàn bộ phần nằm trong màng tế bào trừ nhân. Đây là vùng dịch thể dạng keo đồng nhất khi tế bào non và có cấu trúc lổn nhổn khi tế bào già. Nguyên sinh chất có hai bộ phận chính: Cơ chất tương bào: chủ yếu chứa các enzyme. Các cơ quan con: mesosom, ribosom, không bào, hạt sắc tố, chất dự trữ. 3.3.1. Mesosom Là thể hình cầu giống như cái bong bóng, mesosom có đường kính khoảng 250nm, gồm nhiều lớp bện chặt với nhau, nằm sát vách tế bào chỉ xuất hiện khi tế bào phân chia. Hình thành vách ngăn tế bào trong phân bào và là trung tâm hô hấp của tế bào vi khuẩn hiếu khí. Trong mesosom có nhiều hệ thống men vận chuyển điện tử. 25
27. 3.3.2. Ribosom Ribosom có đường kính 15-20nm, hằng số lắng 70S (tiểu thể lớn 50S và tiểu thể nhỏ 30S). Ribosom chứa 40-60% ARN và 35-60% protein và một ít lipid, một số men như ribonucleaza, và một ít chất khoáng. Mỗi tế bào chứa khoảng 10.000 ribosom chiếm 40% trọng lượng khô tế bào, khi đang phát triển mạnh có thể tăng đến 15.000 ribosom (E. coli). Phần protein của ribosom làm thành một mạng lưới bao quanh phần ARN. Trong tế bào vi khuẩn phần lớn ribosom nằm tự do trong tế bào chất, phần ít bám trên màng nguyên sinh chất. Ribosom là trung tâm tổng hợp protein của tế bào. Nhưng không phải mọi ribosom đều có khả năng tham gia vào quá trình này. Số ribosom tham gia vào quá trình này chiếm khoảng 5-10% và được liên kết với nhau gọi là polisom hay polyribosom. Sự liên kết này thực hiện được nhờ mARN. Các ribosom tự do gắn vào một đầu của mARN, được hoạt hóa và chuyển dịch dọc theo sợi mARN này. Chuỗi polypeptid liên kết với ribosom được dài dần ra, do tuần tự được lắp thêm các acid amin mới. Khi đọc xong một sợi mARN và giải phóng ra một chuỗi polypeptid mới thì ribosom lại tách khỏi đầu cuối của tập hợp, sau đó tham gia vào một mARN khác. 3.3.3. Các hạt dự trữ Trong nguyên sinh chất thấy xuất hiện các hạt có hình dạng, kích thước và thành phần hóa học khác nhau. Sự xuất hiện của các hạt này không thường xuyên, phụ thuộc vào điều kiện môi trường và giai đoạn phát triển của tế bào, đó là các hạt dự trữ hạt vùi không phải là các cơ quan con như ribosom, mesosom, Chúng có hình dạng và kích thước khác nhau và sự có mặt của chúng không ổn định, phụ thuộc vào điều kiện ngoại cảnh. Nhiều loại hạt được vi sinh vật sử dụng như các chất dự trữ. Chúng thường được hình thành khi tế bào tổng hợp thừa các chất đó và được sử dụng khi thiếu thức ăn. Các hạt hydrat carbon: các hạt này chứa tinh bột hoặc glycogen hoặc các chất tương tự nằm trong tế bào chất như những chất dự trữ. Khi thiếu thức ăn vi khuẩn sẽ lấy các hạt này làm nguồn năng lượng hoặc nguồn thức ăn carbon. Hạt volutin: đây là các chất dị nhiễm sắc (bắt màu đỏ khi nhuộm xanh metylen trong khi tế bào chất bắt màu xạnh). Trừ một số vi khuẩn (như Corynebacbacterium, Mycobacterium, ) thường xuyên chứa các hạt volutin ở giai đoạn sinh trưởng cuối, còn thông thường vi sinh vật chỉ chứa hạt volutin trong điều kiện dinh dưỡng bất thường (thiếu chất nào đó). Volutin là một phức chất, cấu tạo bởi polyphosphat, lipoprotein, ARN và Mg+2. Trong số 26
28. các hạt volutin có thể có là giọt mỡ, xuất hiện nhiều khi nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường chứa nhiều đường, glycerin hoặc các hợp chất carbon đễ đồng hóa khác. Giọt lưu huỳnh: Một số vi khuẩn ưu lưu huỳnh, có chứa thường xuyên các giọt lưu huỳnh trong tế bào, do kết quả oxy hóa H2S sinh ra. Giọt lưu huỳnh được dùng làm nguồn năng lượng khi đã sử dụng hết H2S của môi trường xung quanh. H2S + 1/2O2 S + H2O + Q1 2S + 3O2 + H2O  2H2SO4 + Q2 Tinh thể diệt côn trùng: Trong một vài vi khuẩn có thể chứa thêm một tinh thể đặc biệt. Vi khuẩn Bacillus thuringiensis hoặc B. dendrolimus, Các tinh thể đặc biệt này có khả năng giết hại một số côn trùng phá hoại mùa màng. Hiện nay, người ta sử dụng các vi khuẩn này trong công tác bảo vệ thực vật để chống lại một số sâu trong nông nghiệp. Ví dụ sản phẩm BT tức là vi khuẩn B. thuringiensis có khả năng giết sâu tơ trên cải bắp. Không bào khí: Các vi khuẩn quang hợp thủy sinh không có tiên mao, chứa các không bào khí trong tế bào chất. Chúng được bao bọc bởi một lớp màng protein dày khoảng 2 nm, không bào khí đóng vai trò điều tiết tỷ trọng để tế bào nổi lên những tầng nước thích hợp. Thường gặp ở các chi vi khuẩn như Halobacterium, Penlodictyon, Rhodopseudomonas, các chi vi khuẩn lam như: Anabaena. 3.4. Thể nhân (nuclear body) Nhân là một cấu trúc ADN kép, xoắn lại khép kín thành hình cầu, hình que, hình quả tạ hay hình chữ V. Nhân tiếp xúc trực tiếp với nguyên sinh chất, liên kết với protein HU(tương tự histon) vfa gắn vào màng tế bào. Nhân phân chia đơn giản bằng cách thắt lại không có sự gián phân bởi vì nhân vi khuẩn là một nhiễm sắc thể duy nhất. Tế bào vi khuẩn ở thời kỳ ổn định chỉ có một nhân nhưng trong quá trình tiền phân bào thì có từ 2 - 4 nhân. Thể nhân là nhân nguyên thủy chưa có màng nhân, đặc trưng cho các cơ thể thuộc giới Monera (hay Prokaryota). Thể nhân còn gọi là vùng nhân, thể giống nhân, khi nhuộm bằng thuốc thử Feulgen hoặc Shiff có thể quan sát thấy thể nhân có hình dạng bất định, bắt màu tím. Thể nhân của vi khuẩn là một nhiễm sắc thể duy nhất cấu tạo bởi một sợi ADN xoắn kép, rất dài và cuộn lại thành hình vòng tròn. Nhân tế bào vi khuẩn không phân hóa thành khối rõ rệt còn gắn với màng tế bào chất. Như vậy, phần lớn các tế bào của các vi sinh vật có nhân nguyên thủy là tế bào đơn bội. NST của vi khuẩn có chiều dài thay đổi trong khoảng 0,25-3µ m và chứa 6,6-13x106cặp base nitơ, số lượng hệ gen của vi khuẩn thay đổi tùy thuộc vào điều kiện nuôi cấy. Khi nuôi cấy tĩnh tế bào E. coli chứa 1-4 genom (bộ gen). Trong NST vi khuẩn ngoài ADN còn có protein và ARN. Phần lớn protein để cấu tạo nên enzyme ARN-polymeraza. Phân tử ADN là những chuỗi xoắn kép, khép vòng dính với ARN ở giữa đầu mút của nhiều búi khác nhau. Ngoài NST, nhiều vi khuẩn còn chứa ADN ngoài NST, đấy cũng là những sợi ADN kép, dạng vòng kín, có khả năng sao chép độc lập gọi là plasmid. Thể nhân chứa đựng thông tin di truyền của vi khuẩn. Thuốc nhuộm Shiff (nhuộm ADN): Fucsin base 1g hòa vào 20ml nước cất sôi, lắc đun cho sôi trong 5 phút. Làm nguội 500C lọc, cho thêm 20 ml HCl 1N và để nguội 200C. Sau đó thêm 1g Metabisulfite Natri (hoặc Kali) cất vào chỗ tối. Sau 24 giờ cho vào 2g than hoạt tính, lắc đều, lọc cất chỗ tối 0-40C. Trước khi dùng nên làm ấm, để nhiệt độ phòng. Thuốc nhuộm Shiff không màu hoặc vàng sáng. Để lâu thì đục, không dùng được. 27
29. 3.5. Bao nhầy (capsula) Một số loài vi khuẩn bên ngoài thành tế bào còn có chứa một lớp bao nhầy hay còn gọi là lớp giáp mô (vỏ nhầy). Đó là một lớp vật chất dạng keo, có độ dày bất định. Vỏ nhầy có hai loại, vỏ nhầy lớn và vỏ nhầy nhỏ. Vỏ nhầy lớn có chiều dày lớn hơn 0,2 µm nên thấy được dưới kính hiển vi quang học. Còn vỏ nhầy nhỏ có chiều dày dưới 0,2 µ m, chỉ quan sát được qua kính hiển vi điện tử. Một số vi khuẩn không có vỏ nhầy nhưng được bao phủ bởi một lớp dịch nhầy không giới hạn xác định và không có cấu trúc rõ ràng. Ví dụ: Chi Xanthomonas. Một số vi khuẩn vỏ là lớp chất nhầy liên kết yếu, lớp chất nhầy này có khi có kích thước rất lớn so với kích thước tế bào, ví dụ Leucorostoc mesenteroides trong hải sâm. Một số khác lớp vỏ nhầy có liên kết vững chắc, dính sát vào vách tế bào, trong trường hợp này, vỏ nhầy được gọi là giáp mô, có kích thước mỏng (Microcapsula) hay dày (Macrocapsula). Trong điều kiện tự nhiên ở các tế bào ký sinh bắt buộc nhất thiết xuất hiện giáp mô trong cơ thể vật chủ. Giáp mô bảo vệ vi khuẩn khỏi các yếu tố chống vi khuẩn của cơ thể vật chủ. Khả năng bảo vệ vi khuẩn phụ thuộc chủ yếu vào thành phần hóa học chủ yếu của giáp mô và độ thẩm thấu của nó. Thành phần hóa học chủ yếu của vỏ là polyglycozit (chủ yếu ở cầu khuẩn) và polypeptit (chủ yếu ở Bacillus). Ở Mycobacterium màng ngoài cấu tạo từ lipid dạng sáp. Hơn nữa màng lipid này phủ tế bào từ ngoài ở Mycobacterium ovis, M. tuberculosis, M. bovis và như được thẩm hút vào vách tế bào như M. avium Công dụng của vỏ nhầy là để bảo vệ tế bào vi khuẩn và là nơi tích lũy chất dinh dưỡng của vi khuẩn. Ví dụ phế cầu khuẩn Streptococcus pneumoniae khi có vỏ nhầy sẽ không bị bạch cầu thực bào, còn nếu mất vỏ nhầy sẽ bị thực bào mau lẹ. Nhuộm vỏ nhầy là phương pháp làm tiêu bản âm bằng cách trộn vi khuẩn với mực tàu. Một số vi khuẩn, khi môi trường nuôi cấy cạn dần chất dinh dưỡng vi khuẩn tiêu thụ đến chất dinh dưỡng có trong vỏ nhầy, làm cho vỏ nhầy tiêu biến dần đi. Phần lớn thành phần hóa học của vỏ nhầy là nước (98%) và polysaccarit. Vi khuẩn có vỏ nhầy sẽ cho khuẩn lạc tròn ướt, láng trơn, còn vi khuẩn không có vỏ nhầy hoặc dịch nhầy sẽ tạo thành khuẩn lạc khô xù xì. Còn các lớp vi khuẩn có lớp dịch nhầy nhớt sẽ cho những khuẩn lạc nhầy nhớt. 3.6. Tiên mao (Flagella) và khuẩn mao (pilus hay fimbria) Một số loại vi khuẩn có khả năng di động một cách chủ động nhờ những cơ quan đặc biệt gọi là tiên mao (flagella từ tiếng La Tinh có nghĩa là cái roi) hay còn gọi là tiên mao (tricha, trichos). Vi khuẩn có thể có tiên mao hoặc không có tiên mao tùy từng chi. Tiên mao là những sợi nguyên sinh chất rất mảnh, rộng khoảng 0,01-0,05 µm, cấu tạo từ các sợi protein bện xoắn vào nhau. Các sợi protein này khác với protein màng và có tính kháng nguyên H. Trên bề mặt thành tế bào các sợi protein này liên kết với các protein khác của vách tế bào. Phần lõi của tiên mao gắn chặt với nền vách tế bào và màng nguyên sinh chất bởi một (ở vi khuẩn Gram dương) hoặc hai (ở vi khuẩn Gram âm) đôi vòng nhẫn. Nhờ vòng nhẫn này xoay, tiên mao quay quanh trục của nó và làm cho vi khuẩn di động. Nguồn năng lượng này nhờ ATP hoặc thế năng điện hóa học trong và ngoài màng. Nhiệm vụ chính của tiên mao là giúp cho vi khuẩn di dộng một cách chủ động. Tùy theo số lượng của tiên mao người ta chia vi khuẩn thành các loại sau: - Không có tiên mao (vô mao khuẩn), không di động một cách chủ động được. - Tiên mao mọc ở đỉnh: một tiên mao mọc ở một đỉnh (đơn mao khuẩn). Ví dụ: vi khuẩn Xanthomonas campestris. 28
30. - Có thể là một chùm tiên mao mọc ở đỉnh (chùm mao khuẩn). Ví dụ: Pseudomonas solanacearum. - Mỗi đỉnh có một chùm tiên mao. Ví dụ: Spirillum volutans. - Tiên mao mọc xung quanh (chu mao khuẩn): Ví dụ: Escherichiae, Cấu tạo của tiên mao Nhờ kính hiển vi điện tử, chúng ta có thể quan sát được cấu tạo các tiên mao của vi khuẩn. Tiên mao xuất phát từ lớp ngoại nguyên sinh chất, phía bên trong màng nguyên sinh chất. Gốc tiên mao có hai hạt: gốc có đường kính 40 nm, kế đó là các móc để tiên mao đính vào tế bào vi khuẩn, đường kính của móc lớn hơn đường kính của tiên mao. Quan sát một số tế bào vi khuẩn. Ví dụ: như xoắn thể (Spirillum), tiên mao do nhiều sợi nhỏ xoắn lại với nhau. Muốn quan sát rõ tiên mao dưới kính hiển vi thông thường chúng ta phải nhuộm màu, bằng cách dùng alcaloid (tannin) để đắp lên tiên mao làm cho tiên mao to ra, có thể thấy được dưới kính hiển vi. Tốc độ và kiểu di động của vi khuẩn không giống nhau tùy loài và tùy vị trí của tiên mao. Các loại vi khuẩn có tiên mao mọc ở một đầu có tốc độ di chuyển mạnh mẽ nhất (60 -120 µm/giây). Nhìn chung các loài vi khuẩn khác di chuyển chậm hơn khoảng 2 - 10 µ m/giây. Vi khuẩn có tiên mao ở một đầu di chuyển theo một hướng rõ rệt, nhưng vi khuẩn tiên mao chu mao thì lại di chuyển theo một kiểu quay lung tung. Sự có mặt hay không và số lượng, vị trí tiên mao là một yếu tố để định tên của vi khuẩn. Có nhiều vi khuẩn giống hệt nhau về hình thái nhưng khác nhau về khả năng di động hoặc về vị trí sắp xếp của tiên mao. Tuy nhiên, điều kiện môi trường và thời gian nuôi cấy có thể ảnh hưởng rất nhiều đến khả năng di động của các loài vi khuẩn có tiên mao. Nhiệt độ cao quá hoặc thấp quá, pH môi trường, nồng độ muối, nồng độ đường, sự có mặt của chất độc, các sản phẩm trao đổi chất của bản thân vi khuẩn, tác động của năng lượng bức xạ, không những ảnh hưởng đến tốc độ di chuyển mà còn làm đình chỉ hẳn sự di chuyển của vi khuẩn. Đối với vi khuẩn không có tiên mao, trong môi trường lỏng chúng vẫn có thể chuyển động hỗn loạn do hiện tượng va chạm không ngừng của các phân tử vật chất trong chất lỏng (chuyển động Brown). Ngoài tiên mao, một số vi khuẩn còn có sợi pili, đó là những sợi tiên mao rất ngắn và mảnh khoảng 0,3-1µm, đường kính khoảng 0,01 µm và thường có khoảng 100-400 sợi trên một tế bào. Pili không phải là cơ quan di động mà là phương tiện giúp cho vi khuẩn bám được tốt trên bề mặt của cơ chất. Pili còn có thể tham gia vào quá trình dinh dưỡng của vi khuẩn, giúp cho bề mặt tế bào hấp thu chất dinh dưỡng lên rất nhiều lần. Ngoài ra ở một số vi khuẩn có một số sợi pili (nhung mao) sinh dục có nhiệm vụ tiếp nhận các đoạn ADN từ bên ngoài vào, trong trường hợp có trao đổi tín hiệu di truyền, nhất là trong lúc hai vi khuẩn tiếp hợp nhau. Nhung mao còn là chỗ bám cho thực khuẩn thể. Số lượng nhung mao thông thường có hàng trăm nhưng nhung mao sinh dục thì chỉ có 1-5 mà thôi. 3.7. Nha bào và sự hình thành nha bào (spore) Nha bào là một một kết cấu do sự biến đổi của tế bào sinh dưỡng trong một giai đoạn nào đó của quá trình sinh trưởng của vi khuẩn. Mỗi tế bào chỉ có thể tạo ra một nha bào. Thường gặp nha bào ở hai chi trực khuẩn Gram dương là Bacillus và Clotridium. Một số loài trong phẩy khuẩn (Deessulft-vibrio desulfuricans), cầu khuẩn (Sarcina ureae), xoắn khuẩn (Spirillium volutans) cũng có khả năng sinh nha bào. 29
31. Nha bào của Bacillus không vượt quá chiều ngang của tế bào vi khuẩn, do đó khi vi khuẩn mang nha bào vẫn không thay đổi hình dạng. Ví dụ: Trực khuẩn gây bệnh nhiệt thán Bacillus anthracis, trực khuẩn sinh chất kháng sinh Bacillus subtillis. Nha bào Clostridium chiều ngang của nha bào thường lớn hơn chiều ngang của tế bào vi khuẩn, nên khi mang nha bào vi khuẩn bị biến đổi hình dạng như hình thoi, hình vợt, hình dùi trống. Clostridium là loại vi khuẩn kỵ khí bắt buộc. Dưới kính hiển vi điện tử, nha bào có nhiều lớp màng bao bọc, lớp ngoài cùng gọi là lớp màng ngoài của nha bào. Kế đó là lớp vỏ của nha bào gồm nhiều lớp, có tác dụng ngăn chặn sự thẩm thấu của nước và các chất hòa tan trong nước. Dưới đó là lớp màng trong và trong cùng là lớp khối tế bào chất có cấu tạo đồng nhất. Nha bào không giữ nhiệm vụ sinh sản như ở các ngành vi sinh vật khác mà chỉ giữ chức năng lưu tồn mà thôi. Nha bào có khả năng lưu tồn tốt trong những điều kiện khó khăn của môi trường sống, nha bào có khả năng sống rất lâu. Người ta phát hiện có nha bào vi khuẩn trong xác sinh vật cổ đại (1000 năm) hoặc dưới đáy băng hà (3000 năm) hoặc trong quặng mỏ (250 triệu năm) đến nay vẫn còn sống. Nhiệt độ 1000C, nha bào của một số loài của Bacillus có thể chịu được từ 2,5-20 giờ. Nha bào của vi khuẩn có thể chịu được 1000C trong 5 ngày liền. Muốn tiêu diệt nha bào của vi khuẩn phải thanh trùng ở 1210C trong 15-30 phút với nhiệt độ ướt hoặc 165-170 0C trong 2 giờ với nhiệt độ khô. Ngoài việc chịu được nhiệt độ khô cao, nha bào có thể chịu được khô hạn cũng như tác động của nhiều loại hóa chất, cũng như các loại tia sáng. Trong HgCl2 tế bào vi khuẩn chết ngay nhưng nha bào sống được đến hai giờ. Quá trình hình thành nha bào: Các tế bào sinh nha bào khi gặp điều kiện thiếu thức ăn, hoặc có tích lũy các sản phẩm trao đổi chất có hại sẽ bắt đầu thực hiện quá trình hình thành nha bào. Về mặt hình thái học, có thể chia quá trình hình thành nha bào ra làm các giai đoạn: - Hình thành những búi chất nhiễm sắc. - Tế bào bắt đầu phân cắt không đối xứng, tạo ra một vùng nhỏ gọi là tiền bào tử. - Tiền bào tử hình thành hai lớp màng, tăng cao tính kháng bức xạ. - Lớp vỏ sơ khai hình thành giữa hai lớp màng của bào tử sau khi đã tích lũy nhiều PG và tổng hợp ADP, tích lũy canci, tính chiết quang cao. - Kết thúc việc hình thành áo nha bào. - Kết thúc việc hình thành vỏ nha bào. Nha bào thành thục, bắt đầu có tính kháng nhiệt. - Bào nang vỡ ra, bào tử thoát ra ngoài. 30
32. Nha bào được bao bọc bởi nhiều lớp màng. Ngoài cùng là màng ngoài. Dưới đó là lớp vỏ, vỏ bào tử gồm nhiều lớp, không thấm nước. Dưới lớp vỏ là lớp màng trong của bào tử. Trong cùng là khối tế bào chất có cấu tạo đồng nhất, thành phần hóa học của nha bào: nước chiếm 40% ở dạng liên kết, nhiều ion Ca+2, acid dipicolinic (acid này chỉ có ở nha bào). Nha bào vi khuẩn khi chín rất khó bắt màu. Nếu nhuộm bằng các phương pháp nhuộm thông thường ta không thấy rõ bào tử. Để quan sát được nha bào ta phải dùng phương pháp nhuộm màu đặc biệt. Trước tiên dùng acid để xử lý, sau đó mới nhuộm màu. Màu của nha bào khi đó rất khó tẩy. Dùng cồn hay acid để tẩy phần còn lại của tế bào rồi nhuộm bổ sung bằng thuốc nhuộm thứ hai. Nha bào của vi khuẩn không chứa chức năng của cơ quan sinh sản như bào tử của sinh vật khác. Đây là hình thức sống tiềm sinh của vi khuẩn. Bào tử giúp cho vi khuẩn vượt qua những điều kiện bất lợi của ngoại cảnh. Bào tử thường được sinh ra trong điều kiện khó khăn như thiếu thức ăn, nhiệt độ và pH không thích hợp, môi trường tích lũy nhiều sản phẩm trao đổi chất có hại, Tuy nhiên, vi khuẩn nhiệt thán, hình thành nha bào trong điều kiện có lợi nhất định: sự có mặt của oxy khí quyển, nhiệt độ thích hợp (vì vậy cấm mổ xác súc vật chết do bệnh nhiệt thán). Chính vì vậy người ta coi nha bào là hình thức tổ chức lại tế bào chất để nâng cao sức sống của vi khuẩn. Một số nha bào đóng vai trò truyền bệnh (như than, uốn ván, hoại thư sinh hơi, ngộ độc thức ăn, ). Làm vô hoạt nha bào của một số vi khuẩn loại này là nguyên tắc để chế ra một số vaccin. Sự nẩy mầm của nha bào: Quá trình chuyển từ trạng thái nghỉ sang tế bào sinh dưỡng của vi khuẩn được gọi là quá trình nẩy mầm của nha bào. Quá trình này gồm 3 giai đoạn: hoạt hóa, nẩy mầm và sinh trưởng. IV. PHÂN LOẠI VI KHUẨN [7] Như tất cả các động vật, thực vật và vi sinh vật khác, vi khuẩn được sắp xếp vào trong những hệ thống phân loại xác định. Sự sắp xếp này hết sức cần thiết. Khi biết vị trí của một vi khuẩn nào đó mới tìm được ở trong một bảng phân loại xác định nào đó chúng ta sẽ biết được vi khuẩn đó có những tính chất sinh vật học xác định nào đó. Đồng thời nhờ hệ thống phân loại, chúng ta xác định được mối liên hệ giữa các vi khuẩn trong quá trình tiến hóa. Để phân loại vi khuẩn người ta dựa vào hai nguyên tắc: theo genotype và theo phenotype. 4.1. Phân loại học hệ thống vi khuẩn (Bacterial systematics) Phân loại học hệ thống gồm 4 nội dung: -Mô tả (Description) -Xếp lớp (Classification) -Đặt tên (Nomenclature) -Đồng định (Indentification) Mô tả: trình bày tất cả đặc điểm các mẫu thu thập được, chọn chủng quy chuẩn đại diện cho một đơn vị phân loại (taxon). Có hai bước mô tả: mô tả kiểu hình và mô tả kiểu gen. +Mô tả kiểu hình (phenotypeic) Mô tả hình thái: trình bày tất cả các đặc tính hình thái, kích thước, bắt màu thuốc nhuộm Gram, hình thành tiên mao roi (tiên mao), nha bào, giáp mô, Đặc tính sinh hóa: lên men đường và các loại chất liệu khác nhau, năng lực sử dụng môi trường khác nhau. Đề kháng với các chất khác nhau (kháng sinh, thuốc nhuộm, ) Phân tích kiểu dạng thành phần protein tế bào. 31
33. Phân tích kiểu dạng thành phần lipid màng tế bào. +Mô tả kiểu gen (genotypic description) Thành phần các bagơ amin (tức là tỷ lệ: ) của ADN nhiễm sắc thể. Mô tả kiểu dạng phân cắt ADN nhiễm sắc thể bằng các enzyme hạn chế (Chromosomal ADN restriction pattern) Mô tả trình tự sắp xếp nucleotid của một gen nào đó có tính chức năng cao: +Thông thường gen ARN 16S ribosom +Gen tham gia vận chuyển điện tử, 4.2. Xếp lớp (classification) Các cá thể có đặc tính gần gũi nhau được xếp thành nhóm Các nhóm có đặc tính gần gũi nhau được xếp thành nhóm lớn hơn Đơn vị cơ bản trong phân loại học là loài (Species) Trên loài có chi (tên loài và chi được in nghiêng, ngoài ra, tên họ (family) cũng được in nghiêng ở một số nước). Đơn vị cơ bản trong phân loại là loài (Species, Bug), các đơn vị trên loài gồm có: - Chi (trước đây gọi là giống) (gennus) - Tộc: thường có tên tận cùng là -eae - Họ: thường có tên tận cùng là -aceae - Bộ phụ: thường có tên tận cùng bằng -ales Các đơn vị dưới loài gồm có Thứ, Dạng, Nòi. -Thứ (Variety) dùng để chỉ một nhóm nhất định trong một loài nào đó. Ví dụ: Mycobacterium tuberculosis var. hominis (lao người) Mycobacterium tuberculosis var. bovis (lao bò) Mycobacterium tuberculosis var. avium (lao gia cầm). -Dạng: (Fosma, type) chỉ một nhóm nhỏ hơn thứ, căn cứ vào đặc tính phản ứng huyết thanh học. Dạng được ký hiệu bằng chữ số La Mã (I, II, ) -Nòi hay chủng (Strain): là thuật ngữ riêng để chỉ một loài vi sinh vật mới phân lập thuần khiết từ một cơ chất nào đó, ở một nơi nhất định nào đó. 4.3. Đặt tên (Nomenclature) Có hai hình thức đặt tên đó là tên tạm thời và tên khoa học 4.3.1. Tên tạm thời Đây là tên bất kỳ do nhà nghiên cứu có thể quy định để tiện bảo quản, mô tả, Tên này thường chỉ chủng thu thập được của riêng nhà nghiên cứu hay PTN. Nó cũng có thể trở thành tên được công nhận quốc tế nếu quy định bởi một PTN tàng cứu (reference lab), như ATCC (Mỹ), 4.3.2. Tên khoa học Tên khoa học được đặt bởi nhà nghiên cứu tùy ý nhưng tuân thủ những nguyên tắc của Hội Vi sinh vật học: Tên phải ở dạng Latin hoặc Latin hóa Tên loài gồm hai thành phần: tên chi (trước đây gọi là giống) và từ xác định loài. Hai thành phần trên phải được in nghiêng hay gạch chân để phân biệt là tên khoa học. Sau tên viết thường có thể được viết thêm tên các nhà khoa học đã phân lập và năm phân lập. 32
34. Tên khoa học của một vi khuẩn chỉ được công nhận sau khi được đăng trên tạp chí ''Intern. J. of Systematic and Evolutionary Microbiology'' hoặc đăng trên một tạp chí chuyên môn rồi đăng ký trên tạp chí trên. Thời điểm công nhận tên khoa học mới, là thời điểm đăng trên tạp chí nêu trên. Tên khoa học chỉ được chấp nhận chính thức nếu chủng quy chuẩn (type strain) đã được lưu trữ tại một trong những phòng thí nghiệm tàng cứu (Reference lab) được hội Vi sinh vật quốc tế công nhận, nhằm: lưu giữ và có sẵn đối tượng cho các nhà nghiên cứu khác kiểm chứng. Khái niệm ''phân loại học (Taxonomy)'' Ba nội dung trên (mô tả, xếp lớp, đặt tên) được gọi là phân loại học (Taxonomy) Một bậc phân loại được gọi là một đơn vị phân loại (taxon). Loài (species) là taxon cơ bản trong các hệ thống phân loại. Taxonomy được thực hiện bởi các PTN quy mô lớn. 4.4. Đồng định (Indentification) Đồng định được thực hiện ở các phòng thí nghiệm có quy mô bất kỳ. Đồng định hay còn gọi là chẩn đoán phòng thí nghiệm (Laboratory diagnosis). Thực chất đây là mô tả đối tượng ta đang có, để quy thuộc vào nhóm các đối tượng đã được mô tả, xếp lớp và đặt tên trong quá khứ và đã biết là có liên quan đến bệnh hay hiện tượng nào đó (lên men, ) Quá trình quy thuộc được vào nhóm càng nhỏ càng tốt (loài, type huyết thanh học, type phage, type sinh học, ) Giới thiệu tóm tắt hệ thống phân loại vi khuẩn. 33
35. Phân loại vi khuẩn (Phạm Hồng Sơn, 2002)[7] 34
36. Loài Họ Chi (giống) Loài phụ (subsp) E. coli, E. fergusonii, E. Escherichia coli hermannii, E. vulneris S. choleraesuis Ariz (Typhimurium, Dublin, onae, diarizonae Salmonella Paratyphi A, Abortusequi, Abortusovis, Choleraesuis, , salamae, Typhi, Sendai, Gallinarum, houtenae, Pullorum), indica, S. dysenteriae, S. flexneri, S. boydii, S. sonnei Shigella E. tarda1, E. tarda2, E. Edwardsiella hoshinae, E. ictaluri Y. pestis, Y.en Y.pseudotuberculosis, Y. terocolica Yersinia intermedia, Y. fredriksenii, biovar 1, Y. kristensenii, Y. ruckeri 2, 3, 4, 5 K.pneumoniae, K. p oxytoca, K. terrigena, K. neumonia planticola e. Klebsiella Ozaenae, thinoscler Enterobacteriaceae omatis E. cloacae, E. Enterobacter aerogenes, E. gergoviae, E. sakazakii P. vulgaris, P. mirabillis, Proteus P. penneri, P. alcalifacciens, P. stuartii, P. rettgeri, C, freundii, C. diversus, Citrobacter C. amalonaticus Hafnia Hafnia âm yếm khí tùy tiện S. marcescens, S. Serratia liquifacciens, S. plymuthica, S. adorifera n Gram Providencia 35 Trực khuẩ
37. P. aeruginosa, P. fluorescens, P. putida, P. anguilliseptica, B .(P). mallei, Pseudomonas B.(P). pseudomallei, 86 loài Burkholderia, Ba chi khác khác Pseudomonadaceae B. pertussis, B. Bordetella parapertussis, B. ronchiseptica, B. avium âm hiếu khí B. melitensis, B. suis, B. Brucella abortus, B. cannis, B.ovis, B. n Gram neotomae F.tularensis (biovar Frarerisella Tularensis, biovar Trực khuẩ Palacearctica) F. novicida. Taylorella T. equigenitalis Riemerella anatisestifer, Riemerella Chryseobacterium Ornithobacterium Ornithobacterium rhinotrachae, Chryseobacterium N. meningitidis, N. Neisseria gonorrhoeae Moraxella M. bovis, 5 L Branhamella B.ovis Acinetobacter Acinetobacter huẩn G âm hiếu khí 3 L k seriaceae Neis Kingella uẩn và cầu trực ầu kh C 36
38. 44 L Bacteroides 10 L Fusobacterium Bacteroidaceae huẩn G âm yếm khí 7 L (cư trú khoang huẩn k miệng) ceae k Veillonella ầu trực C Veillonella hí C. jejuni, C. coli, C. C. lari, C. hyointestinalis, fetus C. sputorum , subtorum, C. subsp. hiếu k Campylobacter suptorum, subsp bubulus, C. fetus, C. mucosalis, C. mucosalis, C. fetus concisus, subsp. hí hoặc vi venereales Helicobacter Helicobacter pylori âm hiếu k Spirilium oắn thể G X Treponema T. paraluiscuniculi Serpulina B. anserina, B. theileri, Borrelia B. burgdorferi Spirochaeta Spirochaetaceae uẩn Cristispira L. interrogans, * oắn kh SG Hebdomadis, Autunalis, * X L. interrogans SG Autunalis, Canicola, Hebdo, adis, Leptospira Icterohaemorrhagiae, Pomona. L. interrogans SG*Canicola, Icterohaemorrhagiae. Leptospiraceae (SG*=serogroup, nhóm huyết thanh) 37
39. S. aureus, S. Staphylococcus epidermidis, S. felis, S. hyicus, S. intermedius, 24 loài Micrococcus 9 loài Graffkya G. tetragena Micrococaceae Sarcina S. lutea S. pyogenes (A), S. S. agalactiae (B), S. sui (D), S. equi dysgalactiae, S. subsp. ương zooepidermicus (C, L), S. zooepidem d porcinus (C), S .cannis (G), S. icus, S. Streptococcus bovis (D,E,N), S. mutans (một equi uẩn G số E), S. uberis, S. pneumoniae subsp, S. ọ Micrococaceae .(type huyết thanh) zooepider h ầu kh micus; và C goài 31 loài n khác Enterococcus E. fecalis 16 loài khác ương Lactococcus L. lactis, 6 loài khác Peptococcus P. indolicus, 9 loài khác huẩn G d M. pluton Cầu k Melissococcus B. anthracis, B. cereus, ào B. thuringiensis, B. Bacillus megaterium, B. subtillis, B. larvae nh nha b si C. chauvoei, C. septicum, C. pefringens, C. ương novyi typA, C. novyi typ B, C. d novyi typ C, C. haemolyticum, n G C. sodeli, C. sporogens, ( các Clostridium type sinh độc tố C. botulinum ABF, C. botulinum BEF, C. botulinum CD, C. botulinum Trực khuẩ G), C. difficile, C. colinum, C. tetani 38
40. Listeria L. monocytogenes, E. rhusiopathiae, E. tonsillarum h nha bào Erysipelothrix Erysipelothrix, Renibacterium, Lactobacillus hông sin Renibacilus R. salmoninarum k 40 loài ương d n G Lactobacillus Trực khuẩ C. renale, C. pilosum, C. cystitidis, C. hánh) Corynebacterium pseudotuberculosis, C. kutscheri, C. diphtheriae M. tuberculosis, M. bovis, B.microti, M. kansaii, M. marinum, M. scrofulaceum, M. goldonae, M. avium sp, M. Mycobacterium intracellulare, M. ulcerance, M. xenopi, M. gastri, M. phlei, uẩn có xu hướng sinh n M. fortuitum, M. smegmatis, M. avium sp paratuberculosis, M. lepraemurium, M. leprae A. bovis, A. isaraelii, A. Actinomyces pyogennes Dermatophilus, Rhodococcus, Nocardia uẩn gây bệnh (trực kh Liên xạ kh 39
41. ng gây bệnh Propionibacterium, Bifidobacterium, Streptomyces uẩn khô Liên xạ kh M. bovis, M. M. bovigenitalium, M. canadense, mycoides M. dispar, M.diversum, M. subsp agalactiae, M. capricolum, M. mycoides, conjunctivae, M. M ovipneumoniae, M. mycoides hyopneumoniae, subsp. M.hyosynoviae, M. hyorhinis, capri Mycoplasmataceae M. floculare, M. gallisepticum, M. synoviae, M, meleagridis, M. lowae, M. lipofaciens, M. Mycoplasma glycophilum, M. pulmonis, M. ác arthritidis, M. neurolyticum, C M. cynos, M. cannis, M. felis, M. pneumoniae, M. hominis, M. urealyticum, M. A. laidlawii, A. Acholeplasmataceae axanthum. Spiroplasmataceae Rickettsia, Rochalimaea, Rickettsiaceae Coxiella, Ehrlichia, Cowdria, Wolbacchia, Rickettsiella, Bartonellaceae Bartonella, Grahamella, Anaplasma, Aegyptianella, Anaplasmataceae Haemobartonella, Bộ Rickettsiales Eperythrozoon 40
42. C. trachomatis, C. pneumoniae, C. psittaci, C. pecorum Chlamydiales hlamydiales C -Câu hỏi ôn tập: 1. Trình bày phương pháp làm tiêu bản (soi tươi, nhuộm màu) soi kính hiển vi. 2. Kể tên một số loại môi trường nuôi cấy vi sinh vật và tác dụng của chúng. 3. Các dạng hình thái chính của vi khuẩn. 4. Cấu trúc cơ bản của tế bào vi khuẩn. -Tài liệu tham khảo: 1. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2000). Nhà xuất bản giáo dục Hà Nội. 2. Vũ Thị Minh Đức (2001). Thực tập vi sinh vật học. Nhà xuất bản Đại Học Quốc Gia Hà 3. Biền Văn Minh, Phạm Văn Ty, Kiều Hữu ảnh, Phạm Hồng Sơn, Phạm Ngọc Lan, Nguyễn Thị Thu Thủy (2006). Giáo trình vi sinh vật học. Nhà xuất bản Đại học Huế. 4. Hoàng Thủy Nguyên, Đặng Đức Trạch, Ninh Đức Dự, Nguyễn Hồng Điệt, Nguyễn Thị Kê, Nguyễn Thị Oanh (1974). Vi sinh y học tập I. Nhà xuất bản Y học Hà Nội. 5. Nguyễn Vĩnh Phước(1976). Vi sinh vật học Thú y tập III. Nhã xuất bản đại học và trung học chuyên nghiệp Hà Nội. 6. Nguyễn Khắc Tuấn(1999). Vi sinh vật học, nhà xuất bản nông nghiệp Hà Nội. 7. Phạm Hồng Sơn (2002). Giáo trình vi sinh vật thú y. Nhà xuất bản Nông nghiệp Hà Nội. -Giải thích thuật ngữ: 1. Nucleus: nhân 2. Genom: bộ gen 3. Gram: Christian Gram nhà khoa học người Đan Mạch phát hiện ra phương pháp nhuộm màu tế bào vi khuẩn. Thông qua nhuộm Gram vi khuẩn được phân làm hai nhóm: Gram dương (bắt màu tím khi được nhuộm màu kép tím sinh thể và fuschin) Gram âm (không bắt màu tím nhưng bắt màu đỏ hồng khi nhuộm kép tím sinh thể và fuschin) 4. Mycoplasma: là nhóm vi khuẩn có kích thước nhỏ nhất, đặc biệt không có vách tế bào. Chúng sống ký sinh ở động vật và côn trùng. 41
43. CHƯƠNG III- SINH LÝ HỌC VI KHUẨN ( 10 tiết) -Giảng viên: BSTY. Nguyễn Xuân Hòa – PGS.TS. Phạm Hồng Sơn -Tóm tắt: Chương này thời lượng 10 tiết giảng với 32 trang lý thuyết xen kẽ hình ảnh minh họa. Nội dung chính của chương là nghiên cứu thành phần hóa học của tế bào vi khuẩn, các chất dinh dưỡng cần thiết cho tế bào vi khuẩn sinh trưởng và phát triển. Hiểu biết về chất dinh dưỡng chúng ta mới có thể thúc đẩy sự phát triển của những vi khuẩn có lợi đồng thời tìm cách ức chế sự phát triển của các vi sinh vật có hại. Tìm hiểu quá trình vận chuyển các chất vào ra tế bào vi khuẩn và giới thiệu các phương pháp xác định số lượng vi khuẩn. - Mục tiêu: Sinh viên cần nắm được thành phần hóa học của tế bào vi khuẩn, một số quá trình lên men, các phản ứng sinh hóa xẩy ra trong tế bào, phương thức vận chuyển chất dinh dưỡng và các phương pháp định lượng chính. I. DINH DƯỠNG Ở VI KHUẨN [1] 1.1. Thành phần hóa học tế bào vi khuẩn Chất dinh dưỡng đối với vi sinh vật, là bất kỳ chất nào được vi sinh vật hấp thụ từ môi trường xung quanh và được chúng sử dụng làm nguyên liệu cho quá trình sinh tổng hợp và tạo ra các thành phần của tế bào hoặc để cung cấp cho các quá trình trao đổi năng lượng. Quá trình hấp thụ các chất dinh dưỡng để thỏa mãn mọi nhu cầu sinh trưởng và phát triển được gọi là quá trình dinh dưỡng. Hiểu biết về quá trình dinh dưỡng là cơ sở tất yếu để có thể nghiên cứu, ứng dụng hoặc ức chế vi sinh vật. Không phải mọi thành phần của môi trường nuôi cấy vi sinh vật đều được xem là chất dinh dưỡng. Một số chất rất cần thiết cho vi sinh vật nhưng chỉ làm nhiệm vụ bảo đảm các điều kiện về thế oxi hóa khử, pH, áp suất thẩm thấu, cân bằng ion, Chất dinh dưỡng phải là các chất có tham gia vào các quá trình trao đổi chất nội bào. Thành phần hóa học của tế bào vi sinh vật quyết định nhu cầu dinh dưỡng của chúng. Thành phần hóa học của tế bào vi sinh vật gồm có nước (nước tự do và nước liên kết) và vật chất khô (muối khoáng và hợp chất hữu cơ). Lượng chứa của các nguyên tố trong vi sinh vật khác nhau là không giống nhau. Các điều kiện nuôi cấy vi sinh vật khác nhau, các giai đoạn khác nhau, lượng chứa các nguyên tố trong cùng một loài vi sinh vật cũng không giống nhau. 1.1.1. Nước Nước là thành phần không thể thiếu được đối với cơ thể sống. Nước chiếm khoảng 70- 90% khối lượng cơ thể vi sinh vật. Tất cả các phản ứng xẩy ra trong tế bào vi sinh vật đều đòi hỏi có sự tồn tại của nước. Trong vi khuẩn lượng chứa nước thường là 70-85%, nấm sợi 85- 90%. Từ thời cổ xưa người ta đã biết sấy khô các loại thực phẩm để đình chỉ sự phát triển của vi sinh vật. Việc dùng muối hoặc đường để bảo quản thực phẩm chẳng qua cũng tạo ra sự khô cạn về sinh lý không thích hợp cho sự phát triển của vi sinh vật. Nước trong tế bào thường tồn tại ở hai trạng thái khác nhau: nước tự do và nước liên kết. Nước tự do là nước không tham gia vào cấu trúc các hợp chất hóa học của tế bào nên nó dễ bay hơi khi sấy khô. Nước liên kết là nước tham gia vào cấu tạo các hợp chất hữu cơ trong tế bào, nước liên kết khó tách ra khi sấy. 42
44. Yêu cầu của vi sinh vật đối với nước được biểu thị một cách định lượng bằng độ hoạt động của nước trong môi trường ký hiệu aw. Độ hoạt động của nước hay độ hoạt động của thủy phần môi trường được xác định:aw= Ở đây P là áp lực hơi nước của dung dịch, còn Po là áp lực hơi của nước nguyên chất, dung dịch có nồng độ càng cao thì P càng nhỏ. Nước nguyên chất có aw=1, nước biển có aw=0,98, máu người aw=0,995, cá muối có aw= 0,75. Mỗi vi sinh vật thường có một aw tối thích và một aw tối thiểu, một số vi sinh vật có thể phát triển được trong môi trường có áp suất thẩm thấu cao người ta gọi chúng là các vi sinh vật chịu áp lực cao. Chẳng hạn aw có thể chấp nhận được của Saccharoces rouxii là 0,85, Halococcus là 0,75. Khả năng chịu khô hạn của nấm cao hơn so với các vi sinh vật khác. Phần nước có thể tham gia vào các quá trình trao đổi chất của vi sinh vật được gọi là nước tự do. Phần lớn nước trong vi sinh vật tồn tại dưới dạng nước tự do. Nước kết hợp là nước liên kết với các hợp chất hữu cơ cao phân tử trong tế bào (L, P, hydrate carbon, ), nước liên kết mất khả năng hòa tan và lưu động. 1.1.2. Vật chất khô - Muối khoáng Muối khoáng là phần còn lại khi đốt cháy hoàn toàn chất hữu cơ chúng chiếm khoảng 2-5 % khối lượng khô của tế bào. Chúng thường tồn tại dưới dạng các muối sulphate, phosphate, carbonate, clorua, trong tế bào chúng thường ở dạng các ion. Dạng cation như : 2+ 2+ + + - 2- - Mg , Ca , K , Na , Dạng anion như HPO4 , SO4 , Cl , Các ion trong tế bào vi sinh vật luôn tồn tại ở những tỷ lệ nhất định nhằm duy trì pH và áp suất thẩm thấu cho từng loài vi sinh vật. Thành phần hoá học của một tế bào vi khuẩn Phân tử % khối lượng khô Protein 55 Polysaccharide 5 Lipid 9,1 ADN 3,1 ARN 20,5 Tổng các đơn phân tử 3,5 Acid amine và tiền thể 0,5 Đường và tiền thể 2 Nucleotit và tiền thể 0,5 Các ion vô cơ 1 -Chất hữu cơ Chất hữu cơ trong tế bào vi sinh vật chủ yếu cấu tạo từ các nguyên tố C, H, O, N, P, S, Riêng 4 nguyên tố C, H, O, N chiếm tới 90-97% toàn bộ chất khô của tế bào. Đó là các nguyên tố chủ chốt cấu tạo nên protein, nucleic acid, lipid, hydrate carbon. Trong tế bào vi khuẩn các hợp chất đại phân tử thường chiếm tới 96% khối lượng khô, các chất đơn phân tử chiếm 3,5%, còn các ion vô cơ chỉ có 1%. +Protein: Cấu tạo chủ yếu từ các nguyên tố: C, O, N, H, S ngoài ra còn có thể có một lượng rất nhỏ các nguyên tố khác nhau như P, Fe, Zn, Mn, Ca, 43
45. Đơn phân cấu tạo nên các protein là các acid amine. Các acid amine trong phân tử protein đuợc liên kết với nhau bằng liên kết peptide (liên kết cộng hoá trị -CO-NH-). Liên kết này được tạo thành do phản ứng kết hợp giữa nhóm carboxil (COO- )của acid amine này và + nhóm amine (NH 3) của một acid amine khác và loại đi một phân tử nước. + - + - + H3N - CH(R1) - COO + H3N - CH(R2) - COO → H3N - CH(R1) - - C(O) - NH - CH(R2) - COO + H2O Tùy theo số lượng các acid amine liên kết với nhau mà ta có dipeptide , tripeptide, tetrapeptide, phân tử có 15 liên kết peptide trở lên được gọi là polypeptide, protein được hình thành từ một vài chuỗi polypeptide. Có 20 loại acid amine tham gia vào cấu trúc của protein, số acid amine rất lớn nên có thể tạo ra được nhiều loại protein khác nhau. Các protein có thể được xếp loại theo hình dạng, theo cấu trúc hoặc theo chức năng: +Xếp loại theo hình dạng: Protein hình sợi, Protein hình cầu. + Xếp loại theo cấu trúc: Protein đơn giản, protein phức tạp (protein kết hợp) Nucleoprotein (Protein + acid nucleic) Glycoprotein (Protein +hidrate carbon) Lipoprotein (Protein +lipid) Mucoprotein (Protein + mucopolysaccharide) Phosphorprotein (Protein + acidphosphoric) +Xếp loại theo chức năng: Protein phi hoạt tính (kiến tạo, dự trữ, ) Protein hoạt tính (xúc tác, vận tải, chuyển động, truyền xung thần kinh, bảo vệ, ) Trong tế bào vi sinh vật ngoài những acid amine tham gia cấu trúc protein còn có những acid amine ở trạng thái tự do. +Acid nucleic: Cấu tạo chủ yếu bởi các nguyên tố, C, H, O, N, P, căn cứ vào phân tử đường pentose trong phân tử mà acid nucleic chia làm hai loại: ADN (acid deoxiribonucleic, chứa deoxiribose) và ARN (acid ribonucleic, chứa ribose). Các sản phẩm thủy phân của 2 loại acid nucleic này như sau: +ARN → Polynucleotit→ Nucleotit (acid phosphoric, nucleozit (D-Ribose, bazơ nitơ)) Bazơ nitơ ( Adenin-A, Guanin-G, Uraxin-U, Cytozin-C) +ADN → Polynucleotit→ Nucleotit (Ax. phosphorric, nucleozit) Nucleozit: (D-2-Deoxibose, bazơ nitơ) Bazơ nitơ ( Adenin-A, Guanin-G, Thymin-T, Cytozin-C) Tỷ lệ G + C ở các vi sinh vật khác nhau là có thể không giống nhau. Đây là một chỉ tiêu quan trọng trong phân loại hiện nay. Ví dụ: Chi G+C mol % Clostridium 26-34 Proteus 38-42 Staphylococcus 30-40 44
46. +Lipid: gồm có hai loại, lipid phân cực và lipid trung tính Lipid phân cực: nó ở trạng thái hoạt động, tham gia vào cấu trúc màng (lypoprotein, phosphorlipid, glycolipid) Lipid trung tính nó ở dạng dự trữ (các hạt lipid dự trữ trong tế bào chất) Mesosom là nơi chuyển hóa phosphor lipid từ dạng trung tính dự trữ sang dạng hoạt động, nó như mạng lưới nội chất ở vi sinh vật. Tế bào phát triển thì màng tế bào rộng ra khi đó lipid từ dạng dự trữ nó chuyển sang dạng hoạt động để tham gia cấu trúc. +Glucide: (gluxit) Tế bào vi khuẩn thường chứa một lượng glucide, khoảng 12-18 % trọng lượng chất khô. Các glucide thường gặp gồm các dạng đường đơn (ose), đường kép (osie) đường đa. Các loại đường đa thường gặp ở vi sinh vật là: glucan (glucarl), dextran (dextrane), amylose, chitin, cellulose , Glucide tham gia cấu tạo acid nucleic, vào cấu trúc của thành tế bào, vỏ nhầy, của vi sinh vật. Vỏ nhầy và việc hình thành vỏ nhầy liên quan đến độc lực và quá trình bảo vệ vi khuẩn. Một số polysaccharide có thể phối hợp với protein để hình thành gluco-protein. Gluco- protein là kháng nguyên của cơ thể vi sinh vật, polysaccharide đóng vai trò bán kháng nguyên. Một số polysaccharide vi sinh vật cũng có khả năng kích thích cơ thể sản sinh kháng thể. Glucide còn là nguồn dự trữ năng lượng và là sản phẩm trung gian của các quá trình trao đổi năng lượng trong tế bào vi sinh vật. +Vitamine: đây là nhóm chất hữu cơ vi sinh vật cần nhưng không tự tổng hợp được và chỉ cần với lượng rất ít. Nhu cầu về vitamine của các loại vi khuẩn khác nhau không giống nhau. Có những loại vi sinh vật tự dưỡng chất sinh trưởng, chúng có thể tự tổng hợp được các vitamine cần thiết. Nhưng cũng có những loại vi sinh vật dị dưỡng chất sinh trưởng, chúng đòi hỏi phải được cung cấp ít hay nhiều các loại vitamine khác nhau. vitamine có vai trò rất quan trọng trong quá trình phát triển của vi sinh vật. Với lượng rất nhỏ vitamine sẽ giúp cho vi sinh vật phát triển bình thường. vitamine có thể xem là những chất xúc tác sinh học và phần lớn các vitamine là nguyên liệu để cấu tạo men. Nhiều vitamine có vai trò quan trọng trong các quá trình chuyển hóa vật chất (như trong chu trình Crebs, trong các quá trình quang hợp, ). Trong tự nhiên có một số vi sinh vật muốn phát triển bình thường phải cần cung cấp một hoặc nhiều loại vitamine khác nhau. Có một số nòi có mức độ phát triển tỷ lệ thuận với nồng độ của những vitamine nhất định trong môi trường. Người ta sử dụng chúng để kiểm tra và định lượng các vitamine này. Vitamine Dạng coenzyme Chức năng Oxi hoá và khử B1 (Tiamine) Tiamine pirophosphate (TPP) carboxil các ketoacid, chuyển nhóm aldehyd Flavinmononucleotit (FMN), flavin Chuyển hydro B (Riboflavin) 2 adenin dinucleotit (FAD) 45
47. Oxi hoá ketoacid và B3 (Acid pantotenic) CoenzymeA tham gia vào trao đổi chất của acid béo Nicotin adenin dinucleotit (NAD) Khử và chuyển hydro B (Niaxin) 5 và NADP Chuyển amine, khử B (Pyridoxin) Pyridoxin phosphate 6 amine Chuyển CO và nhóm B (Biotin) Biotin 2 7 cacboxilic Trao đổi canxi và phốt D Vitamine 1,25-dihydroxicole - canxiferol 2 pho Dưới đây là lượng chứa vitamine trong một vài loại vi sinh vật (γ/g trọng lượng khô) Enterobacter Pseudomonas Clostridium Torulopin Vitamine acrogenes fluorescens butyricum utilis Acid 249 210 250 500 nicotinic Riboflavin 44 67 55 49 Thiamine 11 26 9 6.2 Piridoxin 7 6 6 - Acid 140 91 93 130 pantotenic Acid folic 14 9 3 2.8 Biotin 4 7 - 1.8 +Enzyme: Như những sinh vật khác ở vi sinh vật luôn luôn xẩy ra quá trình trao đổi vật chất. Nói cách khác, quá trình sống, quá trình sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật bao gồm rất nhiều phản ứng của các quá trình phân giải và tổng hợp. Các phản ứng này tiến hành được trong điều kiện bình thường là do trong cơ thể của vi sinh vật có nhiều loại men. Men có nguồn gốc protein hay nói cách khác nó có bản chất protein. Dựa vào bản chất hóa học có thể chia men ra làm hai loại -Men đơn giản: tương ứng với lớp protein đơn giản, gồm những loại có thành phần thuần túy là acid amine và tính xúc tác sinh học của chúng được quy định bởi cấu trúc phân tử của protein. - Men phức tạp: ngoài thành phần được gọi là protein (apoenzyme hay apofecment) còn có phần không phải protein (gọi là nhóm thêm hay coenzyme hay cofecment) như vitamine hay khoáng. Men phải có phân tử lượng lớn mới có quá trình chuyển hóa cấu hình không gian từ đó mới có thể xúc tác phản ứng hóa học. Mỗi men đều có trung tâm hoạt động. Trung tâm hoạt động là nơi cơ chất tham gia phản ứng gắn kết vào dưới tác động của men. 46
48. Dựa vào vị trí tác dụng của men đối với cơ thể vi sinh vật người ta chia men làm hai loại Men nội bào và men ngoại bào. Men nội bào (endoenzyme) ở trong tế bào vi khuẩn và phát huy tác dụng xúc tác chuyển hóa trong tế bào. Men ngoại bào exoenzyme) phát huy tác dụng ở cả trong và ngoài cơ thể vi sinh vật. Trong cơ thể vi khuẩn chúng có hàng trăm loại men và chúng hoạt động rất nhịp nhàng. Kết quả hoạt động của chúng giúp cho hoạt động sống của sinh vật diễn ra bình thường. Ngược lại vì một lý do nào đó men không hoạt động xúc tác bình thường thì cơ thể sẽ bị ảnh hưởng, quá trình sống của vi sinh vật sẽ bị trì trệ hoặc đảo lộn, vi khuẩn có thể bị tê liệt hay bị chết. + Sắc tố: Khuẩn lạc của nhiều vi sinh vật có màu sắc rõ rệt. Màu sắc có khi chỉ xuất hiện trong khuẩn lạc, có khi hòa tan vào trong nước và khuếch tán ra môi trường xung quanh. Việc tạo thành các màu sắc này là một trong những đặc điểm thường được sử dụng khi phân loại vi sinh vật (nhất là nấm mốc và xạ khuẩn). Ngoài sắc tố quang hợp (được sinh ra từ các vi sinh vật dinh dưỡng quang năng) còn có nhiều sắc tố khác. Sắc tố của vi sinh vật thuộc nhiều nhóm các hợp chất rất khác nhau: carotenoit, phenazim, piaron, araquinon, antoxiamine, Khi có mặt của sắc tố carotenoit khuẩn lạc có màu đỏ da cam (Sarcina, Micrococcus, Mycobacterium, Corynebacterium, ). Các sắc tố carotenoit phân bố trong màng nguyên sinh chất của tế bào. Loại sắc tố này giúp cho vi khuẩn tránh khỏi ảnh hưởng có hại của ánh sáng mặt trời và ánh sáng tử ngoại. Các sắc tố này cùng với bacteriochlorophill có hoạt tính quang hợp. Sắc tố puncherimin được tạo thành trong nấm men Candida puncherima. Sắc tố này nếu trên môi trường có chứa Fe nó sẽ tạo nên màu đỏ tối. Sắc tố prodigiozin làm cho khuẩn lạc Serratia marcescens (Bacterium prodigiosum) có màu đỏ sáng. Sắc tố indigoidin ở Pseudomonas indigofera và nhiều vi khuẩn khác làm cho vi khuẩn có màu lam. Vi khuẩn mủ xanh Pseudomonas acruginosa tạo thành sắc tố piocianin và một số sắc tố khác. Một số sắc tố có tính chất kháng sinh. Chính vì vậy nhiều vi sinh vật có màu sắc có khả năng sinh ra chất kháng sinh. II. CÁC KIỂU DINH DƯỠNG Ở VI KHUẨN [2] Khi nuôi cấy vi sinh vật người ta phải pha chế môi trường có thể ở dạng lỏng hoặc đặc. Trong môi trường có thể có loại chất hữu cơ có loại là chất vô cơ vô cơ. Không phải mọi thành phần của môi trường đều có thể gọi là chất dinh dưỡng. Một số thành phần của môi trường chỉ có nhiệm vụ đảm bảo các điều kiện thích hợp về thế oxi hóa, về pH, áp suất thẩm thấu, cân bằng ion, Chất dinh dưỡng phải là những chất có tham gia vào trao đổi chất của tế bào. Quá trình hấp thu các chất dinh dưỡng từ môi trường xung quanh vào cơ thể sinh vật được gọi là quá trình dinh dưỡng. 2.1. Nhu cầu về thức ăn của vi sinh vật Các chất dinh dưỡng sau khi vào tế bào sẽ được chế biến lại để tạo thành các chất riêng của cơ thể. quá trình này được gọi là quá trình đồng hóa, quá trình này cần năng lượng. Ngược lại với quá trình đồng hóa là quá trình dị hóa. Các sản phẩm của quá trình dị hóa sẽ được thải ra môi trường xung quanh hoặc một phần được sử dụng lại cho quá trình đồng hóa. Căn cứ vào nhu cầu của vi sinh vật người ta chia thức ăn làm ba loại: 47
49. -Thức ăn năng lượng: thức ăn sau khi hấp thu sẽ cung cấp cho vi sinh vật một số năng lượng cần thiết cho hoạt động sống của tế bào. Các loại protein, glucid, lipid, là những thức ăn năng lượng thường gặp. -Thức ăn kiến tạo: thức ăn loại này sau khi hấp thụ sẽ tham gia xây dựng các cấu trúc của vi sinh vật. Trong thực tế thì một loại thức ăn nó vừa là nguồn năng lượng vừa là nguyên liệu để xây dựng các cấu trúc. -Chất sinh trường: là những chất cần thiết cho hoạt động sống của một loại vi sinh vật nào đó mà nó không tự tổng hợp được. Căn cứ vào, nguồn các bon, nguồn năng lượng, chất nhận điện tử cuối cùng, người ta phân chia vi sinh vật thành các kiểu dinh dưỡng sau. Căn cứ vào nguồn carbon: người ta chia vi sinh vật ra làm hai nhóm, dị dưỡng carbon và tự dưỡng carbon. + Dị dưỡng carbon: vi sinh vật dị dưỡng carbon là loại vi sinh vật sử dụng nguồn carbon trong tự nhiên từ các hợp chất hữu cơ. Từ hợp chất hữu cơ này ngoài nguồn carbon vi sinh vật còn thu được nguồn năng lượng cần thiết cho hoạt động sống của mình. Số năng lượng trong quá trình chuyển hóa và hấp thu sẽ khác nhau tùy loại vi sinh vật. +Tự dưỡng carbon: là nhóm vi sinh vật sử dụng nguồn các bon từ các chất vô cơ như CO2 hoặc các muối carbonate. Quá trình này cần năng lượng, vi sinh vật có thể sử dụng hai nguồn năng lượng như: sử dụng trực tiếp năng lượng của ánh sáng mặt trời, sử dụng năng lượng hóa học nhờ sự oxi hóa hợp chất vô cơ. Căn cứ vào nguồn năng lượng: chia vi sinh vật thành dinh dưỡng quang năng và dinh dưỡng hóa năng. +Dinh dưỡng quang năng: là những vi sinh vật nhờ có sắc tố quang hợp mà có khả năng hấp thu năng lượng từ ánh sáng mặt trời và chuyển hóa thành năng lượng hóa học (tích lũy dưới dạng ATP) +Dinh dưỡng hóa năng: là những vi sinh vật sử dụng năng lượng chứa trong các hợp chất hóa học. Căn cứ vào nguồn carbon và nguồn năng lượng: người ta chia vi khuẩn thành các kiểu dinh dưỡng sau: a- Tự dưỡng: -Tự dưỡng quang năng: Nguồn C là CO2, nguồn năng lượng là ánh sáng. -Tự dưỡng hoá năng: Nguồn C là CO2, nguồn năng lượng là một số hợp chất vô cơ đơn giản. b- Dị dưỡng: Vi khuẩn đòi hỏi một phần hoặc toàn bộ nguồn dinh dưỡng phải là chất hữu cơ có sẵn: hydrate carbon (đường, tinh bột, cellulose , ). Còn nguồn N là các acid amine, yếu tố phát triển hoặc sinh trưởng là các vitamine, hoặc các chất chuyển hóa. -Dị dưỡng quang năng: Nguồn C là chất hữu cơ, nguồn năng lượng là ánh sáng. Ví dụ: ở vi khuẩn không lưu huỳnh màu tía. -Dị dưỡng hoá năng: Nguồn C là chất hữu cơ, nguồn năng lượng là từ sự chuyển hoá trao đổi chất của chất nguyên sinh của một cơ thể khác. -Dị dưỡng hoại sinh: Nguồn C là chất hữu cơ, nguồn năng lượng là từ sự trao đổi chất của chất nguyên sinh các xác hữu cơ. -Dị dưỡng kí sinh: Nguồn C là chất hữu cơ, nguồn năng lượng là lấy từ các tổ chức hoặc dịch thể của một cơ thể sống. Ví dụ vi sinh vật gây bệnh cho con người, thực vật, động vật. Loại này chỉ phát triển được trên cơ thể sống. 48
50. Như vậy là tùy từng nhóm vi sinh vật mà nguồn carbon được cung cấp có thể là chất hữu cơ hoặc chất vô cơ. Giá trị dinh dưỡng và khả năng hấp thu các nguồn thức ăn carbon khác nhau phụ thuộc vào hai yếu tố: một là thành phần hoá học và tính chất sinh lý của nguồn thức ăn này, hai là đặc điểm sinh lý của từng loại vi sinh vật. Trên trái đất này không có một hợp chất hữu cơ nào mà không bị vi sinh vật này hay vi sinh vật khác phân giải, hay nói cách khác không có hợp chất hữu cơ nào bền vững tuyệt đối với vi sinh vật. Có những loại vi sinh vật có thể đồng hoá được các hợp chất rất bền như cao su, chất dẻo, dầu mỏ, parafin, khí thiên nhiên. Ngay focmon là chất diệt khuẩn cực mạnh nhưng có nhóm nấm sợi sử dụng chúng làm thức ăn. Nhiều chất hữu cơ vì không tan được trong nước hoặc vì có khối lượng phân tử quá lớn cho nên trước khi hấp thụ vi sinh vật phải tiết ra enzyme thủy phân (amylase, cellulose, proteinase, ) để chuyển chúng thành các hợp chất dễ hấp thụ (đường, acid amine, acid béo, ). Người ta thường sử dụng đường để làm thức ăn carbon cho vi sinh vật dị dưỡng. Chú ý rằng đường đơn khi ở nhiệt độ cao có thể chuyển hoá thành những hợp chất có màu tối gọi là đường cháy, khó hấp thụ. Trong môi trường kiềm, sau khi khử trùng đường còn dễ bị acid hoá làm thay đổi pH môi trường. Để tránh hiện tượng này khi hấp khử trùng môi trường đường người ta thường hấp ở áp lực 0,5atm (112,50C) và duy trì trong 30 phút. Với các loại đường đơn, tốt nhất là nên sử dụng phương pháp hấp gián đoạn, hoặc dùng các nến lọc hay màng lọc vi khuẩn. Khi chế tạo môi trường chứa tinh bột, trước hết phải hồ hoá tinh bột ở 60-700C, sau đó đun sôi rồi mới đưa đi hấp cao áp. cellulose được đưa vào các môi trường nuôi cấy vi sinh vật phân giải cellulose dưới dạng giấy lọc, bông hoặc các bột cellulo. Khi sử dụng lipid, parafin, dầu mỏ, để làm nguồn carbon nuôi cấy một số loại vi sinh vật, phải thông khí mạnh để cho từng giọt nhỏ có thể tiếp xúc được với thành tế bào vi sinh vật. Nồng độ đường để nuôi cấy các loại vi sinh vật khác nhau là không giống nhau, với vi khuẩn, xạ khuẩn thì dùng 0,05-0,2 % đường còn với nấm men thì dùng 3-10% đường. Hầu hết vi sinh vật chỉ đồng hoá được đường ở dạng đồng phân D, và phần lớn đồng phân của đường đơn trong tự nhiên là dạng D chứ không phải dạng L. Các hợp chất hữu cơ chứa cả C và N cũng có thể sử dụng làm vừa làm nguồn C vừa làm nguồn N cho vi sinh vật (pepton, nước thịt, nước chiết nấm men, nước chiết giá đậu, nước chiết ngô, ). Phạm vi đồng hoá các nguồn thức ăn carbon của từng loài vi sinh vật cụ thể rất khác nhau. Có thực nghiệm cho thấy vi khuẩn Pseudomonas cepacia có thể đồng hoá trên 90% loại nguồn thức ăn carbon, trong khi đó các loại vi khuẩn sinh mêtan chỉ có thể đồng hoá được CO2 và vài hợp chất chứa 1 hoặc hai carbon mà thôi. Với các vi sinh vật dị dưỡng nguồn thức ăn carbon làm cả hai chức năng: nguồn dinh dưỡng và nguồn năng lượng. Một số vi khuẩn dị dưỡng, nhất là các vi khuẩn gây bệnh, sống trong máu, trong các tổ chức hoặc trong ruột người và động vật muốn sinh trưởng được, ngoài cabon hữu cơ cần phải được cung cấp một lượng nhỏ CO2 thì mới phát triển đựơc. Trong công nghiệp lên men, nguồn rỉ đường là nguồn carbon rẻ tiền và rất thích hợp sử dụng đối với nhiều loại vi sinh vật khác nhau. 49
51. 2.2. Nguồn thức ăn nitơ của vi khuẩn Nitơ có ý nghĩa rất quan trọng đối với sự phát triển của vi sinh vật, nguồn Nitơ dễ hấp + thụ nhất đối với vi sinh vật là NH3 và NH 4, chúng xâm nhập vào tế bào dễ dàng và ở đó tạo nên các nhóm amine. Trước đây có một số quan điểm cho rằng, một số vi khuẩn không sử dụng muối amon để đồng hoá được. Quan điểm này không đúng, ngày nay người ta cho rằng tất cả các loại vi sinh vật đều có khả năng sử dụng muối amon. Urea là nguồn thức ăn nitơ trung tính về mặt sinh lý, khi bị phân giải bởi enzyme urease nó sẽ giải phóng thành NH3 và CO2. NH3 được vi sinh vật sử dụng mà không làm chua môi trường như các muối amon. NH2-CO-NH2+ H2O (urease)→ NH3+ CO2 Nhiều khi để nuôi cấy vi sinh vật bằng nguồn nitơ từ urê, người ta phải bổ sung thêm muối amon là vì phải có thức ăn nitơ dễ hấp thụ cho vi sinh vật phát triển đã khi đó mới có men urease để thủy phân urea. Nguồn nitơ có trữ lượng nhiều nhất trong tự nhiên đó là nguồn khí nitơ tự do (N2) trong khí quyển. Chúng chiếm tỷ lệ cao trong không khí (75,5% về khối lượng hoặc 78,16% theo thể tích). Số lượng nitơ trong khí quyển trên mỗi ha đất là 85000 tấn, trên trái đất có khoảng 4x1015 tấn. Trong phân tử khí nitơ hai nguyên tử N liên kết với nhau bằng ba liên kết rất bền vững vì vậy nó khó tách ra để liên kết với các chất khác và nitơ tuy có nhiều chung quanh ta mà cả người, động vật lẫn cây trồng đều thiếu thức ăn nitơ. Đa số vi sinh vật không có khả năng đồng hoá N2 trong không khí, tuy nhiên có những vi sinh vật có thể chuyển hoá N2 thành NH3 nhờ hoạt động xúc tác của một hệ thống enzyme có tên gọi là nitrogenase. Người ta gọi các vi sinh vật này là vi sinh vật cố định nitơ còn quá trình này đuợc gọi là quá trình cố định nitơ (vi khuẩn cố định ở nốt sần cây họ đậu). Nguồn nitơ hữu cơ thường được sử dụng để nuôi cấy vi sinh vật là pepton loại chế phẩm thủy phân không triệt để của một loại protein nào đó. Về acid amine Người ta nhận thấy có thể có 3 mối quan hệ khác nhau đối với từng loại vi sinh vật. Có những loại vi sinh vật không cần đòi hỏi cung cấp bất kỳ một loại acid amine nào. Chúng có khả năng tổng hợp ra toàn bộ những acid amine mà chúng cần từ những nguồn nitơ vô cơ hay hữu cơ chuyển thành dạng NH3 để xây dựng cơ thể. Người ta gọi nhóm vi sinh vật này là tự dưỡng amine. Có những vi sinh vật bắt buộc phải cung cấp thêm một số acid amine trong quá trình sống mà chúng không có khả năng tổng hợp được gọi chúng là vi sinh vật dị dưỡng acid amine, loại này chúng tổng hợp protein và nguyên sinh chất của mình từ những acid amine có sẵn, acid amine được sử dụng làm nguyên liệu trực tiếp không bị phân giải thành NH3. Protein là hợp chất cao phân tử chúng không thể xâm nhập vào tế bào vi sinh vật. Vì vậy chỉ có những vi sinh vật tiết vào môi trường men protease thủy phân protein thành peptid và acid amine thì nó mới có khả năng đồng hóa được protein . Rất nhiều vi sinh vật có được khả năng này, đặc biệt là các vi sinh vật gây thối yếm khí. Loại thứ ba là vi sinh vật không có các acid amine trong môi trường vẫn phát triển được, nhưng nếu có mặt của một số acid amine thì chúng phát triển tốt hơn. Nhu cầu về các loại acid amine ở các loài vi sinh vật khác nhau là không giống nhau. Để tìm hiểu mối quan hệ giữa acid amine của một chủng vi khuẩn nào đó, trước hết người ta cấy chúng lên môi trường dinh dưỡng có nguồn nitơ duy nhất là muối amon. Nếu chúng phát triển được, chứng tỏ chúng thuộc nhóm tự dưỡng amine. Nếu chúng không phát triển được và sau khi bổ sung dịch acid amine (thủy phân casein có trộn thêm tryptophan) lại phát triển tốt thì chúng thuộc nhóm dị dưỡng acid amine, nếu sau khi bổ sung acid amine mà vẫn không phát triển được thì phải xem xét đến các yếu tố, nguồn carbon, vitamine, pH, Muốn biết quan hệ của một chủng vi khuẩn nào đó với từng loại acid amine riêng bịêt, người ta sử dụng môi trường có chứa đầy đủ nguồn thức ăn carbon, khoáng, vitamine (dạng 50