Bài giảng Sản xuất protein trong y học - TS. Trần Hoàng Dũng (Phần 2)

Nội dung text: Bài giảng Sản xuất protein trong y học - TS. Trần Hoàng Dũng (Phần 2)

1. Sản xuất protein trong y học CHƯƠNG 3 VECTORS Vectơ là những phân tử DNA tái tổ hợp mà có thể được sử dụng để mang những đoạn DNA ngoại lai. Các đoạn DNA được tạo dòng trong vectơ có thể đạt được với số lượng đủ lớn cho các thao tác trong phòng thí nghiệm. Các vecto dựa vào trình tự DNA đã được sửa đổi và kết hợp để thực hiện những chức năng khác nhau. Việc lựa chọn các vecto dựa vào kích thước phân tử DNA được chèn vào nó. Các Vecto đã được khai thác cho nhiều mục đích khác nhau: sản xuất sợi đơn DNA, sự biểu hiện cấp độ cao của các gen mã hóa protein, và việc sản xuất RNA. Phần lớn các thí nghiệm nhân dòng vô tính phân tử sử dụng vi khuẩn E coli cho nhân dòng DNA vô tính. Thậm chí nơi được đưa các đoạn DNA vô tính vào là tế bào eukaryote. Các cấu trúc DNA hầu như luôn luôn được sản xuất trong E.coli trước rồi sau đó mới đưa vào vật chủ cuối cùng. Việc nhân dòng vô tính có thể khả thi với những ưu điểm của E.coli nên nó được sử dụng rộng rãi trong kĩ thuật di truyền. E.coli, được đặt tên từ nhà vật lý học người Đức Theodor Escherich (1857–1911) là vi khuẩn gram âm, hình que di chuyển bằng cách quay nhanh lông roi. Có nhiều trong miệng và ruột người giúp bảo vệ vùng ruột khỏi các vi khuẩn truyền bệnh, giúp tiêu hóa và sản xuất một lượng nhỏ vitamin B12 và K. Như là một sinh vật sử dụng trong phòng thí nghiệm, E.coli có những ưu điểm sau: Dễ dàng tăng trưởng trong môi trường đơn giản, ít tốn kém. Là sinh vật có khả năng nhân đôi nhanh chóng khoảng 20-30 phút trong phase log. Bộ máy di truyền học của nó đã được hiểu rõ. Sử dụng E.coli trong phòng thí nghiệm thường an toàn và ngăn chặn đột biến là cho chúng không thoát ra được môi trường phòng thí nghiệm. Có một bộ gen đã được xắp sếp và lập chuỗi. 83
2. Sản xuất protein trong y học Các bản sao nhiễm sắc thể phụ của DNA (các Plasmid và thể thực khuẩn DNA) có thể được lợi dụng để mang các DNA ngoại lai. Các tế bào E.coli hầu hết là sinh sản vô tính nhưng để tăng tính đa dạng và tăng tính truyền đạt thông tin gen, chúng có các cơ cấu để chuyển các vật chất di truyền từ một vi khuẩn đến loài khác. Trở lại giữa thập niên 1940 các tế bào vi khuẩn được cho là có khả năng trao đổi vật chất di truyền với loài bán giới tính. Thí nghiệm của Lederberg and Tatum đã mô tả rõ ràng sự vận chuyển thông tin di truyền thông qua sự tiếp hợp vi khuẩn. Khả năng để thực hiện được sự vận chuyển này là từ một bộ gen được gọi là F. Những gen này tồn tại trong mảnh vòng của DNA mà được sao chép lại một cách độc lập từ nhiễm sắc thể vi khuẩn, hoặc chúng có thể được hợp nhất vào trong nhiễm sắc thể. Vi khuẩn mang những gen này ( thường là những vi khuẩn đực) dùng tua để bám vào một vi khuẩn gần nó, 2 tế bào được kéo lại gần nhau, và DNA được chuyển từ vi khuẩn này đến vi khuẩn kia. Có 3 biểu hiển của nhân tố di truyền: .F hay Fepisome là phân tử sợi đôi DNA tròn, lớn mà chỉ mang những gen di truyền, được giữ trong vi khuẩn như là một sợi nhiễm sắc thể phụ plasmid. .Hfr: thành tố F đã được hợp nhất vào trong bộ gen E.coli. Khi sự tiếp hợp xảy ra, các gen F di chuyển qua tua kéo theo phần còn lại của gen sau chúng. Cuối cùng tua bị đứt, vì thế bộ gen không được chuyển hoàn toàn. Bộ gen vi khuẩn có thể được đo trong nhiều phút từ khi bắt đầu chuyển với một lược thời gian cần cho từng gen riêng biệt để được chuyển từ vi khuẩn này đến vi khuẩn kia cho biết được bao lâu kể từ khi bắt đầu sao chép. .F’ : đây là phân tử sợi đôi DNA mang các gen di truyền và một số loại gen khác. Những gen này được vận chuyển với hiệu suất rất cao bởi vì độ dài của sợi DNA được chuyển khá ngắn đủ để nó có thể di chuyển dọc theo khúc nối giữa 2 tế bào vi khuẩn trước khi tua bị đứt. Khả năng của F’ episome để tái tổ hợp và được giữ như là một thực thể tách biệt với các nhiễm sắc thể vi khuẩn làm nó lý tưởng để mang các trình tự DNA ngoại lai. Tuy nhiên kích thước của F’ episome là ngăn cản sự phân tích và thao tác trên nó và thuộc tính gen chuyển của nó có thể làm cho không ổn định. Về tổng quan các DNA ngoại lai cần được mang trong vecto để bảo đảm sự truyền và tái tổ hợp trong tế bào vật chủ. Vecto được mô tả tốt nhất như là các trình tự DNA tự tái tổ hợp mà có thể được dùng để mang các DNA ngoại lai. Các vecto có nền tảng dựa trên các chuỗi DNA được tìm thấy có thể được tái tổ hợp dưới những hình thức khác nhau. Hầu hết các vecto được sử dụng dựa vào cả plasmid và thực khuẩn λ. Tổng quan, các vecto được xem như các môdun riêng biệt mà cung cấp các điều kiện cơ bản thiết yếu cho việc nhân dòng vô tính phân tử hiệu suất cao. Các vecto được sử dụng trong tái tổ hợp DNA thường được quy cho là các vecto dòng vô tính, trong khi nếu nó được sử dụng cho biểu hiện gen được mang trong DNA dòng vô tính, nó được gọi là vecto biểu hiện. Các vecto phải mang một trong các đặc điểm sau đây để làm cho nó trở nên hữu dụng trong nhân dòng vô tính phân tử: 84
3. Sản xuất protein trong y học Có khả năng tự sao chép Có tính chọn lọc để nhận diện những tế bào đã biến đổi với những tế bào chưa biến đổi. Thêm vào đó hầu hết các vecto đều chứa những vùng enzyme nhận diện giới hạn để cho các đoạn DNA có thể được nhân dòng vô tính vào trong vecto một cách dễ dàng. Một mạng lưới lớn những loại vecto được sử dụng ngày nay, với các tính chất chuyên biệt cao và được thiết kế ra để thực hiện một chức năng đặc trưng. Trong chương này chúng ta sẽ bàn về một vài điểm tổng quan của việc thiết kế một vecto, nhưng sẽ tập trung vào các vecto dùng trong các thí nghiệm dòng vô tính. 3.1 PLASMID Plasmid thường được tìm thấy trong các đoạn DNA thuộc nhiễm sắc thể phụ mà thế hệ fromone được thừa hưởng ổn định từ một vùng nhiễm sắc thể phụ khác. Plasmid được phân tán rộng rãi trong prokaryote khoảng 1500bp đến hơn 300kbp. Hầu hết plasmid hiện diện như là các phân tử sợi đôi DNA vòng kín và thường có một kiểu hình riêng biệt trên tế bào vi khuẩn, nơi mà chúng được sao chép lại. Đó là vì plasmid thường mang gen mã hóa để chống lại các tác nhân kháng sinh và kim loại nặng, hoặc để sản xuất nguồn DNA hạn chế và các enzyme sửa chữa, những thứ mà vi khuẩn khi bình thường thì không có được. Sự sao chép plasmid thường được ghép đôi với tế bào chủ nơi mà chúng được giữ lại, cùng với sự sao chép plasmid là sự sao chép lại bộ gen của tế bào vật chủ. Plasmid thường được mô tả như dư dả (relaxed) hoặc khan hiếm (stringent) là dựa vào lượng bản sao của plasmid được giữ trong tế bào, plasmid dư tức nhiều bản sao được giữ lại trong một tế bào(10-200), trong khi plasmid khan hiếm khi chỉ hiện diện 1 hoặc 2 bản sao trong một tế bào.Nền tảng của sự khác nhau này là do cơ cấu khác nhau được thực hiện bởi plasmid để tự nhân đôi. Nói chung,plasmid dư thừa sử dụng vật chủ có nguồn gốc từ protein, trong khi plasmid khan hiếm mã hóa các nhân tố protein cần thiết cho sự nhân đôi của chúng. Hầu hết các plasmid được sử dụng ngày nay dựa trên nguồn gốc sự tự nhân đôi được tìm thấy trong plasmid E.coli ColE1 hoặc họ hàng gần của nó là pMB1. ColE1 là phân tử DNA vòng đóng dài 6646bp mã hóa cho tác nhân kháng sinh của vi khuẩn, 85
4. Sản xuất protein trong y học colicin E1 và các gen đề kháng mà giúp vi khuẩn vật chủ thoát khỏi ảnh hưởng của tác nhân kháng sinh. Colicin E1 là protein vận chuyển trên màng gây nên sự khử cực gây chết màng của vi khuẩn (Konisky và Tokuda, 1979). Gen kháng thuốc mã hóa cho protein ngăn cản hoạt động của Colicin bằng cách kiềm chế khả năng hình thành kênh xuyên màng vi khuẩn (Zhang và Cramer, 1993). Vi khuẩn có chứa pladmid ColE1 có thể khác biệt so với những vi khuẩn không chứa plasmid này bởi chúng có khả năng phát triển trong một dĩa có chứa colicin E1. Tuy nhiên việc bảo vệ cho quá trình phát triển này là khá khó khăn và đã lâu kể từ khi các kĩ thuật bảo vệ thuốc kháng sinh không còn được sử dụng nữa. Plasmid ColE1 được sao chép theo kiểu độc lập sử dụng DNA polymerase được cung cấp từ tế bào vật chủ. Không giống như nguồn gốc sao chép thuộc vi khuẩn, sự sao sao chép của ColE1 chỉ diễn ra theo một chiều. Plasmid không mã hóa cho protein khởi sướng quá trình sao chép nhưng lại mã hóa cho các phân tử RNA không dịch mã, các RNA này có liên quan đến sự khởi sướng quá trình sao chép cũng như một protein đóng vai trò điều hòa các phân tử RNA. Nguồn nhân đôi DNA của ColE1 là một vùng của DNA mà 2 phân tử RNA (RNAI và RNA II) được phiên mã từ nguồn khởi xướng của chúng (hình 3.2). RNA II được bổ sung vào gốc sao chép ColE1 và gắn vào nó hình thành nên dạng lai DNA-RNA (Cesarenivà cộng sự, 1991). Phân tử gắn RNA II được tách ra từ gốc, bởi enzyme mã hóa vật chủ RNase H và đáp ứng như một đoạn mồi nơi mà sự sao chép DNA xảy ra. Trong quá trình bắt cặp base, RNAII chỉ có thể gắn lên 1 sợi DNA, và kể từ đây sự sao chép DNA là đơn hướng. Hình 3.2: Plasmid ColE1 và gốc sao chép. Plasmid ColE1 là một sợi đôi DNA vòng kín, dài 6646bp. Nó mã hóa cho tác nhân kháng sinh trong vi khuẩn colicin E1 và protein miễn dịch giúp ngăn các ảnh hưởng từ chất độc trong các tác nhân kháng khuẩn có trong plasmid. Sự sao chép DNA chỉ xảy ra theo 1 hướng như được chỉ ra từ mũi tên ori. Hai phân tử RNA chưa phiên mã, gọi là RNAI và RNAII, và sản phẩm protein của gen rop điều khiển quá trình sao chép. Mũi tên trên các gen cho thấy chiều hướng phiên mã. 86
5. Sản xuất protein trong y học Điều khiển quá trình sao chép được thực hiện bởi một phân tử RNA chưa phiên mã khác. RNAI được bổ xung vào gốc 5’ của RNAII và dạng RNA kép giữa RNAI và RNAII không thể thực hiện như là một đoạn mồi cho sao chép. RNAI có tồn tại tương đối ngắn, do đó plasmid ColE1 được giữ ở mức 15-20 bản sao trong một tế bào. Sự tương tác giữa RNAI và RNAII được giữ ổn định bởi protein ROP(Helmer-Citterichvà cộng sự, 1988). Cơ cấu sao chép DNA thực hiện bởi ColE1 có một số vai trò quan trọng, 2 plasmid với cùng một gốc sao chép không thể cùng tồn tại trong một tế bào. RNAI của gốc plasmid ngăn cản RNAII của plasmid đi vào để khỏi hình thành đoạn mồi, đây không gọi là sao chép. Điều này quan trọng trong các thí nghiệm nhân dòng vô tính khi mà một tập hợp các plasmid được hòa trộn, điều mà tạo ra các phản ứng thắt nút, được chuyển vào trong vi khuẩn. Các cá thể chuyển theo phương pháp chỉ mang một plasmid đơn mà không phải là một tập hợp. Các Plasmid với các gốc sao chép khác nhau không thể cùng tồn tại trong một tế bào. MỘt hệ quả của cơ cấu sao chép ColE1 là sự tổng hợp DNA mới không cần khởi sướng sự sao chép DNA. Sự hiện diện các yếu tố kháng sinh mà ngăn cản sự tổng hợp protein, sự sao chép DNA nhiễm sắc thể bị ngừng lại nhưng với plasmid nền tảng ColE1 vẫn tiếp tục được sao chép và tích lũy với nồng độ cao (1000–2000 bản sao một tế bào) (Clewell, 1972). 3.1.1. pBR322 ColE1 và tương ứng với nó là pMB1, hữu dụng trong nhân dòng vô tính vecto nhưng chúng lại có một số bất lợi. Đầu tiên, khó khăn trong việc nhận diện plasmid tái tổ hợp làm chúng không được sử rộng rãi. Cần một plasmid có thể được sao chép giống với cách của ColE1, nhưng phải trong plasmid nào dễ nhận diện. Plasmid pBR322 lần đầu tiên được sử dụng như là một vecto plasmid, là một plasmid nhỏ (4363bp) được cấu thành từ các plasmid trong tự nhiên và các đoạn DNA khác (Bolivar và cộng sự, 1977). pBR322 mang những thành phần sau đây. Gốc sao chép : pBR322 mang gốc sao chép ColE1 và gen rop để bảo đảm một lượng bản sao plasmid hợp lý ( 15-20 một tế bào) có thể tăng lên 200 vòng nhờ sự khuyếch đại chloramphenicol. Gen kháng kháng sinh: pBR322 mang 2 gen mà có thể được sử dụng như là các tín hiệu chọn lọc. Gen kháng ampicilin được nhân dòng vô tính vào trong plasmid nhờ 87
6. Sản xuất protein trong y học gen nhảy Tn3. Gen kháng tetracyline được nhân dòng vô tính từ plasmid pSC101 (Bernardi và Bernardi, 1984). Vùng nhân dòng vô tính: plasmid mang các vùng nhận diện enzyme giới hạn.một vài trong số này có trong cac gen kháng kháng sinh. Ví dụ như vùng cho PstI, PvuI và SacI được tìm thấy trong gen kháng ampicilin hoặc vùng cho amHI và HindIII trong gen kháng tetracylin. Các gen kháng kháng sinh trong pBR322 cho phép chọn lọc trực tiếp các chất tái tổ hợp trong một chu trình được gọi là bất hoạt vùng gắn (insertional inactivation). Ví dụ, nếu chúng ta muốn nhân dòng vô tính một đoạn DNA vào trong vùng BamHI của pBR322, sau đó DNA gắn sẽ làm ngắt quãng vai trò của gen KHÁNG chống tetracilin, nhưng vai trò của gen chống ampicilin vẫn không bị thay đổi. Các tế bào đã biến đổi được nuôi trên một đĩa thí nghiệm mang ampicilin để diệt hết tất cả các tế không mang plasmid. Sau đó được cho phát triển tiếp trên mội trường có cả ampicilin và tetracilin. Những tế bào có thể phát triển khi có ampicilin nhưng lại chết dưới sự chọn lọc của tetracilin sẽ mang plasmid có DNA gắn vào. Nói cách khác, sự thêm vào các đoạn DNA ngoại lai vào các gen kháng kháng sinh làm bất hoạt gen và dẫn tới tính nhạy cảm với yếu tố kháng sinh. Hình 3.4 Sự lồng vào yếu tố gây bất hoạt của gen kháng kháng sinh trong pBR322. Nếu đoạn DNA được lồng vào vùng nhận diện enzyme giới hạn BamHI bên trong gen tetracyline, gây ra bởi plasmid tái tổ hợp khi được chuyển vào trong vi khuẩn sẽ vẫn 88
7. Sản xuất protein trong y học đem lại sự sống trên môi trường chứa ampiciline nhưng sẽ không thể xúc tiến được sự phát triển trong môi trường chứa tetracilin. Gen kháng Tetracilin sẽ bất hoạt về mặt chức năng khi có mặt DNA gắn. 3.1.2 pUC plasmid PBR322 là một đột phá trong lĩnh vực sinh học phân tử như là một plasmid lần đầu tiên được sử dụng trong nhân dòng vô tính phân tử nhưng tiêu tốn thời gian và dể gặp lỗi. Vào 1982 một chuỗi plasmid được phát triển cho phép nhận diện tế bào mang DNA ngoại lai trong bước sàng lọc đơn là plasmid pUC (Vieira và Messing, 1982). Nó có 3 đặc tính quan trong khi so với pBR322 Lượng bản sao lớn – đột biến trong gốc sao chép sản xuất ra 500-600 bản sao của plasmid trong một tế bào mà không cần dùng tác nhân khuyếch đại chloroamphenicol. Sàng lọc xanh- trắng – Sàng lọc theo kiểu này là một dạng đặc biệt của hoạt hóa vùng gắn. Nhiều vùng nhân dòng vô tính. Đây là một loại DNA nhân tạo mà chứa trình tự của nhiều vùng nhận diện enzyme giới hạn. Nó được gắn vào một phần của vecto mã hóa β-galactosidase α-peptide theo chiều hướng để không ảnh hưởng đến chức năng và biểu hiện của nó. Tuy nhiên việc gắn DNA ngoại lai vào hầu như luôn luôn làm phá vỡ hoạt động của α-peptide. Do đó các cụm tái tổ hợp vẫn còn màu trắng trong khi cụm không tái tổ hợp lại chuyển xanh. Hình 3.5- pUC plasmid Ưu điểm của pUC plasmid so với pBR322 là đoạn DNA ngoại lai có thể được nhân dòng vào nhiều vùng nhận diện enzyme giới hạn khác nhau và các chất tái tổ hợp nhanh chóng được sàng lọc. Thêm vào đó gốc α-bổ trợ chỉ cần một gen nhỏ để mang trên plasmid. DNA mã hóa α-peptide trong chuỗi pUC trong các vecto thì nhỏ hơn 400bp. Nếu như toàn bộ khung đọc mở LacZ được cần đến, trên 3500bp sẽ được giữ lại trong những vecto này. Nói chung, sự ổn định của nhiều vecto plasmid giảm trong 89
8. Sản xuất protein trong y học khi chiều dài của chúng tăng. Kết quả trong giới hạn chiều dài DNA là có thể được nhân dòng vô tính vào trong một plasmid riêng biệt. Ví dụ, khả năng tế bào vi khuẩn vẫn còn plasmid pUC tái tổ hợp giảm mạnh khi kích thước của chúng đạt đến 15kbp. 3.2 Lựa chọn chỉ thị (Dấu chuẩn chọn lọc) Một đặc điểm cơ bản của các plasmid là chúng tạo điều kiện cho vector được dễ dàng phát hiện. Các plasmid như vậy được sử dụng thường xuyên như các vector trong thí nghiệm tạo dòng. Nhiều loại plasmid được tìm thấy trong tự nhiên trong các vi khuẩn và trong một số nấm men. Việc lựa chọn đánh dấu thường phụ thuộc vào các tế bào vật chủ được chuyển. Một số dấu hiệu chỉ có chức năng với các sinh vật nhân sơ, trong khi những một số khác có một tác động rộng hơn. Một số dấu hiệu thường được sử dụng lựa chọn được liệt kê dưới đây, cùng với cơ chế hoạt động của chúng. Ampicillin – gắn vào và ức chế một số enzym trong màng tế bào vi khuẩn có liên quan đến sự tổng hợp của các thành tế bào Gram âm. Do đó, tế bào không nhân bản trong trường hợp có sự hiện diện của ampicillin. Các gene kháng ampicillin (AMPR hoặc bla) mã hóa cho các enzyme β-lactamase được tổng vào khe quanh tế bào chất của vi khuẩn, nơi mà nó xúc tác thủy phân của vòng β-lactam của ampicillin. Do đó, các sản phẩm của gen AMPR làm mất hiệu lực chất kháng sinh. Theo thời gian ampicillin trong môi trường nuôi cấy trên đĩa petri có thể bị mất hiệu lực khá rõ bởi β-lactamase. Khi điều này xảy ra, sức ép chọn lọc để duy trì các plasmid sẽ không còn nữa và quần thể tế bào có thể phát sinh mà không có plasmid. Tetracycline – kết hợp với một protein tiểu đơn vị 30S của ribosom để ức chế sự di chuyển ribosome dọc theo mRNA và do đó cản trở quá trình dịch mã tổng hợp protein. Các gen kháng tetracycline (TETR) được mã hóa bởi 399 amino acid ở bên ngoài màng liên quan đến protein của tế bào Gram âm và ngăn chặn các kháng sinh xâm nhập vào tế bào. Như vậy, gene kháng thuốc không làm mất hiệu lực của kháng sinh. Sức ép chọn lọc sẽ được duy trì trong suốt quá trình nuôi cấy tế bào để giữ cho các plasmid có chứa gene kháng thuốc. Chloramphenicol – kết hợp với các tiểu đơn vị 50S ribosome để ức chế sự tổng hợp protein. Các chloroamphenicol acetyltransferase (CAT) được mã hóa bởi gen kháng chloramphenicol (CMR). Các protein CAT là bốn (tetrameric) bào thể protein, trong sự hiện diện của acetyl coenzyme A, xúc tác hình thành các chất dẫn xuất hydroxyl acetoxy của chloramphenicol nó không thể liên kết với các ribosome. Như với ampicillin, các sản phẩm gen CMR làm mất hiệu lực của chất kháng sinh. Kanamycin và neomycin – kết hợp với các thành phần ribosome và hạn chế tổng hợp protein. Các protein được tổng hợp bởi mã hóa gene KANR được tổng hợp ở khe quanh tế bào chất và cản trở việc vận chuyển các chất kháng sinh vào trong tế bào. Giống như các gene kháng tetracycline, gene KANR không làm mất hiệu lực các chất kháng sinh. Bleomycin và zeocin – các kháng sinh glycopeptide liên kết với DNA và ức chế DNA và sự tổng hợp RNA. Chúng tác động chống lại hầu hết các vi khuẩn (bao gồm cả E. Coli), vi sinh vật có nhân điển hình (ví dụ như nấm men), các tế bào thực vật và 90
9. Sản xuất protein trong y học tế bào động vật. Các gene Sh ble từ vi khuẩn Streptoalloteichus hindustanus mã hóa một protein nhỏ có đề kháng đối với zeocin bằng cách gắn vào các chất kháng sinh (Gatignol, Durand và Tiraby, 1988). Hygromycin B - ức chế bằng cách can thiệp dịch chuyển vị ribosome. Kháng sinh tác động chống lại cả hai sinh vật nhân sơ và sinh vật nhân chuẩn. Các gen kháng (HYGR, mã hóa hygromycin-B-phosphotransferase) bất hoạt các kháng sinh bởi sự phosphoryl hóa. Mặc dù vectơ plasmid được sử dụng cực kỳ rộng rãi sử dụng trong nhiều ứng dụng của việc tạo dòng và đã được thiết kế với mục đích tạo ra nhiều chức năng hơn. Những chức năng trong số này sẽ được thảo luận trong chương sau của cuốn sách này, nhưng ở đây tôi sẽ liệt kê một số ví dụ để cung cấp cho người đọc một chức năng chính trong sự đa dạng của việc sử dụng plasmid. Tách dòng - hầu hết các thao tác thực hiện trên DNA trong phòng thí nghiệm đều lựa chọn có mang plasmid. Dễ dàng thao tác sử dụng và lưu trữ của plasmid nên thường được sử dụng trong các thí nghiệm về DNA tái tổ hợp. Vector con thoi - những plasmid không chỉ chứa toàn bộ thông tin gốc nhân bản và lựa chọn đánh dấu cho E. coli, những trình tự cũng có chức năng tương tự để duy trì truyền lại ở các tế bào vật chủ khác. Ví dụ, plasmid cho nhân bản và biểu hiện của gen ở nấm men Saccharomyces cerevisiae có chứa toàn bộ thông tin nhân bản và đánh dấu lựa chọn cho cả E. coli và nấm men. Hầu hết các các thao tác DNA sẽ được thực hiện bằng cách sử dụng E. coli là tế bào chủ trước khi chuyển thành DNA cuối cùng được tạo ra vào trong nấm men. Tạo ra RNA - nhiều plasmid đã được thiết kế để nhân bản đoạn DNA ngoại và nó có thể phiên mã thành RNA. Như vậy plasmid bao gồm các vùng khởi động (promoter ) cho một RNA polymerase, ví dụ: Ở bacteriophages có T3, T7 hoặc SP6, Giả sử RNA có thể được thực hiện trong ống nghiệm bằng cách sử dụng RNA polymerase tinh khiết và DNA plasmid. Các RNA được thực hiện bằng phương pháp này thường được sử dụng như thăm dò lai trong Northern blotting. Sản xuất Protein - nhiều plasmid chứa trình tự khởi đầu (promoter) để biểu hiện các gen ngoại mà chúng có. Biểu hiện thường được thực hiện trong E. coli, nhưng bằng cách sử dụng các đoạn khởi động (promoter) phù hợp, protein biểu hiện có thể được định hướng hầu như bất kỳ trong cơ thể nào. Sản xuất protein ở mức độ cao có thể được điều khiển từ một promoter mạnh, trong khi sản xuất ở mức thấp có thể sẽ là từ các promoter yếu hơn. Mức độ sản xuất protein cũng có thể được điều khiển bằng cách thay đổi số lượng bản sao của plasmid này. Trong kỹ thuật di truyền, các plasmid gặp trong tự nhiên thường được sửa đổi nhiều để tạo ra các vector có các đặc điểm mong muốn. Ví dụ, nếu bạn đã nhân bản vô tính một gen, bạn có thể muốn biểu hiện các sản phẩm của gene ở mức cao trong E. coli, trong khi cũng thể biểu hiện protein trong môi trường nuôi cấy tế bào động vật có vú và sản xuất một protein mới dựa trên protein đã biểu hiện mà kháng thể đơn dòng có sẵn để dùng. Các hệ thống nên được thiết kể để vận chuyển vào các đoạn 91
10. Sản xuất protein trong y học ADN giữa các vector mà không cần phải sử dụng enzyme giới hạn. Một trong những hệ thống được phác thảo (hình 3.7). Hình 3.7. Gene xáo trộn giữa các plasmid bằng cách tái tổ hợp. Các gen được chuyển giao từ các plasmid cho đến plasmid nhận tại địa điểm LoxP sử dụng enzyme Cre recombinase. Ở đây, các đoạn DNA mã hóa gene mục tiêu được chuyển từ một plasmid khác do tác động của các enzyme Cre recombinase. Cre nặng 38 kDa protein recombinase từ các vi khuẩn P1 (Sternberg và cộng sự, 1981). Nó làm trung gian để điều chỉnh giữa sự tái tổ hợp và trong các trình tự DNA tại các điểm cụ thể gọi là các điểm loxP ( Abremski và Hoess, 1984 ). Các điểm này bao gồm một cặp 13 bp ngược lặp đi lặp lại cách nhau bởi một vùng đệm 8 bp. Vùng đệm 8 bp trong điểm loxP được định hướng rằng sự tái tổ hợp xảy ra theo một chiều hướng chính xác và định hướng trước. Plasmid cho chứa hai điểm loxP và hai điểm đó kẹp giữa hai đầu của gene mục tiêu. Plasmid nhận chứa một điểm loxP và các yếu tố mà các gen mục tiêu sẽ trở thành hợp nhất. Các gen mục tiêu khi chuyển sẽ liên kết với các yếu tố biểu hiện cụ 92
11. Sản xuất protein trong y học thể mà các vector nhận đã được thiết kế. Hơn nữa, nếu các trình tự mã hóa cho các gen quan trọng nằm trong khung ngược dòng với các điểm loxP ở vector cho nó sẽ tự động được nằm trong khung với tất cả các chuỗi axit amin đã thiết kế ở vector nhận. Một plasmid cho được thay thế và hệ thống chấp nhận plasmid đó là dựa vào một điểm đặc biệt các phản ứng tái tổ hợp trung gian bởi thể thực khuẩn λ (Karimi, Inze và Depicker, 2002). Trong trường hợp này, các đoạn DNA tái tổ hợp hai bên các điểm ( att ) có thể được chuyển vào vector tái tổ hợp có chứa các điểm tương thích ( att × attP hoặc attL × attr ) trong một phản ứng trung gian bởi các protein tái tổ hợp λ. Tính linh hoạt của plasmid đã dẫn đến chúng được sử dụng rộng rãi như là các vectơ cho các thí nghiệm về thao tác trên gene. Tuy nhiên nó cũng có một số hạn chế đáng kể. Thứ nhất, hiệu quả mà plasmid được chuyển đến một tế bào vi khuẩn là rất thấp. Phân tử DNA plasmid được đưa vào tế bào vi khuẩn phải được tế bào chấp nhận ( xem Chương 2 ), nhưng điều này không phải lúc nào cũng được đáp ứng. Plasmid được chuyển vào tế bào E. coli được cho là có mức độ thích nghi tốt nhất 1 × 109 tế bào chuyển đổi có thể được tạo ra mội microgram phân tử DNA plasmid. Đối với một plasmid điển hình, 1 μg đại diện cho khoảng 1,5 × 1011 phân tử. Điều này có nghĩa là các tế bào thu được ít hơn 1 % các phân tử DNA có sẵn. Thứ hai, năng suất của các plasmid để chuyển các đoạn lớn của DNA ngoại lai là rất hạn chế (Bảng 3.1). Hầu hết các plasmid trở nên không ổn định nếu kích thước của chúng vượt quá khoảng 15 kbp.Trong nhiều trường hợp, điều đó không thành vấn đề, nhưng trong một số ứng dụng, điều quan trọng là phải tăng kích thước của các đoạn lên tối đa trước khi tác dòng. Cần có các vector có khả năng tiếp nhận các đoạn DNA lớn. Các loại vector có như vậy được phát triển để khắc phục những khó khăn này. 3.3 λ Vectors Vào đầu năm 1950, Andre lwoff đã miêu tả một đặc tính kì lạ của Escherichia coli. Khi ông soi sáng một chút sự căng của những tế bào E.coli với một lượng ánh sáng cực tím vừa phải, vi khuẩn dừng hẳn sự phát triển và, sau đó khoảng 90 phút, vi khuẩn dung giải và phóng thích ra nhiều mẫu virut, gọi là λ , bên trong môi trường trung gian (Figue 3.8) Những virut, nhiều khi được gọi là thể ăn vi khuẩn hoặc đơn giản là thể thực khuẩn, có thể gây nhiễm tới các tế bào E. coli khác mà trước đây không gây nhiễm bởi những thể thực khuẩn λ. Không chỉ tất cả những tế bào vi khuẩn chịu sự biến đổi phân hủy này khi bức xạ bằng con đường này. Tuy nhiên, vi khuẩn đầu tiên tiêu diệt thễ ăn khuẩn A, nhưng không thể phân hủy, là đặc điểm khác thường.Chống lại sự lây nhiễm bởi thể ăn khuẩn A, những tế bào E. coli sẽ chịu đưng một trong 2 cách thức sau. Hoặc tế bào thủy phân và tổng hợp nên nhiều mảnh thể ăn khuẩn mới sẽ phóng thích vào trong xung quanh khoảng giữa, hoặc, một sự lựa chọn nữa , thể ăn khuẩn có thể thay đổi đột ngột vào trong Dormant lifestyle mà thể ăn khuẩn DNA trở nên hợp nhất trong nhiễm sắc thể E coli bên trong nguyên nhân này là sự phân giải lifestyle được tiếp tục. 93
12. Sản xuất protein trong y học Chu trình sống của thể ăn khuẩn λ được diễn tả trên biểu đồ hình 3.9. Thực ra nó là vi khuẩn phân giải mà nó tỏ ra phân hủy nhanh chóng để chống lại bức xạ cực tím. Trong phòng thí nghiệm, thể ăn khuẩn λ phát triển và tái tạo được kiểm tra trên đĩa petri (hình 3.10). 94
13. Sản xuất protein trong y học Thể ăn khuẩn được pha trộn với những tế bào E. coli xem là 1 dung dịch mềm dẻo agar được gọi là top agar hỗn hợp được rót trên bề mặt dinh dương agar một lớp mỏng và được ủ cho vi khuẩn phát triển. λ phát triển là nguyên nhân của cái chết (sự phân giải) của những tế bào E.coli xung quanh vị trí tiêm nhiễm lúc ban đầu. Trong những vị trí được theo dõi trên đĩa có một chút hỗn độn những màng trong vải batit vi khuẩn. DNA λ có thể được lọc từ những mẫu thể ăn khuẩn bao gồm có những màng này. Di truyền học và phân tử sinh vật học ở cấp độ phân tử của thể thực khuẩn λ vừa được nghiên cứu rộng khắp – xa hơn là cung cấp thông tin về λ , độc giả được hướng dẫn bởi văn bản hết sức hoàn hảo bởi Mark Ptashne (Ptashne, 1992). DNA bao gồm thể ăn khuẩn là 1 phân tử sợi đôi thẳng với kích thước 48502 bp, đầu 5- và 3- kết thúc của λ hệ gene có 12 cặp base mà sợi đôi được gọi là cố kết hay cos kết thúc. Những chuỗi này bổ sung và có thể được thấu với một vài thứ khác tới dạng 1 phân tử sợi đôi mạch vòng (hình 3.11). Chức năng liên quan tới gene của λ thường được tập hợp lại với nhau tạo nên hệ gene λ loại trừ 2 gene điều hòa dương N và Q, những gene bên trên phía bên tay trái của bản đồ gene quy ước mã hóa cho protein đầu và cuối của mảnh thể ăn khuẩn. 95
14. Sản xuất protein trong y học Theo sau nó là những gene mà sản phẩm protein liên quan với sự tái tổ hợp và quá trình hoạt hóa thực khuẩn của nhiễm sắc thể thể ăn khuẩn được chèn vào bên trong nhiễm sắc thể chủ và được tái tạo ổn định như là tiền thể ăn khẩn. Phía bên tay phải của bản đồ gene có liên quan đến sự điều chỉnh bản sao và tiền ăn khuẩn nhiễm vào cho tới lần thứ 2 ( N, cro,cl), theo cùng là những gene cho sự tổng hợp DNA, chức năng điều chỉnh chậm trễ (Q) và sự phân hủy của những tế bào chủ. Sự hiểu biết khá lớn của chúng ta về thể thực khuẩn λ và những con đường mà nó phân hủy và phân giải chu trình sống được điều khiển vừa được tạo nên λ một vector lý tưởng để mang những mảnh DNA ngoại bào. Lợi thế chủ yếu của λ căn cứ vào những vector ngoài bào plasmid có khả năng mà thể ăn khuẩn có thể xâm nhiễm vào tế bào E.coli. Khi chúng ta thực sự có 1 buổi thảo luận, sự biến nạp DNA plasmid vào trong vi khuẩn là 1 quy trình không có hiểu quả, sự xâm nhiễm λ là một con đường có hiệu quả để đưa DNA vào trong tế bào vi khuẩn. Để nghiên cứu làm thế nào mà λ có thể được lợi dụng như là một vector, thật là quan trọng để có 1 hiểu biết cơ bản về chính thể ăn khuẩn. Thể ăn khuẩn λ lây nhiễm và phân giải xảy ra được định rõ trong trong từng buớc. sự lây nhiễm xảy ra như là kết quả của sự hút bám của mảnh thể ăn khuẩn λ tới tế bào vi khuẩn bằng việc kết hợp với receptor maltose. Bộ gen DNA của λ được tiêm nhiễm vào trong tế bào và hầu như gửi thông tin ngay lập tức. ngay tại điểm này nó có thể xâm nhập bằng 1 trong 2 con đường. Con đường Lýogenic. DNA thể ăn khuẩn trở thành hợp nhất với hệ gen vi khuẩn tái tổ hợp via tương đồng giữa attP và khu vực hệ gene attB vi khuẩn) và tái tạo cùng với DNA của vi khuẩn. di chứng DNA tiền thực khuẩn kết hợp cho tới khi nó gây ra việc xâm nhập bằng con đường phân giải 96
15. Sản xuất protein trong y học Con đường phân giải. Số lượng to lớn của những mảnh thể ăn khuẩn (protein và DNA) xảy ra mà cuối cùng dẫn đến sự phân giải tế bào. Sự giả quyết khi sự phân giải hay phân huỷ xảy ra là kết quả của hoạt động của protein cII, Hoạt tính của CII thì phụ thuộc vào bản sao của chất ức chế cI. Và một vài gene phụ thuộc vào sự hoà hợp với DNA thể ăn khuẩn bên trong nhiễm sắc thể E.coli. hoạt tính cII là kết quả sự chấp nhận con đường phân giải , trong khi cII không hoạt tính kết quả trong con đường phân huỷ cũng được kéo theo. Protein cII thì tương đối không bền và dễ bị ảnh huởng tới sự phân tách và phá huỷ của protease vi khuẩn. Những điều kiện của môi truòng ảnh huởng tới hoạt tính của những protease này. Khi phát triển ở mức trung lớn, ví dụ , proteases có hoạt động chung , giống như cII bị suy biến và λ phân giải xảy ra. Dưói những điều kiện của E.coli starvation , protease ít thiết thực và cho nên λ sẽ có nhiều sự phân giản thường xuyên hơn Cách hoạt động này rất có ý nghĩa cho tế bào thiếu đới này sẽ ít cấu thành thiệt suy yếu để tạo nên những mảnh thể ăn khuẩn mới. Con đường phân huỷ được mô tả bởi 1 chuỗi những bản sao xảy ra mà sản xuất sự khác biệt của nhưng protein mà phụ thuộc vào sự tái tạo ra DNA thể ăn khuẩn và sản phẩm của những mảnh thể ăn khuẩn mới. Bản sao sớm bản sao của gene N và cro xuất hiện. bản sao này được đưa ra để ngăn cản bởi sản phẩm của gene cI và trong 1 quá trình phân giải sự ngăn cản này là cơ bản của sự miễn dịch lần hai Bản sao chậm trễ sớm. bản sao protein N kêt shợp với RNA polymerase vi khuẩn và đẩy mạnh bản sao của gene thể ăn khuẩn cuộn tròn vào trong bản sao DNA Sự tái tạo. sự tái tạo lớn tiến đến 1 đơn khởi nguyên của khu vực tái tạo. sự tái tạo chậm trễ dẫn đến via 1 chu trình lăn cuôn tới sản xuất long concatamer của DNA thể ăn khuẩn mà nó kết hợp với những thể ăn khuẩn khác tại những vị trí cos Bản sao trễ. Sản phẩm protein của gene cro che lấp đi mức độ quan trọng và sau đó dừng lại ở bản sao sớm. sản phẩm của gene Q hoạt hoá bản sao, đưa đến kêt quả sản phwmr protein cần đến cho đầu và đuôi của mảnh thể ăn khẩun truởng thành, và những thể ăn khuẩn đó phụ thựôc vào sự phân huỷ tế bào vi khuẩn Cuối cùng, tập hợp thể ăn khuẩn mang đến khi 1 đơn vị chiều dài của DNA được mang vào tập hợp đầu bởi sự phân tách concatameric DNA tại vị trí cos. Đuôi thì được thêm vào và những mảnh truởng thành thể ăn khuẩn được hoàn tất. Cùng với sự phân huỷ tế bào , khoảng 100 mảnh thể ane khuẩn tổng hợp mới được phóng thích từ 1 tế bào lây nhiễm đơn vi khuẩn Wild-type λ DNA bao gồm một vài vị trí nhận ra enzyme hạn chế khác thường bên trong những mảnh DNA ngoại lai có thể được nhân vô tính, và do vậy mà nó không hoàn toàn thích hợp như là 1 vector để mang nhiều chuỗi. thêm vào đó, sự gắn kết của DNA vào trong λ thể ăn khuẩn có kích cỡ giới hạn Khả năng gắn kết sẽ chỉ mang đến với những mảnh DNA tương ứng giữa 78 và 105 % so với kích thuớc của hệ gene wild – type ( 37 – 51 kbp). Những giới hạn đạt ra hạn chế gay gắt với số lượng DNA mà có thể n\tạo dòng trong hệ gene thể ăn 97
16. Sản xuất protein trong y học khuẩn. Hai luận điểm quan trọng, tuy nhiên, giả thiết đưa ra mà λ có thể phù hợp như là vector tạo dòng. Đầu tiên nó được xác định sản phẩm gene phụ thuộc vào sự tái tổ hợp có thể bị loại bỏ bởi hệ gene λ và phân huỷ chu trình sống có thể vẫn đựoc hoàn thiện và những mảng có hình thái, DNA còn lại, thường nhắc đến như ở bên tay trái hay tai phải của hệ gene λ , khả năng có điều kiện tất cả chức năng tất yếu cho cong đưòng phân huỷ mang tới. Điều thứ hai, tất nhiên mang lại những enzyme giới hạn bởi những vị trí được nhận ra có thẻ được được loại trừ mà không có chức năng gene quá ít, mà cho phép sự phát triển của vector với vị trí duy nhất cho sự găn vào của DNA ngoại bào. 1 vector có thể theo cách đó được xây dựng mà nó thiếu những gene phụ thuộc vào sự tái tổ hợp, và vì vậy mà có thể chỉ nhập vào chu trình phân giải, nhưng có khả năng mang nhiều DNA lớn ngoại bào thêm vào. Hai buớc cơ bản của vector vừa được phát triển: Vector thêm vào – DNA được thêm vào trong 1 enzyme giới hạn nhận biết vị trí cắt Vector thay thế - DNA ngoại bào thay thế cho những mảnh DNA (mảnh nhồi) của vector Sự thuận lợi của vector thay thế mà nó có khả năng mang nhưng đoạn DNA lớn. ví dụ, λEMBL4 có 1 vector 42 kbp mà nó bao gồm có 14 kbp DNA đệm giữa bên tay trái và phải của λ. Sự gắn chặt chỉ của nhửng chủng λ sẽ tạo ra 1 hệ gene λ 28kbp. Cái đó quá nhỏ để xếp vào trong 1 mảnh λ . sự thêmvào DNA ngoại bào giữa 2 chủng λ tuy nhiên hệ gene đạt tới kích cỡ gói gọn. Giới hạn kích thuớc gói gọn là cách thức 98
17. Sản xuất protein trong y học mà λEMBL4 có khả năng lưu giữ những mảnh DNA ngoại lai khoảng chùng kích thuớc 23kbp ( hình 3.12) Giới hạn kích thước của gói λ như vậy cung cấp 1 bộ máy chắc chắn để DNA ngoại bào được thêm vào giữa chủng λ tới dạng tái tổ hợp. Một vài kế hoạch cơ bản khác để tìm ra để nhận dạng những thể ăn khuẩn λ tái tổ hợp Sự khử của gene cI. Một vài vector thể ăn khuẩn λ ( e.g λgt 11) có duy nhất enzyme cắt giới hạn nhận dạng những vị trí cắt chứa đựng vị trí gene cI. Những thể ăn khuẩn mà gene cI phá vỡ bởi sự thêm vào DNA ngoại lai có 1 thay đổi hình thái, mà những mãng tạo ra xuất hiện “ clear” khi kháng lại sự hỗn độn. tấm chắn của loại này là kĩ thật khó và phụ thuộc vào khả năng kết nối kỉ năng trên từng phần của nguời quan sát. Tấm chắn blue – white. Những vector ăn khuẩn λ ( e.g. λZAP) được xây dựng để chứa đựng gen lacZ giống hệt nhau của the α-fragment và β -galactosidase. Tấm chắn cho những thể ăn khuẩn tái tổ hợp có thể sau đó được hình thành trong tế bào E coli Nhanh chóng từ the ω-fragment của β –galactosidase trong 1 con đường giống nhau tạo nên tấm chắn tái tổ hợp trong pUC base plasmid. Một lựa chọn là hệ gene λ được tạo ra, vấn đề là làm thế nào để đưa DNA vào trong vi khuẩn mà nó có thể tái tạo lại trong E. coli ( hình 3.13), bình thưòng gói gọn trong vivo của λ DNA bao gồm đầu tiên làm pre-head. Một đơn vị chiều dài của DNA λ sau khi được thêm vào bên trong pre- head , với đơn vị chiều dài chuẩn bị bởi sự phân chia của hệ gene λ concatamerized tại những vị trí xung quanh. Một protein capsid thứ yếu D sau khi thêm vào trong pre – head để hoàn thiện đầu chín, và những sản phẩm của những hệ gene khác đáp ứng như là 99
18. Sản xuất protein trong y học protein chính yếu, bảo đảm sự liên kết của những đuôi đã hàn thành với dầu hoàn thành. Gói gọn λ của hệ gene tái tổ hợp có để xảy ra trong in vitro bằng cách lợi dụng 2 đoạn E.coli mà chống lại λ phân giải kìm hãm những điểm khiếm khuyết khác nhau gói gọn trong cô đưòng này. Một điểm khuyết trong sản xuất protein E, kết quả từ một sự thay đổi t\bên trong gene E, ngăn cản pre-head thành dạng thẳng BHB2688. một sự thay đổi trong gene D cản trở sự thay đổi của pre-head, với DNA kết thúc, bên trong dầu hoàn thiện trong strain BHB2690. thành phần của BHB2699/BHB2690 dung giải nhỏ nhất, tuy nhiên, hoàn thành một vài thứ thiếu hụt khác nhau và cung cấp tất cả những sản phẩm gói gọn chính xác ( hình 3.13 ). Do đó, hệ gene λ tái tổ hợp có thể đựoc tạo nên bằng in vitro và gói gọn trong mảnh thể ăn khuẩn bình thường truớc khi tái sinh và nhân lên trong tế bào Ecoli. 3.4. Các vector cosmid Chỉ những đoạn DNA phù hợp cho in vitro mới được chuyển vào thể thực khuẩn λ tại 2 điểm cos trong chuỗi trình tự ở khoảng 37 – 51 kbp. Vector cosmid đã được phát triển nhờ quan điểm này, và nó giống plasmid ở chỗ được đưa vào trong thể thực khuẩn λ ở điểm cos (Collins and Bruning, 1978). Hình 3.14 cho thấy toàn bộ cấu trúc của một vector cosmid và một hệ thống tạo dòng vô tính để chuyển DNA ngoại lai. Cũng như plasmid, cosmid gồm một bản sao và một marker lựa chọn. Cosmid cũng chỉ có duy nhất một enzyme giới hạn để nhận biết điểm để chèn các đoạn DNA vào. Sau khi phản ứng chuyển vừa xảy ra, thể λ mới sẽ được đưa vào tế bào E.coli. DNA được chuyển vào cũng giống như các λ DNA bình thường và nó sẽ truyền đạt thông tin bổ sung cho các điểm cos. Sẽ có hiện tượng thiếu hụt các chuỗi λ có nghĩa, tuy nhiên, những đoạn λ chuyển sẽ không chuyển sang giai đoạn này. Thông tin trong DNA sẽ được bảo vệ trong tế bào E.coli. Do vậy sự chọn lọc các thể biến dị sẽ dựa trên cơ sở của sự kháng thuốc kháng sinh và khuẩn lạc của vi khuẩn sẽ có dạng chứa các cosmid tái tổ hợp. Khi tiền thể thực khuẩn λ có thể chèn vào khoảng 37 – 51kbp, và hầu hết cosmid có kích thước khoảng 5kbp thì đoạn DNA ở khoảng 37 – 41 kbp có thể được tạo dòng thành những vector. Đây là một tính chất quan trọng so với việc tạo dòng từ chính các vector λ Cosmid, giống plasmid, rất bền vững, tuy nhiên phải chèn vào một đoạn DNA lớn điều này có ý nghĩa trong việc bảo vệ vector trong tế bào vi khuẩn. Các chuỗi DNA lặp lại thường gặp ở các DNA của sinh vật eukaryote, và sự tái cấu trúc của DNA có thể dẫn đến sự tổ hợp lại các trình tự lặp lại của DNA chèn vào cosmid. Khó khăn chính khi làm việc với cosmid là những sản phẩm tuyến tính, chuyển đoạn DNA vào cosmid và chèn nhiều vị trí cùng lúc. Hai vấn đề cơ bản đặt ra: Các phản ứng chuyển vào cosmid và chèn DNA, giống như những gì đã trình bày trong hình 3.14, sẽ tạo ra những phân tử DNA vòng không có khả năng tham gia vào phản ứng “bao gói” in vitro. Có nhiều hơn một phân tử DNA được lồng vào sẽ gắn vào giữa đoạn DNA cosmid. Điều này khiến cho cấu trúc DNA được lồng vào có vẻ sai khác. 100
19. Sản xuất protein trong y học Những khó khăn này có thể được khắc phục với việc cắt cosmid với 2 enzyme giới hạn khác nhau bằng việc tạo ra các điểm giới hạn trái và giới hạn phải để không kết hợp với vị trí nào khác (Ish-Horowicz and Burke, 1981). Enzyme phosphastase sẽ tác động lên DNA chèn để đảm bảo những đoạn lồng vào sẽ không chèn vào DNA của cosmid. 3.5 M13 vectors M13 và các họ hàng của chúng là f1 và fd là thực khuẩn E.coli, dạng sợi. M13 là một lysogenic phage giống đực đặc trưng (male – specific) – thực khuẩn thể sinh ra virus phân hủy vi khuẩn khi bị kích thích. Hệ gene của chúng là một DNA chuỗi đơn dạng vòng dài 6407 bp (hình 3.15). Thực khuẩn thể M13 (M13 phage) có kích thước 900 * 9 nm, chứa một vòng đơn phân tử DNA (goi là chuỗi +). M13 xâm nhập vào vi khuẩn qua “cảng” là tiêm mao. Phage gắn một đầu vào tiêm mao rồi chuỗi đơn DNA của chúng xâm nhập vào vi khuẩn ( hình 3.16). Chuỗi đơn nhân đôi một cách nhanh chóng tạo chuỗi kép ( relicative form, RF) bằng cách tổng hợp mạch DNA bổ sung (mạch -) sử dụng DNA polymerase của vi khuẩn. Dạng RF của phage tăng lên theo cấp số nhân, khoảng 100 phân tử RF xuất hiện trong vi khuẩn. Quá trình phiên mã của hệ gene virus sản xuất những protein cần thiết cho sự lắp ráp một virus mới. Chuỗi đơn mã hóa protein (protein mã hóa bởi gene 2 ) thúc đẩy sự sao chép RF DNA chỉ có 101
20. Sản xuất protein trong y học trên một mạch đơn của DNA virus( mạch +). Các chuỗi phân tử DNA mạch đơn được lắp ráp trong các cơ thể virus mới rồi được giải phóng khỏi tế bào mà không phá hủy tế bào đó. Một tế bào vi khuẩn giải phóng khoảng 1000 phage trong một vòng đời của nó. Sự xâm nhiễm của thực khuẩn thể M13 không gây chết tế bào. Tế bào E.coli không bị phá hủy nhưng chúng phát triển chậm lại do phải gánh vác việc tổng hợp các bộ phận của phage. M13 nguyên thủy của quá trình sao chép (gọi là f1 ori) chứa 2 chuỗi DNA riêng biệt xếp chồng lên nhau có nhiệm vụ kiểm sóat quá trình sinh tổng hợp DNA. Hai vị trí – f1 initiator (khởi đầu) và f1- terminator (kết thúc) là dấu hiệu nhận biết sự bắt đầu và kết thúc sinh tổng hợp DNA. Vị trí khởi đầu được nhận biết bởi protein tổng hợp từ gene 2 – nằm trên mạch + trong RF DNA. Ở vị trí này, vòng DNA bắt đầu sao chép theo một chiều nhất định và kết thúc ở vị trí f1 terminator cũng được nhận biết bởi protein mã hóa bởi gene 2. Sự chuyển đổi giữa dạng mạch đôi RP và mạch đơn (+) của hệ gene của M13 làm nảy ra ý tưởng ứng dụng chúng làm vector. Chúng ta sẽ theo dõi ở chương sau, DNA mạch đơn tổng hợp từ phage rất thuận tiện trong kĩ thuật chuyển gene đột biến invitro (chương 7) và DNA sequencing (chương 8). Khác với λ, M13 không có “ vùng không cần thiết” có thể bị hủy trước khi gắn DNA ngoại lai. Nhưng lại có vùng intergenic (vùng hoạt động) giữa vùng khởi đầu của quá trình lặp và gene 2( hình 3.15) trong đó đoạn DNA ngoại lai được chèn vào. Vector M13 được phát triển cuối thập niên 70 khi gene lacZ (mã hóa α- peptide của β-galacttosidase ) được chèn vào hệ gene M13 102
21. Sản xuất protein trong y học (Messing và cộng sự, 1977). Sau đó, polylinker tương tự và những đoạn α–peptide như dòng pUC plasmid được chuyển gene vào hệ gene M13, vùng nhận biết của enzyme cắt giới hạn bị loại bỏ (Yanisch-Perron, Vieira and Messing, 1985; Norrander, Kempe and Messing, 1983). Dạng RF của vector M13 có thể được xử lí qua các bước chuẩn bị như DNA plasmid và DNA ngoại lai được chèn vào như plasmid thông thường. Những ứng dụng đặc trưng của vector M13 giúp chúng được sử dụng như những phương tiện hình thành chuỗi đơn DNA. Một đoạn DNA ngoại lai được tạo dòng vô tính trong M13, một lượng lớn chuỗi đơn sau đó được cô lập dễ dàng từ các phage trưởng thành xuất ra từ tế bào vi khuẩn E.coli. Khó khăn chính ở dạng vector này là chúng sẽ không ổn định khi đoạn DNA ngoại lai gắn vào lớn hơn vài kilobases. (Zinder and Boeke, 1982). 103
22. Sản xuất protein trong y học 3.6 Phagemids Phagemids là những plasmid chứa đọan phage f1 gốc của sự sao chép để sinh mạch đơn DNA. Phagemids thường là những đoạn plasmid nhỏ vì vậy chúng có khả năng tiếp nhận những đoạn DNA lớn hơn chèn vào đó hơn vector M13-based. Phagemids lần đầu tiên được phát triển vào đầu những năm 1980, khi người ta khám phá ra rằng sự thêm vào của bản gốc f1 khi tái sinh có thể sao chép thành pBR322 để sinh mạch đơn DNA (Dotto và Horuichi, 1981; Dotto, Enea và Zinder, 1981). Sự sao chép bản gốc f1 không đủ để điều khiển sự sản sinh mạch đơn DNA, nhưng nếu một giống vi khuẩn mang phagemid trong cơ thể bị nhiễm độc bởi cấu trúc wild-type M13 hoặc f1 helper phage, thì sự sản sinh mạch đơn phagemid DNA sẽ xảy ra. Các phagemid mạch đơn DNA sẽ được đóng thành các hạt virus và tiết vào môi trường xung quanh theo cùng một cách mà các hạt thực khuẩn M13 được sản sinh. Ngoài ra, người ta khám phá rằng việc nhân bản bản gốc f1 trong việc định hướng đảo ngược sẽ dẫn đến việc sản sinh các mạch đối diện của DNA (Dente, Cesavent and Cortese, 1983). Vì vậy, mạch đơn DNA đại diện hoặc mạch của sợi nhân bản có thể sản sinh sau khi nhân bản vô tính thành một vector phagemid phù hợp. Những phagemids có một điểm là, khi phage hỗ trợ vắng mặt, sợi đôi DNA được tách ra như một plasmid bình thường. Hơn nữa, sự thiếu các gene bổ sung của thể thực khuẩn mà các vector cần mang nghĩa là kích thước nhỏ của chúng có sự gia tăng về công suất để mang những đoạn DNA bên ngoài. Những phagemids khác đã được phát triển để tận dụng lợi thế từ những khía cạnh khác nhau của plasmids, λ phage và M13 phage. Chúng ta thấy rằng sự sao chép bản gốc f1 đều có cùng khởi đầu và kết thúc. Trong bộ máy di truyền của thể thực khuẩn M13, những giải trình tự này trùng lập với nhau, như vậy việc sao chép lại sẽ bắt đầu và kết thúc sau khi đã hình thành bộ máy di truyền hình vòng. Những phần tử khởi đầu và kết thúc sẽ được phân cắt riêng biệt để xác định những điểm khởi đầu và kết thúc cho việc sao mã DNA. Một loại vector λ bổ sung, λZAP, được xây dựng như vậy phía bên trái và phải của cánh tay λ sẽ được kết nối thông qua giải trình tự DNA của một phagemid bắt đầu với f1 khởi đâu và kết thúc với f1 kết thúc (Short và cộng sự, 1988). Loại Vector này (hình 3.17) có khả năng thực hiện chức năng của một thể thực khuẩn λ, ví dụ, xây dựng cấu trúc thư viện cDNA. Tuy nhiên, DNA ngoại bào có thể được cắt từ λ phage dưới dạng một plasmid sau khi dã gây nhiễm lần 2 bằng thể thực khuẩn M13. λZAP chứa đựng tất cả những giải trình tự λ DNA cần thiết cho sự tăng trưởng của các yếu tố gây phân hủy (lytic), và giữa các sợi DNA này là một giải trình DNA cần thiết cho sự sao mã plasmid và chọn lọn (ColE1 ori và AMPR). Thêm vào dó, λZAP chứa gene lacZ và nhiều mạng lưới tự nhân bản với cùng một hình dáng tương tự với pUC plasmids. Giải trình tự plasmid trong vector bắt đầu với f1 khởi đầu và kết thúc với f1 kết thúc. Vector mang DNA ngọai bào có thể được chọn lọc bởi bộ lọc xanh-trắng của màng λ và DNA bổ sung có thể bị cô lập dưới dạng của một plasmid khi vi khuẩn chứa các thể thực khuẩn λ bị nhiễm bởi phage f1 hỗ trợ. Mạch đơn DNA sẽ phát “thông tư” và sẽ được đóng gói như một M13 – như một thể thực khuẩn và tiết ra từ tế bào. Sự ra đời của thể thực khuẩn M13 sẽ hợp thành chủng F_E.coli và việc 104
23. Sản xuất protein trong y học chọn lọc trên các ampicillin sẽ dẫn đến việc hình thành một cụm chứa những plasmid tái tổ hợp, để rồi sau đó có thể bị cô lập như những plasmid mạch đôi. 3.7 Nhiễm sắc thể nhân tạo. Hạn chế chủ yếu của hầu hết các vector mà chúng ta đã nghiên cứu cho đến nay là giới hạn về kích thước của DNA cần tạo dòng. NST của sinh vật nhân chuẩn chứa hàng trăm hoặc hàng ngàn gene, cùng với DNA những yếu tố cần thiết cho sự ổn định về chức năng của NST như telomeres và centromeres. Telomeres, trong đó bao gồm DNA và protein, được đặt ở cuối NST và bảo vệ chúng khỏi bị hư hỏng. Centromeres (tâm động) là những phân đoạn DNA lặp lại rất cần thiết cho sự sắp xếp của NST trong suốt quá trình phân bào. Các vector phải được thiết kế hợp lý sao cho nhân bản được nhiều đoạn DNA, do đó, để khôi phục sự sao chép NST một cách chủ động trong các phân đoạn DNA có thể dung kĩ thuật nhân bản vô tính. Nhân bản vô tính theo cách này cũng tương tự như nhân bản vô tính trong phage λ – với sự tái tạo lại của các phân tử DNA – ngoại trừ các DNA ngoại lai có thể được nhân bản vô tính với tỉ lệ cao hơn. 3.7.1 YACs Các NST nhân tạo của nấm men (YAC). Vector YAC cho phép tạo dòng, trong các tế bào nấm men, các đoạn DNA ngoại lai có thể có kích thước tới 500 kbp. Trong những vector chứa các thành phần quan trọng của NST, bao gồm cả các thành phần sau đây. 105
24. Sản xuất protein trong y học A yeast centromere (CEN4). Trình tự của tâm động, đảm bảo sự chia đôi và đi về 2 cực của tế bào như tâm động, được quy định bởi một đoạn DNA với kích thước 125 bp. Chuỗi hoàn chinh bao gồm 3 yếu tố: một phân đoạn dài 78-86 bp với hơn 90% lượng AT, một đoạn bảo tồn ở một bên và một đoạn bảo toàn ngắn ở bên khác (ghi nhận của Clarke – 1990). Yeast autonomously replicating sequence (ARS1). Trình tự sao chép tự chủ của nấm men, là yếu tố cần thiết của quá trình nhân bản trong tế bào nấm men từ sự tự sao chép của NST ở nấm men. Yeast telomeres (TEL). Trình tự đầu cuối của NST, Telomeres là trình tự đặt biệt (5_-TGTGGGTGTGGTG-3_) có mặt ở các đầu của NST trong nhiều bản sao và là cần thiết cho sự tái tạo và duy trì NST. Genes for YAC selection in yeast. Các gen phù hợp với sự lựa chọn của YAC. Vector có một bản sao chức năng của URA3, một gen liên quan đến sự sinh tổng hợp uracil, và TRP1, một gen liên quan đến sự sinh tổng hợp tryptophan, đó là sự lựa chọn của các tế bào nấm men có mang vector. Bacterial replication origin and a bacterial selectable marker. Vi khuẩn tái tổ hợp và vi khuẩn chuẩn di truyền. Để truyền các vector YAC vào trong các tế bào vi khuẩn, trước khi chèn vào hệ gen, các vector YAC thường chứa các ori ColE1 và các gen kháng ampicillin giúp cho sự tăng trưởng và phân tích trong E.coli. Hình 3.18. Cloning of very large DNA fragments into a YAC vector. 106
25. Sản xuất protein trong y học Quá trình tạo dòng các đoạn DNA trong 1 YAC được thể hiện sơ lược trong hình 3.18. Các YAC được cắt ở một vị trí xác định bằng một enzyme cắt giới hạn tạo thành hai nhánh mà mỗi nhánh đều có 1 chuỗi telomere ở cuối. Một trong hai nhánh chứa 1 trình tự sao chép tự chủ (ARS1), 1 trình tự trung tâm (CEN4) và có dấu chuẩn di truyền (TRP1). Nhánh khác chứa dấu chuẩn di truyền (URA3). Những đoạn DNA lớn (>100kbp) được nối giữa 2 nhánh (Anand, Villasante and Tyler-Smitu, 1989). Việc chèn các DNA ngoại lai vào đã bất hoạt tRNA của gen SUP4, thể hiện chức năng tRNATyr trong DNA vector. Trong một ade2–ochre của tế bào nấm men, sự biểu hiện của SUP4 là sự hình thành các khuẩn lạc màu trắng, trong khi đó việc chèn các DNA ngoại lai sẽ thể hiện các khuẩn lạc màu đỏ (Burke, Carle and Olson, 1987). Tế bào nấm men được đột biến ở gen sản phẩm ADE2 (mã hóa cho các enzyme phosphoribosylamino- cacboxylaza-imidazol) tạo ra nhiều con đường sinh tổng hợp adenine, làm chúng tích tụ trong không bào. Sự tích tụ này đã tạo cho tế bào có màu đỏ. Các YACs tái tổ hợp đã biến đổi một loại nấm men mà trong đó có sự sai sót ở các bản sao NST của các gen ura3, trp1 và ade2. Quá trình biến nạp này đã được xác định bằng các khuẩn lạc phát triển bất định trên những vùng thiếu uracil và tryptophan. Điều này đảm bảo rằng các tế bào đã nhận được một nhiễm sắc thể nhân tạo có cả hai telomere (vì sự bổ sung của 2 yếu tố dinh dưỡng) và nhiễm sắc thể nhân tạo có chứa DNA chèn (vì tế bào có màu đỏ). Có những khó khăn liên khi làm việc với YACs. Một số trong số này là được liệt kê dưới đây. Rất nhiều phân tử DNA lớn rất yếu và dễ gãy, vấn đề đầu tiên là sắp xếp lại. Theo ước tính có khoảng 10-60% bản sao được lưu trong thư viện bộ gen là thể khảm, tức là từ các vùng khác nhau của bộ gen trở thành một bản sao YAC đơn (Green và cộng sự, 1991.). Dòng vô tính có xu hướng không ổn định, với các DNA ngoại lai thường bị biến mất. Trình tự DNA vốn có lặp lại rất hiếm trong hệ gen của nấm men, và với việc chèn các trình tự DNA của người sẽ làm tăng tầng số tái tổ hợp trong YAC. Điều này có thể làm cho YAC không ổn định. Thật thú vị, tuy nhiên, các vector YAC lớn hơn ổn định hơn so với các vector ngắn, do đó nó được chọn để tạo các DNA lớn (Smith, Smyth and Moir, 1990). Có một tỷ lệ lớn các YAC nguyên chất mất trong suốt quá trình tăng trưởng Thật khó khăn để tách các YAC từ các NST vật chủ khác vì kích thước của chúng quá giống nhau. Việc tách chúng đòi hỏi kĩ thuật phức tạp pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) (điện di trên gel với trường dao động). Sản lượng của ADN là không cao khi YAC được phân lập từ tế bào nấm men. 3.7.2 PACs Để khắc phục một số vấn đề liên quan đến sử dụng cosmid hoặc hệ thống YAC, một phương pháp để nhân bản và đóng gói các đoạn DNA bằng cách sử dụng thể thực khuẩn P1đã được phát triển để cung cấp khả năng sao chép các đoạn DNA với kích thước lớn từ 70-95 kbp. Thể thực khuẩn P1 có một bộ gen lớn hơn nhiều so với phage 107
26. Sản xuất protein trong y học λ (trong khoảng 110-115 kbp), và vector cũng được thiết kế với các thành phần thiết yếu để P1 kết hợp vào một plasmid (Ioannou, 1994.). Sau khi được đưa vào E. coli, thể thực khuẩn P1 hoặc có thể thể hiện chức năng lytic của nó, sản xuất 100-200 hạt thể thực khuẩn mới và thay thế các hạt thể thực khuẩn bị hỏng, hoặc các hạt thể khuẩn bị hỏng có thể kiềm chế chức năng lytic của nó, và bộ gen của thể thực khuẩn được thống nhất trọn vẹn, ổn định, bản sao plasmid thấp. Thể thực khuẩn P1có hai quá trình tái tạo – một để kiểm soát quá trình chọn dòng vi khuẩn có chứa DNA lytic, và một cái khác là để duy trì plasmid trong suốt quá trình tăng trưởng không lytic. Trong chu kì không có lytic, các DNA thể thực khuẩn mới được tạo ra và được cắt tai một vị trí pac trước khi được chèn vào các phần tử thể thực khuẩn. Các bản sao của đoạn DNA ngoại lai trong vector P1, hoặc NST nhân tạo của P1 (PAC), được thể hiện trong hình 3,19. Các vector PAC được đồng hóa với các enzyme giới hạn ScaI và BamHI để tạo ra hai nhánh vector: một nhánh ngắn và một nhánh dài. Những đoạn dài từ 70 – 95 kb đã bị tách ra và bị thắt giữa 2 nhánh của vector để tạo ra một loạt các phân tử dài. Nếu thắt giữa 2 nhánh ngắn, kết quả sẽ tạo các phân tử không có P1 gốc và cũng không có gen KANR, và sẽ không khả thi. Nếu ở cả hai nhánh dài thì tại đó đều không có vị trí pac, và quá trình đóng gói các phage không xảy ra. Quá trình tái tổ hợp chỉ khả thi khi chèn các trình tự vào một nhánh ngắn và một nhánh dài. Phage P1 sử dụng 1 “head-full” để đóng gói và có thể chứa một lượng DNA dài khoảng 110 – 115 kbp. Điều này có nghĩa rằng khi chèn bất kì một đoạn có chiều dài hơn 90 – 100 kbp DNA đóng gói sẽ bị cắt trước khi loxP được chèn vào phage, và các phân tử này sẽ không thể truyền được thông tin khi đưa vào các vật chủ. Sau khi tiêm vào các tế bào vật chủ cre+ E. coli, các protein sẽ truyền thông tin đến các vị trí loxP trên DNA, và DNA sao chép bằng cách sử dụng các plasmid gốc. Các vector BamHi được đưa vào các DNA ngoại lai, nằm trong gen sacB của vi khuẩn (mã hóa lavansucrase). Biểu hiện của gen này là hạn chế sự phát triển của tế bào E.coli trên sucrose. Do đó tăng sucrose giúp việc lựa chọn các PACs. Sự lan truyền của các tế bào nấm men có chứa các PAC tái tổ hợp trên các vùng có hàm lượng sucrose cho phép các khuẩn lạc phát triển. Các PACs tái tổ hợp được duy trì như những plasmid trong thời gian E.coli sử dụng gen kháng kanamycin như một gen marker. Số lượng bản sao plasmid có thể được tăng lên 25 lần bởi isopropyl β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) đã kích thích promoter lac kiểm soát quá trình tạo bản sao trong PAC tái tổ hợp. Các phân tử DNA tái tổ hợp sau đó được tách plasmid bằng cách sử dụng các phương pháp truyền thống. Bằng việc sử dụng hệ thống đóng gói DNA P1, hệ gen DNA trong khoảng 70 – 95 kbp có thể dễ dàng nhân bản và thao tác. Các vector được thiết kế để cho phép tạo ra các PACs có thể chứa các đoạn chèn từ 130 – 150 kbp. Các ưu điểm chính của phương pháp đóng gói DNA P1. Các đoạn DNA có kích thước lớn cũng có thể được chèn vào các vector. Không có sự sắp xếp lại hay sự xóa các DNA bị methyl hóa do sử dụng hạn chế các giống vật chủ. DNA tái tổ hợp có thể dễ dàng phục hồi như plasmid. 108
27. Sản xuất protein trong y học Hình 3.19. Việc tạo dòng trong vector PAC. Các vector PAC chứa plasmid của vi khuẩn P1 và replicons lytic, cùng với một pac cho phép lắp ráp DNA vào các phage. Ngoài ra, các vector có thành phần pUC và các gen kháng ampicillin cho quá trình truyền đạt thông tin và lựa chọn các vector cho chính nó.Những trình tự bị mất trong PAC tái tổ hợp. Các DNA cần tạo dòng được chèn trong các gen sacB và đóng gói trong ống nghiệm để đưa vào phage P1. 3.7.3 BACs Nhiễm sắc thể nhân tạo của vi khuẩn (BAC) được tạo ra từ những kiểu plasmid F (Shizuya và cộng sự, 1992). BAC có khả năng mang khoãng 200kbp chuỗi DNA được chèn vào và điểm gốc nhân tố F của sao mã (oriS) duy trì cấp độ của nó khoảng 1 109
28. Sản xuất protein trong y học bản sao trên mỗi tế bào. thêm vào đó, BACs còn chứa 4 gene nhân tố F, là gene cần thiết cho quá trình sao mã và duy trì số lượng bản sao, repE, parA, parB và parC. Hình 3.20 mô tả cấu trúc toàn diện của một dạng BACs. Ngoài các gene nhân tố F, pBeloBac11 cũng chứa một maker kháng kháng sinh có thể được chọn (CAMR) và gene lacZ' chứa một dòng vô tính phức tạp cho screening xanh da trời - trắng của các BAC chứa các trình tự DNA thêm vào (Kim và cộng sự, 1996b). Ngoài ra, BAC chứa một vị trí  cos (cosN) và một vị trí loxP. Những vị trí này được dùng cho quá trình phân tách đặc biệt của các trình tự được chèn vào chứa BAC trong suốt quá trình xắp xếp giới hạn. vị trí cosN có thể được tách ra bằng cách dùng terminase alpha (Rackwitz, 1985), trong khi loxP được tách bởi protein Cre với sự hiện diện của một oligonucleotide trình tự loxP (Abremski, 1983). ngoài ra BAC được tạo ra chứa những vị trí chấp nhận những enzyme cắt giới hạn cực kì hiếm. ví dụ như I-Scel là một intron được mã hóa enzyme cắt giới hạn từ ty thể của nấm men Saccharomyces cervisia (Monteilhet và cộng sự, 1990). Hình 3.20 Cấu trúc của vector BAC Trình tự chấp nhận nó (5'- TAGGGATAACAGGGTAAT-3') không xuất hiện trong hệ gene người và do do rất hữu ích cho quá trình tuyến tính hóa vector không có sự tách ra của các đoạn DNA được chèn vào. DNA được thêm vào một BAC xuất hiện rất bền vững, nó có thể tồn tại nguyên vẹn trong vòng hàng trăm thế hệ tế bào E. coli và xuất hiện ít hơn trong các quá trình tái xắp xếp và hủy bỏ khi duy trì trong sự tái tổ hợp của tế bào chủ E.coli khiếm khuyết. trở ngại chính trong việc sử dụng các vector BAC là chúng hiện diện chì một hoặc là 2 bản sao. điều náy có thể gây rắc rối trong quá trình phân lập và screening. 3.7.4 HACs Nhiễm sắc thể nhân tạo của người (HAC) đã được tạo ra và có thể tồn tại trong những khoảng thời gian dài trong những tế bào nuôi cấy. như chúng ta đã biết, 3 yếu tố được yêu cầu cho sự bền vững của nhiễm sắc thể - trung đoạn, phần kết thúc và một origin cho quá trình sao mã. đoạn cuối trong nhiễm sắc thể người lặp lại trình tự ( 5'- 110
29. Sản xuất protein trong y học TTAGGG-3'), nhưng nó khác với trình tự tương đượng của nấm men và cả 2 không thể thay thế cho nhau. một YAC sẽ không có chức năng như một Nhiễm sắc thể trong các tế bào người. để giúp đỡ trong quá trình phân lập trung đoạn và các trình tự origin cho quá trình sao mã ở người, các HAC được tạo ra có thể thay đổi và duy trì trong các tế bào người (Henning và cộng sự, 1999). phương pháp này nhận ra các đoạn lặp lại phức tạp của một trình tự DNA có 171 bp (được gọi là một đoạn lặp vệ tinh alpha) được chứa trong một đoạn DNA có 3 triệu cặp base của nhiễm sắc thể X có những chức năng như một trung đoạn (Schueler và cộng sự, 2001). tính chất lặp đi lặp lại của những trình tự này làm cho chúng khó nghiên cứu và làm cho quá trình xác định trung đoạn của chính nhiễm sắc thể đó rất khó khăn. Hình 3.21. Một NST nhân tạo ở người trong các tê bào nuôi cấy. Một vệ tinh alpha tổng hợp chứa vi nhiễm sắc thể được hình thành bởi transfection của DNA vệ tinh alpha và các trình tự cuối từ các tế bào nuôi cấy. Một dòng vô tính được phân lập và cho thấy chứa 1 HAC (mũi tên trên hình) tìm thấy từ DNA transfected và không từ sự cắt cụt của các nhiễm sắc thể nội sinh. Hệ gene người chứa những gốc phức tạp cho quá trình sao mã. trung bình nhiễm sắc thể người chứa khoãng 150x106 bp DNA trong khi chức năng của enzyme DNA polymerase tối đa chỉ khoãng 3000 base được tái tạo mỗi phút. Quá trình sao mã được bắt đầu tại một điểm riêng biệt, mỗi nhiễm sắc thể sẽ tách ra trong vòng 1 tháng để được sao mã, hơn lúc nó thật sự xảy ra. Những điểm gốc sao mã phức tạp ám chỉ đến có nhiều nơi trên nhiểm sắc thể prokaryote nơi mà quá trình sao mã có thể bắt đầu và quá trình sao mã diển ra sau đó với tốc độ nhanh hơn. Trình tự của điểm gốc sao mã thì thoái hoá, nhưng sự phát triễn của HAC cho phép một sự xắp xếp chính xác hơn của những vùng này. Các HAC có tiềm năng lớn như là công cụ cho cả các nghiên cứu cơ bản và các phương pháp chữa bệnh trong y học. Các nhiễm sắc thể nhân tạo có thể điều khiển các vector liệu phap gene với nhiều thuận lơi hơn các vector từ virus trước đó. Chúng tồn tại như những thành phần thêm vào nhiễm sắc thể và vì thế sẽ không xuất hiện đột biến chèn vào.Chúng không giới hạn về số lượng DNA mà chúng có thể mang. Vì sự khác nhau giữa trạng thái của trung thể trong quá trình nguyên phân và giảm phân, chúng có thể được thiết kế không có chức năng trong phôi. Những khả năng này vẫn còn trong tương lai và sẽ phụ thuộc vào sự hiểu biết hơn nữa về chức năng của nhiễm sắc thể. 111
30. Sản xuất protein trong y học Chương 4 POLYMERASE CHAIN REACTION Những khái niệm chính:  PCR là khuếch đại những trình tự DNA cụ thể in vitro.  PCR cần có 2 mồi (primer), một trong hai mồi đó sẽ bổ sung cho mỗi mạch DNA và một DNA polymerase.  Những chu kì nóng và lạnh được lặp đi lặp lại nhiều lần sẽ làm khuếch đại đoạn DNA ở giữa hai vị trí liên kết của mồi thành một số lượng lớn DNA tái bản. Kĩ thuật PCR khởi đầu vào giữa thập niên 1980 (Saiki và cộng sự, 1985; Mullis and Faloona, 1987), không phải là không hợp lí khi nói rằng các tác động của PCR lên sinh học phân tử, khoa học pháp lí, chuẩn đoán các bệnh lí về gen ở người đã trở nên rộng mở hơn. Tự bản thân của quá trình này là một sự kéo dài cực kì đơn giản của chu trình sao chép DNA, nhưng nó sử dụng nhiều cách khác nhau để tạo nên nhiều sự nhân bản và thao tác trên DNA trong nhiều trường hợp thì dễ dàng và thích hợp hơn trong lần đầu tiên. Khái niệm đơn giản nhất thì PCR là sự sao chép lặp lại nhiều lần của một đoạn trên chuỗi DNA kép. Tiến trình này được trình bày sơ lược trong hình 4.1. Sự ưu việt của PCR là do nó có khả năng nhân bản một số lượng lớn các bản sao từ một phân đoạn DNA cụ thể trong một thời gian ngắn. PCR cũng có thể khuếch đại nhanh chóng một vùng nào đó trên phân tử DNA mạch đơn trong ống nghiệm để sinh ra một lượng đủ có thể được nhân bản, nối dài, hoặc phân tích bằng cách xác định giới hạn. Tác dụng của PCR đã được tôn vinh vào năm 1993 với giải thưởng Nobel hóa học cho Kary Mullis cho sự đóng góp của ông với khoa học. Mullis đã viết về các phát minh thú vị của mình (Mullis, 1990) và có thể tìm thấy cuốn tự truyện thú vị của Mullis trên web site giải Nobel ( laureates/1993/mullis-autobio.html). PCR liên quan đến hai mồi là hai chuỗi oligonucleotide, thường có chiều dài khoảng 17 đến 30 nucletide, cái mà nhận diện trình tự DNA mục tiêu để sao chép. Một trong hai mồi có trình tự giống với một mạch DNA (sense - mồi xuôi) trong khi mồi còn lại thì có trình tự giống như chuỗi DNA còn lại (antisense - mồi ngược). Mồi xuôi sẽ liên kết, bổ sung bắt cặp với các base, với mồi ngược và bắt đầu tổng hợp mạch DNA mới. Tương tự, mồi ngược cũng liên kết với mồi xuôi và tổng hợp mạch DNA mới của mồi xuôi mới. Chương trình PCR được chia làm ba giai đoạn riêng biệt, mỗi giai đoạn thực hiện ở nhiệt độ khác nhau (hình 4.1). Chu kì quá trình biến tính – bắt cặp với mồi (hay còn gọi là lai) – kéo dài được lặp lại 20-30 lần để đạt được mức độ khuếch đại mong muốn của một trình tự DNA cụ thể. Ba bước trong mỗi chu kì như sau:  Biến tính: hai mạch của phân tử DNA được tách ra bằng nhiệt độ. Như chúng ta đã biết trong chương 1, DNA có thể bị biến tính thuận nghịch bởi chu kì nóng và lạnh. Bước này thường được thực hiện ở nhiệt độ là 94oC.  Bắt cặp với mồi (lai): hai mạch mục tiêu sau đó được làm lạnh với sự có mặt của các đoạn mồi oligonucleotide. Một mồi sẽ nhận diện và gắn vào mạch DNA mục 112
31. Sản xuất protein trong y học tiêu và một mồi khác cũng sẽ nhận diện và gắn vào mạch còn lại. Các mồi được thiết kế sao cho đầu 3’ của mỗi đoạn mồi phải đối mã với cái còn lại, vì vậy sự tổng hợp DNA diễn ra trên cả hai mạch trong vùng giữa hai mồi. Nhiệt độ để bắt cặp của mỗi mồi với DNA mẫu thì phụ thuộc vào chiều dài và trình tự của mồi, và mức độ đặc trưng của các phản ứng PCR cụ thể thì có trong chương 2. Nhiệt độ thông thường được chọn trong phạm vi 45-60oC.  Kéo dài: DNA polymerase sẽ gắn vào đầu 3’ của mỗi liên kết oligonucleotide và sử dụng dNTP để tổng hợp mạch DNA mới theo chiều 5’-3’. Các thí nghiệm PCR đầu tiên sử dụng các phân đoạn Klenow DNA polymerase I như là enzym sao chép, nhưng do bước biến tính nhiệt, các enzym được thêm vào trong suốt mỗi chu kì. Một sự đột phá khi đưa ra Tag DNA polymerase từ vi khuẩn ưa nhiệt Thermus aquaticus (Lawyervà cộng sự, 1989). Tag DNA polymerase kháng với nhiệt độ cao, nó có chịu được nhiệt độ 94oC của giai đoạn biến tính và vẫn còn khả năng hoạt động tốt. Điều này có nghĩa là enzym không cần phải được bổ sung trong suốt phản ứng và các chu kì nóng - lạnh cần thiết trong PCR có thể được thiết kế tự động. Hơn nữa Tag DNA polymerase có nhiệt độ tối ưu cho sự sao chép DNA là 72oC. Ở nhiệt độ cao mà lúc đó các phản ứng kéo dài vẫn có thể diễn ra thì có nghĩa là giai đoạn bắt cặp mồi không bị sai sót.  Sau mỗi vòng của quá trình nhân bản PCR, một phiên bản mới của mỗi mạch DNA được tổng hợp, như minh họa trong hình 4.1. Vị trí bắt đầu của sự tổng hợp DNA được quyết định bởi liên kết của đoạn mồi oligonucleotide với DNA mẫu. Cụ thể trong quá trình lai thông qua liên kết hydro giữa cặp base, chính xác từng vị trí mỗi nucleotide cho tới các trình tự, cái mà được bổ sung vào mạch mẫu. Không có gì quá phức tạp, tuy nhiên sự tồng hợp DNA kết thúc như thế nào. Nếu chúng ta kiểm tra kết quả của một phản ứng PCR điển hình trên gel agarose như trong hình 4.2, ta sẽ thấy những dải đơn rời rạc được tạo thành. Điều này cho thấy những phân đoạn DNA được tạo thành đồng nhất, và chúng bắt đầu và kết thúc ở cùng vị trí. Để hiểu điều này xảy ra như thế nào, ta xem các đoạn DNA được tạo thành trong suốt nhiều chu kì của PCR. Một phân tử DNA mục tiêu (được mô tả bằng màu đỏ và xanh) chứa các trình tự bổ sung với hai oligonucleotide. Các oligonucleotide có tác dụng như là điểm bắt đầu cho sự nhân bản DNA. Các sản phẩm của mỗi chu kì PCR đều là mẫu cho sự nhân bản DNA của chu kì tiếp theo. Trong hình là sản phẩm của chu kì đầu PCR (xanh lá), chu kì hai (tím), chu kì ba (nâu). Sự hoàn thành chu kì dẫn đến hình thành hai phân tử DNA mạch đôi (được đóng khung), cái mà đầu của mạch 5’ và 3’ thích hợp chính xác với đầu của đoạn mồi oligonucleotide. Các chu kì tiếp theo dẫn đến sự gia tăng theo cấp số nhân của phân tử DNA này. Trong suốt chu kì PCR đầu tiên, hai mạch DNA mục tiêu được tách ra và quá trình nhân bản DNA bắt đầu tại điểm liên kết với mồi. Hai mạch DNA mới được tổng hợp ở cuối chu kì 1 (ở hình 4.3), sẽ có đầu 5’ xác định, như là được quy định bởi vị trí liên kết với mồi, nhưng đầu 3’ không xác định. Quá trình tổng hợp DNA không giới hạn ở một điểm cụ thể, nhưng nó sẽ chỉ dừng lại trong suốt bước biến tính nhiệt của chu kì 2. Mỗi mạch DNA có ở cuối chu kì 1 sẽ tiếp nối vào chu kì kế tiếp của PCR, và mỗi mạch sẽ có tác dụng như là mẫu cho sự liên kết với các mồi mới. Trong chu kì 2, 113
32. Sản xuất protein trong y học mồi sẽ gắn với mạch DNA mẫu ban đầu và các mạch được tổng hợp trong chu kì 1. Liên kết giữa mồi với mạch mẫu ban đầu sẽ đưa đến kết quả là tạo thành các sản phẩm tương tự trong suốt chu kì 1. Biến tính Bắt cặp mồi (lai) Kéo dài bằng DNA polymerase Lặp lại Hình 2: Khuếch đại PCR của một gen từ DNA. Hai đoạn mồi oligonucleotide được thiết kế để flank gen trong bộ gen người. Một phản ứng PCR diễn ra 25 chu kì, 114
33. Sản xuất protein trong y học một phần mười phản ứng được chạy trên gel agarose sắp xếp theo kích thước DNA. Gel được nhuộm với ethium bromide và được chụp dưới kính hiển vi. Hình 4.3: Các sản phẩm tạo thành trong suốt 3 chu kì đầu của một thí nghiệm PCR. Tuy nhiên, liên kết giữa mồi với mạch DNA được tổng hợp trong chu 1, tiếp theo đó là sự nhân bản, dẫn đến việc tạo thành một mạch DNA với đầu ở đầu 3’ và 3’ đều xác định. Điều này xảy ra bởi vì sự nhân bản DNA sẽ chấm dứt khi không có thêm trình tự DNA nào nữa được sao chép. Vì thế khi kết thúc chu kì 2 thì 2 mạch DNA được tạo thành (thể hiện trên hình với màu tím) có đầu 5’ và 3’ xác định. Tuy nhiên các base bắt cặp với các đoạn DNA có đầu 3’ không xác định. Một lần nữa, sản phẩm trong chu kì 2 của tiến trình PCR sẽ đi vào chu kì 3, lần nữa mỗi mạch DNA được sử dụng làm mẫu để mồi gắn vào. Vào cuối chu kì 3, phân tử DNA mạch đôi được tạo thành và cuối mạch 5’ và 3’ bắt đầu và kết thúc tại những vị trí mồi gắn vào trình tự DNA mục tiêu ban đầu. Ngoài chu kì 3 của PCR, các chu kì biến tình nhiệt, bắt cặp mồi, kéo dài được lặp lại sẽ dẫn đến sự nhân lên theo cấp số mũ của một đoạn DNA mục tiêu cụ thể (hình 4.1). Sau 25 chu kì, thông thường của các thí nghiệm PCR, mong đợi sẽ khuếch đại khoảng 30 triệu lần, và sự khuếch đại vẫn đạt được như vậy trong thực tế. Tất cả các phản ứng PCR “bị nhiễm” bởi một lượng ít các phân đoạn DNA được tạo thành không đúng với chủ định nhưng không đáng kể, bởi vì phần lớn là sự khuếch đại của các phân đoạn DNA cụ thể. 115
34. Sản xuất protein trong y học Có nhiều yếu tố cần được xem xét khi khuếch đại một trình tự DNA cụ thể bằng phương pháp PCR. Nó bao gồm việc chọn lựa DNA polymerse được sử dụng, mẫu DNA, điều kiện phản ứng và trình tự mồi oligonucleotide. Chúng tôi sẽ thảo luận ngắn gọn về mỗi vấn đề ở phía dưới như là các thí nghiệm về kĩ thuật gen có thể bị ảnh hưởng như thế nào, nhưng cái độc giả hướng tới là các văn bản với những khía cạnh thực tế của PCR theo chiều sâu hơn. 4.1 ĐIỀU KIỆN PHẢN ỨNG PCR  Thành phần của một phản ứng PCR bao gồm các thành phần:  DNA (0.01–0.1 μg)  Primer 1 (20 pmol)  Primer 2 (20 pmol)  Tris-HCl (20 mM, pH 8.0)  MgCl2 (2 mM)  KCl (25 mM) or KCl (10 mM) and (NH4)2SO4 (10 mM)  Deoxynucleotide triphosphates (50 μMeach of dATP, dCTP, dGTP, dTTP)  Thermostable DNA polymerase (2 units)  A total reaction volume of 50–100 μL. Chúng tôi sẽ nói về enzyme polymerase, DNA mục tiêu và mồi rõ hơn ở phần dưới. Một số thành phần phản ứng (Tris, KCl and MgCl2), nồng độ của các ion magiê trong phản ứng đóng vai trò quan trọng trong sự thành công của một phản ứng PCR (Hình 4.4). Mg là chất cần thiết cho DNA polymerase hoạt động, nhưng các đặc điểm của bất kỳ phản ứng PCR phụ thuộc vào nồng độ của Mg được sử dụng. Nồng độ Mg thấp , phản ứng không xảy ra vì enzyme polymerase không hoạt động. Nồng độ Mg cao, phản ứng sẽ mất đi đặc trưng và sản xuất nhiều sản phẩm không mong muốn. Nồng độ tối ưu Mg cần phải được xác định bằng thực nghiệm cho mỗi bộ mồi PCR riêng biệt, nhưng thường sẽ có trong khoảng từ 1-5 mM. Các thành phần đệm và muối của phản ứng (Tris và KCl) thường được sử dụng thường xuyên, mặc dù làm giảm nồng độ KCl kích thích DNA polymerase ở lại trên mẫu lâu hơn và đạt được một chiều dài lớn hơn của sản phẩm khuếch đại (Foord và Rose, 1994). 116
35. Sản xuất protein trong y học Hình 4.4 : Ảnh hưởng của nồng độ Mg về hiệu quả và đặc trưng của một thí nghiệm PCR. Một thí nghiệm PCR đã được thiết lập có chứa nồng độ MgCl2 khác nhau. Sau khi PCR, các sản phẩm đã được tách trên gel agarose và nhuộm với ethidium bromide. Các kích thước của sản phẩm PCR thu được được so sánh với một thang DNA mẫu (M). Tái sản xuất các yếu tố quan trọng cho thành công của PCR , của Qiagen GmbH. Một khi các phản ứng PCR đã được thiết lập, nó thường được phủ một lớp dầu để ngăn chặn sự bốc hơi của mẫu trong quá trình làm nóng - cách khác, một máy PCR với một nắp sẽ ngăn chặn sự bốc hơi nước nóng - trước khi được chịu các nhiệt độ khác nhau mà sẽ thúc đẩy sự biến tính, nhiệt luyện, và các thành phần mở rộng của một chu kỳ PCR. Điều kiện một chu kỳ cho một thí nghiệm PCR có thể được  94°C, 30 s – giai đoạn biến tính  60°C, 30 s – giai đoạn lai  72°C, 1 min – giai đoạn kéo dài Giai đoạn biến tính và lai ngắn, nhưng đủ để cho phép phá vỡ và gắn các liên kết hydro giữa các sợi DNA. Bắt đầu bao gồm một bước biến tính ban đầu (94 0 C, 2 phút) để đảm bảo rằng các mẫu DNA ban đầu là chuỗi đơn. Điều này thường không xảy ra khi tiếp xúc lâu với nhiệt độ cao sẽ chặn lại trong DNA mẫu. Chiều dài của sản phẩm PCR khuếch đại trong thời gian cho phép cho bước kéo dài của phản ứng. Hầu hết các polymerase sử dụng trong PCR sẽ tái tạo DNA trong ống nghiệm với tỷ lệ khoảng 500-1000 bp min-1 (Bảng 4.2). Thời gian mà các thí nghiệm PCR được ủ ở nhiệt độ giãn được điều chỉnh tùy thuộc vào chiều dài của sản phẩm ban đầu. 117
36. Sản xuất protein trong y học Số chu trình PCR được thực hiện trong một thử nghiệm cá nhân phụ thuộc vào số lượng cả hai mẫu DNA ban đầu trong phản ứng và lượng DNA cần thiết sau quá trình khuếch đại. Nói chung, để tránh các lỗi sao chép (xem bên dưới), như vài chu kỳ có thể sẽ được thực hiện. Điều này thường sẽ có trong khoảng 17-25 chu kỳ. Sau khi hoàn thành các chu kỳ , phản ứng chuẩn PCR bao gồm một bước kéo dài cuối cùng (72°C trong 5 phút) để đảm bảo rằng tất cả các DNA trong phản ứng này đã được nhân lên thành dạng mạch đôi. Giai đoạn kéo dài cuối cùng có thể làm tăng hiệu quả nhân bản của sản phẩm PCR (Li và Guy, 1996). 4.2. DNA POLYMERASE CHỊU NHIỆT: Các vi khuẩn Thermus aquaticus lần đầu tiên được phát hiện tại một số suối nước nóng ở Công viên quốc gia Yellowstone (Brock and Freeze, 1969). Từ đó nó được tìm thấy sống trong môi trường nhiệt trên khắp thế giới. Sinh vật này sống ở nhiệt độ từ khoảng 50 và 80°C, và nhiệt độ tối ưu tốc độ tăng trưởng của nó là khoảng 700C. Taq ADN polymerase là enzym monomeric với trọng lượng phân tử 94 kDa được phân lập từ các sinh vật (Chien,Edgar và Trela, 1976; Luật sư và cộng sự, 1989) Các enzyme chịu nhiệt, nó lặp DNA tại 74 0C và vẫn còn chức năng ngay cả sau khi ủ ở 950C. enzyme này bao gồm một hoạt động polymerase 5’ tới 3’ một hoạt động exonuclease 5’tới 3’, nhưng nó thiếu một 3’tới 5’ exonuclease (proofreading) hoạt động. Việc thiếu proofreading hoạt động có nghĩa là nếu một cơ sở không chính xác được đưa vào chuỗi polynucleotide mở rộng, nó không thể được loại bỏ và do đó Taq ADN polymerase là dễ bị lỗi và gây những đột biến cho các sản phẩm PCR khuếch đại. Trong thử nghiệm in vitro, Taq ADN polymerase misincorporates một base 104- 105 những base lặp lại (Barnes năm 1992; Cline, Braman và Hogrefe, 1996). Các sự 118
37. Sản xuất protein trong y học khác biệt lớn trong tỷ lệ lỗi ước tính là do, một phần, với những phương pháp được sử dụng gây những đột biến. Theo ước tính mức độ thấp nhất, với tỷ lệ lỗi của 10 -4 lỗi cho mỗi cặp base tái sử dụng, nếu một chuỗi 1 kb là khuếch đại cho 25 chu kỳ với Taq sau đó khoảng 10 phần trăm của các sản phẩm khuếch đại sẽ có đột biến. Tuy nhiên, vì những đột biến xảy ra trong một chu kỳ sẽ được khuếch đại trong chu kỳ sau đó, thực tế tần số đột biến có thể khác nhau từ các thí nghiệm thử nghiệm. Mức độ báo lỗi là không, tuy nhiên, ảnh hưởng đến ảnh hưởng đến kết quả của một thí nghiệm.Nếu phản ứng PCR đang được thực hiện chỉ đơn thuần là để xác định sự có mặt hay vắng mặt của một gen trong một phân tử DNA mục tiêu, sau đó sự thành công của phản ứng này sẽ không bị ảnh hưởng bởi sự xuất hiện của lỗi vào trong trình tự khuếch đại. Tuy nhiên nếu là để khuếch đại gen để nghiên cứu chức năng, sau đó PCR sai sót có thể ảnh hưởng đến thử nghiệm. Các vấn đề về báo lỗi có nghĩa là, tuy nhiên, sản phẩm PCR có thể bị phân tích trình tự DNA trước khi chúng được sử dụng trong các thí nghiệm nhân bản. Ngoài ra, một số dòng vô tính PCR độc lập nên được lựa chọn để đảm bảo rằng các trình tự thu là điển hình. Một chức năng khác của Taq ADN polymerase tác động đến trình tự của sản phẩm PCR cuối cùng là xu hướng của các enzyme để kết hợp một deoxynucleotide (thường là một adenosine) một cách độc lập mẫu kết thúc ở đầu 3’của sợi DNA mới tổng hợp. Một hệ quả của hoạt động này là sản phẩm PCR được sản xuất bởi Taq không thể kết thúc, nhưng đã có đầu 3’ đơn A nhô ra dư lượng. Đặc tính này đã được khai thác để hỗ trợ nhân bản của sản phẩm PCR (xem bên dưới). Kể từ khi tìm ra Taq polymerase DNA, một số ADN polymerase chịu nhiệt khác đã được mô tả và đã được sử dụng trong các thí nghiệm PCR. Trong khi Taq vẫn là thông dụng nhất của các enzym chịu nhiệt cho PCR, polymerase từ các nguồn khác có tính chất khác nhau mà làm cho chúng hữu ích cho các ứng dụng nhất định (Bảng 4.2). Một số các DNA polymerase chịu nhiệt khác, ví dụ Pfu polymerase cô lập với furiosis vật Pyrococcus, không có một hoạt động 3’tới 5’ exonuclease proofreading, và như vậy tốc độ đột biến giảm. Sử dụng ví dụ trên, nếu là 1 kb phân đoạn của DNA được khuếch đại hơn 25 chu kỳ với Pfu polymerase, sau đó chỉ có 0,1 phần trăm của các sản phẩm khuếch đại sẽ có đột biến. Ngoài ra, một số các DNA polymerase chịu nhiệt khác sản xuất sản phẩm PCR thấp (Bảng 4.2). Các hoạt động 5’ tới 3’ exonuclease của Taq polymerase DNA có nghĩa là enzyme có khả năng làm suy giảm mồi oligonucleotide trong phản ứng PCR. Điều này đặc biệt có liên quan trong bước biến tính đầu tiên của chu kỳ 1, khi các oligonucleotides không bị ràng buộc với các mẫu DNA, và trùng hợp tự do trong dung dịch. Trong chu kỳ nóng nhất, nhiệt độ của hỗn hợp PCR tăng từ nhiệt độ phòng (hoặc 4 0 C nếu phản ứng đã được thiết lập ở nhiệt độ) tới 94 0 C. Điều này có nghĩa rằng, tại một số điểm, nhiệt độ trong ống sẽ được 72 0 C - tối ưu cho polymerase - nhưng các enzyme sẽ không thể sao chép DNA vì tái sử dụng trong số các oligonucleotides với mẫu DNA. Nhiệt độ vượt qua nhiệt độ của enzyme mà sự sao chép không xảy ra sẽ có xu hướng dẫn đến suy thoái mồi, và PCR không hiệu quả. Để khắc phục vấn đề này, và để ngăn chặn các sản phẩm PCR không đặc trưng được tổng hợp trước chu kỳ, Taq polymerase DNA có thể được thêm 119
38. Sản xuất protein trong y học vào hỗn hợp phản ứng đã ở 94 0 C. Khi tăng nhiệt độ tăng cả sản lượng và đặc trưng của phản ứng PCR. Ngoài ra, Taq polymerase DNA có thể được trộn với một kháng thể cụ thể mà liên kết với enzyme và ức chế hoạt động của nó (Kellogg và cộng sự, 1994.). Các kháng thể - ức chế enzyme phức tạp sao chép ở nhiệt độ thấp, nhưng phức tạp không thể phục hồi phân ly ở nhiệt độ cao, sau đó enzyme là không ngăn cản các chức năng của nó. Sự tồn tại của một số ADN polymerase chịu nhiệt với những đặc tính khác nhau đã dẫn đến sự "pha trộn" của polymerase cho các chức năng cụ thể. Ví dụ, Taq ADN polymerase sản xuất sản lượng cao của sản phẩm PCR, nhưng dễ gây lỗi và có kích thước sản phẩm PCR tối đa khoảng 5-7 kbp. Pfu DNA polymerase, mặt khác, là ít hơn nhiều dễ gây lỗi, nhưng vẫn còn gặp khó khăn hiệu quả sản xuất sản phẩm PCR trên 7 kbp. Một hỗn hợp của hai polymerase (15 phần Taq và 1 phần Pfu ) đã được tìm thấy các mảnh DNA có hiệu quả khuếch đại lên đến 35 kbp dài với độ trung thực cao (Barnes, 1994). 4.3. DNA KHUÔN MẪU Hầu như mẫu DNA nào cũng có thể được sử dụng như một khuôn cho một phản ứng PCR, bao gồm dạng thẳng, plasmit DNA dạng tròn và đóng xoắn, genome DNA, cDNA DNA có nguồn gốc từ những chất phi vật thể, do vậy PCR đơn thuần là một chuỗi những phản ứng tiếp diễn. Với yêu cầu duy nhất là vị trí liên kết mồi tạo thành chuỗi giữa chúng là nguyên vẹn. Trong các trường hợp, nhìn về tương lai cho những lợi ích rõ ràng, chúng ta cân nhắc kĩ cho việc khuyết đại DNA mục tiêu đơn. Khi điều này chắc chắn đạt được trong thực tiễn và thường được tiến hành với quy mô số lượng DNA lớn. Khi với một lượng nhỏ DNA được sử dụng nhưng khi bị nhiễm tạp chất trong phản ứng PCR có thể trở nên một vấn đề nghiêm trọng. Khuếch đại đặc tính PCR trên quy mô lớn mà bị nhiễm tạp chất vào DNA có thể gây hỏng thí nghiệm. Nhiễm tạp chất có thể do nhiều nguyên nhân khác nhau bao gồm người đang tiến hành thí nghiệm,những mồi xuôi và mồi ngược sử dụng để thiết lập phản ứng và enzyme hoặc các chất cần thiết trong chính phản ứng. Trong một thí nghiệm PCR điển hình giữa 0,1 và 1 μg DNA sẽ được thêm vào phản ứng với một lượng tương đối thấp số chu kỳ PCR nhưng vẫn có thể được thực hiện được với nguyên liệu đầy đủ cho các thí nghiệm . Điều này làm giảm khả năng gây tạp nhiễm vào sự khuếch đại mong muốn. Với bao nhiêu bản sao của chuỗi mục tiêu đủ lượng DNA cần thiết? Nếu bạn thêm 1 μg DNA bộ gen của người để cho một phản ứng PCR, điều này tương đương với 1×10-6/ (6,4×109×650) = 2,4 × 10-19 mol, khi đó DNA của người có khoảng 6,4×109 bp của DNA và khối lượng trung bình của bp là 650 Da. Thành ra 1 μg DNA của người tương ứng 2,4 ×10- 19mol×6×1023(Avogadro’s number)=khoảng 144.000 phân tử.Điều này có nghĩa là với 1 gen đơn trong 1 μg sẽ tạo ra 288.000 DNA đôi. Tám triệu lần khuếch đại của một 1000 bp trong genomic DNA, trải qua 25 chu kì PCR, khoảng 10 μg của 1000bp của đoạn DNA. Với một phần nhỏ sản phẩm của PCR đủ để phát hiện bằng ethidium bromide trên điện di agarose. 120
39. Sản xuất protein trong y học 4.4 MỒI OLIGONUCLEOTIDE Sự thành công trong một thí nghiệm PCR là gần như hoàn toàn phụ thuộc khi mồi oligonucleotide. Các đoạn mồi cần phải được thiết kế để nhận ra đoạn DNA mà chúng cần được nhân lên. Mồi có những đặc điểm sau đây. + Độ dài mồi khoảng 17-30 nucleotid + Số lượng G và C vào khoảng 50% + Cách tính nhiệt độ của các cặp mồi được tính theo công thức 2(A+T) + 4(G+C)- sử dụng làm thí nghiệm xấp sỉ bằng nhau. +Các mồi riêng lẻ không nên bắt cặp bổ sung với nhau. Ví dụ, một mồi có trình tự như sau 5’-GAGATCGATGCATCGATCTC-3’ có thể là một lựa chọn tốt cho mồi PCR (dài 20 nucleotid, 50% GC, không có sự bắt cặp giữa các trình tự), nhưng nó sẽ tạo thành cấu trúc kẹp nếu đầu 5’ kết thúc liên kết với 3’ kết thúc có thể gây khó khăn trong việc bắt cặp của mồi trong phản ứng PCR nên không khuếch đại được. Hình 4.5. Các vị trí của mồi để khuếch đại một phần của gen GAL4 từ Saccharomyces cerevisiae . (a) Các trình tự DNA, và acid amin tương ứng trình tự, một phần của gen GAL4 . Các chuỗi ADN mã hóa đầu tiên 100 axit amin của protein Gal4p được thể hiện với màu nâu. Các vị trí của mồi để khuếch đại trình tự này được hiển thị. Lưu ý rằng mồi 1 là cùng trình tự như là mạch xuôi (sense strand) và sẽ do đó liên kết với các mạch ngược (antisense strand) và DNA polymerase sẽ tổng hợp ra một sợi mới. Tương tự như vậy, mồi 2 là trình tự giống như mạch antisense, để nó nhận ra các mạch sense và sẽ dẫn đến sự hình thành của một mạch antisense mới. (b) Các kết quả của thí nghiệm PCR được thực hiện với mồi của chính nó, hoặc là sự kết hợp của cả hai mồi. Các sản phẩm PCR sẽ được nhìn thấy sau khi ethidium bromide phát huỳnh quang trên gel agarose. Không nên có sự bắt cặp bổ sung giữa hai mồi hoặc trong đầu 3’ của một mồi. Ví dụ, hai mồi sau đây lần nữa xuất hiện là một sự lựa chọn tốt: 5’-GATCGATCGATACGTGATCC-3’ và 5’-CGTAGCTAGCTAGGATCACG-3’. 121
40. Sản xuất protein trong y học Tuy nhiên, đầu 3’ của những đoạn mồi được bổ sung cho nhau và có thể xảy ra việc tự bắt cặp mồi, điều này có thể sẽ được nhân lên trong các chu kỳ đầu tiên của phản ứng PCR: Hầu hết mồi phù hợp với các tiêu chí trên có thể được sử dụng trong thí nghiệm PCR, nhưng một số gói phần mềm miễn phí sẵn có, bao gồm cả một số trong đó được dựa trên web, đã được viết để hỗ trợ việc thiết kế mồi (Rozen và Skaletsky, 1998). 4.4.1 Tổng hợp mồi Oligonucleotide Hầu hết các oligonucleotides được thực hiện trên việc tổng hợp acid nucleic bằng cách sử dụng phương pháp phosphoramidite hóa học. Phosphoramidite oligonucleotide được tổng hợp hóa học đã được giới thiệu gần 20 năm trước (McBride và Caruthers, 1983). Các khối được sử dụng để tổng hợp được DNA phosphoramidite nucleoside (đôi khi được gọi là monome). Đây là những sửa đổi để ngăn chặn sự bắt cặp hoặc phản ứng phụ không mong muốn khác xảy ra trong quá trình tổng hợp. Chúng sửa đổi đầu 5’ (với một nhóm dimethoxytrityl) và đầu 3’ (với một β- cyanoethyl bảo vệ nhóm 3’-phosphite), và cũng có thể bao gồm thêm sửa đổi để bảo vệ các amin trong phản ứng chính có các cấu trúc vòng nucleoside. Phosphoramidite dẫn đến việc tổng hợp oligonucleotide diễn ra trong bốn bước như hình 4.6. Tự tổng hợp được thực hiện trên các chất hỗ trợ, thường dùng polystyrene. Polystyrene được nạp vào một cột nhỏ như các buồng phản ứng. Một cột nạp được gắn vào đường dây phân phối thuốc thử trên một tác nhân tổng hợp DNA và hóa chất phản ứng tiến hành dưới sự kiểm soát máy tính. Căn cứ được thêm vào chuỗi ngày càng tăng theo một chiều 3’-5’ (ngược với sự tổng hợp enzyme của polymerase DNA). Tổng hợp là bắt đầu sử dụng polystyrene, đã tác động với base đầu tiên thông một liên kết este tại 3’-hydroxyl (Hình 4.6 (a)). Sự tổng hợp primer bắt đầu bằng sự phân cắt của nhóm 5’-trityl (hình 4.6 (b)) bằng cách sử lí với axit. Monomer kích hoạt bởi tetrazole được nối với 5’-hydroxyl (hình 4.6 (c)) và kết quả là liên kết phosphite bị ôxi hóa thành phosphate bằng cách xử lý với i-ốt (hình 4.6 (d)). Điều đó hoàn tất một 'chu kỳ' của tổng hợp oligonucleotide. 122
41. Sản xuất protein trong y học : Hình 4.6. Sự tổng hợp của mồi oligonucleotide. Việc tạo thành 5’-AT-3’. Phophoramidite nucleoside được biến đổi với một nhóm bảo vệ dimethoxytrityl ở đầu 5’ (đỏ) và một cyanoethyl β-bảo vệ nhóm 3’-phosphite (màu xanh). Ngoài ra, một tác nhân biến đổi khác (màu xanh) bảo vệ cho các amin của mồi diễn ra ở bất cứ mọi nơi trong phân tử. Xem các đoạn văn để biết chi tiết về chu kỳ phản ứng Phản ứng ngưng tụ nucleoside có hiệu quả cao, với ít hơn 1 phần trăm của những nhóm 5’- hydroxyl không phản ứng với các nucleoside mới gắn vào. Để ngăn chặn các phân tử chưa phản ứng này tham gia trong các phản ứng tiếp theo dẫn đến việc xóa cắt không mong muốn, các nhóm chưa phản ứng 5’-OH bị khóa bằng cách acetyl hóa các acetic anhydride trước khi diễn ra bước oxy hóa. Hiệu quả của việc bắt cặp đảm bảo rằng mồi lên đến chiều dài khoảng 60 nucleotide chiều có thể được tạo thành một cách dễ dàng. Sau khi tổng hợp xong, oligonucleotide được cắt từ sự hỗ trợ của hydroxit amoni ở nhiệt độ phòng. Tiếp tục trong amoniac ở nhiệt độ cao sẽ tác động đến các nhóm phosphat thông qua xoá gốc β của nhóm cyanoethyl và cũng loại bỏ các nhóm bảo vệ từ các vị trí dị vòng. Các oligonucleotide hoàn thành có thể được tinh sạch từ các hóa chất bị nhiễm do sai sót, và chuỗi trình tự đầy đủ thường bị phân lập bằng cách lọc qua HPLC. Các lợi thế lớn cho tổng hợp hóa học mồi là bất kỳ trình tự nào cũng có thể được sản xuất nhanh chóng và tương đối rẻ (<0,5 % cho mỗi base). Các trình tự của mồi cũng có thể được trộn lẫn. Ví dụ, với các mồi được nêu trong HÌNH 4.6 nếu một hỗn hợp 01:01 của DT và DC monome đã được thêm vào để phản ứng ở giai đoạn C, sau đó sơn lót kết quả có thể có trình tự của một 5’-TA-3’ hoặc 5’-CA-3’. Các sản phẩm cuối cùng sẽ là một hỗn hợp bằng nhau của hai loài. Bởi kiểm soát số lượng của mỗi monomer thêm ở bước ngưng tụ, các mồi có thể được pha tạp với bất kỳ nồng độ 123
42. Sản xuất protein trong y học quy định tại vị trí bất kỳ trừ 3’-kết thúc. Ngoài ra, thay đổi cơ sở (ví dụ như những phosphothioates chứa, hoặc có nhãn với biotin) có thể được thêm vào trình tự mồi. 4.5 MỒI BẤT XỨNG (không khớp) Các đoạn mồi oligonucleotide dùng trong thí nghiệm PCR không cần phải phù hợp một cách chính xác với trình tự mục tiêu. Đặc biệt là khi tạo sự thay đổi, gây đột biến chuỗi DNA khuyếch đại hay để tìm kiếm trình tự gen tương đồng với một trình tự gen đã biết. Chúng tôi sẽ đưa ra một số ứng dụng đơn giản của đột biến dựa trên PCR nhưng phương thức tối ưu gây đột biến sẽ được biết ở chương 7. Nơi duy nhất trong đoạn mồi phù hợp với trình tự mục tiêu là đầu 3’. Nếu đầu 3’ của đoạn mồi không phù hợp với trình tự mục tiêu thì khi đó các polymerase sẽ không thể kéo dài mồi. Kết quả là quá trình PCRse4 thất bại, không đạt hiệu quả. Điều này sẽ gặp trong chẩn đoán đột biến điểm ở gen (xem bên dưới). Người ta nghĩ đến việc dùng PCR trong đột biến để khuyếch đại sản phẩm từ những đoạn mồi. Các mồi bắt đầu quá trình sao chép DNA nhưng chúng sẽ hợp nhất vào sản phẩm cuối cùng. Do đó, bất kì sự thay đổi giữa mồi và DNA mẫu đều sẽ được chuyển vào sản phẩm khuyếch đại. Vì thế không thể thấy những đột biến xảy ra ở đầu 3’ của mồi. Nơi tốt nhất cho ta thấy những thay đổi, đột biến đó là đầu 5' của mồi. Ở trường hợp này, chúng tôi cũng khuyếch đại cùng trình tự như trong hình 4.5. Tuy nhiên lần này các mồi oligonucleotide chứa các trình tự bổ sung tại điểm 5 kết thúc. Mồi 1 trong trường hợp này chứa trình tự nhận biết enzyme giới hạn EcoRi ở điểm 5 kết thúc của chuỗi, và được sử dụng để nhận biết những gen GAL4. Mồi 1 và mồi trong hình 4.5 sẽ liên kết giống nhau với chuỗi DNA mẫu. trình tự nhận biết EcoRi không tương xứng với trình tự mẫu, không đủ để ngăn chặn khả năng lien kết của mồi. Trình tự nhận biết EcoRi sẽ được sát nhập vào sản phẩm cuối cùng của PCR như trong hình 4.7. Mồi 2 trong trường hợp này chứa trình tự nhận biết enzyme giới hạn BamHi, ezym này cũng sẽ được sát nhập vào sản phẩm cuối cùng. Việc nhân bản sản phẩm cuối trở nên đơn giản khi được cắt bởi 2 enzym giới hạn, tuy nhiên không chắc là bản than sản phẩm PCR sẽ không có EcoRi hay BamHi. Thong thường đòi hỏi các enzyme giới hạn cắt đúng chỗ nhằm tách một cách hiệu quả. Vì vậy 3-6 dư lượng bổ sung sẽ được thêm vào điểm 5 kết thúc của mồi trước khi nhận biết enzym . Đây thường là G hoặc C(kẹp GC) để hiệu quả cắt là tối ưu. Bất kì sự không tương thích nào giữa mồi và DNA mẫu đều sẽ được chuyển tiếp vào sản phẩm PCR cuối cùng. Vì vậy, sự đột biến có được dựa trên các sản phẩm PCR cuối cùng bằng cách thay đổi trình tự của mồi. Đặc biệt muốn thay đổi trình tự gen mã hóa từ đó thay đổi trình tự acid amin của protein hay muốn thay đổi việc sử dụng codon của một gen. VD: enzyme giới hạn được nhận biết nhưng vẫn không thay đổi trình tự acid amin của protein kết quả hoặc sử dụng codon nếu protein kết quả được thể hiện ở mức độ cao. Hai mồi không trùng khớp với nhau được sử dụng trong việc tìm kiếm các gen mã hóa cho một protein đặc biệt và tìm kiếm gen tương đồng. Đặc tính biệt lập của protein phổ biến trong sinh hóa. VD: bạn có thể cô lập một protein và kết thúc một trình tự amino để tìm kiếm các acid amin Met-Ile-TRP-Phe. Mã di truyền thoái hóa khi trình tự acid amin này có thể được mã hóa cho các chuỗi DNA sau. Với trình tự protein ở chỉ tay, nó không thể biết codon nào sẽ được sử dụng trong một gen 124
43. Sản xuất protein trong y học đặc biệt để mã hóa một acid amin đơn lẻ. Do vậy để khuyếch đạitrình tự gen mã hóa protein, chúng ta phải thiết kế sự thoái hóa mồi. Các mồi chỉ có thể liên kết với các tổ hợp mà có thể mã hóa cho các trình tự protein.Mồi dưới đây có thể được tổng hợp theo tính chất này. Hình 4.7: Mồi để khuếch đại một phần của gen GAL4 từ genome của Saccharomyces cerevisiae và để bao gồm các enzyme nhận diện các vị trí đặc trưng. Các sản phẩm PCR cuối cùng chứa các trình tự có trong các mồi. Trong đó N là một hỗn hợp đẳng mol của A T C G. Các mồi trên sẽ được sản xuất như là một hỗn hợp của 24 cặp mồi khác nhau. Chỉ một trong 24 cặp mồi này sẽ mã hóa chính xác trình tự protein, những cặp mồi còn lại sẽ khác nhau bởi một nucleotide duy nhất từ trình tự mục tiêu và vẫn phát huy hiệu quả PCR. Trường hợp ở đây cho thấy, quá trình PCR đòi hỏi một mồi bổ sung phải nhận biết đến 3 trình tự. Bốn nucleotide sẽ thay nhau sử dụng inosine tại một vị trí trên mồi. Inosine là một purine,có trong tRNA có khả năng bắt cặp với C, T, A. Cặp đôi inosine-A sẽ không trùng khớp với DNA kép như là cặp purine-purine. Do đó, sẽ có một lượng năng lượng bị mất mát khi xoắn những chỗ phình ra trong lúc kết nối. Khi được yêu cầu, inosine có thể được sử dụng trên mồi tại vị trí bất kì trong 4 base trên. Mỗi inosine được dung sẽ làm giảm sự thoái hóa mồi xuống 4 lần. Sự không tương thích giữa inosine-G có thể xảy ra nhưng sẽ được khắc phục tại những vị trí khác trên mồi sao cho sự bắt cặp là chính xác. Sử dụng inosine trong mồi đòi hỏi các DNA polymerase dung trong thí nghiệm PCR phải có khả năng tổng hợp DNA trong một mẫu có chứa inosine. Taq polymerase có thể làm được điều này, nhưng một số polymerase khác không thể làm được như Vent và Pfu (Knittel và Picard, 1993). Trong cùng một loài nhiều gen có trình tự acid amin giống nhau (do đó trình tự gen cũng tương tự) mã hóa chức năng giống nhau trên những protein khác nhau. PCR có thể được sử dụng để xác định các thành viên trong cùng 1 loài them 1 lần với 1 số đặc trưng. Để minh họa điều này, quan sát 1 vài ví dụ đơn giản nhất. VD: K.POU- vùng chứa protein, là 1 loạt những nhân tố phiên mã tham gia bảo tồn vùng DNA ( figure 4.8a). miền này có nguồn gốc bởi 4 miền đặc trưng là 3 protein động vật có vú Pit-1, Oct-1, Oct-2 và gen-86 UNC từ giun tròn. Hai vùng có độ bảo tồn cao của miền là Pou và Pou homeodomain. Sau này có homeobox chứa protein kiểm soát sự phát triển ở ruồi giấm. 125
44. Sản xuất protein trong y học Sự thay đổi trong những gen này sẽ tác động dến sự phát triển của sinh vật. chẳng hạn những thay đổi trong gen Pit-1 (chuột)dẫn đến thất bại trong sự phát triển của tuyến yên và sự sản xuất những con chuột người lùn(lietal ,1990). Để xác định Othermembers của miền Pou mồi phải được thiết kế cho hầu hết các vùng bảo tồn cụ thể là Pou và homeobox Pou (hình 4.8b). Những đoạn mồi thoái hóa rất cao dựa trên sự thoái hóa của mã di truyền, nhưng được sử dụng thành công để xác định các miền Pou được bổ sung từ nhiều nguồn khác nhau(Lillycrop và cộng sự,1992). Hai mồi được hiển thị ở hình 4.8c đã đươc tìm thấy để khuyếch đại 1 đoạn DNA khoảng 400bp. Tính không đồng nhất là do sự khác biệt trong chiều dài của các gen mã hóa vùng Pou được khuyếch đại từ các mẫu DNA. Vấn đề này đã dẫn đến việc xác định nhiều gen mới bao gồm Brn-3 có trong các tế bào thần kinh, được đánh giá cao cho thấy sự khác biệt và quyết định sống còn của các tế bào thần kinh cảm giác và vận động ( Erkman và cộng sự,1996). 4.6. PCR TRONG CHUẨN ĐOÁN BỆNH DO GEN QUY ĐỊNH: Khả năng của PCR để khuyếch đoạn DNA cụ thể là một công cụ hữu ích trong việc chuẩn đoán bệnh về sự thiếu sót hay đột biến của gen. PCR đòi hỏi phải biết kiến thức cơ bản về chuổi DNA mà đoạn này sẽ được khuyếch đại, vùng đột biến sẽ được biết khi phân tích PCR có thể dẫn đến thất bại. Thuận lợi của phương pháp PCR là chỉ cần một lượng nhỏ DNA được dùng để chuẩn đoán. Mẫu của máu hoăc tế bào từ bên trong mô cung cấp đủ khoán chất để làm chuẩn đoán, trong khi mẫu nhỏ của màng long tơ có thể sử dụng để làm một chuẩn đoán trong utero. PCR được sử dụng để tìm ra cả đột biến chèn và đột biến điểm. 1 phạm vi rộng của công nghệ có thể được phát triển để tìm ra đột biến=PCR. Chúng tôi sẽ tập trung vào 1 cặp mẫu, nhưng người đọc sẽ nhận thấy rằng tồn tại nhiều thay đổi. Đột biến chèn hay bỏ: hội chứng Wardenburg một bệnh thừa hưởng nhiễm sắc thể trổi mà bệnh có đặc điểm biểu hiện bởi 1 sự kết hớp của bệnh điếc và màu da không bình thường. Bệnh này có thể chiếm hơn 2% trường hợp của người điếc trưởng thành, và thường hay lien kết với bệnh đớm trắng của tóc ở trước tráng và long mi trắng. Chắc chắn những dạng của hội chứng Waardenburg được gây ra bởi đột biến trong gen PAX-3 liên quan một yếu tố dịch mã trong sự phát triển của bệnh nhân bị phôi. Một trong những điểm đầu tiên được tìm thấy trong gen PAX-3 từ những hội chứng Waardenburg la mất 18 base trong DNA mã hóa. DNA trội trong yếu tố phiên mã, đột biến mất thể tìm ra trong những bệnh nhân bị bệnh Waardenburg bằng PCR. Mới có thể được thiết kế bên cạnh vùng đột biến (hình 4.9). khuếch đại của chuỗi . Sẽ hình thành một đoạn lớn DNA ( 156bp trong hình 4.9 ),trong khi sự khuếch đại của chuỗi đột biến sẽ hình thành 1 vùng DNA nhỏ hơn (138 bp trong hình 4.9) kích thước của những nhánh này dễ dàng nhận ra trên gel polyacrylamide hoặc gel agarose. Thật vậy, sự biểu hiện của đột biến có thể được quyết định bởi kích thước của sản phẩm PCR. Trong trường hợp này, do bệnh là gen trội , hầu hết người chịu đựng là dị hợp tử, có một bảng coppy của gen wild – type và bản coppy của gen đột biến, PCR khuếch đại của thể dị hợp sẽ mang lại 2 vùng DNA có kích thước khác nhau. 126
45. Sản xuất protein trong y học Hình 4.9: PCR phát hiện đột biến do mất đoạn. Các trình tự DNA tự nhiên (wild-type) của mạch xuôi là một phần của exon 2 từ gen Pax-3 ở người. Trình tự cho thấy phần đầu tiên của sự bắt cặp, là nơi có độ bảo tồn cao, có chức năng như là một yếu tố phiên mã. Một số bệnh nhân bị hội chứng Waardenburg vì bị xóa các trình tự được in đậm. Điều này dẫn đến việc xoá bảy amin axit (MAHHGIR) và sự hình thành của một codon mới (Agg mã hóa arginine). Tiếp theo là việc xoá sáu axit amin (MAHHGI) từ protein. Mồi được thiết kế sao cho nhận biết được vị trí xóa. (b) PCR khuếch đại DNA của cá thể bình thường với mồi 1 và 2 sẽ mang một đoạn ADN 156 bp. Khuếch đại DNA từ một cá thể bị đột biến Waardenburg với hai đoạn DNA dài 156 bp và nhỏ hơn 138 bp. Các chuỗi nhỏ có nguồn gốc từ các nhiễm sắc thể có chứa bp 18 bị xóa. Bởi vì hội chứng Waardenburg có tính chất đặc biệt, đa số những người bệnh là dị hợp tử. Đột biến điểm: phương pháp mô tả ở trên không thể được sử dụng để tìm ra đột biến điểm với một gen. Mồi sẽ tạo ra 2 vùng DNA có cùng kích thước cho cả đột biến và tự nhiên (wild-type). Sản phẩm của PCR có thể đưa ra để phân tích PCR nhưng điều này sẽ tốn thời gian. Điều này thì đòi hỏi là PCR đồng nhất đột biến bazơ đơn. PCR khai thác dựa vào đặc điểm của allen đặc biệt, theo cách này làm tăng khả năng kéo dài của DNA polymerase 1 mồi cần chính xác đầu 3’. PCR khuếch đại allen cụ thể của gen đột biến với β-globin là nguyên nhân gây ra bệnh lưỡi cầu hình liềm. Để tìm ra đột biến điểm của 1 gen 3 mồi phải được thiết kế để tham gia vào 2 phản ứng PCR mồi (mồi 3 trong hình 4.10) thì hiện diện ở cả hai phản ứng, trong khi đó những mồi khác (mồi 1 và mồi 2) được tìm ra sự có mặt hoặc là wild-type hoặc chuỗi DNA đột biến. Sự khuếch đại của wild –type chuỗi DNA với mồi 1 và 3 được thực hiện. Tuy nhiên, nếu mồi 2 va 3 được sử dụng phản ứng sẽ thất bại bởi vì sự ghép đôi không đối xứng giữa chuỗi wild- type và đuôi 3’ của mồi 2 . như vậy sự khuếch đại của chuỗi DNA đột biến với mồi 1 và 3 sẽ thất bại, PCR sẽ được 127
46. Sản xuất protein trong y học thực hiện bình thường với mồi 2 và 3 sử dụng cho chuỗi đột biến như mẫu. Kết quả của 1 phân tích thì được trình bày trên biểu đồ trong hình 4.10. Chúng tôi so sánh 1 chuỗi DNA wilp-type với một nhân vạt người mã bị đột biến đồng hợp tử. Nếu 1 cá thể ở dạng dị hợp ,khi đó phản ứng PCR sẽ thực hiện bình thường từ cả alen sẽ được biểu hiện trong DNA mẫu. Để chắc chắn rằng tất cả phản ứng PCR làm việc một cách chính xác, 1 sự thiết lặp mồi sự khuếch đại 1 vùng không lien quan đến gen thì bao gồm những kinh nghiệm làm PCR , vì thế một nhánh sẽ luôn luôn được biểu hiện, điều kiện PCR, và sự có mặt hoạc váng mặt 1 nhánh phụ thì được nghiên cứu. 4.7. TẠO DÒNG CÁC SẢN PHẨM PCR Như chúng ta đã biết, có thể tạo dòng các sản phẩm PCR bằng cách chèn thêm các trình tự phụ vào trên các đầu 5’ của các mồi để các enzym nhận diện được phối hợp. Cũng có thể tạo dòng các sản phẩm PCR một cách chính xác, thuận lợi bằng các tác dụng vận chuyển giới hạn của Tag DNA polymerase để thêm vào một lượng A tự do vào đầu 3’ của các sản phẩm PCR. Kết quả của việc này là hầu hết các phân tử DNA được khuếch đại sử dụng Tag polymerase có mạch đơn 3’ chứa các trình tự A bị dư ra (kí hiệu là 3’-A). Trong một quá trình gọi là tạo dòng TA, điều đó có thể tạo nên bằng cách sử dụng vector tuyến tính T, cái mà có mạch 3’ chứa các trình tự T ở cả hai đầu tạo nên sự chính xác, hiệu quả tạo dòng cao đối với các sản phẩm PCR (Zhou, Clark and Gomez–Sanchez, 1995;Marchuk và cộng sự, 1991). Việc bổ sung giữa các sản phẩm PCR 3’-A và các vector 3’-T làm tăng thêm hiệu quả ràng buộc, cái mà không xảy ra với các phân tử DNA có kết thúc như thường. Tiến trình tạo dòng TA được thể hiện sơ lược trong hình 4.11. Hình 4.10: PCR dò đột biến điểm. 128
47. Sản xuất protein trong y học a)Bệnh hồng cầu lưỡi liềm gây ra do đột biến một cặp base một sự biến đổi A thành T làm chuyển đổi Glu6 thành Val, trong gen β-globin ở người. Đối với cá nhân đồng hợp tử loại đột biến này, sự thay thế trong đơn phân β-globin trong hemoglobin dẫn đến việc giảm độ hòa tan của deoxyheamoglobin và hồng cầu có hình dạng bất thường. b)Xác định sự thay đổi của một base trong DNA sử dụng PCR với alen cụ thể. Hình 4.11: Quá trình tạo dòng TA của các sản phẩm PCR. Một vector plasmid được cắt bằng enzym cắt giới hạn tạo thành các đầu cùn, ví dụ EcoRV. Vector đã cắt sẽ tương tác với Tag DNA polymerase khi có deoxythymine triphosphate (dTTP). Tác dụng chuyển đổi có giới hạn của polymerase xúc tác thêm vào lượng dT đơn vào đầu 3’-hydroxyl của DNA. Kết quả là vector T được pha trộn với một sản phẩm Taq- generated PCR và cả hai đều sử dụng DNA ligase. Kết quả là sản phẩm PCR được tạo dòng chuyển vào trong vector T. 4.8. RT-PCR Như chúng tôi đã nói ở trên, PCR liên quan đến việc khuếch đại sợi đôi DNA. Tuy nhiên, DNA không nhất thiết phải là vật liệu khởi đầu cho PCR. Sự phiên mã ngược - phản ứng dây chuyền polymerase (RT-PCR) đã được nghĩ ra như là một phương pháp khuếch đại và định lượng RNA sau khi chuyển đổi của nó đến DNA. RT-PCR có thể được sử dụng để nhân bản, xây dựng thư viện cDNA và tổng hợp điều tra. Kỹ thuật này bao gồm hai phần (hình 4.12) - sự tổng hợp DNA từ RNA bằng quá 129