Bài giảng Sắc ký lỏng

Nội dung text: Bài giảng Sắc ký lỏng

1. Sắc ký lỏng
2. 1. Khái niệm về kỹ thuật sắc ký lỏng - Phương pháp tách - Các cấu tử được tách phân bố giữa pha tĩnh và pha động Mobile phase (Pha động) Stationary phase (Pha tĩnh)
3. - Quá trình tách dựa vào tính chất hĩa học, vật lý và hĩa lý của các chất. - Dựa trên 2 quá trình: Hấp phụ Giải hấp phụ - Xảy ra liên tục giữa 2 pha: Pha tĩnh: chất rắn hoặc lỏng Pha động: chất lỏng (1 chất hoặc hỗn hợp nhiều chất)
4. Pha động: hịa tan và di chuyển chất phân tích Pha tĩnh: giữ chất phân tích SKL chia thành 2 nhĩm - SK lỏng áp suất thường (sắc ký cổ điển) - SK lỏng áp suất cao (SKL hiệu năng cao: HPLC) (High Performance Liquid Chromatography)
5. Dựa vào bản chất của quá trình sắc ký, HPLC: - SK phân bố - SK pha thường (normal phase chromatography - SK pha đảo (reversed phase chromatography) - Sk trao đổi ion (ion exchange chromatography) - SK ghép cặp ion (ion pair chromatography)
6. - Dựa vào trạng thái pha tĩnh Pha động: Lỏng SK lỏng – lỏng (LLC) Pha tĩnh: Lỏng (Liquid – liquid chromatography) Pha động: lỏng SK lỏng – rắn (LSC) Pha tĩnh: Rắn (Liquid – solid chromatography)
7. Khi nối với đầu do (detector), HPLC cho phép: - Định tính: dựa vào thời gian lưu - Định lượng: dựa vào chiều cao hoặc diện tích peak
8. 2. Nguyên tắc cấu tạo của hệ thống máy HPLC 0 1 2 3 4 5 0: Nguồn cung cấp pha động (mobile phase) - Bình chứa pha động
9. 1: Bơm cao áp (hệ thống cung cấp dung mơi) - Bơm pha động vào cột tách - Điểu khiển tốc độ dịng, áp suất của pha động
10. 2. Van bơm mẫu (Injection valve): - Bơm mẫu PT vào cột tách theo những lượng mẫu nhất định Tiêm mẫu bằng tay Tiêm mẫu tự động (Auto sampler)
11. 3: Cột tách (Column) - Cột chứa pha tĩnh - Yếu tố quyết định quá trình tách sắc ký - Cột tách cĩ kích cỡ khác nhau - Chiều dài: 10 – 25cm - Đường kính: 2 – 5mm
12. 4: Đầu dị (detector) - Thiết bị phát hiện chất phân tích (định tính và định lượng) - Cĩ nhiều loại khác nhau tùy mục đích phân tích: UV-VIS, Huỳnh Quang, Độ Dẫn, Điện Hóa, Khối Phổ,
13. 5. Hệ thống ghi nhận và xử lý tín hiệu: - Thu thập và xử lý kết quả - Recorder, Computer + printer, software
14. Injector Hệ thống HPLC đơn giản Column Mobile phase Detector tM tR2 tR3 tR4 tR1 Start
15. Detector ♣ UV-Vis: detector phổ hấp thu phân tử →Xáv định các chất cĩ khả năng hấp thu quang ♣ Huỳnh quang (Fluorescence detector): xác định các chất cĩ khả năng phát huỳnh quang - Alflatoxin, Mycotoxin, Amino Acid, thuốc trừ sâu họ Carbamate, . ♣ Đầu dị chỉ số khúc xạ (Refractive Index Detector: RI)
16. ♣ Đầu dị độ dẫn (Conductivity detector): Xác định các ion vơ cơ, hữu cơ ♣ Đầu dị khối phổ (MS: mass spectrometry) Xác định phần lớn các chất hữu cơ
17. 3. Các quá trình tách trong sắc ký lỏng - Quá trình quan trọng nhất trong phương pháp sắc ký - Những cân bằng động xảy ra giữa pha tĩnh và pha động trong cột sắc ký - Là sự vận chuyển và phân bố liên tục của chất PT từ đầu cột đến cuối cột
18. - Chất phân tích luơn phân bố giữa 2 pha, trong đĩ pha động luơn chảy qua cột tách với một tốc độ nhất định hoặc gradient - Hiệu quả của quá trình tách phụ thuộc rất nhiều vào tương tác giữa các chất trong pha tĩnh và pha động - Mục đích chính của sắc ký là tách và định tính các chất trong hỗn hợp chất phức tạp
19. - Thời gian chất PT bị pha tĩnh lưu giữ (thời gian lưu) quyết định bởi: Bản chất của pha tĩnh, cấu trúc và tính chất của chất PT Bản chất và thành phần của pha động dùng để rửa giải chất PT ra khỏi cột sắc ký (pha tĩnh)
20. - Ghi lại tồn bộ quá trình tách sắc ký của hỗn hợp chất PT → sắc ký đồ gồm nhiều peak. - Đặc điểm của peak PT: Các peak cĩ thể tách rời nhau hồn tồn Chập nhau một phần Chập nhau hồn tồn
21. - Sắc ký đồ phản ánh quá trình tách sắc ký trong cột tốt hay khơng tốt. - Tách tốt: hỗn hợp cĩ bao nhiêu chất → cĩ bấy nhiêu peak riêng biệt khơng chập nhau - Chất nào bị lưu giữ mạnh sẽ được rửa giải ra sau cùng, chất lưu giữ kém sẽ ra trước
22. 4. Ưu điểm của phương pháp sắc ký - Cĩ thể phân tích đồng thời nhiều hợp chất - Khơng cần làm bay hơi mẫu - Độ phân giải cao nhờ quá trình tách trên cột - Độ nhạy cao (ppm-ppb) nhờ đầu dị - Thể tích mẫu phân tích nhỏ (1-100L)
23. Hỗn hợp chất tách khỏi nhau thế nào ? Flow Pha tĩnh
24. Tại sao lại cĩ sự khác nhau? Mạnh Yếu Do lực tương tác khác nhau
25. Các cân bằng trong cột HPLC Mẫu PT đi qua cột: tồn tại đồng thời 3 thành phần: - SP khơng chuyển động - Chất PT vừa chuyển động từ đầu cột đến cuối cột, đồng thời phân bố lại giữa SP và MP: Bị SP hấp phụ, rồi rửa giải bởi MP - MP: dung mơi rửa giải và chuyển động Tương tác với các chất, lơi kéo và mang chất PT ra khỏi cột
26. 3 tương tác chính: - Sự tương tác và cân bằng của chất PT với SP - Sự tương tác và cân bằng của chất PT với MP - Sự tương tác của SP và MP
27. PT Fb Fa Fc SP MP
28. Ftot = Fa + Fb + Fc - Chất nào cĩ lực tương tác lơn nhất sẽ bị giữ lại lâu trên cột - Chất nào cĩ F nhỏ → bị rửa giải đầu tiên - Ftot khác nhau nhiều thì quá trình tách tốt
29. • Quá trình tách diễn ra trong cột sắc ký column Vật liệu nhồi cột 3- 5m
30. Quá trình tách mixed sample Mobile phase column
31. 5. Sắc ký lỏng pha thường và pha đảo Pha thường Pha đảo Pha tĩnh Phân cực Khơng phân cực Pha động Khơng phân Phân cực cực
32. Cột nhồi trong sắc ký pha thường - Cột silica trung tính: -Bề mặt cĩ chứa nhĩm H H H phân cực (ưa nước): -OH O O O -Xác định các chất khơng Si Si Si phân cực hoặc ít phân O O O O cực Si Si
33. - Cột silica trên nền mạch carbon: -Si-CH2CH2CH2CN -Si-CH2CH2CH2NH2 -Si-CH2CH2CH2OCH(OH)-CH2(OH) + Cột cyano: đa mục đích + Cột amino: phân tích đường + Cột diol: protein
34. - Dung mơi chủ yếu: khơng phân cực + Hydrocarbon: hexan, pentan, octan + Aromatic hydrocarbon: benzen, toluen, xylen, + Chloroform CHCl3 + Methylene chloride CH2Cl2 - Dung mơi phụ: phân cực hoặc hơi phân cực + Ethanol, methanol, .
35. Liên kết hydrogen và thời gian lưu HO 1 Mạnh Phân SiOH 2 1 cực SiOH Yếu Rất yếu OH Rt 2
36. Liên kết hydrogen ♣ Mẫu phân tích cĩ: –COOH: nhĩm carboxyl Liên kết –OH : nhĩm hydroxyl hydrogen mạnh –NH2 : nhĩm amino ♣ Mẫu phân tích cĩ nhĩm tert-butyl hoặc các nhĩm khơng phân cực lớn → LK hydrogen sẽ yếu
37. Cột nhồi trong sắc ký pha đảo - Cột: khơng phân cực - Pha động: phân cực - Cột silica đã alkyl hĩa các nhĩm –OH trên bề mặt silica trung tính: Cột C18 (ODS) Bề mặt khơng phân cực Cột C8 (octyl) Cột C4 (butyl) hay ít phân cực Cột phenyl (kỵ nước)
38. → Xác định chất phân cực, khơng phân cực và ít phân cực
39. Thời gian lưu và liên kết kỵ nước HO 1 C18 (ODS) Yếu Mạnh OH 1 2 2
40. Dung mơi trong HPLC pha đảo - Dung mơi phân cực: Methanol (CH3OH: MEOH), acetonitrile (CH3CN: ACN) - Dung dịch đệm → Tối ưu hĩa tỉ lệ dd đệm/ dung mơi rất quan trọng để quá trình tách tốt
41. So sánh pha thường và pha đảo Thơng số Normal Phase Reversed Phase Độ phân cực của cột Cao Thấp Độ phân cực của dung Thấp Cao mơi Thứ tự rửa giải Chất kém phân Chất phân cực ra cực ra trước trước Tăng độ phân cực Rửa giải nhanh Rửa giải chậm dung mơi hơn hơn
42. Ứng dụng của HPLC - Chủ yếu xác định các hợp chất hữu cơ khĩ bay hơi trong nhiều đối tượng khác nhau: + Amino acid + Acid hữu cơ + Thuốc trừ sâu + .
43. Sắc ký ion (Ion Chromatography) Ion Exchange R Lực ion N+ R Sample R + + + + + + - Sample + SO3 + + + + + +
44. - Phân tích các hợp chất ion - Cĩ 2 loại cột: + Cột trao đổi cation - Strong cation exchange : (R-SO3 ) Weak cation exchange : (R-COO-) + Cột trao đổi anion: + Strong anion exchange : (R4N ) Weak anion exchange :diethyl aminoethyl)
45. Pha động: thường là dung dịch đệm trong dung mơi nước Anion: • Carbonat/bicarbonate (Na2CO3/NaHCO3) • Potassium hydroxide (KOH) Cation: • Nitric acid • Tartaric acid • Tartaric acid/dipicolinic acid • Tartaric acid/citric acid
46. Ơn tập 1. Khái niệm về phân tích định lượng 2. Tính tốn và xử lý số liệu phân tích 3. Phương pháp phân tích dụng cụ - PP phổ hấp thụ phân tử - PP phổ nguyên tử - PP điện hĩa - PP sắc ký lỏng 4. Các bài thực tập, tính tốn số liệu từ số đo thực nghiệm