›
›

Bài giảng Sinh học phân tử - Nguyễn Khánh Linh

pdf 188 trang phuongnguyen 30
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Bài giảng Sinh học phân tử - Nguyễn Khánh Linh", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfbai_giang_sinh_hoc_phan_tu_nguyen_khanh_linh.pdf

Nội dung text: Bài giảng Sinh học phân tử - Nguyễn Khánh Linh

  1. BAØI GIAÛNG THS NGUYEÃN KHAÙNH LINH
  2. CHÖÔNG 1
  3. A. Acid deoxyribonucleic I. Caáu truùc DNA 1. Caáu taïo vaø caáu truùc DNA a. Caáu taïo - Moãi nucleotide goàm 1 base nitô ( purin A,G hay pirimidin T, & ÓØÖÚQJGHR[\ULERVH NKRÄQJFRÛQKRÛP2+ÖÝt-carbon nhö ñöôøng ribose) + goác phosphat - 4 nucleotide: dATP (deoxyadenosine-triphosphat), dGTP (deoxyguanosine-triphosphat), dCTP (deoxycytidine- triphosphat), dTTP (deoxythymidine-triphosphat)
  4. - Phaân bieät nucleoside -&RÛKØÖÛQJtx t
  5. - Caùc base nitô 2 hai maïch lieân keát hydro (A=T, G=C)
  6. b. Caáu truùc xoaén keùp - Moät voøng xoaén keùp daøi = 3.4nm, khoaûng 10.4 bp thay ñoåi - Ñöôøng kính voøng xoaén=2nm (2 pirimidin: lôùn, 2 purin: maát oån ñònh chuoãi xoaén keùp) - Khoaûng caùch giöõa 2 caëp base lieân tieáp= 0.34nm
  7. „ 1953, James Watson vaø Francis Crick ñaõ ñöa ra moâ hình xoaén keùp cuûa DNA „ Vì moãi caëp base ñöôïc ñònh vò ôû 1 goùc treân truïc xoaén helix neân nhìn toång theå moâ hình DNA nhö moät caàu thang xoaén oác „ Doïc theo phaân töû DNA, coù 2 raõnh. Raõnh lôùn roäng vaø saâu, raõnh nhoû noâng vaø caïn (laø nôi protein seõ töông taùc vôùi caùc base)
  8. „ Caùc loaïi lieân keát khoâng hoùa trò goùp phaàn taïo tính oån ñònh cuûa chuoãi xoaén keùp DNA: Töông taùc kî nöôùc Lieân keát hydro Lieân keát Van der waal Töông taùc tónh ñieän: beà maët beân ngoaøi cuûa DNA ( do khung ñöôøng x phosphat) coù nhoùm phosphat tích ñieän DÄP/ØÑFòҭy giöõa caùc nhoùm phosphat keá caän seõ ñöôïc haïn cheá nhôø pt hoaù trò 2 nhö Mg2+ vaø histon, giuùp oån ñònh DNA
  9. 2.Caáu truùc sieâu xoaén „ Xoaén aâm: xoaén phaûi, DNA xoaén leân chính noù „ Xoaén döông: xoaén traùi, thöôøng gaëp khi DNA xoaén laáy protein „ Kieåm soaùt sieâu xoaén: enzyme topoisomerase ( I, II) „ Ñoái vôùi maïch DNA voøng: khi sao cheùp, enzyme topoisomerase (Enzyme gyrase ôû E.coli) seõ caét maïch
  10. II. Nhieãm saéc theå vaø nhieãm saéc chaát 1.Prokaryote „ Ví duï ôû E.coli: DNA keùp taïo caáu truùc maïch voøng, 4.6Mb (106base), 4300 gen, 9 trieäu nucleotide „ NST maïch voøng vi khuaån ñöôïc neùn chaët taïo caáu truùc coù kích thöôùc 1Pmx2Pm „ NST E.coli ôû daïng sieâu xoaén, gaén keát vôùi protein loõi, naèm töï do trong teá baøo chaát, goïi chung laø nucleoid „ Ñoä neùn: do HU (40 vò trí gaén), caùc polyamine ( polycationic pt nhö spermidine, spermine)
  11. 2. Eukaryote * DNA ñôn maïch thaúng, lk protein histon, protein phi histon, RNA vaø polyamine * Protein histon chia thaønh 5 lôùp: H1, H2A, H2B, H3, H4 * Nucleosome: 2 baûn sao cuûa H2A, H2B, H3, H4, 140bp, DNA linker ( 60bp), 1 pt H1
  12. „ Caùc nucleosome quaán thaønh ñoaïn ñöôøng kính 30nm( 30nm solenoid), 200nm „ Ñoaïn naøy bao goàm nhieàu loop (ñoaïn 30nm) quaán quanh 1 phöùc protein loõi nuclear scaffold
  13. „ Moãi NST ñeàu coù centromer (vuøng giaøu AT, lk protein khoâng histon ñeå taïo thaønh kinetochore noái vôùi thoi voâ saéc) vaø telomere ( giaøu CCCA, caûn vieäc maát thoâng tin di truyeàn trong quaù trình sao cheùp) „ Khi khoâng phaân chia teá baøo, NST ôû daïng nôùi loûng chromatin. ÔÛ daïng loûng, quan saùt vi aûnh ñieän töû thaáy coù nhöõng chaám nucleosome „ Phaân bieät: * Heterochromatin: khoâng ñöôïc phieân maõ. * Euchromatin: seõ neùn chaët ôû metaphase, chöùa phaàn lôùn thoâng tin di truyeàn „ ÔÛ Eukaryote, ti theå vaø luïc laïp ?
  14. II. Caáu truùc gen 1. Prokaryote „ Boä gen ñöôïc neùn, lieân tuïc, ít ñoaïn khoâng giaûi maõ, maïch voøng „ Quaù trình ñieàu hoøa caùc gen ñöôïc thöïc hieän nhôø coù caáu truùc operon ( goàm caùc gen lieân keát vôùi nhau, ñöôïc ñieàu hoøa chung nhö 1 ñôn vò) „ Prokaryote thöôøng coù theâm ñoaïn DNA nhoû, plasmid, thöôøng ôû daïng voøng, coù ôû vi khuaån vaø moät soá eukaryote
  15. 2. Eukaryote „ Khaùc bieät: veà kích thöôùc gen, khaû naêng giaûi maõ ít (khoâng quaù 1.5% ôû ngöôøi giaûi maõ protein; khoâng coù trình töï khôûi söï phieân maõ) „ Boä gen maïch thaúng „ Phöùc taïp, gen goàm intron ( taùch ra khoûi hnRNA ñeå taïo thaønh mRNA tröôûng thaønh), exon ( ñoaïn phieân maõ, ra nhaân, dòch maõ) „ Yù nghóa: vai troø tieán hoùa, lieân quan ñeán caùc domain ôû protein „ ÔÛ ngöôøi: 1.5% genome laø exon, 23.5% genome laø intron, tRNA gen, rRNA gen. Moãi boä 23 NST nhaän töø cha hay meï chöùa khoaûng 6.109 nucleotide hay 3.109 bp
  16. „ Caùc loaïi trình töï DNA: Hoï gen: caùc gen trong cuøng 1 hoï thöôøng giaûi maõ cho caùc protein coù cuøng chöùc naêng chuyeân bieät nhöng vaøo caùc thôøi ñieåm khaùc nhau trong quaù trình soáng, caùc protein ñoù ñgl isoform, ñöôïc phaân bieät baèng caùch theâm kí hieäu Latinh ôû sau teân protein nhö globin D, globin E Satelitte DNA:Coøn khoaûng 45% genome ôû Eukaryote chöa ñöôïc hieåu roõ, coù caùc trình töï DNA nhö nhau ñöôïc laäp ñi laäp laïi hôn 1trieäu laàn treân toaøn boä genome, thöôøng vaøi traêm caëp base, taäp trung ôû centromere Minisatelitte ( 25 caëp base) thöôøng ôû vuøng telomere; microsatellite ( <4bp): ñöôïc duøng laøm daáu hieäu chaån ñoaùn beänh di truyeàn vì chuùng thay ñoåi tuyø loaøi sinh vaät Tandem DNA: laø caùc ñoaïn DNA (phieân maõ ra RNA) coù trình töï nhö nhau, laäp ñi laäp laïi treân cuøng moät NST, goàm rRNA gen (250baûn/tb), tRNA(50 baûn/tb), protein histon Transposon: laø nhöõng ñoaïn DNA coù theå taùch ra vaø cheøn vaøo baát kyø vò trí naøo treân toaøn boä genome
  17. Retrotransposon: qua baûn sao phieân maõ trung gian RNA Alu sequence ôû ngöôøi: 280bp, 500.000 copies
  18. B. Acid ribonucleic I. Caáu taïo „ Khaùc DNA: ñöôøng ribose, caùc base : A, U, G, C „ Maïch ñôn, polymere, coù höôùng, töï taïo caáu truùc baäc 2 „ t-OH cuûa ribose coù theå taïo lieân keát hydro vôùi phaân töû keá caän
  19. II.Phaân loaïi 1. Messenger RNA „ Mang thoâng tin töø DNA ñeå toång hôïp Protein „ Chieám khoaûng 5% toång soá RNA teá baøo, kích thöôùc thay ñoåi (E.coli: 500-6000 nucleotid)
  20. „ Cistron: laø trình töï DNA chöùa thoâng tin di truyeàn cho 1 chuoãi polypeptid vaø vaøi tín hieäu ñeå ribosome thöïc hieän chöùc naêng „ ÔÛ Prokaryote: Polycistronic, mRNA ñöôïc dòch maõ trong khi hay ngay sau khi keát thuùc phieân maõ „ ÔÛ Eukaryote: Monocistronic, mRNA chæ ñöôïc dòch maõ sau khi ñöôïc chænh söûa (caét xeùn, gaén ñuoâi poly-A, gaén FDSPHW\OÖÝÓDÂXt
  21. 2. Transfer RNA „ 15% RNA teá baøo, trung bình 75 nucleotide „ Caáu truùc baäc 3 nhö cloverleaf ( coû 3 laù) „ ³DÂXtOLHÄQNHÃW&+7YÖÛLDDDQWLFRGRQORRSYÖÛLFRGRQ „ D loop (dihydrouridin), T<C loop (thymine, pseudouridin, cytosine), variable loop : vtroø? „ Variable loop: ñeå phaân loaïi tRNA ( ña soá 80% chöùa 4-5 nucleotid, coøn laïi côõ 20 nucleotide)
  22. -Mang nhieàu loaïi base boå sung nhö pseudouridine, dihydrouridine. . . - Coù nhieàu loaïi, töông öùng vôùi caùc loaïi acid amin
  23. 3. Ribosome RNA „ Chieám ñeán 80% toång soá RNA cuûa teá baøo „ Veà trình töï nucleotid khaùc nhau tuøy loaøi nhöng caáu truùc 3 chieàu haàu nhö baûo toàn „ Thaønh phaàn taïo neân ribosome
  24. 4. Heterogeneous nuclear RNA (hnRNA) „ Laø baûn phieân maõ ñaàu tieân, laø tieàn thaân cuûa mRNA 5. Small nuclear RNA (snRNA) „ 90-300 nucleotid „ Keát hôïp vôùi protein taïo thaønh snRNP (small nuclear ribonucleoprotein particles), coù vai troø trong quaù trình chænh söûa RNA
  25. CHÖÔNG 2
  26. I. Cô sôû hoùa sinh cuûa quaù trình sao cheùp DNA Tröôùc khi phaân chia teá baøo, boä gen phaûi ñöôïc sao cheùp theo nguyeân taéc baùn baûo toàn semiconservation. Quaù trình naøy ñöôïc coâng boá ñaàu tieân vaøo naêm 1958 do Mathew Meselson vaø Franklin Stahl
  27. II. Quaù trình sao cheùp DNA ôû Prokaryote - 1 replicon - 1ori C, 1 ter
  28. U Khôûi ñaàu sao cheùp: xaûy ra ôû Ori C ƒDnaA + vuøng oriC (9bp) ƒDnaB + DnaC + oriC ƒDnaB tröôït thaùo xoaén, DnaA phoùng thích ra ngoaøi
  29. - Toång hôïp moài: Enzyme primase + protein primosome - Toång hôïp DNA: DNA polymerase III laø 1 holoenzyme, goàm toái thieåu 10 tieåu ñôn vò -'1$SRO\PHUDVH,FRÛYDLWURÚVØÝDVDL'1$ t-tH[RQXFOHDVH YDÚ loaïi boû phaàn moài RNA khi sao cheùp -DNA polymerase II coù vai troø chöa ñöôïc hieåu chính xaùc - Noái phaân ñoaïn DNA: enzyme ligase
  30. - &DÝORDÑL'1$SRO\PHUDVHt-tH[RQXFOHDVH - /RDÑL,WKHÄPt-tH[RQXFOHDVH
  31. Toác ñoä sao cheùp ôû E.coli laø 1000 bp/s/chæa 3 sao cheùp. Ñoä chính xaùc raát cao, chæ 1/109-1010bp ôû moãi theá heä .
  32. „Moät boä maùy replisome : 2 baûn DNA polymerase III ( dimer), 1 primosome vaø caùc protein thaùo xoaén Maïch chaäm taïo loop
  33. Hoaït ñoäng Topoisomerase I Vai troø thaùo xoaén lieân tuïc tröôùc sao cheùp „ Kieåm soaùt söï sieâu xoaén cuûa DNA: ÔÛ Prokaryote, topoisomerase II (DNA gyrase vai troø trong sao cheùp)
  34. III. Quaù trình sao cheùp DNA ôû Eukaryote Thôøi ñieåm sao cheùp: pha S
  35. - Toác ñoä sao cheùp: chaäm hôn, côõ 50 nucleotid/s ôû 1 chæa 3 sao cheùp - Replicon: Tuy chaäm nhöng quaù trình xaûy ra ngaén laø do coù caáu truùc replicon - Ñoaïn okazaki: töø 100-200 nucleotid
  36. Coù 5 loaïi DNA polymerase - D ( khôûi ñaàu sao cheùp caû maïch tôùi vaø maïch chaäm) - E ( coù vai troø söûa sai) - G ( = DNA polymerase III x keùo daøi maïch sau ñoù, khoâng dimer, keát hôïp vôùi PCNA x proliferating cell nuclear antigen) - H YDLWURÚH[RQXFOHDVHÓDÂXt-t - J (sao cheùp boä gen ti theå) Töông töï SSB laø RPA (replication protein A) Taùch moài RNA ra khoûi ñoaïn okazaki nhôø enzyme ribonuclease H Quaù trình sao cheùp DNA ôû luïc laïp ?
  37. Hoaït ñoäng cuûa Topoisomerase II: taùch 2 maïch ñaõ sao cheùp
  38. Vuøng Telomere - ¶½QJØÖÚLt77$ t FRSLHV
  39. Vaán ñeà gì xaûy ra ôû Telomere ?
  40. - 33EÎQKWKØÖÚQJÓDÂXtFKXRÅLPÖÛLVH×NKRÄQJÓØÖÑFKRDÚQWKDÚQK ngaén daàn sau moãi laàn sao cheùp 125 laàn sc maát Telomere Teá baøo sinh döôõng bình thöôøng chæ NP 1 soá laàn roài döøng haún. Ngoaïi tröø 1 soá loaïi tb ñaëc bieät Caàn Telomerase
  41. Hoaït ñoäng cuûa Telomerase „ Laø ribonucleoprotein, xuùc taùc toång hôïp DNA töø khung RNA „ Tp RNA (TERC- telomer RNA component) taïo khung AAUCCC ( ôû ngöôøi) ñeå taïo ñoaïn TTAGGG „ Tp protein ( TERT x telomere reverse transcriptase) xuùc taùc phaûn öùng
  42. „ Coù maët ôû ( baát töû do duy trì ñöôïc chieàu daøi Telomere): 9 Teá baøo maàm ôû phoâi, tröôûng thaønh ( germline) 9 Eukaryote ñôn baøo 9 Tb ung thö ( 85-90% tb toång hôïp löôïng telomerase cao) höôùng ñieàu trò Telomerase vaø Telomere: yeáu toá quyeát ñònh ñôøi soáng teá baøo
  43. IV. Söûa sai DNA Caùc loaïi toån thöông „ Maát purin: maát A hay G do lk giöõa base purin vaø ñöôøng bò nöôùc thuûy giaûi. Ñaây laø toån thöông xaûy ra nhieàu nhaát. „ Khöû amin: xaûy ra khoâng phoå bieán taùc ñoäng cuûa nöôùc leân lieân keát noái nhoùm amin vôùi cystosin seõ taïo thaønh uracil. Neáu khoâng söûa thì seõ thaønh lk AU trong laàn sao cheùp DNA tieáp theo. „ Taùc ñoäng tia töû ngoaïi hay taùc nhaân hoùa hoïc nhö benzopyren trong khoùi thuoác laù seõ gaây toån haïi DNA. Aûnh höôûng cuûa tia töû ngoaïi seõ laøm 2 thymine keá caän noái laïi vôùi nhau taïo thaønh thymine dimer.
  44. Cѫ chӃ sӱa sai
  45. „ Caét DNA: coù 2 loaïi laø caét base vaø caét nucleotide „ Trình töï söûa sai: enzyme nhaän bieát choå sai, nôi toån thöông bò caét, toång hôïp laïi nucleotid ñuùng, enzyme noái laïi vuøng môùi ñöôïc chænh söûa „ Khi Cytosin bò thay theá bôûi Uracil, U seõ ñöôïc nhaän bieát vaø chænh söûa bôûi U-DNA-glycosidase. Enzyme naøy seõ taïo moät khoaûng troáng ôû DNA taïi vò trí base lk vôùi nhoùm deoxyribose. Enzyme AP endonuclease seõ nhaän bieát khoaûng troáng roài caét nhoùm ñöôøng nhôø phaù lk phosphodiester „ Khi DNA toån thöông do maát purin thì AP endonuclease cuõng caét nhoùm ñöôøng maø ñaõ maát ñi base purin. „ DNA polymerase I seõ toång hôïp nucleotid môùi vaø enzyme ligase noái laïi vôùi nhau
  46. CHÖÔNG 3
  47. I. Caùc yeáu toá quan troïng 1. RNA polymerase +ØÖÛQJSKLHÄQPD×tx t - Maõ di truyeàn ( maõ protein) - Maïch maõ ( coding strand)
  48. 3. Lieân keát DNA-protein Moái lieân keát beàn vöõng do töông taùc kî nöôùc, lk hydro, lk ion
  49. II. Quaù trình phieân maõ vaø ñieàu hoøa bieåu hieän gen ôû Prokaryote 1. Ñaëc ñieåm caáu taïo RNA polymerase w - Troïng löôïng phaân töû 450 kD w - 5 loaïi polypeptid: D, E, EtY, G (sigma) w -ÔÛ E.coli, coù nhieàu loaïi , G70 cho phaàn lôùn caùc gen, G32 cho gen soác nhieät, G28 cho gen taïo roi flagellin Holoenzyme
  50. 2. Cô cheá phieân maõ ôû E.coli ( taäp trung vaøo phieân maõ taïo mRNA vaø rRNA) - Caáu truùc Promotor ( 20-200 bp) coù 2 vuøng consensus sequence * vuøng -10 (thöôøng TATATT- Pribnow box) * vuøng -35( thöôøng TTGACA)
  51. * Quaù trình khôûi ñaàu
  52. w - RNA polymerase tröôït ñeán vuøng promotor - Ñoaïn ngaén DNA gaàn -10 ñöôïc thaùo xoaén ( vôùi söï hoå trôï cuûa vuøng pribnow vì giaøu AT neân chæ coù 2lk hydro), taïo thaønh phöcù hôïp môû. - Baét ñaàu phieân maõ ôû vò trí +1, khi ñöôïc 10 ribonucleotid thì G seõ bò phoùng thích, keát thuùc quaù trình khôûi ñaàu ( baét ñaàu baèng vieäc lk giöõa A hay G leân RNA polymerase, sau ñoù ribonucleotid khaùc seõ ñeán ñeå hình thaønh lk phosphodiester)
  53. * Quaù trình keùo daøi - Khi yeáu toá G taùch khoûi thì aùi löïc giöõa RNA polymerase vaø promotor bò giaûm, quaù trình keùo daøi baét ñaàu - Core enzyme trôû thaønh phöùc hôïp phieân maõ, theo höôùng t-t'1$SKÏDWUØÖÛFuWUDQVFULSWLRQEXEEOHv 7% EDËW ñaàu thaùo xoaén daàn. Boïng phieân maõ laø vuøng maø 2 maïch DNA thaùo xoaén taïm thôøi, coù keát hôïp giöõa DNA vaø RNA - Söï thaùo xoaén cuûa RNA polymerase laøm cho vuøng tröôùc TB laø xoaén döông, coøn sau TB laø xoaén aâm. Vì vaäy phaûi caàn coù topoisomerase - Tieåu ñôn vò E gaén leân caùc ribonucleotid, vai troø xuùc taùc taïo lk phosphodiester khi tröôït treân khuoân DNA - Tieåu ñôn vò EtJLXÛSHQ]\PHJDËQFKDÍWOHÄQNKXRÄQ'1$ - Hai tieåu ñôn vò D giuùp toå hôïp enzyme gaén leân promotor ôû giai ñoaïn ñaàu
  54. w* Quaù trình keát thuùc -RNA polymerase seõ ngöøng phieân maõ khi gaëp trình töï keát thuùc ( laø trình töï coù 2 vuøng giaøu G, C, caùch nhau moät ñoaïn khoҧng 10 bp), theo sau laø moät ñoaïn giaøu A -Khi ñoaïn naøy ñöôïc phieân maõ, thì ôû RNA seõ taïo thaønh caáu truùc keïp toùc giöõa 2 vuøng naøy vôùi nhau -Caáu truùc naøy laøm cho phöùc hôïp RNA polymerase chaäm vaø döøng haún
  55. -Ñoàng thôøi, lk giöõa A vaø U treân RNA raát loûng leûo, quaù yeáu ñeå duy trì TB, neân caû RNA seõ phoùng thích ra ngoaøi, keát thuùc phieân maõ, caáu truùc xoaén keùp DNA hình thaønh trôû laïi Hình thöùc keát thuùc khoâng phuï thuoäc vaøo yeáu toá rho. -Vaøi gen ôû E.coli coù vuøng keát thuùc khaùc, ñöôïc nhaän bieát baèng protein rho, laøm giaûi phoùng phöùc hôïp RNA-DNA ( laø enzyme xuùc taùc thaùo xoaén giöõa RNA vaø DNA, caàn coù ATP hoå trôï), noù gaén leân RNA, khoâng phaûi RNA polymerase Hình thöùc keát thuùc phuï thuoäc yeáu toá rho.
  56. -mRNA laø polycistronic
  57. - Chaúng haïn operon chöùa nhieàu gen rRNA polycistronic daøi, ñöôïc metyl hoùa Rnase caét rRNA tröôûng thaønh 16S, 23S, 5S, moät vaøi tRNA
  58. 3. Cô cheá ñieàu hoøa bieåu hieän gen a. Operon caûm öùng Lactose -Vuøng kieåm soaùt goàm promotor, CAP site, operator - Goàm 3 gen caáu truùc Z ( E-galactosidase x xuùc taùc thuûy giaûi lactose taïo ñöôøng ñôn laø galactose vaø glucose), Y(lactose permease x laø chaát mang chuyeån lactose vaøo trong tb), A (thiogalactoside transacetylase)
  59. Gen i repressor gaén leân operator Allolactose + repressor taùch repressor ra operator khôûi ñoäng phieân maõ
  60. - Operon lac coøn ñöôïc kieåm soaùt bôûi protein CAP -( catabolite activator protein)
  61. -Glucose laø nguoàn carbon öa chuoäng ñoái vôùi E.coli -Caùc enzyme cuûa operon lac chæ ñöôïc caûm öùng phieân maõ vôùi toác ñoä nhanh khi khoâng coøn glucose. Cô cheá naøy ñöôïc ñieàu hoøa bôûi 1 phaân töû truyeàn tin noäi baøo goïi laø cAMP (cyclic adenosine monophosphat) -Khi noàng ñoä glucose giaûm, noàng ñoä cAMP taêng cAMP keát hôïp CAP, phöùc hôïp naøy gaén leân vuøng CAP site quaù trình phieân maõ xaûy ra caøng hieäu quaû Ñaây laø cô cheá ñieàu hoøa döông do phöùc hôïp CAP- cAMP
  62. b. Operon kìm haõm Tryptophan
  63. ƒ Gen Tryp R giaûi maõ cho protein kìm haõm ôû daïng baát hoaït gl aporepressor. Khi tryp gaén leân pro naøy thì môùi trôû thaønh daïng hoaït ñoäng gl corepressor ƒ Phöùc hôïp naøy gaén leân vuøng operator cuûa operon, ngaên caûn khoâng cho RNA polymerase gaén leân vuøng promotor khôûi ñoäng phieân maõ ƒ Khi löôïng tryptophan trong teá baøo giaûm, phöùc hôïp treân khoâng ñöôïc hình thaønh neân seõ phieân maõ seõ ñöôïc xuùc tieán, keát quaû taïo ra caùc enzyme toång hôïp tryptophan Ñaây laø daïng ñieàu hoøa feedback aâm
  64. III. Quaù trình phieân maõ vaø ñieàu hoøa bieåu hieän gen ôû Eukaryote 1. Ñaëc ñieåm vaø caáu taïo RNA polymerase - Coù 3 loaïi RNA polymerase: 9RNA polymerase I ôû haïch nhaân ( rRNA) 9RNA polymerase II taïo mRNA vaø snRNA 9RNA polymerase III taïo tRNA vaø 5S rRNA - Coù söï keát hôïp vôùi nhieàu yeáu toá khaùc nhö TBP, TFIIF, . . .
  65. 2.Cô cheá phieân maõ ( chuû yeáu taïo mRNA) vaø quaù trình chænh söûa sau phieân maõ Promotor 9Lôùn vaø phöùc taïp 9Promotor cuûa RNA polymerase II coù trình töï consensus, gl TATA box ( -25 ñeán -30) 9Coù nhöõng gen khoâng coù TATA box, nhöõng gen naøy maõ hoùa cho caùc protein caàn thieát ôû moïi teá baøo ñgl housekeeping gen. Promotor cuûa nhöõng gen naøy gl GC box 9Hoaït ñoäng cuûa nhieàu promotor coøn bò aûnh höôûng bôûi trình töï enhancer x khi ñöôïc moät protein ñeán keát hôïp (transcription factor)
  66. Cheá bieán sau phieân maõ - *DËQtFDS
  67. -Gaén ñuoâi poly-A -Splicing - Caét choïn loïc
  68. 3. Cô cheá ñieàu hoøa bieåu hieän gen „ Moät trong nhöõng yeáu toá ñieàu hoøa bieåu hieän gen laø qt methy KRÛD'1$ ÖÝF\WRVLQÖÝYXÚQJt-CG-tODÚPQJØQJSKLHÄQPD×  vaø acetyl hoùa histon ( gaén acetyl vaø chuoãi nhaùnh cuûa lysin ôû histon H3, H4 laøm aùi löïc giöõa histon vaø DNA giaûm, vì vaäy kích hoaït phieân maõ) „ Euchromatin laø chromatin ít neùn, thaáy ôû kyø interphase, laø vuøng seõ ñöôïc phieân maõ. Tuy nhieân, ôû 1 soá tb thì 1 phaàn euchromatin seõ neùn chaët hôn ( khoâng baèng heterochromatin), ñaây cuõng laø 1 cô cheá ñeå ñieàu tieát bieåu hieän 1 soá gen nhaát ñònh
  69. a. Ñieàu hoøa bieåu hieän gen ôû cô xöông
  70. b. Ñieàu hoøa bôûi glucocorticoid
  71. - Hai phöùc hôïp thuï quan gaén leân DNA nhö 1 dimer. Laø do enhancer HRE laø palindrome ( maïch treân, döôùi coù trình töï nhö QKDXNKLÓRÑFWØÚt- AGAACA -t x Moãi ñoaïn ôû 1 maïch gl motif, 2 motif caùch nhau khoҧng 3bp. Moãi phöùc hôïp thuï quan seõ ñeán gaén ôû 1 motif
  72. „ Nhöõng chaát hoùa hoïc tieát ra töø 1 teá baøo, laøm thay ñoåi caùch bieåu hieän ôû caùc tb khaùc thì ñgl transmitter x chaát truyeàn tin ( trong ñoù coù glucocorticoid). Caùc teá baøo ôû sv ña baøo khôûi ñoäng hay döøng phieân maõ khi coù daáu hieäu cuûa caùc chaát hoùa hoïc ngoaïi baøo. „ Khoâng nhö hormon steroid, coù nhöõng chaát truyeàn tin khoâng dc ñöôïc qua maøng teá baøo, vì vaäy chuùng phaûi kích hoaït heä thoáng truyeàn thoâng tin noäi baøo (intracellular messenger system) ñeå chuyeån chuùng töø maøng vaøo nhaân.
  73. CHÖÔNG 4
  74. I. Maõ di truyeàn - Vì coù 4 loaïi nucleotid neân seõ coù 43 = 64 codon, taïo thaønh boä maõ di truyeàn - Maõ di truyeàn treân mRNA seõ quy ñònh trình töï aa treân maïch polypeptid qua quaù trình dòch maõ. Codon do 4 loaïi A, U, G, C
  75. Vieäc xaùc ñònh boä 3 maõ hoùa cho 1 aa ñöôïc phaùt hieän vaøo naêm 1961 ƒMarshall Nirenberg vaø Heinrich Mathew thöïc hieän moät loaït caùc thí nghieäm söû duïng heä thoáng toång hôïp protein nhaân taïo chöùa dòch chieát E.coli ñaõ bò phaù vôõ tb ƒCaùc polymere RNA toång hôïp ñaõ bieát trình töï vaø 20 aa, ATP, GTP ñöôïc boå sung vaøo ƒKhi RNA laø poly U : saûn phaåm laø polyphenylalanin (UUU) ƒTöông töï poly A, sf laø polylysine ( AAA). Khung laø C, saûn phaåm laø polyproteinlin (CCC) ƒMaïch khung goàm CU laäp ñi laäp laïi : leucin (CUC)x serin(UCU) ƒTrong 64 codon, coù 61 codon maõ hoùa aa, 3 codon vai troø keát thuùc dòch maõ ( UAA, UAG, UGA) . Trong 61 codon, coù 1 codon (AUG) vöøa quy ñӏnh methionin, vöøa coù vai troø codon khôûi ñoäng dòch maõ
  76. Ñaëc tính cuûa maõ di truyeàn: „ Suy bieán nhöng raát roõ raøng Methionin vaø tryptophan laø 2 aa duy nhaát ñöôïc toång hôïp töø 1 codon Coøn 18 aa coøn laïi ñöôïc quy ñònh bôûi 2,3,4,6 codon. Vì vaäy codon coù tính suy bieán Khoâng coù codon naøo giaûi maõ cho hôn 1 aa, ñieàu QDÚ\WKHÇKLHÆQWÏQKFKDÃWuUR×UDÚQJvFXÝDFRGRQ
  77. „ Khoâng choàng laép, khoâng coù chaám keát thuùc 9 Trình töï codon treân mRNA ñöôïc ñoïc bôûi ribosome lieân tuïc töø codon khôûi ñaàu ñeán codon keát thuùc 9 Moät boä goàm caùc codon lieân tieáp treân mRNA ñöôïc goïi laø khung ñoïc reading frame
  78. 9Coù theå xaûy ra ñoät bieán leäch khung, ñoät bieán voâ nghóa, ñoät bieán coù nghóa (missen mutation)
  79. 9 Trình töï thöù 2 haàu nhö luoân ñoàng nhaát, oån ñònh nhaát ñoái vôùi cuøng 1 aa. Aa tích ñieän, coù chuoãi beân öa nöôùc (vò trí 2=purin, A hay G). Ví duï ôû vò trí thöù 6 ôû globin trong phaân töû hemoglobin, khi bò ñoát bieán ñoåi GAG sang GUG treâm mRNA (chuyeån töø glutamat sang valin), laøm thay ñoåi toaøn boä ñieän tích toång theå maïch chuoãi cuûa aa. Hұu quҧ „ Phoå quaùt 9 Codon coù tính phoå quaùt cho taát caû sinh vaät, töø E.coli cho ñeán con ngöôøi 9 Ngoaïi leä: UGA giaûi maõ tryptophan (ti theå); UAA, UAG giaûi maõ glutamine (1 soá ñoäng vaät ñôn baøo)
  80. II. Caùc yeáu toá quan troïng a. Ribosome - Vai troø: nôi toång hôïp protein - Ribosome coù vuøng gaén vaøo khung mRNA, vaø vuøng cho 2 tRNA tích ñieän. tRNA mang aa seõ ñeán vò trí A, coøn tRNA gaén vaøo chuoãi polypeptid ñang ñöôïc hình thaønh gaén ôû vò trí P
  81. „ Ribosome Prokaryote vaø Eukaryote: khaùc kích thöôùc vaø thaønh phaàn nhöng cuøng chöùc naêng vaø hình daïng ( 2 tieåu ñôn vò khaùc nhau, döïa treân S x ñôn vò laéng Svedberg) Vd: E.coli 70S = 30S ( 16S rRNA + 21 polypeptid) + 50S ( 5S rRNA + 23S rRNA + 34 polypeptid) Eukaryote 80S = 60S (5S, 5.8S, 28S rRNA + 49 polypeptid) + 40S ( 18S rRNA + 30 polypeptid)
  82. b. Töông taùc giöõa codon x anticodon „ tRNA laø maáu chuyeån tieáp ( adaptor) ñeå dòch maõ thoâng tin di truyeàn „ 0RÅLW51$PDQJDDFKX\HÄQELHÆWÖÝÓDÂXtYDÚ anticodon „ Naêm 1966, Crick ñaõ ñöa ra giaû thuyeát Wobble giaûi thích vì sao chæ coù ít tRNA caàn ñeå dòch maõ 61 codon, döïa vaøo caùc cô sôû sau:
  83. 9Thöôøng aa thay ñoåi boä 3 maõ hoùa ôû vò trí thöù 3 9Moái lieân keát giöõa 2 nucleotid ñaàu giöõa codon vaø anticodon xaûy ra nhö lyù thuyeát A=U, G=C 9Töông taùc ôû vò trí 3 khoâng nhö chuaån hoùa. Vì vaäy chæ caàn coù 1 tRNA cho 2 codon khaùc nhau 9Ngoaøi ra, tRNA anticodon ôû vò trí 3 ( vuøng wobble) coù nucleotid khaùc goïi laø nucleoside inosine (I)- coù base laø purin hypoxanthin, coù theå gaén vôùi U, C, A ôû codon
  84. 9Coù toái thieåu 31 tRNA khaùc nhau ñeå dòch maõ 61 codon thaønh 20 loaïi aa. Tính theâm tRNA khôûi ñaàu seõ laø 32 loaïi tRNA 9Boä gen ty theå ( 24 tRNA) vaø luïc laïp (30tRNA) ôû Eukaryote thì giaûi maõ tRNA ít hôn boä gen trong nhaân
  85. c. Quaù trình gaén acid amin vaøo tRNA töông öùng - Thöïc hieän bôûi enzyme aminoacyl tRNA synthase, enzyme naøy thöïc hieän 2 phaûn ØÛQJÓHÇJDËQDDYDÚRÓDÂXtFXÝDW51$WØÖQJ öùng:
  86. 9Aa ñöôïc noái vôùi AMP qua nhoùm carboxyl, taïo phöùc hôïp aminoacyl-AMP baèng caùch thuûy giaûi phoùng thích pyrophosphat
  87. 9 Chuyeån aa töø AMP sang tRNA, taïo lk ester giöõa QKRÛPFDUER[\OYDÚFDÝtYDÚt-OH cuûa nhoùm ñöôøng ôû A trong trình töï CCA ôû cuoái moãi tRNA ñeå taïo thaønh phöùc hôïp aminoacyl-W51$1KØQJFKÈFRÛt- aminoacyl ester môùi ñöôïc duøng trong dòch maõ. Böôùc naøy ñöôïc xem nhö böôùc hoaït hoùa aa vì naêng löôïng töø lieân keát phosphodiester naøy seõ ñöôïc duøng ñeå taïo lieân keát peptid sau ñoù 9 Pöù: Acid amin + ATP + tRNA Aminoacyl-tRNA + AMP + Pi
  88. -tRNA ñöôïc noái vôùi aa töông öùng: tRNA tích ñieän ( charged tRNA) - Coù ít nhaát 20 ezyme aminoacyl tRNA synthase, moãi enzyme thöïc hieän cho moãi aa vôùi tRNA töông öùng - Enzyme naøy coù khaû naêng nhaän bieát chính xaùc caáu truùc cuûa tRNA töông öùng ñeå dòch maõ. Ví duï giöõa valin vaø leucin vôùi aminoacyl-tRNA töông öùng. tRNA coù khaû naêng chænh söûa aa sai do vuøng proof reading
  89. II. Sinh toång hôïp protein ôû Prokaryote - Toác ñoä nhanh, moãi ribosome dòch maõ khoaûng 15-20aa/s - Lieân keát peptid ñöôïc hình thaønh taïi 1 vuøng chuyeân bieät ôû tieåu ñôn vò lôùn ribosome
  90. Khôûi ñaàu 9Hình thaønh phöùc hôïp khôûi ñoäng goàm ribosome, mRNA, tRNA 9IF1, IF3 + tieåu ñôn vò nhoû 30S. IF1 gaén leân vuøng A-site, choát vuøng naøy laïi trong suoát quaù trình khôûi ñoäng toaøn boä seõ gaén leân mRNA 9Trình töï ñeå ñònh vò mRNA gaén YDÚRULERVRPt- GGAGG-tQDÊPXSVWUHDPtFDÛFK codon AUG töø 8-13 nucleotid (Shine-Dalgarno ) 96KLQH'DOJDUQRONERÇVXQJYÖÛLt- CCUCC-tÖÝWLHÇXÓÖQYÔQKRÝ6 ÓDÂXt- 1 phaân töû 16S rRNA) tieåu ñôn vò nhoû ôû vò trí ñuùng ñeå dòch maõ
  91. 9Sau ñoù IF2 ( GTP) seõ ñeán phöùc hôïp tieåu ñôn vò nhoû, xuùc tieán vieäc gaén tRNA khôûi ñaàu vôùi codon töông öùng treân mRNA. tRNA khôûi ñaàu ôû Prokaryote laø formylmethionin-tRNA (fmet- W51$IPHW W51$QDÚ\FRÛDQWLFRGRQt- CAU-tW51$QDÚ\PDQJDDVH×JDËQÖÝ P-site ôû tieåu ñôn vò 30S 9Quaù trình khôûi ñaàu keát thuùc khi GTP ôû IF2 bò thuûy giaûi thaønh GDP vaø Pi, laøm tieåu ñôn vò lôùn ñeán gaén vaøo, sau ñoù taát caû IF seõ ñöôïc phoùng thích 9Nhö vaäy phöùc hôïp 70S ñaõ ñöôïc hình WKDÚQKFKXDÇQEÔGÔFKPD×WØÚÓDÂXt-t treân mRNA
  92. Keùo daøi 9Goàm 3 böôùc: ñònh vò aminoacyl-tRNA treân vuøng A- site, hình thaønh lieân keát peptid, chuyeån vò. Quaù trình naøy caàn coù caùc EF (elongation factor) 9Aminoacyl-tRNA thöù 2 ñeán vuøng A-site, E= peptidyl transferase xuùc taùc hình thaønh lieân keát peptid ( ôû phaàn 23S rRNA ôû tieåu ñôn vò lôùn ribosome) 9 Hai acid amin naøy seõ gaén leân tRNA ôû vuøng A-site( aminoacyl-tRNA gaén vôùi EF- tu vaø GTP). Khi gaén ñöôïc vaøo A-site, GTP seõ bò thuûy giaûi 9Sau ñoù, EF-ts taùch GDP ra khoûi EF-tu, khi GTP khaùc ñeán seõ taùch EF-tu ra khoûi phöùc hôïp
  93. 9tRNA ban ñaàu ôû P-site khoâng coøn aa, seõ bò phoùng thích ra ngoaøi vaø coù theå taùi söû duïng 9Ribosome di chuyeån doïc theo mRNA sang phaûi ñeå tRNA mang 2 peptid treân di chuyeån qua vuøng P-site, A- site seõ troáng ñeå aminoacyl- tRNA thöù 3 ñeán tieáp tuïc. Söï di chuyeån naøy goïi laø söï chuyeån vò (translocation), caàn coù EF-G-GTP 9Quaù trình keùo daøi keát thuùc khi codon keát thuùc vaøo vuøng A-site
  94. polysome
  95. Quaù trình phieân maõ x dòch maõ xaûy ra song song ôû Prokaryote ( aûnh chuïp döôùi kính hieån vi ñieän töû)
  96. Keát thuùc 9Quaù trình baét ñaàu khi codon keát thuùc ñeán vuøng A-site ( UAA, UAG, UGA) 9Khi ñoù thay vì vuøng naøy seõ gaén vôùi aa-tRNA töông öùng thì vuøng naøy seõ bò laáp bôûi RF (release factor) goàm RF-1, RF-2, RF-3. Khi ñoù chuoãi polypeptid seõ ñöôïc phoùng thích khoûi ribosome, coøn mRNA, tRNA, caùc tieåu ñôn vò cuõng ñöôïc giaûi phoùng 9 RF-1 phoùng thích polypeptid töø codon UAA, UAG; RF-2 cho codon UAA, UGA. RF-3 chöa bieát roõ, vai troø döôøng nhö hoå trôï 2 loaïi treân
  97. Chænh söûa sau dòch maõ ÔÛ Prokaryote, goàm caùc thay ñoåi nhö: 9Caét protein: loaïi boû formylmethionin, trình töï tín hieäu (thöôøng naèm gaàn aa cuoái cuøng, coù vai troø quyeát ñònh ñieåm ñeán cuûa protein) 9Methyl hoùa 9Phophoryl hoùa 9Noái vôùi moät soá nhoùm chöùc nhö: lipoprotein, glycoprotein. Cô cheá kieåm soaùt dòch maõ 9ÔÛ Prokaryote, cc kieåm soaùt dòch maõ xaûy ra ôû möùc ñoä phieân maõ 9Chính bieán theå cuûa trình töï Shine-Dalgarno giuùp laøm thay ñoåi toác ñoä dòch maõ ôû caùc gen khaùc nhau ( vd saûn phaåm thöù 3 trong operon lac chæ ñöôïc taïo thaønh khoaûng 1/5 so vôùi saûn phaåm thöù 1)
  98. IV. Sinh toång hôïp protein ôû Eukaryote 1. Moät soá ñieåm khaùc bieät quan troïng 9 Giai ñoaïn keùo daøi vaø keát thuùc khoâng khaùc bieät 9 Giai ñoaïn khôûi ñaàu phöùc taïp hôn. Aa khôûi ñaàu laø methionin, vôùi tRNA met töông öùng 9 Sau dòch maõ, methionin thöôøng bò loaïi boû 9 mRNA khoâng coù trình töï Shine-Dalgarno ñeå ribosome gaén vaøo 9 'RP51$ÖÝÓDÂXtFRÛJDËQFDS-methylguanosine neân seõ coù 1 soá protein gaén vaøo tieåu ñôn vò nhoû 40S ñeå gaén leân cap naøy. Khi gaén vaøo tieåu ñôn vò nhoû seõ tröôït doïc mRNA ñeå tìm codon AUG 9 Taát caû mRNA ôû Eukaryote ñeàu coù trình töï töông töï t-CCACC-tSKÏDWUØÖÛFÖÝNHÃEHÄQFRGRQ$8*  Kozak), giuùp ribosome bieát ñaõ ñeán codon khôûi ñaàu. Quaù trình naøy caàn toái thieåu 9 protein hoå trôï
  99. 2. Quaù trình cheá bieán protein sau dòch maõ ¾ Thuûy giaûi protein: laø thuûy giaûi caét lieân keát peptid nhôø protease. Laø quaù trình thöôøng xaûy ra ôû teá baøo Eukaryote. caét boû methionin ôû ñaàu N hay loaïi boû trình töï tín hieäu chuyeån protein tieàn chaát baát hoaït ( pro- protein) thaønh daïng hoaït ñoäng. ¾ Ñöôøng hoùa ôû löôùi noäi chaát: Ña soá protein Eukaryote ñeàu seõ bò ñöôøng hoùa, laø quaù trình gaén nhoùm saccharid vaøo protein, laø quaù trình chænh söûa ñoàng dòch maõ hay sau dòch maõ ôû Eukaryote Xaûy ra ôû protein tieát, protein baøo quan . . . ¾ Phosphoryl hoùa: giuùp töông taùc protein-protein
  100. ¾Hydroxyl hoùa: gaén -OH ¾Metyl hoùa: gaén -CH3 do methyltransferase xuùc taùc ¾Lieân keát lipid: Vieäc noái hoùa trò vôùi nhoùm lipid vôùi protein giuùp taêng khaû naêng gaén vaøo maøng teá baøo cuõng nhö töông taùc protein-protein ¾Taïo lieân keát disulfid: lieân keát disulfid thöôøng chæ thaáy ôû caùc protein tieát ( insulin) vaø 1 soá protein maøng). Lieân keát thöôøng ñöôïc taïo thaønh ôû moâi tröôøng khoâng khöû ¾Caét gheùp protein: xaûy ra sau dòch maõ. Keát quaû taïo ra ñoaïn intein khoâng hoaït ñoäng vaø extein hoaït ñoäng
  101. 3. Ñònh höôùng protein ™ Trình töï tín hieäu ( signal sequence): Vò trí: ñaàu N ñaàu C giöõa maïch polypeptid
  102. Ví duï: Söï vaän chuyeån protein qua RER: -Caàn SRP ( signal recognition particle) khi ñoaïn polypeptid ñuû daøi, côõ 70 aa Quaù trình naøy ñöôïc goïi laø chuyeån vò ñoàng dòch maõ.
  103. ™Ñoái vôùi tröôøng hôïp chuyeån vò sau dòch maõ polypeptid ñöôïc chuyeån qua maøng laø nhôø protein hsp70 coù gaén ATP. Sau ñoù, trình töï tín hieäu seõ ñöôïc caét bôûi enzyme signal peptidase.
  104. 4. Gaáp khuùc protein Chaperon: Hsp70 Chaperonin 9 Söï roái loaïn gaáp khuùc protein laø nguyeân nhaân cuûa 1 soá beänh ôû ngöôøi nhö Alzheimer (maát trí nhôù), Creutzfeld- Jacob (neurodegenerative disease) . . .
  105. 5. Cô cheá kieåm soaùt dòch maõ ôû Eukaryote 9 mRNA di chuyeån ra ngoaøi: phieân maõ vaø dòch maõ taùch bieät, giuùp coù thôøi gian ñieàu hoøa bieåu hieän gen. Söï di chuyeån qua loã maøng nhaân laø quaù trình caàn naêng löôïng, FDÂQFRÛPDÍWFXÝDtFDSYDÚtSRO\$- tail 9 Tính oån ñònh cuûa mRNA 9 Kieåm soaùt dòch maõ aâm: quaù trình dòch maõ ñoâi khi bò döøng laïi do coù 1 protein kìm haõm gaén leân trình töï gaàn ÓDÂXt9ÏGXÑSURWHLQIHUULWLQÓØÖÑFWRÇQJKÖÑSNKLQRÂQJ ñoä Fe teá baøo leân cao 9 Phosphoryl hoùa nhaân toá khôûi ñaàu eIF 9 Tröôït khung dòch maõ: thöôøng gaëp ôû teá baøo bò nhieãm retrovirus, keát quaû seõ taïo ra hôn 1 chuoãi polypeptid töø mRNA
  106. V.Aûnh höôûng cuûa thuoác khaùng sinh leân quaù trình sinh toång hôïp protein 9 Chloramphenicol: öùc cheá hoaït ñoäng peptidyl transferase 9 Tetracyclin: öùc cheá gaén aminoacyl-tRNA leân A-site 9 Streptomycin: öùc cheá hình thaønh phöùc hôïp 70S khôûi ñaàu do khoâng cho tRNAfmet gaén vaøo P-site 9 Puromycin: laøm phoùng thích sôùm chuoãi polypeptid, taùc ñoäng ôû Prokaryote vaø Eukaryote.
  107. CHÖÔNG 6
  108. I. Phöông thöùc vaän chuyeån protein noäi baøo Coù 3 caùch: 1. Vaän chuyeån coù coång kieåm soaùt (gated transport): - Protein gaáp khuùc ñeán caáu truùc cuoái cuøng - Di chuyeån ñeán ñieåm ñích Vd: Söï vaän chuyeån Protein vaøo nhaân 2. Chuyeån vò xuyeân maøng ( transmembrane translocation): - Protein khoâng gaáp khuùc hay gaáp khuùc 1 phaàn - Di chuyeån ñeán ñieåm ñích Vd: Söï vaän chuyeån Protein ñeán Peroxisome, luïc laïp, ti theå
  109. 3. Boïng vaän chuyeån( vesicle trafficking): - Protein ñöôïc goùi trong caùc boïng ( vesicle) - Di chuyeån ñeán ñieåm ñích Vd: söï vaän chuyeån Protein + Töø löôùi noäi chaát nhaùm ñeán Golgi ( maët cis) + Töø Golgi xuaát baøo, ñeán lysozome
  110. II. Vaän chuyeån töø nhaân vaø ñeán nhaân * Caáu taïo loå maøng nhaân
  111. * Kieåm soaùt vaän chuyeån ra vaøo nhaân: nhôø heä enzyme GTPase vaø chu kyø GDP/GTP cuûa noù Caàn effector protein : - GAP thuùc ñaåy GTPase thuûy giaûi GTP - GEF trao ñoåi GDP x GTP
  112. Vaän chuyeån ra vaøo nhaân nhôø GTPase coù teân goïi laø RAN - GEF vaø RAN-GTP: coù trong nhaân - GAP vaø RAN-GDP: coù trong teá baøo chaát
  113. Con ñöôøng vaän chuyeån protein vaøo nhaân:
  114. Con ñöôøng vaän chuyeån protein ra ngoaøi nhaân:
  115. III. Vaän chuyeån xuyeân maøng 1. Vaän chuyeån protein ñeán ti theå - Protein ti theå coù trình töï tín hieäu coù theå ôû ñaàu N ( bò caét) hay ôû giöõa ( seõ khoâng bò caét nhö Cyt c, a. . . )
  116. hsp70 70 Maøng ngoaøi 20 TOM 22 40 40 TIM 23 17 44 MPP Maøng trong hsp70 + Caùc protein giuùp chuyeån vò ôû maøng ngoaøi: TOM ( translocon of the outer mitochondrial membrane) + Caùc protein chuyeån vò maøng trong: TIM
  117. - Caùc beänh lieân quan ñeán roái loaïn protein ti theå: ñoät quî, Parkinson, thính giaùc keùm, tieåu ñöôøng. . . ( do roái loaïn ôû caû gen ti theå vaø gen boä nhaân)
  118. 2. Vaän chuyeån protein ñeán luïc laïp - Trình töï tín hieäu ôû ñaàu N ( 20 -120 trình töï) - Ví duï: moâ hình vaän chuyeån protein vaøo stroma luïc laïp
  119. hsp70 160 Maøng ngoaøi 34 TOC 75 75 hsp70 TIC 20 17 110 SPP Maøng trong hsp70 + Phöùc hôïp vaän chuyeån maøng ngoaøi: TOC ( translocon of the outer membrane of chloroplasts) + Phöùc hôïp vaän chuyeån maøng trong: TIC
  120. 3. Vaän chuyeån Protein ñeán Peroxisome - Peroxisome coù 1 lôùp maøng ñoâi phospholipid - laø 1 ngoaïi leä - Trình töï tín hieäu ( ôû ñaàu C hay N) seõ gaén vôùi 1 thuï quan ôû teá baøo chaát chuyeån vaøo trong peroxisome
  121. IV. Söï vaän chuyeån qua caùc boïng giöõa caùc khoang noäi baøo - Exocytotic pathway: töø löôùi noäi chaát, ñeán theå Golgi, ñeán maøng plasma, ñeán baøo quan - Endocytotic pathway: töø maøng plasma ñeán lysosome Ñaây laø con ñöôøng maø caùc ñaïi phaân töû ñöôïc haáp thuï vaø cheá bieán.
  122. 1. Quaù trình taùch maøng vaø hoøa maøng
  123. Boïng do lôùp aùo coatomer Ñaây laø cô cheá xaûy ra trong söï vaän chuyeån giöõa löôùi noäi chaát vaø theå Golgi, giöõa caùc choàng Golgi rieâng reû, trong vieäc naåy choài caùc boïng tieát töø maët trans cuûa Golgi.
  124. - Lôùp aùo naøy goàm 7 protein khaùc nhau keát hôïp thaønh 1 phöùc hôïp. Moâ hình hình thaønh lôùp aùo naøy ôû Golgi nhö sau:
  125. Aùo Coatomer - Caàn coù GTPase laø ARF ( coù GEF ôû maøng cho ñeå trao ñoåi GTP/GDP) - ARF-GTP gaén leân maøng cho - Protein Coatomer ñeán gaén leân phöùc hôïp - Laøm maøng taïo choài - Khi ñeán maøng ñích: GAP ôû maøng ñích thuûy giaûi GTP, giaûi phoùng ARF vaø Coatomer
  126. Boïng do aùo clathrin - Laø phöông thöùc vaän chuyeån Protein mang mannose x 6- phosphat töø trans-Golgi ñeán Lysosome
  127. - Protein thuï quan( xen maøng) + protein vaän chuyeån ( ôû mannose x 6- phosphat) - Protein trung gian ( adaptor) ñeán gaén vaøo - Clathrin ñeán gaén leân phöùc hôïp, laøm maøng naåy choài ( nhöng khoâng taùch ñöôïc) Caàn GTPase laø Dynamin ( coù gaén GTP). Söï thuûy giaûi GTP taïo löïc giuùp choài taùch ra ngoaøi. Khi ñoù clathrin phoùng thích ra khoûi phöùc hôïp, boïng chuaån bò hoøa vôùi maøng ñích
  128. ++ Quaù trình hoøa maøng 9Caàn protein SNARES treân caû maøng cho laãn maøng ñích 9Caàn GTPase-GTP ( GTPase thuoäc hoï RAB)
  129. 2. Trans-golgi vaø söï tieát protein + Protein töø Golgi ( maët trans): - tieát ra ngoaøi ( tieát caáu truùc hay tieát ñieàu hoøa) - ñeán lysosome + Söï khaùc bieät giöõa: - Tieát caáu truùc: Protein ñöôïc tieát ra khoûi teá baøo lieân tuïc, goïi laø xuaát baøo - Tieát ñieàu hoøa: Protein ñöôïc giöõ trong caùc boïng, tích luõy ôû teá baøo chaát Khi gaëp tín hieäu ( ion Calcium) tieát tích cöïc ra ngoaøi
  130. Vaán ñeà phaùt sinh veà kích thöôùc maøng tbc, protein xen maøng? 9Giaûi quyeát baèng cô cheá Nhaäp baøo Endocytosis taïo theå noäi baøo Endosome 9Ñöa ñeán Lysosome hay Golgi
  131. 3. Söï vaän chuyeån ñeán lysosome - ÔÛ golgi: gaén mannose x 6- phosphat
  132. Chöùc naêng cuûa lysosome: phaân giaûi nhöõng vaät lieäu thöøa cuûa teá baøo. Ñeå thöïc hieän vai troø naøy, lysosome baäc 1 ( primary) seõ hoøa vôùi moät boïng mang vaät lieäu thöøa ( coù theå ñeán töø beân ngoaøi hay laø chaát thaûi cuûa caùc baøo quan beân trong x daïng sau coøn ñöôïc goïi laø khoâng baøo töï huûy) ñeå tieâu hoùa chuùng. Khi naøy ta coù lysosome baäc 2. Caùc vaät chaát naøy coù theå ñöôïc phaân huûy hay vaãn ôû trong lysosome suoát thôøi gian soáng cuûa teá baøo. Khi ñoù lysosome naøy ñöôïc goïi laø theå cö truù - residual bodies.
  133. CHÖÔNG 7
  134. I. Taïo doøng 1. Ñònh nghóa: Moät doøng: taäp hôïp nhieàu teá baøo töø 1 teá baøo goác ban ñaàu
  135. 2. Caùc giai ñoaïn taïo doøng a. Taïo cDNA ( complemetary DNA) - Thu nhaän, tinh saïch mRNA toång soá - Taïo cDNA nhôø enzyme Reverse Transcriptase ( RT x phieân maõ ngöôïc)
  136. 9Duøng moài oligo-T 9RT 9Ribonuclease H 9DNA polymerase 9DNA ligase
  137. b. Ñöa phaân töû DNA ngoaïi lai vaøo trong teá baøo vi khuaån Choïn loïc vector taïo doøng
  138. Ví duï: Plasmid pBluescript
  139. * Daïng ñaàu baèng: Caét vaø noái ñôn giaûn, khoâng chuyeân bieät * Daïng ñaàu ñính: Tính chuyeân bieät cao. Vì vaäy phaûi cheøn ñieåm nhaän bieát cuûa enzyme caét giôùi haïn vaøo 2 ñaàu cuûa ñoaïn DNA ngoaïi lai
  140. Ñöa plasmid taùi toå hôïp vaøo teá baøo vi khuaån -Xöû lyù CaCl2 -Bieán naïp -Choïn doøng mang plasmid
  141. ++ Choïn doøng teá baøo mang plasmid taùi toå hôïp 9Duøng cô chaát X-gal vaø chaát caûm öùng IPTG 9Khi coù IPTG operon lactose hoaït ñoäng coù E - galactosidase, laøm khuaån laïc coù maøu xanh 9Khi coù DNA ngoaïi lai cheøn ñuùng vaøo plasmid khuaån laïc maøu traéng
  142. Taäp hôïp nhöõng vi khuaån mang plasmid taùi toå hôïp treân goïi laø Thö vieän doøng hay Thö vieän cDNA
  143. c. Choïn doøng cDNA -Nguyeân taéc: doø DNA hay doø protein saûn phaåm Chuaån bò thö vieän cDNA ñeå chaïy maãu doø 9Traûi vi khuaån treân ñóa moâi tröôøng 9Ñaùnh soá 9Aùp leân maøng nylon 9Xöû lyù maøng vôùi chaát ly giaûi teá baøo 9Xöû lyù maøng tieáp vôùi NaOH( neáu duøng ñeå doø DNA)
  144. Duøng maãu doø laø oligonucleotid ( neáu theo nguyeân taéc doø DNA) 9Saûn phaåm protein bieát 1 vaøi trình töï acid amin toång hôïp in-vitro 1 ñoaïn oligonuleotid 9Ñaùnh daáu phoùng xaï ñoaïn oligonucleotid treân ( ) 9Maøng nylon ñöôïc uû vôùi oligonucleotid phoùng xaï treân 9Röûa oligonucleotid dö thöøa 9Ñaët maøng leân X-ray film, duøng kyõ thuaät Phoùng xaï töï ghi ñeå xem keát quaû ( ñoám ñen) 9Ñoái chieáu laïi vôùi vò trí khuaån laïc treân ñóa caáy ban ñaàu 9Caáy ria, giöõ gioáng
  145. ( ) Phöông phaùp ñaùnh daáu phoùng xaï maãu doø oligonucleotid - Nghóa laø phaûi coù gaén nhoùm P32 - Duøng enzyme polynucleotid kinase ( PNK) vaø cô chaát [ J-P32] ATP 31.ORDÑLERÝtSKRVSKDWFXÝDPRÅLQXFOHRWLGÓHÇODÑL QKRÛPtK\GUR[\O Chuyeån [ J-P32] FXÝD$73VDQJQKRÛPt-hydroxyl naøy
  146. Duøng maãu doø laø khaùng theå ( doø protein saûn phaåm) - Duøng khaùng theå doø tìm protein ( nguyeân taéc nhö Western blot)