Bài giảng Nuôi cấy mô tế bào thực vật

Nội dung text: Bài giảng Nuôi cấy mô tế bào thực vật

1. Sơ lược về lịch sử • Áp dụng trên hoa lan – 1 năm/1 lần. • Nhân qua protocorms, 1,000,000/năm. Chồi phát sinh Tái sinh thành cây từ protocorm hoàn chỉnh
2. Các phương pháp nhân giống vô tính in vitro • Chồi nách • Tạo chồi bất định • Tạo phôi soma
3. Nuôi cấy chồi nách Thân Lá Ngọn Chồi nách trên trục của lá
4. Lựa chọn mẫu nuôi cấy Các đặc tính mong • Ngọn (mô phân sinh muốn: đỉnh) • Dễ tiệt trùng • Chồi nách • Non • Hạt • Phản ứng tốt với môi • Lá trường nuôi cấy
5. Môi trường • Khi cắt mẫu nuôi cấy Ngọn - Auxin và Gibberellin ra khỏi cây mẹ, lấy đi nguồn dinh dưỡng cần phải cung cấp các chất này cho mẫu nuôi cấy. Lá - Đường, GA Rễ - Nước, vitamins Chất khoáng và cytokinin
6. Thành phần môi trường • Môi trường khoáng cơ bản • Đường • Vitamins • Nước • Hormon sinh trưởng TV - auxin, cytokinin, GA • Các chất tạo gel • Các thành phần không xác định
7. Đường • Khi nuôi cấy mô thường quang hợp không đủ cung cấp đủ đường thêm saccaroza 2-3% w/v. • Glucoza hay hỗn hợp glucoza và fructoza. • Khi nuôi cấy công nghiệp, các nguồn carbon khác (rỉ đường, dịch thủy phân tinh bột) có thể sử dụng.
8. Nuôi cấy tự dưỡng • Sinh trưởng không có nguồn carbon cần kích thích quang hợp • Cường độ ánh sáng lớn (90-150mMole/m2/s) điều kiện tự nhiên (30-50). • Nồng độ CO2 lớn (1000ppm) thông thường 369.4ppm. • Ức chế sự nhiễm VSV và cây dễ thích ứng khi chuyển vào nhà kính.
9. Môi trường khoáng cơ bản • Bao gồm các nguyên tố đa lượng (>mg/l) và vi lượng ( mg/l). • Tồn tại rất nhiều môi trường khoáng cơ bản. • Môi trường MS (Murashige và Skoog, 1965) là môi trường nuôi cấy chồi phổ biến nhất. • Môi trường Gamborgs B5 được sử dụng phổ biến cho canh trường huyền phù tế bào (không chứa NH4).
10. Vitamin • Chức năng là các coenzyme (vitamin nhóm B). • Mẫu nuôi cấy càng nhỏ, nhu cầu vitamin càng chính xác. • Thường sử dụng hỗn hợp vitamin (Nicotinic acid, glycine, Thiamine, pyridoxine). • Inositol thường sử dụng với nồng độ lớn gấp hàng trăm lần (100mg/l)
11. Chất kích thích sinh trưởng • Auxin • Cytokinin • Axit Gibberellic • Ethylene • Axit Abscisic • Các chất khác
12. Auxin • Không thể thay thế (không tồn tại đột biến) • Trong tự nhiên có 1 chất: Indole-3-acetic acid (IAA). Dẫn xuất tổng hợp: NAA, IBA, 2,4-D, 2,4,5-T, Pichloram • Kích thích sự phân chia tế bào và sự tăng kích thước. Tạo rễ. • Được tổng hợp ở mô phân sinh đỉnh.
13. Cytokinin • Không thể thay thế • Trong tự nhiên có 1 chất: Zeatin. Dẫn xuất tổng hợp: Benyzladenine (BA), Kinetin. • Kích thích sự phân chia tế bào. • Tạo chồi. • Được tổng hợp ở rễ.
14. Gibberellin • Tổ hợp 70 hợp chất tương tự gọi là các axit Gibberellic. • Thường sử dụng GA3 và GA4+9. • Kích thích sự kéo dài tế bào chiều cao cây và kích thước quả • Phá ngủ cho hạt. • Tổng hợp ở lá non.
15. Ethylene • Kiểm soát quá trình chín của quả. • Tổng hợp ở tất cả các tế bào làm tăng chiều dày thân và gây héo lá. • Ngăn cản quá trình tạo chồi bất định sử dụng AgNO3 hay norbonadien.
16. Axit Abscisic (ABA) • Có duy nhất 1 chất. • Kích thích sự héo của lá và ngủ của hạt. • Kiểm soát sự đóng khí khổng và tính chịu hạn ở thực vật. • Giúp tạo phôi soma.
17. Các chất tương tự hormon • Polyamin – vai trò quan trọng trong sự phát triển của phôi. • Axit Jasmonic – phản ứng của cây khi bị tổn thương. • Axit Salicylic. • Không được coi là hormon do nồng độ sử dụng cao. 07 March 2002 Dr. Michael Parkinson 23
18. Các thành phần không xác định • Nguồn hormon, vitamin and polyamin. • Ví dụ nước dừa, cao nấm men, cao malt • Không lặp lại • Hiệu quả
19. Kiểm soát quá trình phân hóa Cytokinin Đĩa lá Chồi bất định Rễ Mô sẹo Auxin
20. Điều kiện trong nuôi cấy mô TBTV • Vật liệu nuôi cấy khởi đầu phải phù hợp (một số loại mô phản ứng tốt hơn so với các mô khác) • Môi trường thích hợp • Điều kiện vô trùng • Cấy chuyển
21. Các giai đoạn trong nuôi cấy mô TBTV
22. Các giai đoạn nuôi cấy mô TBTV • Chọn vật liệu khởi đầu: thường từ các mô non, chưa bị phân hóa từ các cây mẹ khỏe, sạch bệnh
23. Các giai đoạn nuôi cấy mô TBTV • Tiệt trùng bề mặt mẫu nuôi cấy: sử dụng tác nhân oxy hóa, clo hoạt động, kim loại nặng, rượu kết hợp với các chất tẩy rửa Nồng độ Thời gian Tác dụng NaOCl 10-20% v/v 10-20 phút Oxy hóa / clo CaOCl 10-20% v/v 10-20 phút Oxy hóa / clo H2O2 1% v/v 10 phút Oxy hóa HgCl2 0.1% w/v 10-30 phút KL nặng Ethanol 70% v/v 30 giây • Đảm bảo điều kiện vô trùng sau tiệt trùng và trong khi cấy chuyển: tủ cấy vô trùng gió thổi ngang áp suất dương
24. Các giai đoạn nuôi cấy mô TBTV • Đưa mẫu nuôi cấy lên môi trường nuôi cấy thích hợp (mỗi loài, giống cây trồng có môi trường riêng) →Nhân nhanh trong ống nghiệm
25. Các giai đoạn nuôi cấy mô TBTV • Đưa cây vào vườn ươm
26. Các ứng dụng nuôi cấy mô TBTV • Nhân nhanh giống cây • Bảo tồn các giống, loài cây quí hiếm • Cho phép sản xuất quanh năm, không phụ thuộc vào mùa vụ • Làm sạch bệnh virut • Sản phẩm dễ được vận chuyển đi xa