Bài giảng Vi sinh môi trường - TS. Lê Quốc Tuấn

Nội dung text: Bài giảng Vi sinh môi trường - TS. Lê Quốc Tuấn

1. ÑAÏI HOÏC NOÂNG LAÂM TP. HOÀ CHÍ MINH KHOA MOÂI TRÖÔØNG VAØ TAØI NGUYEÂN W”X TS. Leâ Quoác Tuaán Baøi giaûng VI SINH moâi tröôøng Löu haønh noäi boä -2009-
2. GIÔÙI THIEÄU Vi sinh vaät hoïc moâi tröôøng laø ngaønh nghieân cöùu caùc ñoái vi sinh vaät toàn taïi trong moâi tröôøng töï nhieân vaø nhaân taïo. Nguoàn goác cuûa caùc nghieân cöùu baét ñaàu töø söï quan saùt cuûa Antony van Leeuwenhoek (1677). Van Leeuwenhoek ñaõ söû duïng moät kính hieån vi ñeå khaùm phaù nhöõng gì maø oâng goïi laø “nhöõng ñoäng vaät nhoû” chuùng soáng vaø sinh saûn trong nöôùc möa, nöôùc gieáng, nöôùc bieån vaø nöôùc baêng tan. Trong suoát nhieàu theá kyû, söï hieåu bieát cuûa chuùng ta veà vi sinh vaät moâi tröôøng döïa treân nhöõng quan saùt chi tieát vaø caùc thí nghieäm vôùi söï giuùp ñôõ cuûa kính hieån vi vaø caùc coâng cuï hoaù sinh cuõng nhö toaùn hoïc hieän ñaïi. Nhieàu nghieân cöùu cuûa van Leeuwenhoek döïa vaøo vieäc kieåm tra caùc maãu vaät ñöôïc ñaët trong oáng nghieäm, trong chai thuyû tinh taïi nhaø oâng. Hieän taïi, ngöôøi ta cho raèng oâng ñaõ taïo neân moät moâi tröôøng nhaân taïo, cuõng nhôø ñoù maø ngaøy nay chuùng ta coù nhöõng kyõ thuaät nuoâi caáy vi sinh vaät trong phong thí nghieäm ñeå xaùc ñònh caáu truùc cuõng nhö chöùc naêng cuûa chuùng. Nhö chuùng ta ñaõ bieát vi sinh vaät hieän dieän khaép nôi, trong ñaát, trong nöôùc, khoâng khí, trong cô theå sinh vaät khaùc, ñaëc bieät chuùng coù theå toàn taïi trong nhöõng moâi tröôøng khaéc nghieät nhaát. Chuùng ñoùng moät vai troø quan troïng trong voøng tuaàn hoaøn vaät chaát. Vì theá, chuùng ñöôïc xem laø laø moät maéc xích quan trong trong quaù trình chuyeån hoaù vaät chaát. Trong phaàn vi sinh vaät moâi tröôøng naøy, chuùng ta seõ tìm hieåu caùc quaù trình chuyeån hoaù vaät chaát trong moâi tröôøng töï nhieân vaø nhaân taïo. Qua ñoù, coù theå naém baét ñöôïc caùc quy luaät chuyeån hoaù chaát höõu cô vaø voâ cô bôûi vi sinh vaät nhaèm ñieàu khieån vaø aùp duïng chuùng moät caùch hieäu trong caùc coâng trình xöû lyù chaát thaûi. Nghieân cöùu söï taùc ñoäng töông hoã giöõa caùc cô theå vi sinh vaät, giöõa vi sinh vaät vaø moâi tröôøng (caùc taùc nhaân lyù hoaù vaø sinh hoïc) nhaèm kieåm soaùt söï phaùt trieån cuûa chuùng, vaø nhaèm taêng cao hieäu quaû xöû lyù chaát thaûi cuûa chuùng khi ñöôïc aùp duïng. Töø ñoù chuùng ta seõ coù nhöõng hieåu bieát ñuùng ñaén veà vi sinh vaät vaø taàm quan troïng cuûa chuùng trong moâi tröôøng töï nhieân cuõng nhö nhaân taïo. W X Khoa Moâi Tröôøng vaø Taøi Nguyeân Ñaïi Hoïc Noâng Laâm TP. HCM
3. MUÏC LUÏC Chöông 1. Söï phaân boá cuûa vi sinh vaät trong moâi tröôøng Trang 1.1. Moâi Tröôøng ñaát vaø söï phaân boá cuûa vi sinh vaät trong ñaát 1 1.1.1. Moâi tröôøng ñaát 1 1.1.2. Söï phaân boá cuûa vi sinh vaät trong ñaát vaø moái quan heä giöõa caùc nhoùm VSV 1 1.1.3. Moái quan heä giöõa ñaát, vi sinh vaät vaø thöïc vaät 4 1.2. Moâi tröôøng nöôùc vaø söï phaân boá cuûa vi sinh vaät trong nöôùc 5 1.2.1. Söï phaân boá cuûa vi sinh vaät trong nöôùc 5 1.3. Moâi tröôøng khoâng khí vaø söï phaân boá cuûa vi sinh vaät trong khoâng khí 7 Chöông 2. Khaû naêng chuyeån hoùa caùc hôïp chaát trong moâi tröôøng töï nhieân cuûa VSV 2.1. Voøng tuaàn hoaøn nitrogen trong töï nhieân 8 2.2. Quaù trình amoân hoùa 8 2.2.1. Söï amoân hoùa urea 8 2.2.2. Söï amoân hoùa protein 9 2.3. Quaù trình nitrate hoùa 10 2.3.1. Giai ñoaïn nitrite hoùa 10 2.3.2. Giai ñoaïn nitrate hoùa 10 2.4. Quaù trình phaûn nitrate hoùa 11 2.5. Quaù trình coá ñònh nitrogen phaân töû 12 2.6. Söï chuyeån hoùa caùc hôïp chaát phosphore cuûa vi sinh vaät 12 2.6.1. Voøng tuaàn hoaøn phosphore trong töï nhieân 12 2.6.2. Söï phaân giaûi phosphore höõu cô trong ñaát do vi sinh vaät 13 2.6.3. Söï phaân giaûi phosphore voâ cô do vi sinh vaät 14 2.7. Söï chuyeån hoùa caùc hôïp chaát löu huyønh cuûa vi sinh vaät 15 2.7.1. Voøng tuaàn hoaøn löu huyønh trong töï nhieân 15 2.7.2. Söï oxy hoùa caùc hôïp chaát löu huyønh 15 2.7.3. Söï khöû caùc hôïp chaát löu huyønh voâ cô do vi sinh vaät 16 Chöông 3. Sinh tröôûng vaø phaùt trieån ôû vi sinh vaät 3.1. Maãu lyù thuyeát veà sinh tröôûng vaø phaùt trieån cuûa vi khuaån 17 3.2. Sinh tröôûng vaø phaùt trieån cuûa vi khuaån trong ñieàu kieän nuoâi caáy tónh – 19 Ñöôøng cong sinh tröôûng 3.2.1. Pha lag 19 3.2.2. Pha log 20 3.2.3. Pha oån ñònh 23 3.2.4. Pha töû vong 24 3.3. Sinh tröôûng cuûa vi khuaån trong quaù trình nuoâi caáy lieân tuïc 25 3.4. Laøm ñoàng boä söï phaân chia teá baøo 27 3.5. Caùc phöông phaùp xaùc ñònh sinh tröôûng vaø phaùt trieån cuûa vi khuaån 29 3.5.1. Caùc phöông phaùp xaùc ñònh soá löôïng teá baøo 29 3.5.2. Caùc phöông phaùp xaùc ñònh sinh khoái teá baøo 30
4. 3.6. Taùc duïng cuûa caùc yeáu toá beân ngoaøi leân sinh tröôûng vaø phaùt trieån cuûa vi 31 khuaån 3.6.1. Cô cheá taùc duïng cuûa caùc yeáu toá beân ngoaøi leân vi khuaån 32 3.6.2. Caùc yeáu toá vaät lyù 33 3.6.3. Caùc yeáu toá hoùa hoïc 36 3.6.4. Caùc yeáu toá sinh hoïc 38 Chöông 4. Thaønh phaàn vi sinh vaät tham gia trong quaù trình xöû lyù nöôùc thaûi 4.1. Vi khuaån 40 4.1.1. Caáu truùc teá baøo 40 4.1.2. Ñieàu kieän moâi tröôøng 41 4.1.3. Söï phaùt trieån cuûa vi khuaån 42 4.1.4. Ñoäng hoïc cuûa quaù trình xöû lyù sinh hoïc 45 4.1.5. ÖÙng duïng söï phaùt trieån cuûa vi khuaån vaø hoaït ñoäng söû duïng chaát neàn trong 47 xöû lyù sinh hoïc. 4.2. Naám 47 4.3. Taûo 48 Chöông 5. Xöû lyù nöôùc thaûi baèng vi sinh vaät 5.1. Xöû lyù nöôùc thaûi baèng vi sinh dính baùm trong moâi tröôøng hieáu khí 51 5.1.1. Cô sôû lyù thuyeát cuûa phöông phaùp 51 5.1.2. Beå loïc sinh hoïc coù vaät lieäu tieáp xuùc khoâng ngaäp nöôùc 52 5.1.3. Beå loïc sinh hoïc coù lôùp vaät lieäu ngaäp trong nöôùc 59 5.2. Xöû lyù nöôùc thaûi baèng vi sinh vaät yeám khí trong moâi tröôøng caën lô löõng 60 vaø moâi tröôøng vi sinh dính baùm 5.2.1. Caùc quaù trình sinh hoïc vaø phaân loaïi coâng trình 60 5.2.2. Beå xöû lyù yeám khí coù lôùp caën lô löûng 63 5.2.3. Beå loïc yeám khí 65 5.2.4. Ñaùnh giaù quaù trình 66 Chöông 6. Caùc quaù trình khöû nitrogen baèng vi sinh vaät 6.1. Söï chuyeån hoùa amonia baèng quaù trình nitrate hoùa sinh hoïc 68 6.1.1. Moâ taû quaù trình 68 6.1.2. Phaân loaïi caùc quaù trình nitrate 69 6.1.3. Söï oxy hoùa carbon vaø nitrate hoùa ôû giai ñoaïn ñôn (sô ñoà phoái hôïp) 70 6.1.4. Nitrate hoùa giai ñoaïn keùp (sô ñoà taùch bieät) 73 6.2.1. Loaïi boû nitrogen baèng nitrate hoùa/phaûn nitrate hoùa sinh hoïc 74 6.2.2. Phaân loaïi caùc quaù trình nitrate hoùa/phaûn nitrate hoùa 76 Chöông 7. Khöû phosphorus baèng caùc phöông phaùp sinh hoïc 7.1. Caùc quaù trình khöû phosphorus 82 7.1.1. Quaù trình A/O (khöû phosphorus doøng chính) 84 7.1.2. Quaù trình PhoStrip (khöû phosphorus doøng phuï) 84 7.1.3. Beå phaûn öùng meû lieân tuïc 85 7.1.4. So saùnh caùc quaù trình khöû phosphorus sinh hoïc 85 7.2. Vieäc khöû nitrogen vaø phosphorus keát hôïp baèng caùc phöông phaùp xöû lyù 86
5. sinh hoïc 7.2.1. Quaù trình A2/O 87 7.2.2. Quaù trình 5 giai ñoaïn 87 7.2.3. So saùnh caùc quaù trình khöû nitrogen vaø phosphorus sinh hoïc keát hôïp 88 Chöông 8. Caùc heä thoáng xöû lyù töï nhieân vaø öùng duïng 8.1. Caùc heä thoáng xöû lyù töï nhieân 90 8.1.1. Söï phaùt trieån cuûa caùc heä thoáng xöû lyù töï nhieân 90 8.1.2. Toác ñoä chaäm 93 8.1.3. Ræ nhanh 95 8.1.4. Heä chaûy traøn beà maët 97 8.1.5. Ñaát ngaäp nöôùc 99 8.1.6. Heä thöïc vaät thuûy sinh baäc cao 100 8.1.7. Heä nuoâi troàng thuûy saûn 100 8.2. Nhöõng nghieân cöùu cô baûn trong vieäc öùng duïng heä thoáng xöû lyù töï nhieân 101 8.2.1. Caùc ñaëc tính cuûa nöôùc thaûi vaø cô cheá xöû lyù 101 8.2.2. Nhöõng vaán ñeà veà söùc khoûe coäng ñoàng 106 Taøi lieäu tham khaûo 108
6. Chöông 1 SÖÏ PHAÂN BOÁ CUÛA VI SINH VAÄT TRONG MOÂI TRÖÔØNG W—X 1.1. Moâi tröôøng ñaát vaø söï phaân boá cuûa vi sinh vaät trong ñaát 1.1.1. Moâi tröôøng ñaát. Ñaát laø moät moâi tröôøng thích hôïp nhaát ñoái vôùi vi sinh vaät, vì theá noù laø nôi cö truù roäng raõi nhaát cuûa vi sinh vaät, caû veà thaønh phaàn cuõng nhö soá löôïng so vôùi caùc moâi tröôøng khaùc. Sôû dó nhö vaät laø do trong ñaát coù moät löôïng lôùn caùc chaát höõu cô. Ñoù laø nguoàn thöùc aên cho caùc nhoùm vi sinh vaät dò döôõng (vi sinh vaät phaân huyû caùc chaát carbon höõu cô, nhoùm vi sinh vaät phaân huûy caùc chaát nitrogen höõu cô ). Caùc chaát voâ cô coù trong ñaát cuõng laø nguoàn dinh döôõng cho caùc nhoùm vi sinh vaät töï döôõng (caùc nhoùm phaân huûy caùc chaát voâ cô, chuyeån hoaù caùc chaát S, P, Fe ) Caùc chaát dinh döôõng khoâng nhöõng taäp trung nhieàu ôû taàng ñaát maët maø coøn phaân taùn xuoáng caùc taàng ñaát saâu. Bôûi vaäy, ôû caùc taàng ñaát khaùc nhau, söï phaân boá vi sinh vaät khaùc nhau phuï thuoäc vaø haøm löôïng caùc chaát dinh döôõng. Möùc ñoä thoaùng khí cuûa ñaát cuõng laø moät ñieàu kieän aûnh höôûng ñeán söï phaân boá cuûa vi sinh vaät. Caùc nhoùm hieáu khí phaùt trieån nhieàu ôû nhöõng nôi coù noàng ñoä oxy cao. Nhöõng nôi yeám khí, haøm löôïng oxy thaáp thöôøng phaân boá nhieàu loaïi vi sinh vaät kî khí. Ñoä aåm vaø nhieät ñoä trong ñaát cuõng aûnh höôûng ñeán söï phaùt trieån cuûa vi sinh vaät ñaát. Ñaát vuøng nhieät ñôùi thöôøng coù ñoä aåm 70-80% vaø nhieät ñoä 200C – 300C. Ñoù laø nhieät ñoä vaø ñoä aåm thích hôïp vôùi ña soá vi sinh vaät. Bôûi vaäy, trong moãi gam ñaát thöôøng coù haøng chuïc trieäu ñeán haøng tæ teá baøo vi sinh vaät bao goàm nhieàu nhoùm khaùc nhau veà vò trí phaân loaïi cuõng nhö hoaït tính sinh lyù, sinh hoaù vaø sinh thaùi. 1.1.2. Söï phaân boá cuûa vi sinh vaät trong ñaát vaø moái quan heä giöõa caùc nhoùm vi sinh vaät. 1.1.2.1. Söï phaân boá cuûa vi sinh vaät trong ñaát. Vi sinh vaät laø nhöõng cô theå nhoû beù deå daøng phaùt taùn nhôø gioù vaø caùc sinh vaät khaùc. Bôûi vaäy chuùng coù theå di chuyeån deã daøng ñeán moïi nôi trong töï nhieân. Nhaát laø nhöõng vi sinh vaät coù baøo töû, baøo töû cuûa chuùng coù khaû naêng soáng tieàm sinh trong caùc ñieàu kieän khoù khaên. Khi gaëp ñieàu kieän thuaän lôïi, chuùng laïi phaùt trieån vaø sinh soâi. Tuy nhieân, ñaát laø nôi vi sinh vaät toàn taïi nhieàu nhaát so vôùi caùc moâi tröôøng khaùc. Söï phaân boá cuûa vi sinh vaät ñaát coøn goïi laø khu heä vi sinh ñaát. Chuùng bao goàm caùc nhoùm coù ñaëc tính sinh lyù, sinh hoaù vaø sinh thaùi raát khaùc nhau. Caùc nhoùm vi sinh vaät chính cö truù trong ñaát bao goàm: Vi khuaån, Vi naám, Xaï khuaån, Virus, Taûo, Nguyeân sinh ñoäng vaät. Trong ñoù vi khuaån laø nhoùm chieám nhieàu nhaát veà soá löôïng. Chuùng bao goàm vi khuaån hieáu khí, vi khuaån kî khí, vi khuaån töï döôõng, vi khuaån dò döôõng Neáu chia theo caùc nguoàn dinh döôõng thì noù laïi coù nhoùm töï döôõng carbon, töï döôõng amin, dò döôõng amin, vi khuaån coá ñònh nitrogen 1
7. Theo nhieàu taøi lieäu thì trung bình trong ñaát vi khuaån chieám khoaûng 90% toång soá. Xaï khuaån chieám khoaûng 8%, vi naám 1%, coøn laïi 1% laø taûo, nguyeân sinh ñoäng vaät. Tæ leä naøy thay ñoåi tuyø theo caùc loaïi ñaát khaùc nhau cuõng nhö khu vöïc ñòa lyù, taàng ñaát, thôøi vuï, cheá ñoä canh taùc ÔÛ nhöõng ñaát coù ñaày ñuû chaát dinh döôõng, ñoä thoaùng khí toát, nhieät ñoä, ñoä aåm vaø pH thích hôïp thì vi sinh vaät phaùt trieån nhieàu veà soá löôïng vaø thaønh phaàn. Söï phaùt trieån cuûa vi sinh vaät laïi chính laø nhaân toá laøm cho ñaát theâm phì nhieâu, maøu môõ. Söï phaân boá cuûa vi sinh vaät trong ñaát coù theå chia ra nhö sau: * Phaân boá theo chieàu saâu. Quaàn theå vi sinh vaät thöôøng taäp trung nhieàu nhaát ôû taàng canh taùc. Ñoù laø nôi taäp trung reã caây, chaát dinh döôõng, coù cöôøng ñoä chieáu saùng, nhieät ñoä, ñoä aåm thích hôïp nhaát. Soá löôïng vi sinh vaät giaûm daàn theo taàng ñaát, caøng xuoáng saâu caøng ít vi sinh vaät. Rieâng ñoái vôùi caùc ñaát baïc maøu, do hieän töôïng röûa troâi, taàng 0 – 20 cm ít chaát höõu cô hôn taàng 20 – 40 cm. Bôûi vaäy, ôû taàng naøy soá löôïng vi sinh vaät nhieàu hôn ôû taàng treân. Sau ñoù giaûm daàn ôû caùc taàng döôùi. Thaønh phaàn vi sinh vaät cuõng thay ñoåi theo taàng ñaát: vi khuaån hieáu khí, vi naám, xaï khuaån thöôøng taäp trung ôû taàng maët vì taàng naøy coù nhieàu oxy. Caøng xuoáng saâu, caùc nhoùm vi sinh vaät hieáu khí caøng giaûm maïnh. Ngöôïc laïi, caùc nhoùm vi khuaån kî khí nhö vi khuaån phaûn nitrate hoaù phaùt trieån maïnh ôû ñoä saâu 20 – 40 cm. ÔÛ vuøng khí haäu nhieät ñôùi noùng aåm thöôøng coù quaù trình röûa troâi, xoùi moøn neân taàng 0 – 20 cm deå bieán ñoäng, taàng 20 – 40 cm oån ñònh hôn. * Phaân boá theo caùc loaïi ñaát. Caùc loaïi ñaát khaùc nhau coù ñieàu kieän dinh döôõng, ñoä aåm, ñoä thoaùng khí, pH khaùc nhau. Bôûi vaäy söï phaân boá cuûa vi sinh vaät cuõng khaùc nhau. ÔÛ ñaát luùa nöôùc, tình traïng ngaäp nöôùc laâu ngaøy laøm aûnh höôûng ñeán ñoä thoâng khí, cheá ñoä nhieät, chaát dinh döôõng Chæ coù moät lôùp moûng ôû treân khoaûng 0 – 3 cm laø coù quaù trình oxy hoaù, ôû taàng döôùi quaù trình khöû oxy chieám öu theá. Bôûi vaäy, trong ñaát luùa nöôùc caùc loaïi vi sinh vaät kî khí phaùt trieån maïnh. Ví duï nhö vi khuaån amoân hoaù, vi khuaån phaûn nitrate hoaù. Ngöôïc laïi, caùc loaïi vi sinh vaät hieáu khí nhö vi khuaån nitrate hoaù, vi khuaån coá ñònh nitrogen, vi naám vaø xaï khuaån ñeàu raát ít. Tyû leä giöõa vi khuaån hieáu khí vaø yeám khí luoân nhoû hôn 1. ÔÛ ñaát troàng hoa maøu, khoâng khí löu thoâng toát, quaù trình oxy hoaù chieám öu theá, bôûi vaäy caùc loaøi vi sinh vaät hieáu khí phaùt trieån maïnh, vi sinh vaät yeám phaùt trieån yeáu. Tyû leä giöõa vi khuaån hieáu khí vaø yeám khí thöôøng lôùn hôn 1, coù tröôøng hôïp ñaït tôùi 4 – 5. ÔÛ ñaát giaøu dinh döôõng nhö ñaát phuø sa soâng Hoàng, soá löôïng vi sinh vaät toång soá raát cao. Ngöôïc laïi, vuøng ñaát baïc maøu Haø Baéc coù soá löôïng vi sinh vaät ít nhaát. * Phaân boá theo caây troàng. Ñoái vôùi taát caû caùc loaïi caây troàng, vuøng reã caây laø vuøng vi sinh vaät phaùt trieån maïnh hôn so vôùi vuøng khoâng coù reã. Sôû dó nhö theá vì reã caây cung caáp moät löôïng lôùn chaát höõu cô khi noù cheát ñi. Khi coøn soáng, baûn thaân reã caây cuõng thöôøng xuyeân tieát ra caùc chaát höõu cô laøm nguoàn dinh döôõng cho vi sinh vaät. Reã caây coøn laøm cho ñaát thoaùng khí, giöõ ñöôïc ñoä 2
8. aåm. Taát caû nhöõng nhaân toá ñoù laøm cho soá löôïng vi sinh vaät ôû vuøng reã phaùt trieån maïnh hôn vuøng ngoaøi reã. Tuy nhieân, moãi loaïi caây troàng trong quaù trình soáng cuûa noù thöôøng tieát qua boä reã nhöõng chaát khaùc nhau. Boä reã khi cheát ñi cuõng coù thaønh phaàn caùc chaát khaùc nhau. Thaønh phaàn vaø soá löôïng caùc chaát höõu cô tieát ra töø boä reã quyeát ñònh thaønh phaàn vaø soá löôïng vi sinh vaät soáng trong vuøng reã ñoù. Ví duï nhö vuøng reã caây hoï ñaäu thöôøng phaân boá nhoùm vi khuaån coá ñònh nitrogen coäng sinh coøn ôû vuøng reã luùa laø nôi cö truù cuûa caùc nhoùm coá ñònh nitrogen töï do hoaëc hoäi sinh v.v Soá löôïng vaø thaønh phaàn vi sinh vaät cuõng thay ñoåi theo caùc giai ñoaïn phaùt trieån cuûa caây troàng. Ñaát vuøng phuø sa soâng Hoàng, soá löôïng vi sinh vaät ñaït cöïc ñaïi ôû giai ñoaïn luùa choài nhanh, ñeû nhaùnh, giai ñoaïn naøy laø caây luùa sinh tröôûng maïnh. Bôûi vaäy thaønh phaàn vaø soá löôïng chaát höõu cô tieát qua boä reã caøng lôùn – ñoù laø nguoàn dinh döôõng cho vi sinh vaät vuøng reã. Soá löôïng vi sinh vaät ñaït cöïc tieåu ôû thôøi kyø luùa chín. Thaønh phaàn vi sinh vaät cuõng bieán ñoäng theo caùc giai ñoaïn phaùt trieån cuûa caây phuø hôïp vôùi haøm löôïng caùc chaát tieát qua boä reã. 1.1.2.2. Moái quan heä giöõa caùc nhoùm vi sinh vaät trong ñaát. Söï phaân boá cuûa vi sinh vaät trong ñaát voâ cuøng phong phuù caû veà soá löôïng cuõng nhö thaønh phaàn. Trong quaù trình soáng chung nhö theá, chuùng coù moät moái quan heä töông hoã voâ cuøng chaët cheõ. Döïa vaøo tính chaát cuûa caùc loaïi quan heä giöõa caùc nhoùm vi sinh vaät, ngöôøi ta chia ra laøm 4 loaïi quan heä: kyù sinh, coäng sinh, hoã sinh vaø khaùng sinh. * Quan heä kyù sinh: Quan heä kyù sinh laø hieän töôïng vi sinh vaät naøy soáng kyù sinh treân vi sinh vaät khaùc, hoaøn toaøn aên baùm vaø gaây haïi cho vaät chuû. Ví duï nhö caùc loaïi virus soáng kyù sinh trong teá baøo vi khuaån hoaëc moät vaøi loaøi vi khuaån soáng kyù sinh treân vi naám. Caùc loaïi vi khuaån coá ñònh nitrogen coäng sinh thöôøng hay bò moät loaïi thöïc khuaån Rhizobium kyù sinh, treân moâi tröôøng dòch theå coù hieän töôïng moâi tröôøng ñang ñuïc trôû neân trong. Nguyeân nhaân laø do thöïc khuaån theå xaâm nhaäp vaø laøm tan taát caû caùc teá baøo vi khuaån – goïi laø hieän töôïng sinh tan. Khi nuoâi caáy vi khuaån treân moâi tröôøng ñaëc cuõng coù hieän töôïng nhö vaäy. Caùc thöïc khuaån naøy toàn taïi ôû trong ñaát troàng caây hoï ñaäu laøm aûnh höôûng raát lôùn ñeán quaù trình hình thaønh noát saàn ôû caây ñaäu. * Quan heä coäng sinh Laø quan heä hai beân cuøng coù lôïi, beân naøy khoâng theå thieáu beân kia trong quaù trình sinh soáng. ÔÛ vi sinh vaät ngöôøi ta ít quan saùt thaáy quan heä coäng sinh. Coù moät soá giaû thieát cho raèng: ty theå – cô quan hoâ haáp cuûa teá baøo vi naám chính laø moät vi khuaån coäng sinh vôùi vi naám. Giaû thieát ñoù döïa treân caáu taïo cuûa ty theå coù caû boä maùy DNA rieâng bieät, coù theå töï sao cheùp nhö moät cô theå ñoäc laäp. Giaû thieát naøy chöa ñöôïc coâng nhaän hoaøn toaøn. Laïi coù giaû thieát cho raèng: caùc plasmid coù trong vi naám vaø vi khuaån chính laø söï coäng sinh giöõa virus vaø vi naám hay vi khuaån ñoù. Ví duï nhö caùc plasmid mang gen khaùng thuoác ñaõ mang laïi moái lôïi cho vi khuaån chuû laø khaùng ñöôïc thuoác khaùng sinh vì theá maø hai beân cuøng coù lôïi vaø goïi laø quan heä coäng sinh. 3
9. * Quan heä hoã sinh Laø quan heä hai beân cuøng coù lôïi nhöng khoâng nhaát thieát phaûi coù nhau môùi soáng ñöôïc nhö quan heä coäng sinh. Quan heä naøy thöôøng thaáy trong söï soáng cuûa vi sinh vaät vuøng reã. Ví duï nhö moái quan heä giöõa naám moác phaân huyû tinh boät thaønh ñöôøng vaø nhöõng nhoùm vi khuaån phaân giaûi loaïi ñöôøng ñoù. Moái quan heä giöõa nhoùm vi khuaån phaân giaûi phosphore vaø nhoùm vi khuaån phaân giaûi protein cuõng laø quan heä hoã sinh, trong ñoù nhoùm thöù nhaát cung caáp P cho nhoùm thöù hai vaø nhoùm thöù hai cung caáp N cho nhoùm thöù nhaát. * Quan heä khaùng sinh Quan heä khaùng sinh laø moái quan heä ñoái khaùng laãn nhau giöõa hai nhoùm vi sinh vaät. Loaïi naøy thöôøng tieâu dieät loaïi kia hoaëc haïn cheá quaù trình soáng cuûa noù. Ví duï ñieån hình laø xaï khuaån khaùng sinh vaø nhoùm vi khuaån maãn caûm vôùi chaát khaùng sinh do xaï khuaån sinh ra. Khi nuoâi caáy 2 nhoùm naøy treân moâi tröôøng thaïch ñóa, ta coù theå thaáy roõ hieän töôïng khaùng sinh: xung quanh nôi xaï khuaån moïc coù moät voøng voâ khuaån, taïi ñoù vi khuaån khoâng moïc ñöôïc. Ngöôøi ta caên cöù vaøo ñöôøng kính cuûa voøng voâ khuaån ñoù maø ñaùnh giaù khaû naêng khaùng sinh cuûa xaï khuaån. Taát caû caùc moái quan heä treân ñaây cuûa khu heä vi sinh vaät ñaát taïo neân nhöõng heä sinh thaùi voâ cuøng phong phuù trong töøng loaïi ñaát. Chuùng laøm neân ñoä maøu môõ cuûa ñaát, thay ñoåi tính chaát lyù hoaù cuûa ñaát vaø töø ñoù aûnh höôûng ñeán caây troàng. 1.1.3. Moái quan heä giöõa ñaát, vi sinh vaät vaø thöïc vaät 1.1.3.1. Quan heä giöõa ñaát vaø vi sinh vaät ñaát. Ñaát coù keát caáu töø nhöõng haït nhoû lieân keát vôùi nhau thaønh caáu truùc ñaát. Coù quan ñieåm cho raèng vi sinh vaät ñoùng vai troø giaùn tieáp trong söï lieân keát caùc haït ñaát vôùi nhau. Hoaït ñoäng cuûa vi sinh vaät, nhaát laø nhoùm hieáu khí ñaõ hình thaønh neân moät thaønh phaàn cuûa muøn laø acid humic. Caùc muoái cuûa acid humic taùc duïng vôùi ion Ca2+ taïo thaønh moät chaát deûo gaén keát nhöõng haït ñaát vôùi nhau. Sau naøy ngöôøi ta ñaõ tìm ra vai troø tröïc tieáp cuûa vi sinh vaät trong vieäc taïo thaønh keát caáu ñaát. Trong quaù trình phaân giaûi chaát höõu cô, naám moác vaø xaï khuaån phaùt trieån moät heä khuaån ty khaù lôùn trong ñaát. Khi naám moác vaø xaï khuaån cheát ñi, vi khuaån phaân giaûi chuùng taïi thaønh caùc chaát deûo coù khaû naêng keát dính caùc haït ñaát vôùi nhau. Baûn thaân vi khuaån khi cheát ñi vaø töï phaân huyû cuõng taïo thaønh caùc chaát keát dính. Ngoaøi ra lôùp dòch nhaày bao quanh caùc vi khuaån coù voû nhaày cuõng coù khaû naêng keát dính caùc haït ñaát vôùi nhau. Caùc chaát keát dính taïo thaønh keát caáu ñaát coøn ñöôïc goïi laø muøn hoaït tính. Nhö vaäy muøn khoâng nhöõng laø nôi tích luyõ chaát höõu cô laøm neân ñoä phì nhieâu cuûa ñaát maø coøn laø nhaân toá taïo neân keát caáu ñaát. * Taùc ñoäng cuûa phaân boùn ñeán vi sinh vaät ñaát Khi ta boùn phaân vaøo ñaát, phaân taùc duïng nhanh hay chaäm ñeán caây troàng laø nhôø hoaït ñoäng cuûa vi sinh vaät. Vi sinh vaät phaân giaûi phaân höõu cô thaønh daïng voâ cô cho caây troàng haáp thuï, bieán daïng voâ cô khoù tan thaønh deå tan. Ngöôïc laïi caùc loaïi phaân boùn cuõng aûnh höôûng ñeán sinh tröôûng vaø phaùt trieån cuûa vi sinh vaät trong ñaát. 4
10. * Taùc ñoäng cuûa cheá ñoä nöôùc ñoái vôùi vi sinh vaät: Ñaïi ña soá caùc loaïi vi khuaån coù ích ñeàu phaùt trieån maïnh ôû ñoä aåm 60 – 80%. Ñoä aåm quaù thaáp hoaëc quaù cao ñeàu öùc cheá vi sinh vaät. Chæ coù naám moác vaø xaï khuaån laø coù theå phaùt trieån ñöôïc ôû ñieàu kieän khoâ. * Taùc ñoäng cuûa cheá ñoä canh taùc khaùc tôùi vi sinh vaät: Ngoaøi caùc cheá ñoä phaân boùn, nöôùc, laøm ñaát, cheá ñoä canh taùc khaùc cuõng coù taùc duïng roõ reät tôùi hoaït ñoäng cuûa vi sinh vaät. Ví duï nhö cheá ñoä luaân canh caây troàng. Moãi loaïi caây troàng ñeàu coù moät khu heä vi sinh vaät ñaëc tröng soáng trong vuøng reã cuûa noù. Bôûi vaäy luaân canh caây troàng laøm cho khu heä vi sinh vaät ñaát caân ñoái vaø phong phuù hôn. Ngöôøi ta thöôøng luaân canh caùc loaïi caây troàng khaùc vôùi caây hoï ñaäu ñeå taêng cöôøng haøm löôïng ñaïm cho ñaát. Caùc laïi thuoác hoaù hoïc tröø saâu, dieät coû gaây taùc ñoäng coù haïi tôùi vi sinh vaät cuõng nhö heä sinh thaùi ñaát noùi chung. Vieäc duøng caùc loaïi thuoác hoaù hoïc laøm oâ nhieãm moâi tröôøng ñaát, tieâu dieät phaàn lôùn caùc loaïi vi sinh vaät vaø ñoäng vaät nguyeân sinh trong ñaát. Taát caû nhöõng bieän phaùp canh taùc coù aûnh höôûng tröïc tieáp vaø saâu saéc ñeán söï phaùt trieån cuûa vi sinh vaät trong ñaát, töø ñoù aûnh höôûng ñeán quaù trình hoaït ñoäng sinh hoïc, cuï theå laø söï chuyeån hoaù caùc chaát höõu cô thaønh voâ cô trong ñaát, aûnh höôûng ñeán quaù trình hình thaønh muøn vaø keát caáu ñaát. 1.1.3.2. Moái quan heä giöõa vi sinh vaät vaø thöïc vaät Moãi loaïi caây ñeàu coù moät khu heä vi sinh vaät vuøng reã ñaëc tröng cho caây ñoù vì reã thöïc vaät thöôøng tieát ra moät löôïng lôùn caùc chaát höõu cô vaø voâ cô, caùc chaát sinh tröôûng , thaønh phaàn vaø soá löôïng cuûa caùc chaát ñoù khaùc nhau tuyø loaïi caây. Nhöõng chaát tieát cuûa reã coù aûnh höôûng quan troïng ñeán vi sinh vaät vuøng reã. Treân beà maët cuûa reã vaø lôùp ñaát naèm saùt reã chöùa nhieàu chaát dinh döôõng neân taäp trung vi sinh vaät vôùi soá löôïng lôùn. Caøng xa reã soá löôïng vi sinh vaät giaûm caøng giaûm ñi. Thaønh phaàn vi sinh vaät vuøng reã khoâng nhöõng phuï thuoäc vaøo loaïi caây troàng maø coøn phuï thuoäc vaøo thôøi kyø phaùt trieån cuûa caây. Vi sinh vaät phaân giaûi cellulose coù raát ít khi caây coøn non nhöng khi caây giaø thì raát nhieàu. Ñieàu ñoù chöùng toû vi sinh vaät khoâng nhöõng söû duïng caùc chaát tieát cuûa reã maø coøn phaân huyû reã khi reã caây giaø vaø cheát ñi. Vi sinh vaät soáng trong vuøng reã coù quan heä maät thieát vôùi caây, chuùng söû duïng nhöõng chaát tieát cuûa caây laøm chaát dinh döôõng, ñoàng thôøi cung caáp chaát dinh döôõng cho caây qua quaù trình hoaït ñoäng phaân giaûi cuûa mình. Vi sinh vaät coøn tieát ra caùc vitamin vaø chaát sinh tröôûng coù lôïi ñoái vôùi caây troàng. Beân caïnh ñoù coù raát nhieàu vi sinh vaät gaây beänh cho caây, coù nhöõng loaïi öùc cheá söï sinh tröôûng cuûa caây, coù nhöõng loaïi taøn phaù muøa maøng nghieâm troïng. 1.2. Moâi tröôøng nöôùc vaø söï phaân boá cuûa vi sinh vaät trong nöôùc. 1.2.1. Söï phaân boá cuûa vi sinh vaät trong moâi tröôøng nöôùc. Vi sinh vaät coù maët ôû khaép nôi trong caùc nguoàn nöôùc. Söï phaân boá cuûa chuùng hoaøn toaøn khoâng ñoàng nhaát vaø raát khaùc nhau tuyø thuoäc vaøo ñaëc tröng cuûa töøng loaïi moâi tröôøng. Caùc yeáu toá moâi tröôøng quan troïng quyeát ñònh söï phaân boá cuûa vi sinh vaät laø ñoä maën, chaát 5
11. höõu cô, pH, nhieät ñoä vaø aùnh saùng. Nguoàn nhieãm vi sinh vaät cuõng raát quan troïng vì ngoaøi nhöõng nhoùm chuyeân soáng ôû nöôùc ra coøn coù nhöõng nhoùm nhieãm töø caùc moâi tröôøng khaùc vaøo. ÔÛ moâi tröôøng nöôùc ngoït, ñaëc bieät laø nhöõng nôi luoân coù söï nhieãm khuaån töø ñaát, haàu heát caùc nhoùm vi sinh vaät coù trong ñaát ñeàu coù maët trong nöôùc, tuy nhieân vôùi tæ leä khaùc bieät. Nöôùc ngaàm vaø nöôùc suoái thöôøng ngheøo vi sinh vaät nhaát do ôû nhöõng nôi naøy ngheøo chaát dinh döôõng. Trong caùc suoái coù haøm löôïng saét cao thöôøng chöùa caùc vi khuaån nhö Leptothrix ochracea. ÔÛ caùc suoái chöùa löu huyønh thöôøng coù nhoùm vi khuaån löu huyønh maøu luïc hoaëc maøu tía. Nhöõng nhoùm naøy ñeàu thuoäc loaïi töï döôõng hoaù naêng vaø quang naêng. ÔÛ nhöõng suoái nöôùc noùng thöôøng chæ toàn taïi caùc nhoùm vi khuaån öa nhieät nhö Leptothrix thermalis. ÔÛ ao, hoà vaø soâng do haøm löôïng chaát dinh döôõng cao neân soá löôïng vaø thaønh phaàn vi sinh vaät phong phuù hôn nhieàu. Ngoaøi nhöõng vi sinh vaät töï döôõng coøn coù nhieàu nhoùm vi sinh vaät dò döôõng coù khaû naêng phaân huyû caùc chaát höõu cô. Haàu heát caùc nhoùm vi sinh vaät trong ñaát ñeàu coù maët ôû ñaây. ÔÛ nhöõng nôi bò nhieãm baån bôûi nöôùc thaûi sinh hoaït coøn coù maët caùc vi khuaån ñöôøng ruoät vaø caùc vi sinh vaät gaây beänh khaùc. Tuy nhöõng vi khuaån naøy chæ soáng trong nöôùc moät thôøi gian nhaát ñònh nhöng nguoàn nöôùc thaûi laïi ñöôïc ñoå vaøo thöôøng xuyeân neân luùc naøo chuùng cuõng coù maët. Ñaây chính laø nguoàn oâ nhieãm vi sinh nguy hieåm ñoái vôùi söùc khoeû con ngöôøi. ÔÛ nhöõng thuyû vöïc coù nguoàn nöôùc thaûi coâng nghieäp ñoå vaøo thì thaønh phaàn vi sinh vaät cuõng bò aûnh höôûng theo caùc höôùng khaùc nhau tuyø thuoäc vaøo tính chaát cuûa nöôùc thaûi. Söï phaân boá cuûa vi sinh vaät trong thuyû vöïc coøn phuø thuoäc vaøo caùc taàng nöôùc khaùc nhau. ÔÛ taàng maët nhieàu aùnh saùng thöôøng coù nhöõng nhoùm vi sinh vaät töï döôõng quang naêng. Döôùi ñaùy hoà giaøu chaát höõu cô thöôøng coù caùc nhoùm vi khuaån dò döôõng phaân giaûi chaát höõu cô. ÔÛ nhöõng taàng ñaùy coù söï phaân huyû chaát höõu cô maïnh tieâu thuï nhieàu oxy taïo ra nhöõng vuøng khoâng coù oxy hoaø tan thì chæ coù maët nhoùm kî khí baét buoäc. Coù nhöõng vi sinh vaät coù khaû naêng chòu maën cao, nhöng coù nhöõng vi sinh vaät chæ coù theå soáng trong nöôùc ngoït. Caùc vi sinh vaät soáng trong moâi tröôøng nöôùc maën noùi chung coù khaû naêng söû duïng chaát dinh döôõng coù noàng ñoä thaáp. Chuùng phaùt trieån chaäm hôn nhieàu so vôùi vi sinh vaät ñaát. Chuùng thöôøng baùm vaøo caùc haït phuø sa ñeå soáng. Vi sinh vaät ôû bieån thöôøng thuoäc nhoùm öa laïnh vaø chòu ñöôïc aùp suaát cao. Noùi chung caùc nhoùm vi sinh vaät soáng ôû caùc nguoàn khaùc nhau raát ña daïng veà hình thaùi cuõng nhö hoaït tính sinh hoïc. Chuùng tham gia vaøo vieäc chuyeån hoaù vaät chaát. ÔÛ trong moâi tröôøng nöôùc cuõng coù maët ñaày ñuû caùc nhoùm tham gia vaøo caùc chu trình chuyeån hoaù caùc hôïp chaát carbon, nitrogen vaø caùc chaát khoaùng khaùc. Moái quan heä giöõa caùc nhoùm vôùi nhau cuõng raát phöùc taïp, quan heä kyù sinh, coäng sinh, hoã sinh, khaùng sinh nhö trong moâi tröôøng ñaát. Ngaøy nay caùc nguoàn nöôùc, ngay caû nöôùc ngaàm vaø nöôùc bieån ôû nhöõng möùc ñoä khaùc nhau ñaõ bò oâ nhieãm do caùc nguoàn chaát thaûi khaùc nhau. Do ñoù khu heä vi sinh vaät bò aûnh 6
12. höôûng raát nhieàu vaø do ñoù khaû naêng töï laøm saïch caùc nguoàn nöôùc do hoaït ñoäng phaân giaûi cuûa vi sinh vaät cuõng bò aûnh höôûng. 1.3. Moâi tröôøng khoâng khí vaø söï phaân boá cuûa vi sinh vaät trong khoâng khí. Moâi tröôøng khoâng khí khoâng phaûi laø ñoàng nhaát, tuy töøng vuøng khaùc nhau, moâi tröôøng khí raát khaùc nhau veà thaønh phaàn caùc loaïi khí. ÔÛ nhöõng vuøng khoâng khí trong laønh nhö vuøng nuùi, tyû leä khí O2 thöôøng cao. ÔÛ nhöõng vuøng khoâng khí bò oâ nhieãm, tyû leä caùc khí ñoäc nhö H2S, SO2, CO2 thöôøng cao, nhaát laø ôû thaønh phoá vaø caùc khu coâng nghieäp. Söï phaân boá cuûa vi sinh vaät trong khoâng khí cuõng khaùc nhau tuyø töøng vuøng. Khoâng khí khoâng phaûi laø moâi tröôøng soáng cuûa vi sinh vaät. Tuy nhieân trong khoâng khí coù raát nhieàu vi sinh vaät toàn taïi. Nguoàn goác cuûa nhöõng vi sinh vaät naøy laø töø ñaát, töø nöôùc, töø con ngöôøi, ñoäng vaät, thöïc vaät, theo gioù, theo buïi phaùt taùn ñi khaép nôi trong khoâng khí. Moät haït buïi coù theå mang theo raát nhieàu vi sinh vaät, ñaëc bieät laø nhöõng vi sinh vaät coù baøo töû coù khaû naêng toàn taïi laâu trong khoâng khí. Neáu ñoù laø nhöõng vi sinh vaät gaây beänh thì ñoù chính laø nguoàn gaây beänh coù trong khoâng khí. Caùc vi sinh vaät gaây beänh ñöôøng hoâ haáp coù theå toàn taïi laâu trong khoâng khí. Khi ngöôøi hít phaûi khoâng khí coù nhieãm khuaån ñoù seõ coù khaû naêng nhieãm beänh. Nhöõng vi khuaån gaây beänh ræ saét coù theå theo gioù bay ñi vaø laây beänh cho caùc caùnh ñoàng ôû raát xa nguoàn beänh. 7
13. Chöông 2 KHAÛ NAÊNG CHUYEÅN HOAÙ CAÙC HÔÏP CHAÁT TRONG MOÂI TRÖÔØNG TÖÏ NHIEÂN CUÛA VI SINH VAÄT W—X 2.1. Voøng tuaàn hoaøn nitrogen trong töï nhieân Trong caùc moâi tröôøng töï nhieân, nitrogen toàn taïi ôû caùc daïng khaùc nhau, töø nitrogen phaân töû ôû daïng khí cho ñeán caùc hôïp chaát höõu cô phöùc taïp coù trong cô theå ñoäng vaät, thöïc vaät vaø con ngöôøi. Trong cô theå vi sinh vaät, nitrogen toàn taïi chuû yeáu döôùi daïng caùc hôïp chaát höõu cô nhö protein, acid amin. Khi cô theå vi sinh vaät cheát ñi, löôïng nitrogen höõu cô naøy toàn taïi ôû trong ñaát. Döôùi taùc ñoäng caùc nhoùm vi sinh vaät hoaïi sinh, protein ñöôïc phaân giaûi thaønh caùc acid amin. Caùc acid amin laïi ñöôïc moät nhoùm vi sinh vaät phaân giaûi thaønh + NH3 hoaëc NH4 goïi laø nhoùm vi khuaån amoân hoaù. Quaù trình naøy goïi laø söï khoaùng hoaù chaát + höõu cô vì qua ñoù nitrogen höõu cô ñöôïc chuyeån thaønh daïng nitrogen khoaùng. Daïng NH4 - seõ ñöôïc chuyeån hoaù thaønh daïng NO3 nhôø nhoùm vi khuaån nitrate hoaù. Caùc hôïp chaát nitrate laïi ñöôïc chuyeån hoaù thaønh nitrogen phaân töû, quaù trình naøy goïi laø phaûn nitrate hoaù ñöôïc thöïc hieän bôûi nhoùm vi khuaån phaûn nitrate. Khí N2 seõ ñöôïc coá ñònh laïi trong teá baøo vi khuaån vaø teá baøo thöïc vaät sau ñoù ñöôïc chuyeån hoaù thaønh daïng nitrogen höõu cô nhôø nhoùm vi khuaån coá ñònh nitrogen. Nhö vaäy, voøng tuaàn hoaøn nitrogen ñöôïc kheùp kín. Trong haàu heát caùc khaâu chuyeån hoaù cuûa voøng tuaàn hoaøn ñeàu coù söï tham gia cuûa caùc nhoùm vi sinh vaät khaùc nhau. Neáu söï hoaït ñoäng cuûa moät nhoùm naøo ñoù ngöøng laïi, toaøn boä söï chuyeån hoaù cuûa voøng tuaàn hoaøn cuõng seõ bò aûnh höôûng nghieâm troïng. 2.2. Quaù trình amoân hoaù Trong thieân nhieân toàn taïi nhieàu daïng hôïp chaát nitrogen höõu cô nhö protein, acid amin, acid nucleic, urea Caùc hôïp chaát naøy ñi vaøo ñaát töø nguoàn xaùc ñoäng vaät, thöïc vaät, caùc loaïi phaân chuoàng, phaân xanh, raùc thaûi höõu cô. Thöïc vaät khoâng theå ñoàng hoaù ñöôïc daïng nitrogen höõu cô phöùc taïp nhö treân, noù chæ coù theå söû duïng ñöôïc sau quaù trình amoân + hoaù. Qua quaù trình amoân hoaù, caùc daïng nitrogen höõu cô ñöôïc chuyeån hoaù thaønh NH4 hoaëc NH3. 2.2.1. Söï amoân hoaù urea. Urea coù trong thaønh phaàn nöôùc tieåu cuûa ngöôøi vaø ñoäng vaät, chieám khoaûng 2.2% nöôùc tieåu. Urea chöùa tôùi 46.6% nitrogen, vì theá noù laø moät nguoàn dinh döôõng ñaïm toát ñoái vôùi caây troàng. Tuy nhieân, thöïc vaät khoâng theå ñoàng hoaù tröïc tieáp urea maø phaûi qua quaù trình amoân hoaù. Quaù trình amoân hoaù urea chia laøm 2 giai ñoaïn, giai ñoaïn ñaàu döôùi taùc duïng cuûa enzyme urease tieát ra bôûi caùc vi sinh vaät, urea seõ bò thuyû phaân taïo thaønh muoái carbonate amoni. Giai ñoaïn 2, carbonate amoni chuyeån hoaù thaønh NH3, CO2 vaø H2O. CO(NH2)2 + 2 H2O (NH4)2CO3 (NH4)2CO3 2NH3 + CO2 + H2O 8
14. Trong nöôùc tieåu coøn coù acid uric, toàn taïi trong ñaát moät thôøi gian acid uric seõ bò phaân giaûi thaønh urea vaø acid tactronic. Sau ñoù urea tieáp tuïc bò phaân giaûi thaønh NH3. Nhoùm vi sinh vaät phaân giaûi urea vaø acid uric coøn coù khaû naêng amoân hoaù cyanamid calci laø moät loaïi phaân boùn hoaù hoïc. Chaát naøy sau khi ñi vaøo ñaát cuõng bò chuyeån hoaù thaønh urea roài sau ñoù qua quaù trình amoân hoaù ñöôïc chuyeån thaønh NH3. CN-Nca + 2 H2O CN-NH2 + Ca(OH)2 CN-NH2 + H2O CO(NH2) Nhieàu loaïi vi khuaån coù khaû naêng amoân hoaù urea, chuùng ñeàu tieát ra enzyme urease. Trong ñoù coù moät soá loaøi coù hoaït tính phaân giaûi cao nhö Planosarcina urea, Micrococcus urea, Bacillus amylovorum, Proteus vulgaris Ña soá vi sinh vaät phaân giaûi urea thuoäc nhoùm hieáu khí hoaëc kî khí khoâng baét buoäc, chuùng öa pH trung tính hoaëc hôi kieàm. Bôûi vaäy khi söû duïng urea laøm phaân boùn ngöôøi ta thöôøng keát hôïp vôùi boùn voâi hoaëc tro, ñoàng thôøi laøm thoaùng ñaát. 2.2.2. Söï amoân hoaù protein. Protein laø thaønh phaàn quan troïng cuûa teá baøo sinh vaät, khi ñoäng vaät, thöïc vaät cheát ñi, nguoàn protein coù trong teá baøo cuûa chuùng ñöôïc tích luyõ trong ñaát. Protein chöùa tôùi 15 – 17% nitrogen, nhöng caây troàng khoâng theå haáp thu tröïc tieáp protein maø phaûi thoâng qua söï phaân huyû cuûa vi sinh vaät. Nhoùm vi sinh vaät phaân huyû protein coù khaû naêng tieát ra enzyme protease bao goàm proteinase vaø peptidase. Döôùi taùc duïng cuûa proteinase phaân töû protein seõ ñöôïc phaân giaûi thaønh caùc chuoãi polypeptide vaø oligopeptide (chöùa töø 3 – 5 acid amin). Sau ñoù döôùi taùc duïng cuûa enzyme peptidase caùc polypeptide vaø oligopeptide seõ ñöôïc phaân giaûi thaønh caùc acid amin. Moät phaàn acid amin seõ ñöôïc teá baøo vi sinh vaät haáp thu laøm chaát dinh döôõng. Phaàn khaùc seõ thoâng qua quaù trình khöû amin taïo thaønh NH3 vaø nhieàu saûn phaåm trung gian khaùc. Söï khöû amin coù theå xaûy ra theo moät trong nhöõng phöông thöùc sau: R-CH(NH2)COOH R=CHCOOH + NH3 R-CH(NH2)COOH + H2O R-CH2OH-COOH + CO2 + NH3 R-CH(NH2)COOH + ½ O2 R-CO-COOH + NH3 Moät soá acid amin bò deamin hoaù bôûi vi sinh vaät nhôø enzyme deaminase, sau ñoù taïo ra saûn phaåm cuoái cuøng laø amoân, ví duï: Ala-deaminose Alamin + O2 Piprevar + NH4 Ñoái vôùi caùc acid amin coù voøng nhö triptophan, khi phaân giaûi seõ taïo thaønh caùc hôïp chaát coù muøi thoái nhö indon vaø scaton. Khi phaân giaûi caùc acid amin chöùa S nhö methionin, cystein, vi sinh vaät giaûi phoùng ra H2S, chaát naøy ñoäc ñoái vôùi caây troàng. Moät soá hôïp chaát amin sinh ra trong quaù trình amoân hoaù coù taùc duïng ñoäc ñoái vôùi ngöôøi vaø ñoäng vaät. Ví duï 9
15. nhö histamin, armatin ñoù chính laø nguyeân nhaân bò nhieãm ñoäc thöùc aên thòt caù thiu thoái hoaëc thòt hoäp ñeå quaù laâu (oâ nhieãm thöïc phaåm). Tyû leä C:N trong ñaát raát quan troïng ñoái vôùi nhoùm vi sinh vaät phaân huyû protein. Neáu nhö tyû leä naøy quaù cao, trong ñaát quaù ít ñaïm vi sinh vaät seõ tranh chaáp thöùc aên ñaïm ñoái vôùi caây troàng, chuùng phaân huyû ñöôïc bao nhieâu laø haáp thu baáy nhieâu. Neáu tyû leä C:N quaù thaáp, ñaïm dö thöøa, quaù trình phaân huyû seõ chaäm laïi, caây troàng khoâng coù ñaïm khoaùng ñeå haáp thuï. Nhieàu coâng trình nghieân cöùu ñaõ ruùt ra tyû leä C:N baèng 20 laø thích hôïp nhaát cho quaù trình amoân hoaù protein, coù lôïi nhaát ñoái vôùi caây troàng. Nhieàu vi sinh vaät coù khaû naêng amoân hoaù protein. Trong nhoùm vi khuaån coù Bacillus mycoides, B. mesentericus, B. subtilis, Pseudomonas fluorescens, Clostridium sporogenes Xaï khuaån coù Streptomyces griseus Vi naám coù Aspergillus oryzae, A. flavus, A. niger, Penicilium camemberti Ngoaøi protein vaø urea, nhieàu loaøi vi sinh vaät coù khaû naêng amoân hoaù kitin. Kitin laø thaønh phaàn cuûa voû nhieàu loaïi coân truøng, giaùp xaùc. Haøng naêm kitin ñöôïc tích luyõ laïi trong ñaát vôùi moät löôïng khoâng nhoû, nhoùm vi sinh vaät phaân huyû kitin coù khaû naêng tieát enzyme kitinase vaø kitobiase phaân huyû phaân töû kitin thaønh caùc goác ñôn phaân töû, sau ñoù goác amin ñöôïc amoân hoaù taïo thaønh NH3. 2.3. Quaù trình nitrate hoaù. Sau quaù trình amoân hoaù NH3 ñöôïc hình thaønh, moät phaàn phaûn öùng vôùi caùc anion trong ñaát taïo thaønh caùc muoái amoân. Moät phaàn muoái amoân cuõng ñöôïc caây troàng haáp thu, phaàn coøn laïi ñöôïc oxy hoaù thaønh daïng nitrate goïi laø quaù trình nitrate hoaù. Nhoùm vi sinh vaät tieán haønh quaù trình naøy goïi chung laø nhoùm vi khuaån nitrate hoaù bao goàm 2 nhoùm tieán haønh qua 2 giai ñoaïn. 2.3.1. Giai ñoaïn nitrite hoaù + - Quaù trình oxy hoaù NH4 taïo thaønh NO2 ñöôïc tieán haønh bôûi vi khuaån nitrite hoaù. + Chuùng thuoäc nhoùm vi sinh vaät töï döôõng hoaù naêng coù khaû naêng oxy hoaù NH4 baèng oxy khoâng khí vaøo taïo ra naêng löôïng. + - NH4 + 3/2 O2 NO2 + H2O + 2 H + Q Naêng löôïng ñöôïc vi khuaån söû duïng ñeå ñoàng hoaù CO2 thaønh carbon höõu cô. Enzyme xuùc taùc cho quaù trình naøy laø caùc enzyme cuûa quaù trình hoâ haáp hieáu khí. Nhoùm vi khuaån nitrite hoaù bao goàm 4 chi khaùc nhau: Nitrosomonas, Nitrosocystis, Nitrosolobus vaø Nitrosospira chuùng ñeàu thuoäc loaïi töï döôõng baét buoäc, khoâng coù khaû naêng soáng treân moâi tröôøng thaïch. Bôûi vaäy phaân laäp chuùng raát khoù, phaûi duøng silicagen thay cho thaïch. 2.3.2. Giai ñoaïn nitrate hoaù - - Quaù trình oxy hoaù NO2 thaønh NO3 ñöôïc thöïc hieän bôûi nhoùm vi khuaån nitrate. - Chuùng cuõng laø nhöõng vi sinh vaät töï döôõng hoaù naêng coù khaû naêng oxy hoaù NO2 taïo thaønh naêng löôïng. Naêng löôïng naøy ñöôïc duøng ñeå ñoàng hoaù CO2 taïo thaønh ñöôøng. 10
16. - - NO2 + ½ O2 NO3 + Q - - Nhoùm vi khuaån tieán haønh oxy hoaù NO2 thaønh NO3 bao goàm 3 chi khaùc nhau: Nitrobacter, Nitrospira vaø Nitrococcus. Ngoaøi nhoùm vi khuaån töï döôõng hoaù naêng noùi treân, trong ñaát coøn coù moät soá loaøi vi sinh vaät dò döôõng cuõng tieán haønh quaù trình nitrate hoaù. Ñoù laø caùc loaøi vi khuaån vaø xaï khuaån thuoäc caùc chi Pseudomonas, Corynebacterium, Streptomyces Quaù trình nitrate hoaù laø moät khaâu quan troïng trong voøng tuaàn hoaøn nitrogen, nhöng ñoái vôùi noâng nghieäp noù coù nhieàu ñieàu baát lôïi. Daïng ñaïm nitrate thöôøng deã bò röõa troâi xuoáng caùc taàng saâu, deã bò ñi vaøo quaù trình phaûn nitrate hoaù taïo thaønh khí N2 laøm cho ñaát - + maát ñaïm. Anion NO3 thöôøng keát hôïp vôùi ion H trong ñaát taïo thaønh HNO3 laø cho pH ñaát giaûm xuoáng raát baát lôïi cho caây troàng. Hôn nöõa, löôïng NO3 dö thöøa trong ñaát ñöôïc caây troàng haáp thu nhieàu laøm cho haøm löôïng nitrate trong saûn phaån löông thöïc, thöïc phaåm cao gaây ñoäc cho ngöôøi vaø gia suùc. Bôûi vaäy ngaøy nay ngöôøi ta thöôøng haïn cheá vieäc boùn phaân ñaïm hoaù hoïc coù goác nitrate. 2.4. Quaù trình phaûn nitrate hoaù Caùc hôïp chaát ñaïm daïng nitrate ôû trong ñaát raát deã bò khöû bieán thaønh nitrogen phaân töû. Quaù trình naøy goïi laø quaù trình phaûn nitrate hoaù. Noù khaùc vôùi quaù trình oxy hoaù nitrate + taïo thaønh NH4 coøn goïi laø quaù trình amoân hoaù nitrate. Coù theå phaân bieät ñöôïc hai quaù trình treân qua sô ñoà sau. Amoân hoaù nitrate NH2OH NH3 NO3 NO2 NO N2O N2 Phaûn nitrate hoaù Quaù trình amoân hoaù nitrate do moät soá vi khuaån dò döôõng tieán haønh trong ñieàu kieän + hieáu khí coù chöùc naêng cung caáp NH4 cho teá baøo vi khuaån ñeå toång hôïp acid amin. - - Phaûn öùng khöû NO3 thaønh N2 chæ xaûy ra trong ñieàu kieän kî khí. NO3 laø chaát nhaän ñieän töû cuoái cuøng trong chuoãi hoâ haáp kî khí, naêng löôïng taïo ra ñöôïc duøng ñeå toång hôïp neân ATP. Nhoùm vi sinh vaät thöïc hieän quaù trình phaûn nitrate hoaù phaân boá roäng raõi trong ñaát. Thuoäc nhoùm töï döôõng hoaù naêng coù Thiobacillus denitrificans, Hydrogenomonas agilis Thuoäc nhoùm dò döôõng coù Pseudomonas denitrificans, Micrococcus denitrificanas, Bacillus licheniformis soáng trong ñieàu kieän kî khí, trong nhöõng vuøng ñaát ngaäp nöôùc. 11
17. Ñoái vôùi noâng nghieäp quaù trình phaûn nitrate hoaù laø moät quaù trình baát lôïi vì noù laøm cho ñaát maát ñaïm. Quaù trình naøy xaûy ra maïnh trong ñieàu kieän kî khí. Oxy coù taùc duïng öùc cheá caùc enzyme xuùc taùc cho quaù trình khöû nitrate, ñoù laø caùc enzyme nitrate reductase vaø nitrite reductase. ÔÛ caùc ruoäng luùa nöôùc ngöôøi ta thöôøng laøm coû xuïc buøn ñeå haïn cheá quaù trình naøy, ñoàng thôøi boùn ñaïm amoân chöù khoâng boùn ñaïm nitrate. Trong caùc moâi tröôøng töï nhieân ngoaøi quaù trình phaûn nitrate sinh hoïc noùi treân coøn coù quaù trình phaûn nitrate hoaù hoïc thöôøng xaûy ra khi pH<5.5. Caùc quaù trình naøy khoâng coù söï tham gia cuûa vi sinh vaät NH4Cl + HNO3 N2 + HCl + H2O R-NH2 + HNO3 N2 + R-OH + H2O 2.5. Quaù trình coá ñònh nitrogen phaân töû (xem phaàn vi sinh vaät hoïc ñaïi cöông) 2.6. Söï chuyeån hoaù caùc hôïp chaát phosphore cuûa vi sinh vaät. 2.6.1. Voøng tuaàn hoaøn phosphore trong töï nhieân. Trong töï nhieân, P naèm trong nhieàu daïng hôïp chaát khaùc nhau. P höõu cô coù trong cô theå ñoäng thöïc vaät, ñöôïc tích luyõ trong ñaát khi ñoäng vaät vaø thöïc vaät cheát ñi. Nhöõng hôïp chaát phosphore höõu cô naøy ñöôïc vi sinh vaät phaân giaûi taïo thaønh caùc hôïp chaát phosphore voâ cô khoù tan, moät soá ít ñöôïc taïo thaønh daïng deã tan. Caùc hôïp chaát phosphore voâ cô khoù tan coù nguoàn goác töø nhöõng quaëng thieân nhieân nhö apatit, phosphorite, phosphate saét, phosphate nhoâm Nhöõng hôïp chaát naøy raát khoù hoaø tan vaø caây troàng khoâng theå haáp thu tröïc tieáp ñöôïc. Caây troàng chæ coù theå haáp thu ñöôïc khi chuùng ñöôïc chuyeån hoaù thaønh daïng deã tan. Quaù trình naøy ñöôïc thöïc hieän moät phaàn quan troïng laø nhôø vi sinh vaät phaân huyû phosphore voâ cô. Caùc muoái cuûa acid phosphoric daïng deã tan ñöôïc caây troàng haáp thuï vaø vaän chuyeån thaønh caùc hôïp chaát phosphore höõu cô trong cô theå thöïc vaät. Ñoäng vaät vaø ngöôøi söû duïng caùc saûn phaåm thöïc vaät laøm thöùc aên laïi bieán phosphore höõu cô cuûa thöïc vaät thaønh P höõu cô cuûa ñoäng vaät vaø ngöôøi. Voøng tuaàn hoaøn cuûa caùc daïng hôïp chaát phosphore trong töï nhieân cöù dieãn ra. Vi sinh vaät ñoùng moät vai troø quan troïng trong voøng tuaàn hoaøn ñoù. Neáu nhö thieáu söï hoaït ñoäng cuûa moät nhoùm vi sinh vaät naøo ñoù thì söï chuyeån hoaù cuûa voøng tuaàn hoaøn seõ bò aûnh höôûng nghieâm troïng. Voøng tuaàn hoaøn cuûa caùc daïng phosphore trong töï nhieân ñöôïc bieåu dieãn nhö sô ñoà sau. 12
18. P voâ cô deã tan P voâ cô P höõu cô khoù tan trong ñaát Phaân P P höõu cô (Chaát baøi tieát) thöïc vaät P höõu cô Ñoäng vaät 2.6.2. Söï phaân giaûi phosphore höõu cô trong ñaát do vi sinh vaät. Caùc hôïp chaát P höõu cô trong ñaát coù nguoàn goác töø xaùc ñoäng vaät, thöïc vaät, phaân xanh, phaân chuoàng Hôïp chaát phosphore höõu cô quan troïng nhaát ñöôïc phaân giaûi ra töø teá baøo vi sinh vaät laø nucleotide. Nucleotide coù trong thaønh phaàn nhaân teá baøo. Nhôø taùc ñoäng cuûa caùc nhoùm vi sinh vaät hoaïi sinh trong ñaát, chaát naøy taùch ra khoûi thaønh phaàn teá baøo vaø ñöôïc phaân giaûi thaønh 2 phaàn protein vaø nuclein. Protein seõ ñi vaøo voøng chuyeån hoaù caùc hôïp chaát nitrogen, nuclein seõ ñi vaøo voøng chuyeån hoaù caùc hôïp chaát phosphore. Söï chuyeån hoaù caùc hôïp chaát phosphore höõu cô thaønh muoái cuûa H3PO4 ñöôïc thöïc hieän bôûi nhoùm vi sinh vaät phaân huyû phosphore höõu cô. Nhöõng vi sinh vaät naøy coù khaû naêng tieát ra enzyme phosphatase ñeå xuùc taùc cho quaù trình phaân giaûi. Nhoùm vi sinh vaät phaân giaûi phosphore höõu cô ñöôïc phaùt hieän töø naêm 1911 do J. Stoklasa, oâng ñaõ phaân laäp ñöôïc 3 loaøi vi khuaån coù khaû naêng phaân huyû phosphore höõu cô ñeàu thuoäc gioáng Bacillus. Sau ñoù oâng nuoâi caáy nhöõng vi khuaån naøy trong moâi tröôøng chæ coù acid nucleic laøm nguoàn P vaø N duy nhaát vaø nhaän thaáy löôïng phosphore ñöôïc phaân giaûi töø 15 ñeán 23%. Neáu boå sung vaøo moâi tröôøng moät ít (NH4)2SO4 thì löôïng P ñöôïc phaân giaûi taêng leân. Sau ñoù ngöôøi ta ñaõ tìm ra nhieàu loaøi vi sinh vaät coù khaû naêng phaân huyû P höõu cô theo sô ñoà toång quaùt sau: Nucleoprotein nuclein a. nucleic H3PO4 13
19. H3PO4 thöôøng phaûn öùng vôùi caùc kim loaïi trong ñaát taïo thaønh caùc muoái phosphate khoù tan nhö Ca3(PO4)2, FePO4, AlPO4 Vi sinh vaät phaân giaûi P höõu cô chuû yeáu thuoäc 2 chi Bacillus vaø Pseudomonas. Caùc loaøi coù khaû naêng phaân giaûi maïnh laø B. megatherium, B. mycoides vaø Pseudomonas sp. Ngaøy nay, ngöôøi ta ñaõ phaùt hieän thaáy moät soá xaï khuaån vaø vi naám cuõng coù khaû naêng phaân giaûi phosphore höõu cô. 2.6.3. Söï phaân giaûi phosphore voâ cô do vi sinh vaät. Caùc hôïp chaát phosphore voâ cô ñöôïc hình thaønh do quaù trình phaân giaûi laân höõu cô (coøn goïi laø quaù trình khoaùng hoaù laân höõu cô) phaàn lôùn laø caùc muoái phosphate khoù tan. Caây troàng khoâng theå haáp thu ñöôïc nhöõng daïng khoù tan naøy. Neáu khoâng coù caùc quaù trình phaân giaûi caùc hôïp chaát phosphore khoù tan bieán thaønh daïng deã tan thì haøm löôïng phosphore toång soá trong ñaát daãu coù nhieàu cuõng trôû thaønh voâ duïng. Veà cô cheá cuûa quaù trình phaân giaûi phosphore voâ cô do vi sinh vaät cho ñeán nay vaãn coøn nhieàu tranh caõi. Nhöng ñaïi ño soá caùc nhaø nghieân cöùu ñeàu cho raèng söï saûn sinh acid trong quaù trình soáng cuûa moät soá nhoùm vi sinh vaät ñaõ laøm cho noù coù khaû naêng chuyeån caùc hôïp chaát phosphore töø daïng khoù tan thaønh daïng deã tan. Ña soá caùc vi sinh vaät phaân giaûi phosphore voâ cô ñeàu sinh CO2 trong quaù trình soáng, CO2 seõ phaûn öùng vôùi H2O coù trong moâi tröôøng taïo thaønh H2CO3. H2CO3 seõ phaûn öùng vôùi phosphate khoù tan taïo thaønh phosphate deã tan theo phöông trình sau: Ca3(PO4)2 + 4 H2CO3 + H2O Ca(H2PO4)2 + H2O + 2 Ca(HCO3)2 Daïng khoù tan Daïng deã tan Daïng deã tan Caùc vi khuaån nitrate hoaù trong ñaát cuõng coù khaû naêng phaân giaûi phosphore voâ cô do - - + noù coù khaû naêng chuyeån hoaù NH3 thaønh NO3 . NO3 seõ phaûn öùng vôùi H taïo thaønh HNO3. Sau ñoù HNO3 phaûn öùng vôùi muoái phosphate khoù tan taïo thaønh daïng deã tan. Ca3(PO4)2 + 4 HNO3 Ca(H2PO4)2 + 2 Ca(NO3)2 Caùc vi khuaån sulphate hoaù cuõng coù khaû naêng phaân giaûi phosphate khoù tan do söï taïo thaønh H2SO4 trong quaù trình soáng. Ca3(PO4)2 + 2 H2SO4 Ca(H2PO4)2 + 2 CaSO4 Ngoaøi ra caùc nhoùm vi sinh vaät coù khaû naêng taïo thaønh caùc acid höõu cô trong quaù trình soáng cuõng coù theå laøm cho daïng phosphate khoù tan chuyeån thaønh daïng deã tan. Tuyeät ñaïi ña soá caùc vi sinh vaät phaân huyû phosphore voâ cô trong quaù trình soáng ñeàu laøm giaûm pH cuûa moâi tröôøng. Tuy nhieân, gaàn ñaây coù moät vaøi taùc giaû ñaõ coâng boá tìm ra moät vaøi chuûng vi khuaån phaân giaûi phosphore maø trong quaù trình nuoâi caáy khoâng laøm giaûm pH moâi tröôøng. Raát nhieàu vi sinh vaät coù khaû naêng phaân giaûi phosphore voâ cô, trong ñoù nhoùm vi khuaån ñöôïc nghieân cöùu nhieàu hôn caû. Caùc loaøi coù khaû naêng phaân giaûi maïnh laø Bacillus megatherium, B. butyricus, B. mycoides, Pseudomonas radiobacter, P. gracilis trong 14
20. nhoùm vi naám thì Aspergillus niger coù khaû naêng phaân giaûi maïnh nhaát. Ngoaøi ra moät soá xaï khuaån cuõng coù khaû naêng phaân giaûi phosphore voâ cô. 2.7. Söï chuyeån hoaù caùc hôïp chaát löu huyønh cuûa vi sinh vaät. 2.7.1. Voøng tuaàn hoaøn löu huyønh trong töï nhieân. Cuõng nhö phosphore, löu huyønh laø moät trong nhöõng chaát dinh döôõng quan troïng cuûa caây troàng. Trong ñaát noù thöôøng ôû daïng caùc hôïp chaát muoái voâ cô nhö CaSO4, Na2SO4, FeS2, Na2S moät soá ôû daïng höõu cô. Trong cô theå sinh vaät, S naèm trong thaønh phaàn cuûa caùc acid amin chöùu löu huyønh nhö methionin, cystein vaø trong nhieàu loaïi enzyme quan troïng 2- khaùc. Thöïc vaät huùt caùc hôïp chaát löu huyønh voâ cô trong ñaát chuû yeáu döôùi daïng SO4 vaø chuyeån sang daïng S höõu cô cuûa teá baøo. Ñoäng vaät vaø ngöôøi söû duïng thöïc vaät laøm thöùc aên vaø cuõng bieán S cuûa thöïc vaät thaønh S cuûa ñoäng vaät vaø ngöôøi. Khi ñoäng thöïc vaät cheát ñi ñeå laïi moät löôïng löu huyønh höõu cô trong ñaát. Nhôø söï phaân giaûi cuûa vi sinh vaät, S höõu cô seõ ñöôïc chuyeån hoaù thaønh H2S. H2S vaø caùc hôïp chaát voâ cô khaùc coù trong ñaát seõ ñöôïc oxy 2- hoaù bôûi caùc nhoùm vi khuaån töï döôõng thaønh S vaø SO4 , moät phaàn ñöôïc taïo thaønh löu 2- huyønh höõu cô cuûa teá baøo vi sinh vaät. SO4 laïi ñöôïc thöïc vaât haáp thuï, cöù theá voøng chuyeån hoaù caùc hôïp chaát löu huyønh dieãn ra lieân tuïc. Trong ñoù caùc nhoùm vi sinh vaät ñoùng moät vai troø quan troïng khoâng theå thieáu ñöôïc. 2.7.2. Söï oxy hoaù caùc hôïp chaát löu huyønh. 2.7.2.1. Söï oxy hoaù caùc hôïp chaát löu huyønh do vi khuaån töï döôõng hoaù naêng. Trong nhoùm vi khuaån töï döôõng hoaù naêng coù moät soá loaøi coù khaû naêng oxy hoaù caùc hôïp chaát löu huyønh voâ cô nhö thiosulphate, khí hydro sulfur vaø löu huyønh nguyeân chaát 2- thaønh daïng SO4 theo caùc phöông trình sau: 2H2S + O2 2 H2O + 2 S + Q 2 S + 3 O2 + 2 H2O 2 H2SO4 + Q 5 Na2S2O3 + H2O + 4 O2 5 Na2SO4 + 2 S2 + H2SO4 + Q Na2S4O6 + O2 3 Na2SO4 + 5 H2SO4 + Q H2SO4 sinh ra laøm pH ñaát haï xuoáng (dieät tröø ñöôïc beänh thoái do Streptomyces gaây ra vaø pH thaáp vi khuaån cuûa moät soá loaøi gaây beänh cho caây troàng khoâng soáng ñöôïc). Naêng löôïng sinh ra trong quaù trình oxy hoaù treân ñöôïc vi sinh vaät söû duïng ñeå ñoàng hoaù CO2 taïo thaønh ñöôøng. Ñoàng thôøi moät soá ít hôïp chaát daïng S cuõng ñöôïc ñoàng hoaù taïo thaønh S höõu cô cuûa teá baøo vi khuaån. Caùc loaøi vi khuaån coù khaû naêng oxy hoaù caùc hôïp chaát löu huyønh theo phöông thöùc treân laø Thiobacillus thioparus vaø Thiobacillus thioxidans. Caû hai loaøi naøy ñeàu soáng ôû pH thaáp, thöôøng laø pH=3, ñoâi khi ôû pH=1 – 1.5 hai loaøi naøy vaãn coù theå phaùt trieån. Nhôø ñaëc ñieåm naøy maø ngöôøi ta duøng 2 loaøi vi khuaån treân ñeå laøm taêng ñoä hoaø tan cuûa quaëng apatide. Ngoaøi 2 loaøi vi khuaån treân coøn coù 2 loaøi vi khuaån khaùc coù khaû naêng oxy hoaù caùc hôïp chaát löu huyønh voâ cô, ñoù laø Thiobacillus denitrificans vaø Begiatra minima. 15
21. Thiobacillus denitrificans coù khaû naêng vöøa khöû nitrate vöøa oxy hoaù löu huyønh theo phöông trình sau: 5 S + 6 KNO3 + 2CaCO3 2 K2SO4 + CaSO4 + 2 CO2 + 3 N2 + Q Vi khuaån Begiatra minima coù theå oxy hoaù H2S hoaëc S. Trong ñieàu kieän coù nhieàu H2S noù seõ oxy hoaù H2S taïo thaønh S tích luyõ trong teá baøo. Trong ñieàu kieän thieáu H2S caùc haït S seõ ñöôïc oxy hoaù ñeán khi S döï tröõ heát thì vi khuaån cheát hoaëc ôû traïng thaùi tieàm sinh. 2.7.2.2. Söï oxy hoaù caùc hôïp chaát löu huyønh do vi khuaån töï döôõng quang naêng. Moät soá nhoùm vi khuaån töï döôõng quang naêng coù khaû naêng oxy hoaù H2S taïo thaønh 2- SO4 . H2S ñoùng vai troø chaát cho ñieän töû trong quaù trình quang hôïp cuûa vi khuaån. Caùc vi khuaån thuoäc hoï Thiodaceae thöôøng oxy hoaù H2S theo phöông trình sau: aùnh saùng CO2 + H2S + H2O C6H12O6 + H2SO4 Caùc vi khuaån thuoäc hoï Chlorobacteriaceae thöôøng oxy hoaù H2S theo phöông trình sau: aùnh saùng CO2 + H2S + H2O C6H12O6 + S ÔÛ nhoùm vi khuaån treân, S ñöôïc hình thaønh khoâng tích luyõ trong cô theå maø ôû ngoaøi moâi tröôøng. 2.7.3. Söï khöû caùc hôïp chaát löu huyønh voâ cô do vi sinh vaät. Ngoaøi quaù trình oxy hoaù, trong ñaát coøn coù quaù trình khöû caùc hôïp chaát löu huyønh voâ cô thaønh H2S. Quaù trình naøy coøn goïi laø quaù trình phaûn sulphate hoaù. Quaù trình naøy ñöôïc tieán haønh ôû ñieàu kieän kî khí, ôû nhöõng taàng nöôùc saâu. Nhoùm vi sinh vaät tieán haønh quaù trình naøy goïi laø nhoùm vi khuaån phaûn sulphate hoaù. C6H12O6 + 3 H2SO4 6 CO2 + 6 H2O + 3 H2S + Q ÔÛ ñaây chaát höõu cô ñoùng vai troø cung caáp hydro trong quaù trình khöû SO4 coù theå laø ñöôøng hoaëc caùc acid höõu cô hoaëc caùc hôïp chaát höõu cô khaùc. H2SO4 seõ bò khöû daàn tôùi H2S. Quaù trình phaûn sulphate hoaù daãn ñeán vieäc tích luyõ H2S trong moâi tröôøng laøm oâ nhieãm moâi tröôøng, aûnh höôûng ñeán ñôøi soáng cuûa thöïc vaät vaø ñoäng vaät trong moâi tröôøng ñoù. Luùa moïc trong ñieàu kieän yeám khí coù quaù trình phaûn sulphate hoaù maïnh seõ bò ñen reã vaø aûnh höôûng xaáu ñeán quaù trình sinh tröôûng vaø phaùt trieån cuûa chuùng. 16
22. Chöông 3 SINH TRÖÔÛNG VAØ PHAÙT TRIEÅN ÔÛ VI SINH VAÄT W—X Sinh tröôûng vaø phaùt trieån laø thuoäc tính cô sôû cuûa sinh vaät. Cuõng nhö ñoäng vaät vaø thöïc vaät, vi sinh vaät cuõng sinh tröôûng vaø phaùt trieån. Sinh tröôûng laø söï taêng kích thöôùc vaø khoái löôïng cuûa teá baøo, coøn phaùt trieån (hoaëc sinh saûn) laø söï taêng soá löôïng teá baøo. Trong phaàn naøy chuùng ta chuû yeáu ñeà caäp ñeán sinh tröôûng vaø phaùt trieån cuûa vi khuaån. Khi noùi veà sinh tröôûng vaø phaùt trieån cuûa vi khuaån töùc laø ñeà caäp ñeán sinh tröôûng vaø phaùt trieån cuûa moät soá löôïng lôùn teá baøo cuûa cuøng moät loaïi. Roõ raøng, vieäc nghieân cöùu ôû moät caù theå teá baøo vi khuaån quaù nhoû laø raát khoù. Tuy nhieân, söï taêng khoái löôïng teá baøo khoâng phaûi bao giôø cuõng dieãn ra song song vôùi söï taêng sinh khoái. Chaúng haïn, khi chaát dinh duôõng trong moâi tröôøng ñaõ caïn, vi khuaån tuy coøn phaân chia 1 - 2 laàn nhöng cho 2 -4 teá baøo nhoû hôn teá baøo bình thöôøng; trong pha môû ñaàu, sinh khoái vi khuaån taêng leân, nhöng soá teá baøo khoâng thay ñoåi, ngöôïc laïi, vaøo cuoái pha logarit kích thöôùc teá baøo giaûm ñi nhöng soá teá baøo vaãn coøn taêng. Vì vaäy caàn phaân bieät caùc thoâng soá vaø haèng soá khaùc nhau khi xaùc ñònh soá löôïng hoaëc khoái löôïng vi khuaån. Khi xaùc ñònh soá löôïng hay khoái löôïng cuûa vi khuaån ta thöôøng duøng dòch treo ñoàng ñeàu cuûa caùc teá baøo trong moâi tröôøng dòch theå naøo ñoù maø xaùc ñònh noàng ñoä vi khuaån (soá teá baøo trong 1ml) hoaëc maät ñoä vi khuaån (mg/ml). Töø keát quaû ñoù caùc chæ soá naøy coù theå tính ñöôïc haèng soá toác ñoä phaân chia teá baøo (theå hieän baèng soá laàn taêng ñoâi noàng ñoä vi khuaån sau 1 giôø) vaø ñaïi löôïng ngöôïc laïi, töùc thôøi gian theá heä (thôøi gian caàn cho soá löôïng teá baøo trong moät quaàn theå vi khuaån taêng gaáp ñoâi). Trong ñieàu kieän phoøng thí nghieäm thöôøng ta theo doõi aûnh höôûng cuûa caùc yeáu toá moâi tröôøng leân sinh tröôûng vaø phaùt trieån cuûa vi khuaån nhôø caùc phöông phaùp nuoâi caáy thích hôïp. Tuyø tính chaát thay ñoåi trong heä vi khuaån - moâi tröôøng ta phaân bieät hai phöông phaùp cô baûn nuoâi caáy vi khuaån : nuoâi caáy tónh vaø nuoâi caáy lieân tuïc. Moät vi sinh vaät trong ñieàu kieän moâi tröôøng thích hôïp seõ khoâng ngöøng haáp thuï chaát dinh döôõng vaø tieán haønh trao ñoåi chaát. Neáu quaù trình ñoàng hoaù lôùn hôn quaù trình dò hoaù thì toång soá nguyeân sinh chaát (khoái löôïng, theå tích, kích thuôùc) seõ khoâng ngöøng taêng leân. Ñoù laø hieän töôïng sinh tröôûng cuûa caù theå. Neáu quaù trình sinh tröôûng caân baèng thì caùc thaønh phaàn cuûa teá baøo cuõng taêng leân theo nhöõng tæ leä thích hôïp, khi ñaït ñeán moät möùc ñoä nhaát ñònh thì seõ hình thaønh söï sinh saûn. Khi ñoù soá löôïng caù theå taêng leân. Caù theå ban ñaàu seõ phaùt trieån daàn leân thaønh moät quaàn theå, söï tieáp tuïc sinh tröôûng cuûa caù theå trong quaàn theå taïo ra söï sinh tröôûng cuûa quaàn theå. 3.1. Maãu lyù thuyeát veà sinh tröôûng vaø phaùt trieån cuûa vi khuaån Giaû söû trong moät bình kín chöùa moät löôïng lôùn moâi tröôøng dinh döôõng, ta caáy vaøo ñoù moät teá baøo vi khuaån. Neáu thaønh phaàn moâi tröôøng hoaøn toaøn phuø hôïp vôùi nhu caàu cuûa teá baøo, vi khuaån seõ sinh tröôûng, taêng khoái löôïng vaø theå tích, toång hôïp caùc thaønh phaàn cuûa 17
23. teá baøo (thaønh teá baøo, maøng teá baøo chaát, DNA, RNA, protein ) cho ñeán khi kích thöôùc lôùn gaáp ñoâi. Roài vi khuaån phaân chia cho hai teá baøo. Hai teá baøo naøy laïi tieáp tuïc sinh tröôûng vaø phaân chia ñeå cho 4 roài 8, 16 teá baøo. Neáu soá teá baøo ban ñaàu khoâng phaûi laø 1 maø laø No thì sau n laàn phaân chia ta seõ coù soá teá baøo toång coäng laø N : n N = No . 2 (1) Caùc giaù trò N vaø No coù theå xaùc ñònh nhôø phoøng ñeám hoaëc tính soá khuaån laïc moïc treân moâi tröôøng ñaëc. Coøn giaù trò n (soá theá heä) coù theå tính nhôø logarit thaäp phaân : logN = logNo + n.log2 Töø ñoù : 1 n = . (logN - logNo) (2) log 2 Ví duï vi khuaån phaân chia n laàn sau thôøi gian t, khoaûng thôøi gian giöõa hai laàn phaân chia lieân tieáp (hoaëc thôøi gian caàn cho vieäc taêng ñoâi soá teá baøo) goïi laø thôøi gian theá heä vaø bieåu thò baèng g : t t2 − t1 g = = log2 (3) n log N − log No ÔÛ ñaây t2 - t1 bieåu thò söï sai khaùc giöõa thôøi gian ñaàu (t1) vaø thôøi gian cuoái (t2) tính baèng giôø trong ñoù soá teá baøo ñöôïc xaùc ñònh. Giaù trò ñaûo ngöôïc cuûa thôøi gian theá heä hay laø soá laàn phaân chia sau moät ñôn vò thôøi gian (töùc sau 1 giôø) goïi laø haèng soá toác ñoä phaân chia C Haèng soá toác ñoä phaân chia phuï thuoäc vaøo moät soá ñieàu kieän : a. Loaøi vi khuaån : Ví duï : ôû 370C, C = 3 ñoái vôùi E. coli vaø C = 0,07 ñoái vôùi Mycobacterium tuberculosis. b. Nhieät ñoä nuoâi caáy : Ví duï : E. coli nuoâi caáy trong nöôùc thòt : Nhieät ñoä (0C) Thôøi gian theá heä (phuùt) Haèng soá toác ñoä phaân chia C 18 120 0,5 22 60 1 30 30 2 37 20 3 42 20 3 43 - 0 18
24. c. Moâi tröôøng nuoâi caáy Khi nuoâi caáy B. subtitis ôû 370C, trong : - nöôùc thòt C = 2 - moâi tröôøng khoaùng - glucose C = 0,8 - moâi tröôøng khoaùng - citrate C = 0,3 - moâi tröôøng khoaùng - glucose - citrate C = 1,2 Ñoái vôùi moät soá cô chaát ñaõ cho haèng soá toác ñoä phaân chia khoâng phuï thuoäc vaøo noàng ñoä trong moät giôùi haïn roäng. Chaúng haïn, ñoái vôùi B. subtitis, khi nuoâi caáy trong moâi tröôøng chöùa glucose, duø noàng ñoä glucose baèng 0,3 hay 50g/l ta vaãn coù C = 0,8 ; C chæ giaûm khi noàng ñoä ñöôøng vöôït ra ngoaøi caùc giôùi haïn noùi treân. Tuy nhieân, khoâng phaûi bao giôø sinh tröôûng (taêng sinh khoái vi khuaån) cuõng dieãn ra song song vôùi sinh saûn (taêng soá löôïng vi khuaån), tröôøng hôïp naøy chæ gaëp trong pha logarit. Vì vaäy, khi nghieân cöùu ñoäng hoïc trong caùc quaù trình nuoâi caáy lieân tuïc ta thöôøng theo doõi sinh tröôûng vaø sinh saûn cuûa quaàn theå vi khuaån baèng moät tieâu chuaån khaùc. Cuõng coù theå bieåu thò baèng soá löôïng teá baøo nhöng phoå bieán hôn laø bieåu thò baèng sinh khoái vi khuaån, baèng chaát khoâ hay baèng maät ñoä quang hoïc (caàn chuù yù raèng maät ñoä quang hoïc tæ leä vôùi soá teá baøo). 3.2. Sinh tröôûng vaø phaùt trieån cuûa vi khuaån trong ñieàu kieän nuoâi caáy tónh. Ñöôøng cong sinh tröôûng Neáu theo doõi sinh tröôûng vaø phaùt trieån cuûa vi khuaån trong ñieàu kieän phoøng thí nghieäm ta nhaän thaáy soá löôïng chuùng taêng leân raát nhanh. Ñieàu naøy deã hieåu, vì vôùi ñieàu kieän thích hôïp thôøi gian t theá heä (hay noùi ñuùng hôn, thôøi gian taêng ñoâi) cuûa nhieàu loaøi vi khuaån chæ vaøo khoaûng 30 phuùt. Roõ raøng caùc quaù trình sinh toång hôïp cuõng nhö caùc quaù trình dò hoaù (nhö hoâ haáp) nhaèm cung caáp nguyeân lieäu vaø naêng löôïng cho caùc phaûn öùng toång hôïp ñaõ dieãn ra trong teá baøo vôùi toác ñoä raát nhanh, hoaøn toaøn khoâng thaáy ôû caùc sinh vaät khaùc. Dó nhieân hieän töôïng noùi treân khoâng bao giôø xaûy ra vì sinh tröôûng vaø sinh saûn cuûa vi khuaån trong moät heä thoáng ñoùng kín chæ sau moät thôøi gian nhaát ñònh, vì nhieàu nguyeân nhaân khaùc nhau, seõ bò ngöøng laïi. Phöông phaùp nuoâi caáy maø trong suoát thôøi gian ñoù ta khoâng theâm vaøo chaát dinh döôõng cuõng khoâng loaïi boû ñi caùc saûn phaåm cuoái cuøng cuûa trao ñoåi chaát goïi laø nuoâi caáy tónh. Söï sinh tröôûng trong moät heä thoáng nhö vaäy tuaân theo nhöõng quy luaät baét buoäc khoâng nhöõng ñoái vôùi caùc cô theå ñôn baøo maø caû ñoái vôùi caùc cô theå ña baøo. 3.2.1. Pha lag Pha naøy tính töø luùc baét ñaàu caáy ñeán khi vi khuaån ñaït ñöôïc toác ñoä sinh tröôûng cöïc ñaïi. Trong pha lag vi khuaån chöa phaân chia (nghóa laø chöa coù khaû naêng sinh saûn) nhöng theå tích vaø khoái löôïng teá baøo taêng leân roõ reät do quaù trình toång hôïp caùc chaát, tröôùc heát laø caùc cao phaân töû (protein, enzyme, acid nucleic ) dieãn ra maïnh meõ. Moät soá enzyme caàn 19
25. cho quaù trình toång hôïp thuoäc caùc endoenzyme loaïi proteinase, amylase vaø caùc enzyme naèm trong quaù trình chuyeån hoaù glucide, ñeàu ñöôïc hình thaønh trong pha naøy. Ñoä daøi cuûa pha lag phuï thuoäc tröôùc heát vaøo tuoåi cuûa oáng gioáng vaø thaønh phaåm moâi tröôøng. Chaúng haïn, pha lag seõ khoâng coù neáu ta duøng oáng gioáng goàm caùc teá baøo ñang ôû pha sinh tröôûng logarit vaø caáy chuùng vaøo cuøng moät moâi tröôøng döôùi nhöõng ñieàu kieän nuoâi caáy nhö nhau. Traùi laïi neáu ta caáy caùc teá baøo ôû pha oån ñònh hoaëc caùc baøo töû vaøo cuøng moät moâi tröôøng döôùi nhöõng ñieàu kieän nuoâi caáy nhö nhau, pha lag vaãn coù. Thöôøng thöôøng teá baøo caøng giaø thì pha lag caøng daøi. Roõ raøng nguyeân nhaân cuûa pha lag laø söï khaùc bieät giöõa caùc teá baøo ôû pha oån ñònh (hoaëc baøo töû) vôùi caùc teá baøo ñang sinh tröôûng logarit. Trong pha lag dieãn ra vieäc xaây döïng laïi caùc teá baøo nghæ thaønh caùc teá baøo sinh tröôûng logarit. Nhöng ngay khi duøng caùc teá baøo ñang sinh tröôûng logarit maø caáy vaøo moâi tröôøng môùi khaùc vôùi moâi tröôøng tröôùc ñaây ta vaãn thaáy pha lag. Nguyeân nhaân cuûa pha lag trong tröôøng hôïp naøy chính laø söï thích öùng cuûa vi khuaån vôùi ñieàu kieän nuoâi caáy môùi. Söï thích öùng ñoù coù lieân quan vôùi söï toång hôïp caùc enzyme môùi maø tröôùc ñaây teá baøo chöa caàn Caùc enzyme môùi naøy ñöôïc toång hôïp nhôø söï caûm öùng vôùi cuûa caùc cô chaát môùi. Vieäc tìm hieåu ñoä daøi thôøi gian cuûa pha lag laø caàn thieát trong vieäc phaùn ñoaùn ñaëc tính cuûa vi khuaån vaø tính chaát cuûa moâi tröôøng. Nhö ta ñaõ bieát, pha lag bieåu thò söï thích nghi cuûa vi khuaån vôùi moät moâi tröôøng ñaõ cho. Traïng thaùi sinh lyù cuûa vi khuaån caøng xa vôùi sinh tröôûng logarit trong moâi tröôøng môùi thì pha lag caøng daøi. Nhöng yeáu toá thöù hai aûnh höôûng ñeán ñoä daøi thôøi gian cuûa pha lag laø toác ñoä cuûa caùc quaù trình dieãn ra trong teá baøo, tröôùc heát laø toác ñoä toång hôïp caùc enzyme thích öùng môùi. Coù raát nhieàu yeáu toá aûnh höôûng ñeán pha lag. Ñaùng chuù yù nhaát laø 3 yeáu toá sau ñaây: - Tuoåi gioáng caáy : Tuoåi cuûa quaàn theå gioáng caáy töùc laø chuùng ñang ôû giai ñoaïn sinh tröôûng naøo, coù aûnh höôûng raát roõ ñeán pha lag. Thöïc nghieäm chöùng minh neáu gioáng caáy ôû giai ñoaïn pha lag (hay pha chæ soá) thì pha lag seõ ngaén. Ngöôïc laïi neáu gioáng caáy ôû pha töû vong thì pha lag ôû vaät nuoâi seõ keùo daøi. - Löôïng caáy gioáng : noùi chung löôïng caáy gioáng nhieàu thì pha lag ngaén vaø ngöôïc laïi. Trong coâng nghieäp leân men tyû leä caáy gioáng thöôøng ôû möùc 1/10. - Thaønh phaàn moâi tröôøng : Moâi tröôøng coù thaønh phaàn dinh döôõng phong phuù (thöôøng laø moâi tröôøng coù cô chaát thieân nhieân) thì cho pha lag ngaén. Trong coâng nghieäp leân men thaønh phaàn cuûa moâi tröôøng leân men thöôøng traùnh sai khaùc nhieàu so vôùi thaønh phaàn cuûa moâi tröôøng nhaân gioáng. 3.2.2. Pha log Trong pha naøy vi khuaån sinh tröôûng vaø phaùt trieån theo luyõ thöøa, nghóa laø sinh khoái ct μt vaø soá löôïng teá baøo taêng theo phöông trình N = No . 2 hay X = Xo . c . kích thöôùc cuûa teá 20
26. baøo, thaønh phaàn hoaù hoïc, hoaït tính sinh lyù noùi chung khoâng thay ñoåi theo thôøi gian. Teá baøo ôû traïng thaùi ñoäng hoïc vaø ñöôïc coi nhö laø “nhöõng teá baøo tieâu chuaån”. Neáu ta laáy truïc tung laø soá teá baøo, truïc hoaønh laø thôøi gian ta seõ coù ñöôøng bieåu dieãn laø ñöôøng cong I. Moät ñoà thò nhö vaäy roõ raøng khoâng coù lôïi cho vieäc tính toaùn. Cho neân ngöôøi ta thöôøng laáy truïc tung laø logarit cuûa soá teá baøo vaø ñöôøng bieåu dieãn sinh tröôûng theo luyõ thöøa cuûa vi khuaån seõ laø ñöôøng thaúng. Vì pha sinh tröôûng theo luyõ thöøa cuûa vi khuaån ñöôïc bieåu dieãn baèng söï phuï thuoäc theo ñöôøng thaúng giöõa thôøi gian vaø logarit cuûa soá teá baøo neân pha naøy ñöôïc goïi laø pha logarit. Hôn nöõa, ngöôøi ta thöôøng duøng logarit cô soá 2 laø thích hôïp 21
27. hôn caû vì söï thay ñoåi moät ñôn vò cuûa log2 treân truïc tung chính laø söï taêng ñoâi soá löôïng vi khuaån vaø thôøi gian caàn ñeå taêng moät ñôn vò cuûa log2 laïi laø thôøi gian theá heä. Ba thoâng soá quan troïng cuûa pha log laø thôøi gian theá heä (hoaëc thôøi gian taêng ñoâi) g, haèng soá toác ñoä phaân chia c vaø haèng soá toác ñoä sinh tröôûng μ. Neáu xaùc ñònh thôøi gian theá heä g theo soá teá baøo baèng phöông phaùp noùi treân ta seõ nhaän ñöôïc giaù trò trung bình. Treân thöïc teá, trong moät quaàn theå vi khuaån luoân luoân coù moät soá teá baøo khoâng coù khaû naêng phaân chia. Vì vaäy caùc teá baøo phaân chia maïnh thöôøng coù thôøi gian theá heä nhoû hôn giaù trò trung bình tìm thaáy. Caùc haèng soá c vaø μ coù theå tính ñöôïc töø phöông trình : log X − log X μ = 2 2 2 1 log 2 e(t 2 − t1 ) Caùc haèng soá naøy thay ñoåi tuyø theo haøng loaït yeáu toá moâi tröôøng vaø ñieàu kieän nuoâi caáy. Tuy nhieân trong ñieàu kieän thí nghieäm coù theå ñieàu chænh sao cho toác ñoä sinh tröôûng cuûa vi khuaån chæ maãn caûm, nghóa laø chæ phuï thuoäc vaøo moät yeáu toá, coøn caùc yeáu toác khaùc cuûa moâi tröôøng khoâng coù aûnh höôûng gì. Trong tröôøng hôïp nhö vaäy yeáu toá ñaõ cho laø yeáu toá haïn cheá toác ñoä sinh tröôûng. Monod (1942) laø ngöôøi ñaàu tieân ñaõ chöùng minh raèng neáu taát caû caùc chaát dinh döôõng ñeàu ôû noàng ñoä dö thöøa tröø moät chaát haïn cheá thì haèng soá toác ñoä phaân chia (hoaëc sinh tröôûng) seõ laø haøm soá cuûa noàng ñoä chaát dinh döôõng haïn cheá naøy. Chaát dinh döôõng haïn cheá coù theå laø ñöôøng (saccharose, glucose) acid amin (tryptophan, arginin), chaát voâ cô (phosphate, CO2). Sinh tröôûng theo luyõ thöøa cuûa moät vi khuaån coù thôøi gian theá heä laø 20 phuùt Thôøi gian Soá laàn phaân Soá teá baøo bieåu thò baèng (phuùt ) chia soá soá hoïc log2 log10 0 0 1 0 0,000 20 1 2 1 0,301 40 2 4 2 0,602 60 3 8 3 0,903 80 4 16 4 1,204 100 5 32 5 1,505 Vì vaäy Monod ñaõ neâu leân moät caùch töông töï moái quan heä giöõa caùc haèng soá c vaø μ vôùi noàng ñoä chaát dinh döôõng haïn cheá qua caùc phöông trình : [S] c = cmax K s + [S] [S] vaø μ = μ max K s − [S] ÔÛ ñaây cmax vaø μmax laàn löôït laø haèng soá toác ñoä phaân chia vaø haèng soá toác ñoä sinh tröôûng cöïc ñaïi, Ks laø haèng soá baõo hoaø vaø [S] laø noàng ñoä chaát dinh döôõng haïn cheá. Gioáng 22
28. nhö haèng soá Michaelis km, haèng soá baõo hoaø Ks bieåu thò aùi löïc cuûa teá baøo ñoái vôùi chaát dinh döôõng : Giaù trò cuûa Ks caøng nhoû thì aùi löïc caøng lôùn. Ñoù laø noàng ñoä cuûa chaát dinh döôõng 1 haïn cheá maø ôû ñoù μ ñaït ñöôïc nöûa giaù trò cöïc ñaïi, töùc μ = . Giaù trò cuûa Ks thöôøng raát μ max thaáp. Moät soá haèng soá baõo hoaø Vi sinh vaät Chaát dinh döôõng haïn Ks cheá E. coli glucose 4mg/l E. coli mannitol 2mg/l E. coli lactose 20mg/l E. coli glucose 7,5mg/l E. coli tryptophan 0,2 ñeán 1,0 μg/l E. coli tryptophan 0,4 μg/l M. tuberculosis glucose 3, 9μg/l A. aerogenes phosphate 0,6mmol/l B. megatherium -8 O2 3,1 . 10 mol/l E. coli 7 O2 6,0 . 10 mol/l -8 O2 2,2 . 10 mol/l 3.2.3. Pha oån ñònh Trong pha naøy quaàn theå vi khuaån ôû traïng thaùi caân baèng ñoäng hoïc, soá teá baøo môùi sinh ra baèng soá teá baøo cuõ cheát ñi. Keát quaû: soá teá baøo vaø caû sinh khoái khoâng taêng cuõng khoâng giaûm. Toác ñoä sinh tröôûng baây giôø phuï thuoäc vaøo noàng ñoä cô chaát. Cho neân khi giaûm noàng ñoä cô chaát (tröôùc khi cô chaát bò caïn hoaøn toaøn) toác ñoä sinh tröôûng cuûa vi khuaån cuõng giaûm. Do ñoù vieäc chuyeån töø pha lag sang pha oån ñònh dieãn ra daàn daàn. Nguyeân nhaân toàn taïi cuûa pha oån ñònh laø do söï tích luyõ caùc saûn phaåm ñoäc cuûa trao ñoåi chaát (caùc loaïi röôïu, acid höõu cô) vaø söï caïn chaát dinh döôõng (thöôøng laø chaát dinh döôõng coù noàng ñoä thaáp nhaát). Nguyeân nhaân thöù nhaát raát phöùc taïp vaø khoù phaân tích, nguyeân nhaân thöù hai ñaõ ñöôïc nghieân cöùu kyõ hôn. Söï taêng sinh khoái toång coäng tyû leä thuaän vôùi noàng ñoä ban ñaàu cuûa chaát dinh döôõng haïn cheá. G = K . c ÔÛ ñaây G laø ñoä taêng sinh khoái toång coäng, c laø noàng ñoä ban ñaàu cuûa chaát dinh döôõng haïn cheá. K laø haèng soá hieäu suaát : K = G / c 23
29. Haèng soá hieäu suaát K thöôøng ñöôïc bieåu thò baèng soá mg chaát khoâ ñoái vôùi 1mg chaát dinh döôõng. Ñoái vôùi caùc ñöôøng, K thöôøng dao ñoäng khoaûng töø 0,20 ñeán 0,30 nghóa laø töø 100mg ñöôøng ñöôïc taïo thaønh 20 - 30mg khoái löôïng khoâ cuûa teá baøo. Caàn chuù yù raèng ngay trong pha oån ñònh coù theå dieãn ra caùc quaù trình nhö söû duïng chaát dinh döôõng, phaân huyû moät phaàn ribosome. Nhöõng teá baøo maãn caûm seõ cheát tröôùc, nhöõng teá baøo khaùc coøn toàn taïi moät thôøi gian cho tôùi khi naøo vieäc oxy hoaù caùc chaát döï tröõ hoaëc caùc protein cuûa teá baøo ñaõ caïn. Löôïng sinh khoái ñaït ñöôïc trong pha oån ñònh goïi laø hieäu suaát hoaëc saûn löôïng. Saûn löôïng phuï thuoäc vaøo tính chaát vaø soá löôïng caùc chaát dinh döôõng söû duïng vaø vaøo ñieàu kieän nuoâi caáy. Ñoù laø söï sai khaùc giöõa soá löôïng vi khuaån cöïc ñaïi vaø khoái löôïng vi khuaån ban ñaàu. X = Xmax - Xo Ñaïi löôïng naøy ñöôïc bieåu thò baèng gam. 3.2.4. Pha töû vong Trong pha naøy soá löôïng teá baøo soáng coù khaû naêng soáng giaûm theo luyõ thöøa (maëc duø soá löôïng teá baøo toång coäng coù theå khoâng giaûm). Ñoâi khi caùc teá baøo töï phaân nhôø caùc enzyme cuûa baûn thaân. ÔÛ caùc vi khuaån sinh baøo töû thì phöùc taïp hôn do quaù trình hình thaønh baøo töû. Thöïc ra chöa coù moät quy luaät chung cho pha töû vong. Söï cheát cuûa teá baøo coù theå nhanh hay chaäm, coù lieân quan ñeán söï töï phaân hay khoâng töï phaân. Do söùc soáng lôùn, baøo töû bò cheát chaäm nhaát (trong nhöõng ñieàu kieän thích hôïp nhö khoâ vaø nhieät ñoä thaáp baøo töû coù theå duy trì ñöôïc khaû naêng soáng haøng traêm naêm). Nguyeân nhaân cuûa pha töû vong chöa thaät roõ raøng, nhöng coù lieân quan vôùi ñieàu kieän baát lôïi cuûa moâi tröôøng. Trong tröôøng hôïp moâi tröôøng tích luyõ caùc acid (Escherichia, Lactobacillus) nguyeân nhaân cuûa söï cheát teá baøo töông ñoái deã hieåu. Noàng ñoä chaát dinh döôõng thaáp döôùi möùc caàn thieát, seõ laøm giaûm hoaït tính trao ñoåi chaát, phaân huyû daàn daàn caùc chaát döï tröõ vaø cuoái cuøng daãn ñeán söï cheát cuûa haøng loaït teá baøo. Ngoaøi ñaëc tính cuûa baûn thaân chuûng vi khuaån, tính chaát cuûa caùc saûn phaåm trao ñoåi chaát tích luyõ cuõng aûnh höôûng ñeán tieán trình cuûa pha töû vong. Moät soá enzyme theå hieän hoaït tính xuùc taùc cöïc ñaïi trong pha töû vong nhö deaminase, decarboxylase, caùc amilase vaø proteinase ngoaïi baøo. Ngoaøi chöùc naêng xuùc taùc moät soá quaù trình toång hôïp nhöõng enzyme noùi treân chuû yeáu xuùc taùc caùc quaù trình phaân giaûi. Toác ñoä töû vong cuûa teá baøo coù lieân quan tröïc tieáp ñeán thöïc tieãn vi sinh vaät hoïc vaø kyõ thuaät, ñoù laø vaán ñeà baûo quaûn caùc chuûng vi sinh vaät quan troïng veà maët lyù thuyeát (caùc chuûng vaø caùc bieán chuûng ñaëc bieät) vaø kyõ thuaät (caùc chuûng sinh chaát khaùng sinh, acid amin, vitamine vôùi saûn löôïng cao). Ngoaøi khaû naêng soáng ta coøn caàn baûo quaûn caû caùc ñaëc tính di truyeàn cuûa vi khuaån. Coù nhieàu phöông phaùp baûo quaûn khaùc nhau, nhöng taát caû ñeàu nhaèm laøm giaûm trao ñoåi chaát ñeán toái thieåu chuû yeáu baèng caùch giaûm nhieät ñoä vaø ñoä aåm. Sau ñaây laø moät soá phöông phaùp thöôøng duøng trong vieäc baûo quaûn vi sinh vaät : 24
30. a. Caáy chuyeån thöôøng xuyeân treân thaïch nghieâng hoaëc trích saâu vaøo thaïch. Sau khi ñaõ sinh tröôûng, vi khuaån ñöôïc giöõ trong tuû laïnh ôû + 40C. Phöông phaùp naøy ñôn giaûn nhaát vaø thöôøng ñöôïc duøng, nhöng keùm hieäu quaû nhaát. b. Baûo quaûn döôùi daàu voâ truøng : daàu parafin vöøa ngaên caûn moâi tröôøng khoâ vöøa laøm giaûm trao ñoåi chaát do caûn trôû söï xaâm nhaäp cuûa oxy. c. Baûo quaûn trong caùt hoaëc ñaát seùt voâ truøng : Do caáu truùc lyù - hoaù caùt vaø ñaát seùt ñeàu laø nhöõng vaät chaát toát mang caùc teá baøo vi sinh vaät, chuû yeáu laø caùc baøo töû. Sau khi laøm khoâ khoâng khí caùt (hoaëc ñaát seùt) cuøng vôùi vi khuaån coù theå baûo quaûn teá baøo raát laâu. d. Ñoâng khoâ ; laø phöông phaùp hoaøn thieän vaø coù hieäu quaû nhaát. Vi khuaån ñöôïc troän vôùi moâi tröôøng thích hôïp (söõa, huyeát thanh, ) roài laøm laïnh vaø laøm khoâ nhôø baêng khoâ. Sau maáy naêm baûo quaûn teá baøo vaãn giöõ ñöôïc khaû naêng soáng maø khoâng bò bieán ñoåi veà di truyeàn. e. Baûo quaûn trong glycerin (10%) vaø giöõ trong tuû laïnh saâu (-600C hay -800C) : Ñaây laø phöông phaùp raát thích hôïp nhöng caàn mua ñöôïc loaïi oáng nhöïa chòu nhieät (khi khöû truøng). 3.3. Sinh tröôûng cuûa vi khuaån trong quaù trình nuoâi caáy lieân tuïc Trong phöông phaùp nuoâi caáy tónh noùi treân, caùc ñieàu kieän moâi tröôøng luoân luoân thay ñoåi theo thôøi gian, maät ñoä vi khuaån taêng leân coøn noàng ñoä cô chaát giaûm xuoáng. Vi khuaån phaûi sinh tröôûng vaø phaùt trieån theo moät soá pha nhaát ñònh, sinh khoái ñaït ñöôïc khoâng cao. Tuy nhieân trong nhieàu nghieân cöùu vaø thöïc tieån saûn xuaát ta caàn cung caáp cho vi sinh vaät nhöõng ñieàu kieän oån ñònh ñeå trong moät thôøi gian daøi chuùng coù theå vaãn sinh tröôûng trong pha log. Dó nhieân ôû moät möùc ñoä naøo ñoù coù theå caáy chuyeàn teá baøo nhieàu laàn (qua nhöõng khoaûng thôøi gian ngaén) vaøo moâi tröôøng dinh döôøng môùi . Nhöng ñôn giaûn hôn, ngöôøi ta ñöa lieân tuïc moâi tröôøng dinh döôõng môùi vaøo bình nuoâi caáy vi khuaån ñoàng thôøi loaïi khoûi bình moät löôïng töông öùng dòch vi khuaån. Ñaây chính laø cô sôû cuûa phöông phaùp nuoâi caáy lieân tuïc trong chemostat vaø turbidostat. Giaû söû ta coù moät bình nuoâi caáy trong ñoù vi khuaån ñang sinh tröôûng phaùt trieån, cho chaûy lieân tuïc vaøo bình moâi tröôøng môùi coù thaønh phaàn khoâng ñoåi. Theå tích bình nuoâi caáy ñöôïc giöõ khoâng ñoåi, nghóa laø doøng moâi tröôøng ñi vaøo ñöôïc buø bôûi doøng moâi tröôøng ñi ra côùi cuøng toác ñoä. Ta goïi theå tích bình laø v (lít) laø toác ñoâï vaøo cuûa moâi tröôøng dinh döôõng, toác ñoä doøng ñi vaøo laø f (lít/giôø). Do ñoù toác ñoä pha loaõng (coøn goïi laø heä soá pha loaõng) D laø f/v. Ñaïi löôïng D bieåu thò söï thay ñoåi theå tích sau 1 giôø. Neáu vi khuaån khoâng sinh tröôûng vaø phaùt trieån, chuùng seõ bò ruùt khoûi bình nuoâi caáy vôùi toác ñoä : dX v − = − = D.X dt ÔÛ ñaây X laø sinh khoái teá baøo (g/l). 25
31. Toác ñoä sinh tröôûng cuûa quaàn theå vi khuaån trong bình cho bôûi phöông trình : dX v + = = μX dt toác ñoä thay ñoåi cuoái cuøng (taêng hoaëc giaûm) maät ñoä vi khuaån trong nuoâi caáy lieân tuïc laø söï sai khaùc giöõa toác ñoä taêng vaø toác ñoä giaûm v : dX v = v+ - v- = = (μ - D)X dt Neáu μ < D giaù trò v = dX/dt coù giaù trò döông, nghóa laø maät ñoä vi khuaån trong bình taêng, ngöôïc laïi neáu μ < D, v seõ coù giaù trò aâm vaø maät ñoä vi khuaån trong bình giaûm. Trong tröôøng hôïp ñaëc bieät μ = D ta coù v = 0, nghóa laø maät ñoä teá baøo khoâng taêng khoâng giaûm theo thôøi gian, quaàn theå vi khuaån ôû trong traïng thaùi caân baèng ñoäng hoïc. Neáu bình thí nghieäm coù thieát bò duy trì sao cho μ luoân luoân baèng D ta seõ thu ñöôïc quaàn theå vi khuaån sinh tröôûng vaø phaùt trieån theo luyõ thöøa thöôøng xuyeân ôû moät maät ñoä teá baøo khoâng ñoåi vaø khoâng phuï thuoäc vaøo thôøi gian. Trong tröôøng hôïp nhö vaäy khoâng nhöõng kích thöôùc trung bình cuûa teá baøo, traïng thaùi sinh lyù cuûa chuùng maø caû moâi tröôøng nuoâi caáy ñeàu khoâng ñoåi vaø khoâng phuï thuoäc vaøo thôøi gian. Ñieàu naøy, moät maët taïo ñieàu kieän cho vieäc nghieân cöùu sinh tröôûng vaø sinh lyù cuûa teá baøo vi khuaån, maët khaùc caûi thieän quaù trình saûn xuaát vi sinh vaät ôû quy moâ coâng nghieäp. Chemostat vaø turbidostat laø hai thieát bò nuoâi caáy trong ñoù ta coù theå duy trì ñöôïc ñieàu kieän μ = D Chemostat goàm moät bình nuoâi caáy, dung dòch dinh döôõng töø moät bình döï tröõ chaûy vaøo ñaây vôùi moät toác ñoä khoâng ñoåi. Nhôø thoâng khí vaø khuaáy cô hoïc bình nuoâi caáy ñöôïc cung caáp ñaày ñuû oxy vaø baûo ñaûm vieäc phaân boá nhanh vaø ñoàng ñeàu caùc chaát dinh döôõng trong doøng moâi tröôøng ñi vaøo. Theo möùc ñoä vaøo cuûa moâi tröôøng maø dòch vi khuaån ñöôïc ruùt khoûi bình moät caùch thích hôïp. Sinh tröôûng cuûa vi khuaån trong chemostat ñöôïc ñieàu chænh bôûi noàng ñoä cô chaát. Chaát dinh döôõng haïn cheá naøy coù theå laø moät thaønh phaàn chuû yeáu naøo ñoù cuûa moâi tröôøng. Phoå bieán hôn caû laø nguoàn carbon vaø naêng löôïng, nhöng thöôøng ngöôøi ta cuõng choïn nguoàn nitrogen, phosphore, löu huyønh hoaëc Mg2+. Nhö ñaõ noùi treân, μ laø haøm soá cuûa noàng ñoä chaát dinh döôõng haïn cheá. μ = μmax Nghóa laø coù voâ soá haèng soá μ töø μ = 0 ñeán μ = μmax (haèng soá toác ñoä sinh tröôûng cöïc ñaïi ñaït ñöôïc khi baõo hoaø cô chaát) tuyø theo noàng ñoä chaát dinh döôõng haïn cheá sao cho maät ñoä vi khuaån trong bình khoâng bò giaûm. Nhö theá seõ coù moät toác ñoä pha loaõng Dm, ôû ñoù sinh khoái vi khuaån ñaït ñöôïc cöïc ñaïi, nghóa laø Dm = μmax. Traùi vôùi chemostat hoaït ñoäng cuûa turbidostat (töø chöõ turbidity = ñoä ñuïc) döïa vaøo vieäc duy trì maät ñoä (hoaëc ñoä ñuïc) vi khuaån khoâng ñoåi. Teá baøo quang ñieän ño ñoä ñuïc ñieàu chænh moâi tröôøng ñi vaøo bình qua moät heä thoáng rôle. Trong bình nuoâi caáy taát caû chaát dinh döôõng ñeàu ôû noàng ñoä dö thöøa vaø vi khuaån sinh tröôûng vôùi toác ñoä gaàn cöïc ñaïi. 26
32. Neáu maät ñoä teá baøo taêng quaù giaù trò caàn thieát thì heä soá pha loaõng seõ taêng vaø phaàn teá baøo thöøa bò loaïi ra ngoaøi (vì D > μmax). Ngöôïc laïi neáu maät ñoä teá baøo giaûm xuoáng döôùi möùc choïn löïa heä soá D laïi giaûm vaø maät ñoä teá baøo seõ taêng (vì μmax > D). keát quaû cuûa söï ñieàu chænh laø duy trì cho heä soá pha loaõng D = μmax. Roõ raøng veà maët kyõ thuaät phöông phaùp turbidostat phöùc taïp hôn chemostat. Toùm laïi, coù nhöõng sai khaùc chính giöõa nuoâi caáy tónh vaø nuoâi caáy lieân tuïc: Nuoâi caáy tónh ñöôïc xem nhö laø heä thoáng ñoùng, quaàn theå teá baøo sinh tröôûng trong ñoù phaûi traûi qua caùc pha môû ñaàu logarit, oån ñònh vaø töû vong. Moãi pha sinh tröôûng ñöôïc ñaëc tröng bôûi nhöõng ñieàu kieän nhaát ñònh. Vieäc ñieàu khieån töï ñoäng khoù thöïc hieän. Nuoâi caáy lieân tuïc, traùi laïi, laø heä thoáng môû coù khuynh höôùng daãn ñeán vieäc thieát laäp moät caân baèng ñoäng hoïc. Yeáu toá thôøi gian ôû ñaây, trong phaïm vi nhaát ñònh, bò loaïi tröø. Teá baøo ñöôïc cung caáp nhöõng ñieàu kieän moâi tröôøng khoâng ñoåi, nhôø vieäc ñieàu chænh töï ñoäng. 3.4. Laøm ñoàng boä söï phaân chia teá baøo Bình thöôøng quaàn theå vi khuaån ñang sinh tröôûng vaø phaân chia laø moät hoãn hôïp teá baøo ôû caùc pha sinh tröôûng raát khaùc nhau cuûa söï phaân chia teá baøo, nghóa laø vaøo luùc baát kyø, trong moâi tröôøng nuoâi caáy ta coù theå ñoàng thôøi gaëp caùc teá baøo vöøa phaân chia xong, saép phaân chia hoaëc ôû nhöõng giai ñoaïn keá tieáp. Tuy nhieân, muoán nghieân cöùu caùc quaù trình trao ñoåi chaát trong suoát chu kyø phaân chia teá baøo ta caàn coù moät quaàn theå vi khuaån trong ñoù caùc teá baøo phaân chia ñoàng thôøi (ñoàng boä). Coù theå laøm ñoàng boä söï phaân chia teá baøo baèng moät phöông phaùp nhaân taïo nhö thay ñoåi sinh lyù teá baøo hoaëc döïa vaøo vieäc choïn loïc cô hoïc caùc teá baøo coù cuøng kích thöôùc. Phöông phaùp sinh lyù laøm ñoàng boä söï phaân chia teá baøo phoå bieán laø phöông phaùp gaây choaùng nhieät. Nhö ta bieát, trong nhöõng ñieàu kieän nuoâi caáy bình thöôøng ôû nhieät ñoä thích hôïp (ôû vi khuaån laø 300C, 370C) caùc quaù trình toång hôïp phaàn lôùn caùc cao phaân töû (DNA, RNA, protein) dieãn ra song song vaø ôû traïng thaùi caân baèng. Baèng caùch giaûm nhieät ñoä ta seõ phaù huyû caân baèng naøy. Trong khi toång hôïp DNA coøn tieáp tuïc moät thôøi gian thì vieäc toång hôïp RNA vaø protein bò ngöøng. Keát quaû laø söï phaân chia teá baøo cuõng bò ngöøng. Neáu phuïc hoài laïi nhieät ñoä thích hôïp ban ñaàu thì chæ sau moät thôøi gian lag ngaén, teá baøo seõ baét ñaàu phaân chia nhöng baây giôø phaân chia ñoàng boä töùc laø phaàn lôùn teá baøo ñeàu phaân chia trong moät khoaûng thôøi gian töông ñoái ngaén. Sau khi naâng nhieät ñoä quaù trình toång hôïp RNA vaø protein ñöôïc phuïc hoài coøn haøm löôïng DNA vaãn ôû möùc ban ñaàu töông öùng vôùi chaëng keát thuùc nhaân ñoâi cuûa nhieãm saéc theå. Tuy nhieân, söï phaân chia ñoàng boä, khoâng phaûi laø traïng thaùi beàn vöõng , chæ sau vaøi theá heä tính ñoàng boä laïi bò phaù huyû vaø quaàn theå vi khuaån laïi laø moät hoãn hôïp teá baøo ôû caùc pha phaân chia khaùc nhau. Phöông phaùp naâng cao nhieät ñoä ñaõ ñöôïc öùng duïng ñaàu tieân vôùi ñoäng vaät nguyeân sinh (Tetrahymena). Vieäc phaân tích sinh lyù caùc teá baøo phaân chia ñoàng boä chöùng minh raèng do söï phaù huyû thöù töï bình thöôøng cuûa söï phaân chia nhieãm saéc theå vaø söï phaân chia teá baøo maø gaây 27
33. neân hieän töôïng sinh tröôûng maát caân baèng ñoù laø nguyeân nhaân cuûa söï phaân chia ñoàng boä. Nhö ta bieát ñieàu kieän ñeå môû ñaàu vieäc phaân chia teá baøo laø söï keát thuùc quaù trình nhaân ñoâi nhieãm saéc theå. Maët khaùc, moät khi ñaõ ôû trong traïng thaùi nhaân ñoâi nhieãm saéc theå seõ ñoäc laäp vôùi caùc ñieàu kieän sinh tröôûng vaø chu trình nhaân ñoâi seõ hoaøn thaønh ngay khi toång hôïp protein bò kìm haõm bôûi cloramphenicol hoaëc bôûi thieáu moät acid amin chuû yeáu. Treân cô sôû cuûa nhöõng keát quaû naøy ta coù theå hieåu ñöôïc nguyeân taéc laøm ñoàng boä khoâng phaûi chæ baèng gaây choaùng nhieät maø noùi chung baèng moïi taùc ñoäng khaùc ñeán traïng thaùi sinh lyù bình thöôøng cuûa teá baøo. Nhieät ñoä thaáp laøm ngöøng toång hôïp RNA vaø protein nhöng vieäc nhaân ñoâi nhieãm saéc theå vaãn ñöôïc hoaøn thaønh maëc duø vôùi toác ñoä chaäm. Do toång hôïp RNA vaø protein bò kìm haõm maø söï phaân chia teá baøo vaø sinh tröôûng cuõng bò ngöøng. Bôûi vì deã hieåu raèng, toång hôïp protein laø caàn khoâng nhöõng cho vieäc môû ñaàu moät chu trình nhaân ñoâi môùi cuûa DNA maø caû cho vieäc toång hôïp caùc enzyme vaø caùc caáu truùc caàn thieát ñoái vôùi söï hình thaønh vaùch ngaên ngang. Coøn sinh tröôûng bò ngöøng thì coù theå hieåu raèng vì protein laø thaønh phaàn chuû yeáu cuûa teá baøo vaø sinh tröôûng ñoøi hoûi coù nhöõng enzyme thöôøng xuyeân hoaït ñoäng khoâng nhöõng tham gia vaøo caùc quaù trình sinh toång hôïp maø caû vaøo caùc quaù trình phaân giaû (quaù trình cung caáp naêng löôïng vaø caùc tieàn chaát cho vieäc toång hôïp). Nguyeân nhaân tröïc tieáp cuûa söï phaân chia ñoàng boä sau khi phuïc hoài nhieät ñoä thích hôïp laø traïng thaùi gioáng nhau cuûa söï nhaân ñoâi nhieãm saéc theå. Vaøo cuoái luùc gaây choaùng laïnh taát caû vi khuaån ñeàu chöùa moät nhieãm saéc theå ñaõ nhaân ñoâi, baát keå teá baøo ñaõ ôû giai ñoaïn naøo cuûa söï nhaân ñoâi khi haï nhieät ñoä. Vieäc phuïc hoài nhieät ñoä daãn ñeán vieäc hoaït ñoäng ñoàng thôøi cuûa caùc quaù trình keá tieáp söï nhaân ñoâi : phaân ly nhieãm saéc theå vaø hình thaønh caùc vaùch ngang. Moät phöông phaùp sinh lyù khaùc laøm ñoàng boä söï phaân chia teá baøo laø thay ñoåi thaønh phaàn cuûa moâi tröôøng. Neáu vaøo moät luùc naøo ñoù ta loaïi khoûi moâi tröôøng nuoâi caáy moät chaát dinh döôõng hoaëc moät chaát trao ñoåi chuû yeáu naøo ñoù vi khuaån seõ sinh tröôûng maát caân baèng : sau khi phuïc hoài noàng ñoä chaát naøy, teá baøo seõ phaân chia ñoàng boä. Chaúng haïn, coù theå gaây ñoùi timin trong thôøi gian ngaén ôû caùc bieán chöùng E. coli trôï döôõng ñoái vôùi timin hoaëc gaây ñoùi moät soá acid amin caàn thieát cho sinh toång hôïp caùc protein cuûa teá baøo. Veà nguyeân taéc laøm ñoàng boä söï phaân chia teá baøo baèng gaây ñoùi acid amin ta coù theå giaûi thích nhö sau: Trong tröôøng hôïp naøy toång hôïp RNA vaø protein bò ngöøng ngay nhöng quaù trình nhaân ñoâi nhieãm saéc theå, neáu ñaõ môû ñaàu, vaãn coù theå dieãn ra cho ñeán khi hoaøn thaønh. Nguyeân nhaân ôû ñaây laïi laø söï sinh tröôûng maát caân baèng trong thôøi gian ñoùi acid amin. Vì böôùc môû ñaàu moät chu trình nhaân ñoâi môùi lieân quan chaët cheõ ñeán toång hôïp protein neân nhieãm saéc theå cuûa taát caû vi khuaån sau khi ñaõ nhaân ñoâi thì ngöøng laïi. Vieäc theâm acid amin seõ phuïc hoài toång hôïp RNA vaø protein, do ñoù cuõng kích thích phaûn öùng môû ñaàu chu trình nhaân ñoâi môùi sau khi caùc nhieãm saéc theå nhaân ñoâi ñaõ ñöôïc phaân ly. Nhö theá laøm ñoàng boä söï phaân chia teá baøo laø haäu quaû cuûa vieäc laøm ñoàng boä söï phaân chia nhieãm saéc theå. Nguyeân taéc laøm ñoàng boä baèng gaây ñoùi timin, töø quan ñieåm toång hôïp DNA, vaãn chöa ñöôïc giaûi thích. Vieäc loaïi boû timin cuõng ñoàng thôøi laøm ngöøng toång hôïp DNA, nghóa 28
34. laø caùc teá baøo trong quaàn theå chöùa nhieãm saéc theå ôû caùc giai ñoaïn khaùc nhau cuûa söï nhaân ñoâi. Khoaûng thôøi gian gaây ñoùi khoâng ñöôïc quaù giôùi haïn 30 - 45 phuùt, neáu khoâng sau ñoù teá baøo seõ cheát vì thieáu timin. Ñaây laø quaù trình khoâng thuaän nghòch, khoâng theå loaïi boû baèng caùch theâm ñaày ñuû timin. Phöông phaùp choïn loïc cô hoïc xuaát phaùt töø thöïc teá caùc teá baøo caù theå vaøo thôøi kyø tröôùc khi phaân chia ñeàu taêng theå tích. Trong moät quaàn theå vi khuaån sinh tröôûng döôùi nhöõng ñieàu kieän bình thöôøng, nhöõng teá baøo nhoû nhaát chính laø nhöõng teá baøo vöøa phaân chia xong. Neáu choïn loïc rieâng nhöõng teá baøo naøy ta seõ thu ñöôïc caùc vi khuaån maø sau khi nuoâi caáy tieáp seõ phaân chia ñoàng boä. Ngöôøi ta ñaõ duøng caùc maøng loïc coù kích thöôùc loã töông öùng vôùi caùc vi khuaån nhoû nhaát, keát quaû cho khaù toát. Ngoaøi ra cuõng coù theå choïn loïc baèng caùch ly taâm caùc teá baøo. YÙ nghóa cuûa vieäc laøm ñoàng boä söï phaân chia teá baøo laø ôû choã noù cho ta khaû naêng nghieân cöùu moät quaàn theå teá baøo ñoàng nhaát, nghóa laø trong ñoù caùc ñaëc tính hình thaùi vaø sinh lyù cuûa moät teá baøo töông öùng vôùi cuûa caû quaàn theå. Nhôø ñoù ta coù theå chöùng minh ñöôïc raèng caùc thaønh phaàn cuûa teá baøo vi khuaån khoâng ñöôïc toång hôïp vôùi toác ñoä nhö nhau vaøo thôøi gian giöõa hai laàn phaân chia. Chaúng haïn, trong quaù trình phaân chia teá baøo Azotobacter vinelandii ngöøng toång hôïp DNA nhöng taêng cöôøng toång hôïp caùc acid amin töï do. Traùi laïi, haøm löôïng RNA vaø protein taêng nhö nhau trong pha naøy. 3.5. Caùc phöông phaùp xaùc ñònh sinh tröôûng vaø phaùt trieån cuûa vi khuaån Soá löôïng teá baøo vaø sinh khoái maëc duø coù moái lieân heä theo tyû leä thuaän y = kx nhöng moái lieân heä naøy chæ ñuùng trong ñieàu kieän thí nghieäm raát haïn cheá, khoâng coù yù nghóa phoå bieán. Ñieàu naøy chính laø do kích thöôùc vaø khoái löôïng cuûa töøng vi khuaån thay ñoåi tuyø theo loaøi vaø chuûng, trong quaù trình sinh tröôûng thì phuï thuoäc vaøo thôøi gian (ôû caùc pha cuûa ñöôøng cong sinh tröôûng), vaøo toác ñoä sinh tröôûng, thaønh phaàn moâi tröôøng nuoâi caáy vaø vaøo ñieàu kieän nuoâi caáy. Vì vaäy trong vieäc theo doõi sinh tröôûng vaø phaùt trieån cuûa vi khuaån caàn phaân bieät caùc phöông phaùp xaùc ñònh soá löôïng teá baøo vaø sinh khoái. 3.5.1. Caùc phöông phaùp xaùc ñònh soá löôïng teá baøo Trong moät quaàn theå vi khuaån khoâng phaûi moïi teá baøo ñeàu coù khaû naêng soáng. Nhöõng vi khuaån goïi laø soáng phaûi taïo thaønh khuaån laïc treân (hoaëc trong) moâi tröôøng thaïch vaø phaùt trieån trong moâi tröôøng dòch theå. Do ñoù tuyø theo muïc ñích thí nghieäm ta coù theå xaùc ñònh soá löôïng teá baøo toång coäng (caû teá baøo soáng vaø cheát) hoaëc soá löôïng teá baøo soáng. Ñeå xaùc ñònh soá löôïng teá baøo toång coäng ngöôøi ta thöôøng duøng phöông phaùp ñeám teá baøo tröïc tieáp döôùi kính hieån vi nhôø caùc “phoøng ñeám” (phoøng ñeám Neubauer, Thom hoaëc Petrof - Hauser). Neáu chieàu daøy cuûa lôùp dòch chöùa vi khuaån laø 0,02mm vaø caïnh hình vuoâng laø 0,05mm (theå tích 5.10-8cm3) thì muoán xaùc ñònh soá löôïng teá baøo trong 1ml phaûi nhaân soá tìm thaáy vôùi 2.107. Caàn chuù yù laø sau khi teá baøo vaøo “phoøng ñeám” phaûi ñôïi moät thôøi gian ñeå vi khuaån laéng vaø naèm trong moät maët phaúng quang hoïc. Neáu teá baøo chuyeån ñoäng tích cöïc phaûi duøng formaldehyde gieát cheát tröôùc. 29
35. Coù theå duøng kyõ thuaät nhuoäm ñaëc bieät ñeå phaân bieät teá baøo soáng vaø teá baøo cheát. Do teá baøo soáng coù maøng sinh chaát hoaït ñoäng, khoâng thaám thuoác nhuoäm neân hai loaïi teá baøo baét maøu khoâng gioáng nhau. Chaúng haïn ñoû congo chæ nhuoäm maøu teá baøo cheát coøn teá baøo soáng khoâng maøu. Tuy nhieân, keát quaû nhuoäm maøu phuï thuoäc vaøo nhieàu yeáu toá : loaøi vi khuaån, ñoä pha loaõng cuûa thuoác nhuoäm, pH Ví duï, caùc teá baøo soáng cuûa C. acetobutylicum baét maøu xanh vaø caùc teá baøo cheát baét maøu ñoû khi duøng Acridin orange vôùi noàng ñoä 1 : 10.000. Keát quaû seõ ngöôïc laïi neáu duøng Acridin orange 1 : 5.000. Trong tröôøng hôïp xaùc ñònh soá löôïng teá baøo soáng ngöôøi ta thöôøng ñeám soá khuaån laïc taïo thaønh bôûi caùc vi khuaån soáng trong ñieàu kieän sinh tröôûng thuaän lôïi. Dòch treo vi khuaån ñöôïc pha loaõng vaø moät theå tích nhaát ñònh ñöôïc ñöa leân moâi tröôøng thaïch trong hoäp petri. Sau khi nuoâi caáy ngöôøi ta ñeám soá khuaån laïc moïc leân. Neáu giaû duï raèng moãi teá baøo taïo thaønh moät khuaån laïc thì ñeám soá khuaån laïc ta seõ ñeám ñöôïc soá teá baøo soáng. Taát nhieân ñieàu naøy khoâng ñuùng ñoái vôùi caùc vi khuaån moïc thaønh chuoãi, thaønh ñoâi hay thaønh ñaùm hoaëc ñoái vôùi caùc dòch treo vi khuaån khoâng ñoàng nhaát. Ngoaøi ra cuõng caàn choïn ñoä pha loaõng vi khuaån thích hôïp sao cho soá khuaån laïc khoâng ít (keùm chính xaùc), khoâng nhieàu (khuaån laïc coù theå bò sít vaøo nhau vaø 2 teá baøo coù theå cho 1 khuaån laïc). Thöôøng treân moät hoäp thaïch soá khuaån laïc töø 40 - 400 laø thích hôïp. Soá khuaån laïc cuõng raát phuï thuoäc vaøo thaønh phaàn moâi tröôøng. Teá baøo moïc thaønh khuaån laïc treân moâi tröôøng naøy khoâng nhaát thieát cuõng cho xuaát hieän khuaån laïc treân moâi tröôøng khaùc. Vôùi moät soá loaïi vi khuaån khoù phaùt trieån treân moâi tröôøng thaïch ngöôøi ta coù theå kieån tra soá löôïng baèng phöông phaùp pha loaõng lieân tieáp sau ñoù caáy töø moãi ñoä pha loaõng 1ml vaøo töøng oáng ñöïng moâi tröôøng chæ thò (neáu coù 1 vi khuaån ñöa vaøo cuõng ñuû cho phaûn öùng döông tính sau khi nuoâi caáy). Phöông phaùp naøy goïi laø phöông phaùp soá löôïng coù khaû naêng nhaát (MPN, Most Probable Number). Coù theå caáy vaøo 5 oáng vaø laáy soá lieäu ôû 3 ñoä pha loaõng cuoái (coù phaûn öùng döông tính) roài tra baûng ñeå tìm ra soá löôïng gaàn ñuùng maät ñoä vi khuaån. Coøn coù theå loïc chaát dòch qua maøng loïc vi khuaån roài daët maøng loïc leân ñóa moâi tröôøng thaïch ñeå kieåm tra soá khuaån laïc seõ moïc vaø suy ra maät ñoä vi sinh vaät trong chaát dòch. 3.5.2. Caùc phöông phaùp xaùc ñònh sinh khoái teá baøo Vieäc choïn phöông phaùp ñeå xaùc ñònh sinh khoái vi khuaån tuyø thuoäc vaøo muïc ñòch nghieân cöùu. Chaúng haïn, muoán ñaùnh giaù saûn löôïng teá baøo thì ta caàn sinh khoái töôi hoaëc khoâ sau khi ñaõ ly taâm teá baøo; muoán xaùc ñònh cöôøng ñoä trao ñoåi chaát hay hoaït tính men, ngöôøi ta laïi tính haøm löôïng protein hoaëc nitrogen. Nhö vaäy, trong thöïc teá coù theå söû duïng caùc phöông phaùp tröïc tieáp hoaëc giaùn tieáp. Caùc phöông phaùp tröïc tieáp goàm coù : 1. Xaùc ñònh sinh khoái töôi hoaëc sinh khoái khoâ (phöông phaùp naøy keùm chính xaùc) 30
36. 2. Xaùc ñònh haøm löôïng nitrogen toång soá (phöông phaùp micro - Kjehdal) vaø phöông phaùp vi khuaån taùn xaùc ñònh NH3 hay haøm löôïng carbon toång soá (theo Van Slike- Folch). Caùc phöông phaùp naøy cho ñoä chính xaùc cao. 3. Trong thöïc teá haøng ngaøy ngöôøi ta thöôøng xaùc ñònh haøm löôïng protein cuûa vi khuaån. Coù theå duøng phöông phaùp biure caûi tieán hoaëc phöông phaùp so maøu khaùc. Caùc phöông phaùp vi löôïng döïa vaøo vieäc ño soá löôïng caùc thaønh phaàn ñaëc tröng cuûa protein nhö tirosine, triptophan (theo Lowry hoaëc Folin-Ciocalteu) cuõng cho keát quaû toát. Coù theå noùi xaùc ñònh haøm löôïng protein trong sinh khoái laø phöông phaùp thích hôïp nhaát vì moät maët protein laø thaønh phaàn chuû yeáu cuûa chaát khoâ, maët khaùc ñoù laø nhöõng thaønh phaàn hoaït ñoäng trong sinh khoái (haàu heát protein cuûa teá baøo laø enzyme) Caùc phöông phaùp giaùn tieáp ñeå ño sinh khoái vi khuaån: 1. Ño ñoä ñuïc cuûa dòch treo teá baøo. Ñaây laø phöông phaùp raát thuaän lôïi. Trong thöïc teá ta thöôøng ño maät ñoä quang hoïc cuûa dòch treo (dòch huyeàn phuø). Trong moät soá tröôøng hôïp ngöôøi ta cuõng xaùc ñònh söï khueách taùn aùnh saùng. Tuy nhieân söï phuï thuoäc theo ñöôøng thaúng giöõa hai chæ soá naøy vôùi sinh khoái vi khuaån chæ thaáy trong vuøng caùc giaù trò raát thaáp cuûa maät ñoä teá baøo. Vì söï khueách taùn aùnh saùng phuï thuoäc vaøo ñöôøng kính, hình daïng vaø chæ soá chieát quang cuûa caùc haït khueách taùn neân thænh thoaûng caàn kieåm tra laïi töông quan giöõa caùc ñaïi löôïng quang hoïc vaø caùc chæ soá ño nhö sinh khoái khoâ, haøm löôïng nitrogen hoaëc haøm löôïng carbon. Cuõng caàn chuù yù raèng ñoái vôùi khí cuøng moät sinh khoái vi khuaån trong dòch treo nhöng coù theå coù maät ñoä quang hoïc khaùc nhau. Chaúng haïn maät ñoä quang hoïc ñoái vôùi 1mg/ml chaát khoâ cuûa E.coli trong pha log laø 1,54 coøn trong pha oån ñònh laø 2,38. giaù trò cuûa maät ñoä quang hoïc (O.D)/mg chaát khoâ cuõng thay ñoåi theo toác ñoä sinh tröôûng . 2. Ño caùc chæ soá cöôøng ñoä trao ñoåi chaát nhö haáp thuï O2, taïo thaønh CO2 hay acid, vì caùc chæ soá naøy lieân quan tröïc tieáp vôùi sinh tröôûng. Dó nhieân ta chæ duøng caùc phöông phaùp naøy trong tröôøng hôïp khoâng söû duïng caùc phöông phaùp khaùc, ví duï khi maät ñoä sinh khoái raát nhoû. Ñeå ño caùc chæ soá noùi treân coù theå duøng caùc phöông phaùp chuaån ñoä, ñieän hoaù 3.6. Taùc duïng cuûa caùc yeáu toá beân ngoaøi leân sinh tröôûng vaø phaùt trieån cuûa vi khuaån Sinh tröôûng vaø trao ñoåi chaát cuûa vi khuaån lieân quan chaët cheõ vôùi caùc ñieàu kieän cuûa moâi tröôøng beân ngoaøi. Caùc ñieàu kieän naøy bao goàm haøng loaït caùc yeáu toá khaùc nhau taùc ñoäng qua laïi vôùi nhau. Ña soá caùc yeáu toá ñoù ñeàu coù moät ñaëc tính taùc duïng chung bieåu hieän ôû 3 ñieåm hoaït ñoäng : toái thieåu, toái thích vaø cöïc ñaïi. Vôùi taùc duïng toái thieåu cuûa yeáu toá moâi tröôøng vi khuaån baét ñaàu sinh tröôûng vaø môû ñaàu caùc quaù trình trao ñoåi chaát, vôùi taùc duïng toái thích vi khuaån sinh tröôûng, vôùi taùc duïng 31
37. cöïc ñaïi vaø bieåu hieän hoaït tính trao ñoåi chaát, trao ñoåi naêng löôïng lôùn nhaát, vôùi taùc duïng cöïc ñaïi vi khuaån ngöøng sinh tröôûng vaø thöôøng cheát. AÛnh höôûng cuûa caùc yeáu toá moâi tröôøng leân vi khuaån coù theå laø thuaän lôïi hoaëc baát lôïi. AÛnh höôûng baát lôïi seõ daãn ñeán taùc duïng öùc khuaån hoaëc dieät khuaån. Do taùc duïng öùc khuaån cuûa yeáu toá moâi tröôøng, teá baøo ngöøng phaân chia, neáu loaïi boû yeáu toá naøy khoûi moâi tröôøng vi khuaån laïi tieáp tuïc sinh tröôûng vaø phaùt trieån. Khi coù maët chaát dieät khuaån, traùi laïi vi khuaån ngöøng sinh tröôûng, phaùt trieån vaø cheát nhanh choùng. Söï cheát cuûa teá baøo thöôøng khoâng xaûy ra ngay moät luùc trong caû quaàn theå maø dieãn ra daàn daàn, coù theå bieåu dieãn baèng ñöôøng cong töû vong logarit. Moät soá yeáu toá, chuû yeáu laø caùc hoaù chaát coù theå hieän taùc duïng öùc khuaån hoaëc dieät khuaån tuyø noàng ñoä. Taùc duïng khaùng khuaån cuûa caùc yeáu toá beân ngoaøi chòu aûnh höôûng cuûa moät soá ñieàu kieän nhö tính chaát vaø cöôøng ñoä taùc duïng cuûa baûn thaân yeáu toá, ñaëc tính cuûa cô theå vaø tính chaát cuûa moâi tröôøng. 3.6.1. Cô cheá taùc duïng cuûa caùc yeáu toá beân ngoaøi leân vi khuaån Caùc yeáu toá cuûa moâi tröôøng beân ngoaøi taùc duïng leân teá baøo vi khuaån thuoäc 3 loaïi : yeáu toá vaät lyù (ñoä aåm, nhieät ñoä ), yeáu toá hoaù hoïc (pH moâi tröôøng, theá oxy hoaù khöû ) vaø yeáu toá sinh hoïc (chaát khaùng sinh). Duø laø yeáu toá naøo nhöng khi ñaõ taùc duïng baát lôïi leân teá baøo thì thöôøng tröôùc heát gaây toån haïi ñeán caùc caáu truùc quan troïng cho söï soáng cuûa teá baøo Nhöõng toån haïi ñoù daãn ñeán phaù huyû chöùc phaân hoaït ñoäng cuûa caùc caáu truùc vaø laøm teá baøo cheát Taùc duïng coù haïi cuûa caùc yeáu toá beân ngoaøi teá baøo vi khuaån theå hieän chuû yeáu ôû nhöõng bieán ñoåi sau : 3.6.1.1. Phaù huyû thaønh teá baøo. Moät soá chaát nhö lisozyme (chöùa trong laù laùch, baïch caàu, loøng traéng tröùng, ) coù khaû naêng phaân huyû thaønh teá baøo vi khuaån daãn ñeán taïo thaønh caùc nguyeân laïp chuû yeáu ôû vi khuaån G+ vaø caùc caàu laïp ôû vi khuaån G- Trong söï coù maët cuûa penicillin, caùc caàu laïp ñöôïc hình thaønh vaø deã phaân huyû. ÔÛ vi khuaån G-, do taùc duïng cuûa chaát khaùng sinh naøy, teá baøo taïo thaønh caùc daïng hình caàu maãn caûm vôùi aùp suaát thaåm thaáu töông töï vôùi caùc daïng L cuûa vi khuaån. 3.6.1.2. Bieán ñoåi tính thaám cuûa maøng teá baøo chaát Moät soá chaát khoâng nhaát thieát phaûi xaâm nhaäp teá baøo nhöng vaãn gaây taùc duïng khaùng khuaån. Do taùc duïng leân moät hoaëc moät soá chöùc naêng sinh lyù cuûa maøng teá baøo chaát naøy laøm vi khuaån maát khaû naêng sinh saûn. Taùc duïng khaùng khuaån cuûa caùc chaát oxy hoaù vaø caùc chaát khöû (H2O2, caùc halogien ) laø do aûnh höôûng cuûa chuùng leân caùc thaønh phaàn cuûa maøng teá baøo chaát. Cuõng coù theå xeáp vaøo nhoùm caùc hôïp chaát naøy, caùc röôïu, phenol, caùc chaát taåy röûa toång hôïp vaø moät soá khaùng sinh. 32
38. 3.6.1.3. Thay ñoåi ñaëc tính keo cuûa nguyeân sinh chaát Caùc yeáu toá vaät lyù cuõng nhö hoaù hoïc ñeàu coù theå gaây neân taùc duïng naøy. Chaúng haïn, nhieät ñoä cao laøm bieán tính protein vaø laøm chuùng ñoâng tuï. 3.6.1.4. Kìm haõm hoaït tính Moät soá chaát taùc ñoäng vaøo caùc heä thoáng sinh naêng löôïng cuûa teá baøo, cyanide kìm haõm enzyme cytochrome - oxydase, fluoride ngaên caûn quaù trình ñöôøng phaân. Caùc chaát oxy hoaù maïnh (H2O2, caùc halogien) phaù huyû caùc heä thoáng teá baøo laøm toån haïi ñeán chöùc naêng trao ñoåi chaát 3.6.1.5. Huyû hoaïi caùc quaù trình toång hôïp Trong söï coù maët cuûa moät soá chaát töông töï veà maët caáu truùc vôùi caùc chaát trao ñoåi töï nhieân, goïi laø chaát antimetabolite quaù trình sinh toång hôïp coù theå bò öùc cheá. Cô cheá taùc duïng cuûa caùc chaát antimetabolieâ khoâng gioáng nhau. Moät soá gaén vôùi trung taâm hoaït ñoäng cuûa enzyme nhöng khoâng tham gia vaøo phaûn öùng khieán enzyme maát hoaït tính phaân huyû cô chaát; moät soá khaùc coù theå tham gia vaøo phaûn öùng enzyme vaø ñöôïc laép vaøo saûn phaåm cuûa phaûn öùng nhöng sau ñoù khoâng ñöôïc söû duïng trong trao ñoåi chaát vôùi cuøng möùc ñoä nhö trong tröôøng hôïp cuûa cô chaát thöïc. 3.6.2. Caùc yeáu toá vaät lyù 3.6.2.1. Ñoä aåm Haàu heát caùc quaù trình soáng cuûa vi khuaån coù lieân quan ñeán moâi tröôøng nöôùc do ñoù ñoä aåm laø moät yeáu toá quan troïng cuûa moâi tröôøng. Ña soá vi khuaån thuoäc caùc sinh vaät öa nöôùc nghóa laø chuùng caàn nöôùc ôû daïng töï do, deã haáp thuï. Chæ moät soá xaï khuaån coù theå xeáp vaøo boïn öa khoâ vì chuùng söû duïng ñöôïc caû nöôùc hydroscopic gaén treân beà maët caùc haït ñaát ôû daïng caùc phaân töû. Khi thieáu nöôùc seõ xaûy ra hieän töôïng loaïi nöôùc khoûi teá baøo vi khuaån, trao ñoåi chaát bò giaûm vaø teá baøo cheát. So vôùi teá baøo dinh döôõng, caùc baøo töû chòu ñöïng ñöôïc khoâ haïn hôn raát nhieàu. Neáu laøm laïnh teá baøo ñoàng thôøi laøm khoâ trong chaân khoâng ta coù theå baûo quaûn ñöôïc söùc soáng cuûa teá baøo trong moät thôøi gian daøi. Ñaây laø nguyeân taéc cuûa phöông phaùp laøm ñoâng khoâ vi khuaån. 3.6.2.2. Nhieät ñoä Hoaït ñoäng trao ñoåi chaát cuûa vi khuaån coù theå coi laø keát quaû cuûa caùc phaûn öùng hoaù hoïc. Vì caùc phaûn öùng naøy phuï thuoäc chaët cheõ vaøo nhieät ñoä neân yeáu toá nhieät ñoä roõ raøng aûnh höôûng saâu saéc ñeán caùc quaù trình soáng cuûa teá baøo. Teá baøo thu ñöôïc nhieät chuû yeáu töø moâi tröôøng beân ngoaøi, moät phaàn cuõng do cô theå thaûi ra do keát quaû cuûa hoaït ñoäng trao ñoåi chaát. Hoaït ñoäng cuûa vi sinh vaät giôùi haïn trong moâi tröôøng chöùa nöôùc coù theå haáp thuï. Vuøng naøy cuûa nöôùc naèm töø 20 ñeán khoaûng 1000 goïi laø vuøng sinh ñoäng hoïc. Haàu heát teá baøo sinh döôõng cuûa vi sinh vaät bò cheát ôû nhieät ñoä cao protein bò bieán tính, moät hoaëc haøng loaït enzyme bò baát hoaït. Caùc enzyme hoâ haáp ñaëc bieät laø caùc enzyme trong chu trình Krebs raát maãn caûm vôùi nhieät ñoä. Söï cheát cuûa vi khuaån ôû nhieät ñoä cao cuõng coù theå coøn laø haäu quaû cuûa söï baát hoaït hoaù RNA vaø söï phaù hoaïi maøng teá baøo chaát. 33