Bài giảng Miễn dịch học ứng dụng trong phòng bệnh

Nội dung text: Bài giảng Miễn dịch học ứng dụng trong phòng bệnh

1. I. LỊCH SỬ PHÁT HIỆN VÀ DANH PHÁP • Vacxin có chức năng tạo miễn dịch cho cơ thể người và động vật để chống lại các bệnh truyền nhiễm. • Từ xa xưa, con người đã nhận thấy có những bệnh truyền nhiễm chỉ gặp ở một số loài động vật và trong cùng một vụ dịch có thể có cá thể mắc nặng, có cá thể mắc nhẹ. Mặt khác, có những bệnh sau khi bị bệnh qua khỏi thì vĩnh viễn không bị mắc lại, tức là con người đã biết tới những gì mà ngày nay chúng ta gọi miễn dịch. • Đối với các bệnh truyền nhiễm nguy hiểm, con người đã có một quá trình đấu tranh phòng chống để giành giật lấy sự sống.
2. • Để phòng chống bệnh dại, nhà khoa học nổi tiếng nhất người Hy Lạp (384 – 322 trước Công nguyên) đã đề nghị chặt bỏ tổ chức bị chó dại cắn. • Đấu tranh phòng chống bệnh đậu mùa, người ta đã biết lấy vẩy mụn đậu mùa phơi khô, tán nhỏ cho người lành hít để gây bệnh nhẹ, tạo nên một tình trạng miễn dịch. Phương pháp này mang lại những hiệu quả nhất định nhưng điều nguy hiểm nhất là không kiểm soát được liều lượng nên có thể gây chết người hoặc tạo ra ổ dịch trong cộng đồng. • Năm 1798, Edward Jenner, một thầy thuốc vùng Gloucestershive (thuộc Anh) đã dùng dịch mủ trong mụn đậu bò để chủng cho người tạo trạng thái miễn dịch chống bệnh đậu mùa. Đây là phát minh quan trọng trong sự phát triển của miễn dịch học, tức là mở đầu cho sự nghiên cứu về khả năng bảo vệ đặc hiệu của cơ thể chống lại các tác nhân gây bệnh.
3. • Sau đó, Luis Pasteur, trên cơ sở này đã thành công trong việc chế tạo vacxin phòng bệnh nhiệt thán, bệnh tụ huyết trùng gia cầm và bệnh dại. • Để ghi nhận sự kiện này, trong một hội nghị về danh pháp quốc tế người ta đề nghị gọi tất cả các chế phẩm sinh học có nguyên lý phòng bệnh như vậy với mọt tên chung là vacxin, xuất phát từ từ vaccinia – tên của virus đậu bò. • Danh pháp gồm 2 từ ghép: từ đầu: vacxin từ sau: tên bệnh • Hiện nay các thuật ngữ về các sản phẩm sinh học dùng trong thú y thay đổi giữa các quốc gia.
4. ➢ Ví dụ: • ở Mỹ: – Thuật ngữ vacxin được dùng để chỉ những sản phẩm chứa virus hoặc nguyên trùng sống hay nhược độc, vi khuẩn sống hoặc các axit nucleic. – Các sản phẩm chứa vi khuẩn chết và các vi sinh vật khác được gọi tên như bacterin, chất chiết của vi khuẩn (bacterial extract), các chất dưới đơn vị (sub units), độc tố vi khuẩn (toxoid). • Châu Âu: – Các sản phẩm dùng trong thú y được gọi là “các sản phẩm sử dụng cho động vật nhằm tạo ra miễn dịch chủ động hoặc bị động hoặc để chẩn đoán tình trạng miễn dịch”.
5. • Trong chương này, thuật ngữ vacxin bao gồm tất cả các sản phẩm tạo ra để kích thích sinh miễn dịch chủ động cho cơ thể động vật chống lại bệnh, việc sử dụng này phù hợp với thuật ngữ quốc tế, không liên quan đến các sản phẩm sinh học sinh miễn dịch thụ động, chất kích thích miễn dịch, chất điều trị dị ứng hoặc chẩn đoán bệnh. • Vacxin được coi là thành tựu vĩ đại nhất của y học hiện đại. Công tác tiêm chủng đã được thực hiện ở tất cả các quốc gia và đã thực sự trở thành tấm lá chắn để phòng chống nhiều bệnh truyền nhiễm ở người và động vật. Tuy nhiên vẫn còn nhiều bệnh truyền nhiễm hiểm nghèo do các vi sinh vật, đặc biệt là do virus gây ra vẫn chưa tìm được vacxin dự phòng. • Hiện nay, việc nghiên cứu để cải tạo các vacxin hiện có, chế tạo các vacxin mới đang là mục tiêu phấn đấu của các nhà khoa học.
6. 1.2. Khái niệm về vacxin • Vacxin là một chế phẩm sinh học trong đó chứa chính mầm bệnh hoặc kháng nguyên của mầm bệnh gây ra một bệnh truyền nhiễm nào đó cần phòng (nếu là mầm bệnh thì phải được giết hoặc làm nhược độc bởi các yếu tố vật lý, hóa học và sinh vật học). • Khi sử dụng cho động vật, vacxin tạo ra một đáp ứng miễn dịch chủ động giúp động vật chống lại được sự xâm nhiễm của mầm bệnh tương ứng.
7. 1.3. Nguyên lý • Vacxin tạo ra trong cơ thể sống một đáp ứng miễn dịch. • Hệ thống miễn dịch của cơ thể hoạt động, sinh ra kháng thể dịch thể đặc hiệu hoặc kháng thể tế bào chống lại những nhóm quyết định kháng nguyên của yếu tố gây bệnh. • Cơ thể sử dụng vacxin xuất hiện trạng thái miễn dịch thu được chủ động nhân tạo có khả năng chống lại sự xâm nhiễm của yếu tố gây bệnh tương ứng.
8. 1.4. Đặc tính cơ bản của một vacxin Vacxin phải đảm bảo 4 đặc tính cơ bản là:  Tính sinh miễn dịch hay tính mẫn cảm (immunogenicity) • Đó là khả năng gây ra đáp ứng miễn dịch dịch thể hoặc tế bào hay cả hai. • Tính sinh miễn dịch phụ thuộc vào kháng nguyên và cơ thể nhận kích thích. • Có nghĩa là phụ thuộc vào tính lạ của kháng nguyên, đường đưa của kháng nguyên và cơ địa của mỗi cá thể động vật.
9. . Tính kháng nguyên hay tính sinh kháng thể • Một vacxin khi đưa vào cơ thể phải có khả năng kích thích cơ thể sinh ra kháng thể. • Các yếu tố gây bệnh có thể có nhiều Epitop khác nhau. Trong đó có thể có Epitop quá nhỏ (Hapten) không có tính sinh kháng thể nếu để nguyên. • Muốn chúng sinh kháng thể chống lại mầm bệnh cần đổi chúng thành có tính kháng nguyên, thường kết hợp chúng với một protein mang tải vô hại.
10. • . Tính hiệu lực • Tính hiệu lực nói lên khả năng bảo hộ động vật sau khi được sử dụng vacxin. • Một vacxin đưa vào cơ thể, nhiều kháng thể được tạo ra nhưng không phải loại nào cũng có hiệu lực tức là tiêu diệt được yếu tố gây bệnh. • Do yếu tố gây bệnh có nhiều kháng nguyên khác nhau nên trong bào chế vacxin trước tiên phải làm sao cho đáp ứng miễn dịch chống lại những nhóm quy định kháng nguyên thiết yếu, nghĩa là nếu đánh vào đó thì yếu tố gây bệnh bị tiêu diệt hoặc chí ít cũng không còn khả năng sinh hại nữa.
11. • Vì thế, trong nghiên cứu sản xuất vacxin hiện nay người ta đang có những cố gắng phân lập những kháng nguyên hay nhóm quy định kháng nguyên thiết yếu để làm cho vacxin được thuần khiết và tiến tới có thể tổng hợp được chúng. • Ví dụ: – Với virus Gumboro thì protein PV2 là kháng nguyên thiết yếu; – virus cúm gia cầm thì kháng nguyên H và N là thiết yếu; – virus viêm gan B thì kháng nguyên bề mặt HBS là thiết yếu.
12. • Tính hiệu lực hay khả năng bảo vệ của vacxin được đánh giá qua thực nghiệm nhưng chủ yếu phải là đánh giá trên thực địa sau tiêm chủng ở các cá thể và mức độ miễn dịch quần thể, có thể thông qua hàm lượng kháng thể trung bình trong huyết thanh và tỷ lệ bảo hộ trong quần thể. – Trên ĐVTN: Đánh giá mức độ đáp ứng miễn dịch sau tiêm chủng vacxin và đánh giá hiệu lực bảo hộ là động vật qua thử thách cường độc. – Thử nghiệm thực địa: Vacxin được tiêm chủng cho một quần thể động vật, theo dõi thống kê các phản ứng phụ, đánh giá khả năng bảo hộ khi mùa dịch tới đồng thời tiến hành thử thách cường độc một nhóm ngẫu nhiên trong quần thể.
13. • Vacxin có hiệu lực là vacxin gây được miễn dịch ở mức độ cao và bảo vệ cơ thể động vật lâu bền. • Tuy nhiên, hiệu lực của một vacxin phụ thuộc vào nhiều yếu tố như bảo quản, vận chuyển và kỹ thuật tiêm phòng. • Vì vậy, người ta đã xây dựng một môn khoa học mới gọi là vacxin học (vaccinology) mà mục đích là nghiên cứu mọi biện pháp từ lúc sản xuất đến lúc tiêu dùng để tăng tính hiệu lực của vacxin.
14.  Tính an toàn: Đây là đặc tính rất quan trọng. • Sau khi sản xuất vacxin phải được cơ quan kiểm định nhà nước kiểm tra chặt chẽ về mặt vô trùng, thuần khiết và vô độc. – Vô trùng: Không được nhiễm các vi sinh vật khác. – Thuần khiết: Không được lẫn các thành phần kháng nguyên khác có thể gây ra các phản ứng phụ. – Vô độc: Liều sử dụng phải thấp hơn rất nhiều so với liều gây độc. • Sau sản xuất, vacxin phải được thử tính an toàn trong phòng TN, thực địa, ở quy mô nhỏ và đại trà. • Tần suất và mức độ nặng nhẹ của các phản ứng phụ nếu có phải được xác định trước khi được đem ra dùng chung, nhưng vẫn phải được theo dõi hết sức cẩn thận.
15. 1.5. Các loại vacxin ❖Có thể chia vacxin làm 4 loại sau: • Vacxin chết (vô hoạt) • Vacxin sống • Vacxin dưới đơn vị • Vacxin thế hệ mới sản xuất bằng công nghệ gen
16. 1.5.1. Vacxin chết • Là loại kinh điển nhất, nguyên tắc là làm chết yếu tố gây bệnh (virus hoặc vi khuẩn) nhưng vẫn giữ được tính mẫn cảm và tính kháng nguyên. • Vacxin loại này chủ yếu gây miễn dịch kiểu dịch thể.
17. ❖ Phương pháp làm chết yếu tố gây bệnh • Có 2 phương pháp: hóa học và vật lý. - Phương pháp hóa học: Dùng các hóa chất như formol để giết chết vi khuẩn. Ví dụ: vacxin tụ huyết trùng lợn vô hoạt, vacxin đóng dấu lợn vô hoạt. • Với virus có thể dùng các hóa chất khử có hoạt tính cao như Ethylenamine hay  propiolacton. Những hóa chất này vô hoạt hoàn toàn virus nhưng không làm biến đổi protein cấu trúc. Ví dụ: vacxin bại liệt salk dạng tiêm ở người vacxin dại bất hoạt dùng  propiolacton vacxin lở mồm long móng dùng Ethylenamine - Phương pháp vật lý: Dùng sức nóng, tia xạ (X, UV).
18. • Ưu, nhược điểm của vacxin chết ➢ Ưu điểm: Không độc, không gây ô nhiễm môi trường, tính an toàn cao. ➢ Nhược điểm: ✓Thời gian duy trì miễn dịch ngắn do lượng kháng nguyên cố định và ít dần chứ không nhân lên được như vacxin sống. ✓Liều lượng tiêm lớn do đó khó tiêm và dễ gây áp xe. ✓MD xuất hiện chậm, gây miễn dịch tế bào kém. ✓Không can thiệp trực tiếp vào ổ dịch ✓Phải đưa vacxin nhiều lần, tăng nguy cơ dị ứng. • Do là mầm bệnh cường độc, nếu bất hoạt không tốt sẽ có nguy cơ phát dịch. • Ví dụ: một vụ dịch bại liệt ở Mỹ do sử dụng vacxin bại liệt vô hoạt nhưng không triệt để.
19. 1.5.2. Vacxin sống • Là loại vacxin được sản xuất nhờ chủng virus hay vi khuẩn còn sống, hầu như không có tính gây bệnh cho động vật được tiêm phòng nhưng có khả năng gây đáp ứng miễn dịch mạnh, chúng nhân lên trong cơ thể vật chủ và tiếp tục tạo ra sự kích thích của kháng nguyên trong một khoảng thời gian. • Vacxin sống bao gồm: • Vacxin nguyên độc; • Vacxin vô độc; • Vacxin nhược độc.
20. ❖Vacxin nguyên độc: • Dùng chủng virus nguyên độc có quan hệ từ loài động vật khác. • Ví dụ: Dùng virus đậu bò làm vacxin phòng bệnh đậu ở người. • Đưa vào cơ thể virus có độc lực hoặc đã giảm một phần độc lực theo con đường thực nghiệm: Độc lực của virus sẽ giảm đi khi chúng được đưa vào cơ thể theo đường thực nghiệm (không giống sự xâm nhập của chúng trong tự nhiên). • Ví dụ: Tiêm phòng hội chứng viêm phổi ở người bằng adenovirus sống.
21. * Vacxin vô độc (vacxin nhược độc tự nhiên): Vacxin được sản xuất từ những chủng vi sinh vật vô độc phân lập trong tự nhiên. * Vacxin nhược độc hóa: được sản xuất từ những chủng vi sinh vật sống có độc lực yếu, không có khả năng gây bệnh cho động vật được tiêm chủng. • Các chủng vi sinh vật này được làm giảm độc lực bằng các phương pháp: vật lý, hóa học, sinh vật học và công nghệ gen.
22. Phương pháp làm giảm độc vi sinh vật ❖ Giảm độc bằng nhiệt độ: VSV gây bệnh thường nhậy cảm với yếu tố nhiệt độ, nếu nuôi cấy chúng ở nhiệt độ không phù hợp, vi sinh vật sẽ giảm độc lực nhưng vẫn giữ được tính kháng nguyên. • Ví dụ: – Vacxin nhiệt thán: nuôi ở nhiệt độ 42 – 430C từ 15- 20 ngày, vk mất khả năng hình thành giáp mô, độc lực giảm, sử dụng làm giống gốc sản xuất vacxin. – Vacxin Sabin dạng uống chống bại liệt: Chọn các chủng virus bại liệt đã đột biến, cho nhân lên nhiều lần trong tế bào thận khỉ, nuôi cấy ở nhiệt độ thấp. Virus có thể nhân lên trong tuyến nước bọt đường tiêu hóa nhưng không xâm nhập được vào mô thần kinh do đó không gây chứng bại liệt nữa. ❖ Giảm độc bằng yếu tố hóa học – Ví dụ: Vacxin BCG (Bacterium Calmette Guerin): Là một chủng trực khuẩn lao bò M.T. bovinus có độc lực cao, nuôi cấy trong môi trường có mật bò trong 13 năm sau 230 lần cấy chuyển, vi khuẩn đã không còn độc, được sử dụng để sản xuất vx BCG.
23. ❖ Giảm độc bằng phương pháp sinh vật học • Đây là phương pháp giảm độc vi sinh vật cổ điển: phần lớn vacxin virus sử dụng cho người, động vật được sản xuất theo phương pháp này. Người ta cấy chuyển sinh vật nhiều đời qua môi trường ít cảm thụ (động vật thí nghiệm hoặc môi trường nuôi tế bào). • Vi sinh vật không đủ điều kiện để thực hiện đầy đủ chu kỳ sống gây thay đổi hệ gen, do đó thay đổi về độc lực, khả năng gây bệnh. • Ví dụ: – Người ta dùng virus cường độc DTL tiêm truyền liên tục 155 đời qua thỏ sẽ thu được giống virus nhược độc DTL. – Virus dịch tả vịt chuyển 41 – 46 đời qua phôi gà. – Virus viêm gan vịt typ I cấy chuyển 54 đời quan phôi gà. – Virus bại liệt được cấy chuyển nhiều đời qua môi trường tế bào thận khỉ. – Virus sởi được nuôi cấy qua tế bào xơ phôi gà.
24. ❖ Ưu điểm của vacxin sống: - Tạo miễn dịch nhanh, mạnh, miễn dịch tồn tại lâu bền do vi sinh vật vẫn có khả năng nhân lên và tồn tại lâu trong cơ thể được tiêm chủng. - Tạo miễn dịch tế bào cao hơn vacxin chết. Có thể dùng can thiệp trực tiếp vào ổ dịch. - Liều lượng ít, dễ tiêm chủng. ❖ Nhược điểm: - Mức độ an toàn thấp do đột biến dẫn đến sự trở lại cường độc. - Tạp nhiễm virus trong nuôi cấy tế bào. Ví dụ: Tế bào thận khỉ có thể tạp nhiễm với SV40 (Simianvirus) - Khó bảo quản, chi phí lớn. - Không sử dụng được cho động vật mang thai. - Không dùng cho những vùng an toàn dịch.
25. Bảng so sánh giữa 2 loại vacxin Loại vacxin Chỉ tiêu Vacxin sống Vacxin chết Phương thức sản xuất Đơn giản Đơn giản Tính ổn định Tương đối ổn định Ổn định Liều lượng Thấp Cao Số lần đưa vacxin 1 lần Nhiều lần Chất bổ trợ Không Có Thời gian miễn dịch Dài Ngắn Đáp ứng miễn dịch IgG IgA, IgG CMI Tốt Kém Sự trở lại cường độc Có thể có Không
26. 1.5.3. Vacxin dưới đơn vị • Là vacxin sản xuất chứa những kháng nguyên tương đối tinh khiết phân lập từ virus hay vi khuẩn sinh bệnh • Một số vk gây bệnh bằng độc tố như Cl.tetani, Co.diphtheria, người ta nuôi cấy vi khuẩn, chiết tách độc tố, giải độc bằng yếu tố hóa học hoặc vật lý theo nguyên lý của vacxin chết. Các độc tố mất hoạt tính được gọi là giải độc tố (anatoxin) và được dùng làm vacxin. • Phảy khuẩn tả gây bệnh nhờ Enterotoxin, độc tố này gồm 1 dưới đơn vị A rất độc và 5 dưới đơn vị B không độc, nhưng B lại có khả năng sinh kháng thể bảo vệ nên người ta nuôi vi khuẩn, tinh lọc Enterotoxin, tách dưới đơn vị B dùng làm vx chống bệnh thổ tả. • Cần lưu ý rằng việc tăng độ tinh khiết có thể dẫn đến mất tính sinh miễn dịch hoặc sẽ bị các enzym phá hủy trước khi kích thích miễn dịch. Vì vậy loại vacxin này đòi hỏi phải có pr¬tin mang hay chất bổ trợ, ví dụ như muối nhôm. • Vacxin dưới đơn vị có mức độ thuần nhất và tinh khiết hơn toàn bộ vi sinh cho nên các tính mẫn cảm, tính sinh kháng thể và tính hiệu lực đều cao.
27. ❖ Ở một số bệnh do virus gây ra, vacxin không dùng toàn bộ hạt virus mà chỉ dùng một vài thành phần của virus như protein capxit hoặc glycoprotein vỏ ngoài do đó vacxin còn được gọi là vacxin dưới hạt (subvirion). ❖ Sở dĩ không dùng virus nguyên vẹn là do: – Nhiều loại virus không có khả năng nhân lên ở các tế bào nuôi cấy (virus viêm gan B). – Một số virus được coi là rất nguy hiểm nên không đảm bảo an toàn khi sản xuất kể cả vacxin sống hoặc chết (HIV) – Một số vacxin nếu sản xuất từ virus nguyên vẹn có thể ảnh hưởng đến cơ thể do gây phản ứng phụ (vacxin cúm). Các protein capxit hoặc glycoprotein vỏ ngoài thường gắn vào receptor trên bề mặt một số loại tế bào ký chủ, hoặc thu được từ huyết tương bệnh nhân, sau đó làm bất hoạt (kháng nguyên bề mặt của virus viêm gan HBSAg) hoặc có thể sản xuất bằng kỹ thuật tái tổ hợp ADN Các vacxin subvirion như: vacxin HA chống virus cúm typ A, B vacxin HBS chống virus viêm gan B.
28. 1.5.4. Vacxin thế hệ mới sản xuất bằng công nghệ gen 1.5.4.1. Khái niệm • Những tiến bộ về KH - KT trong lĩnh vực vi sinh vật, miễn dịch học, sinh hóa protein, đặc biệt là kỹ thuật gen học và công nghệ sinh học phân tử đã mở ra một hướng ứng dụng mới đó là nghiên cứu sản xuất các loại hình vacxin bằng công nghệ gen. • Những loại vacxin tạo ra bằng phương pháp này trên gọi là vacxin thế hệ mới nhằm phân biệt với các loại vacxin đã có được nghiên cứu sản xuất bằng phương pháp công nghệ truyền thống. • Một vacxin được gọi là vacxin thế hệ mới phải là thành phẩm của một quy trình có sự can thiệp, sử dụng, thao tác của công nghệ gen. • Hiện nay nhiều loại vacxin thế hệ mới đã và đang được đưa vào sử dụng có hiệu quả, góp phần vào việc phòng chống bệnh tật cho người và động vật.
29. 1.5.4.2. Nguyên lý • Trong một loại vacxin, yếu tố quyết định tính sinh miễn dịch chính là thành phần protein đặc biệt có trên bề mặt của VSV gây bệnh. Thành phần protein này được gọi là kháng nguyên và do một gen hay một số gen có trong hệ gen của VSV gây bệnh quyết định tổng hợp nên. Những gen chịu trách nhiệm về việc tổng hợp (hay sản xuất) protein KN được gọi là gen KN. • Nếu tách gen KN khỏi vật liệu di truyền của VSV rồi ghép vào một hệ thống plasmid vector thích ứng nào đó thì gen kháng nguyên này vẫn hoạt động như khi tồn tại trong hệ gen của VSV chủ và phân tử protein kháng nguyên được tổng hợp ra vẫn có thể có chức năng như cũ, tức là có tính sinh miễn dịch. • Chế phẩm protein kháng nguyên được tạo ra bằng kü thuËt • gen như thế được gọi là vacxin tái tổ hợp gen hay vacxin thế hệ mới – vacxin công nghệ gen.
30. Sơ đồ tạo vacxin tái tổ hợp véctơ dẫn truyền vị trí cắt vùng khởi khởi phát kết thúc TAA ATG động gen vacxin Plasmid cắt điểm mầm gen nối virus đậu vacxin vectơ Plasmid tái tổ hợp virus đậu chọn lọc Nuôi cấy tế bào tái tổ hợp
31. 1.5.4.3. Phân loại Vacxin thế hệ mới có nhiều loại. Căn cứ vào nguồn kháng nguyên nhân lên được hay không nhân lên trong cơ thể động vật, người ta chia vacxin thế hệ mới làm 2 loại: a. Vacxin có kháng nguyên sống được nhân lên, bao gồm:  Vacxin tái tổ hợp có vector dẫn truyền  Vacxin axit nucleic (vacxin ADN)  Vacxin xóa gen độc b. Vacxin có nguồn gốc kháng nguyên không nhân lên, bao gồm:  Vacxin chứa kháng nguyên là protein sản xuất bằng kỹ thuật gen  Vacxin ăn được  Vacxin peptit tổng hợp
32. a. Vacxin có KN sống được nhân lên, bao gồm:  Vacxin tái tổ hợp có vector dẫn truyền Loại vacxin này chứa 2 thành phần chính: - Đoạn ADN chứa gen mã hóa cho kháng nguyên chính được tách ra từ vi sinh vật gây bệnh. - Hệ gen của vector dẫn truyền. - Người ta tách rời gen kháng nguyên từ vi sinh vật gây bệnh rồi ghép vào hệ gen của vector dẫn truyền là plasmid hay vi sinh vật rồi đưa vào vật chủ. Là vi sinh vật sống nên khi gây nhiễm, chúng sẽ nhân lên do đó nguồn gen kháng nguyên và sản phẩm của gen kháng nguyên là protein kháng nguyên luôn được sản xuất ra tạo miễn dịch lâu bền cho cơ thể.
33. ❖ Các vector dẫn truyền • Hiện nay các vector dẫn truyền được chọn thường là những sinh vật (vi khuẩn, virus, nấm men, thực vật) thông dụng có thể nhân lên được ở nhiều loài động vật và đã được làm giảm độc hoặc vô độc bằng kỹ thuật gen. + Vi khuẩn S. typhimurium: đây là loại VK không độc được chọn làm vector dẫn truyền vì có các ưu điểm: • Dễ sử dụng qua đường tiêu hóa. • Có thể tồn tại và nhân lên ở tổ chức Lympho đường tiêu hóa, cung cấp protein kháng nguyên bền vững để gây đáp ứng miễn dịch toàn diện: dịch thể, tế bào và miễn dịch cục bộ. • Việc nuôi cấy vi khuẩn tái tổ hợp gen này dễ thực hiện và thời gian sản xuất rút ngắn.
34. • Hiện nay Sl.typhimurium được sử dụng phổ biến làm vector dẫn truyền để sản xuất các vacxin: cúm, viêm gan B, sốt xuất huyết, thổ tả, liên cầu khuẩn, KST sốt rét • Ngoài Sl. typhimurium, người ta còn sử dụng vi khuẩn E.coli và một số loài nấm men như Pichia pastoris hoặc Sacharomyces cerevisiae làm vector dẫn truyền. + Virus đậu bò vaccinia: thuộc nhóm Orthopoxvirus đã được sử dụng một thời kỳ dài làm vacxin phòng bệnh đậu mùa. • Hệ gen của vaccinia có 200.000 nucleotit và có khả năng tiếp nhận nhiều gen ngoại lai có độ dài 25.000 nucleotit → là vector lý tưởng để sản xuất vacxin đa giá.
35. • Mặt khác virus vaccinia có khả năng gây nhiễm vào nhiều loại vật chủ nhưng không gây bệnh, có thể nhân lên trong nhiều loại tế bào nuôi cấy, thậm chí ở nhiều dòng tế bào mà ở đó chúng không hoàn thiện được chu trình nhân lên → không bị dung bào → thuận tiện làm vector. Virus vaccinia tái tổ hợp có thể biểu hiện gen KN sớm và sản xuất ra protein KN gây đáp ứng miễn dịch toàn diện. • Các vacxin sử dụng virus vaccinia làm vector dẫn truyền như: • Vacxin ND với gen mã hóa kháng nguyên F • Vacxin cúm với gen mã hóa kháng nguyên H và N • Vacxin viêm gan B với gen mã hóa bề mặt HBS – Ag (Hepatitis B surface Antigen).
36.  Vacxin axit nucleic (vacxin ADN) • Đây là vacxin có thành phần chính là ADN của plasmid tái tổ hợp chứa gen kháng nguyên. • Gen mã hóa cho kháng nguyên của vi sinh vật gây bệnh được tạo dòng rồi gắn vào plasmid. Đưa plasmid tái tổ hợp vào cơ thể bằng cách vi tiêm hoặc bằng súng bắn gen. • Vacxin thường được tiêm vào cơ thể để đưa gen trực tiếp vào một số tế bào cơ. Khi vào trong tế bào, ADN của plasmid tái tổ hợp được nhân lên, protein kháng nguyên được sản sinh trực tiếp bởi tế bào vật chủ, chúng sẽ kích thích cơ thể sản sinh miễn dịch.
37. ❖ Ưu điểm của vacxin ADN: - Gen kháng nguyên biểu thị mạnh, thời gian sản xuất kháng nguyên lâu do đó tạo miễn dịch mạnh và lâu bền nên không cần tiêm nhắc lại. - Vacxin ADN rất an toàn vì gen độc đã được loại trừ, hiệu lực ổn định, dễ bảo quản, thuận tiện cho việc sử dụng, có ý nghĩa kinh tế. - - Tạo miễn dịch tốt ở những cơ thể bị suy giảm miễn dịch và cơ thể suy nhược. - Có thể thiết kế một vacxin đa giá do trên cùng một plasmid gắn nhiều gen mã hóa hoặc trộn nhiều loại plasmid có chứa ADN mã hóa cho các loại protein kháng nguyên khác nhau mà hỗn hợp vacxin ADN này không bị ảnh hưởng lẫn nhau, như thế sẽ đơn giản hóa được tiến trình tiêm chủng.
38. ❖ Nhược điểm • Thực nghiệm cho thấy khi đưa vacxin ADN vào cơ thể động vật, sự phân bố ADN vacxin trong tế bào không đạt được mức tối đa. • Mặt khác, nếu ADN vacxin hòa nhập vào hệ gen của động vật chủ sẽ gây hậu quả về di truyền ở các thế hệ tiếp theo hoặc có thể đột biến tế bào gây ung thư hoặc ức chế sự hoạt động của gen chống ung thư, gây biến đổi tế bào dẫn đến trạng thái tự miễn dịch. • Vacxin ADN thuộc thế hệ mới nhất, được coi là loại vacxin có triển vọng lớn. Hiện tại vacxin này mới được nghiên cứu thử nghiệm trên động vật như: – Vacxin ADN chứa gen HBsAg – Vacxin ADN chứa gen kháng nguyên chủ yếu của HIV – Vacxin ADN chứa gen H và N chống cúm
39. •  Vacxin xóa gen độc • Là vacxin chứa yếu tố gây bệnh được làm nhược độc bằng kỹ thuật gen cắt bỏ gen độc. • Ví dụ: – Để tạo ra giống gốc sản xuất vacxin cúm gia cầm, hiện tại Bộ Y tế và Viện khoa học công nghệ Việt Nam nhập ngoại chủng virus vacxin NiBRG-14 từ Viện Tiêu chuẩn và kiểm nghiệm sinh phẩm quốc gia – Vương quốc Anh thông qua WHO. – Chủng NiBRG-14 được tạo ra bằng kỹ thuật di truyền nhược thông qua việc ghép 6 gen của chủng /PR8/34 (H1N1) với 2 gen H5N1 của chủng A/Vietnam/1194/2004 (H5N1). – Riêng gen H5 bị loại 12 nucleotit mã hóa 4 axit amin thuộc vùng độc cho phép chủng virus này có thể nuôi cấy trên phôi gà. • Vacxin Aujeski cũng là một vacxin nhược độc kiểu này.
40. b. Vacxin có nguồn gốc kháng nguyên không nhân lên • Đây là các loại vacxin vô hoạt sản xuất bằng kỹ thuật gen bao gồm:  Vacxin chứa kháng nguyên là protein sản xuất bằng kỹ thuật gen • Loại vacxin này được sản xuất bằng cách tách gen kháng nguyên từ tác nhân gây bệnh, ghép vào hệ gen của một loại vi sinh vật làm vector dẫn truyền (vi khuẩn, virus, nấm men). • Nuôi cấy vi sinh vật tái tổ hợp này trong môi trường thích ứng như hệ thống bioreactor hoặc thiết bị lên men lớn, lượng protein sẽ được sản xuất với số lượng nhiều sau đó. • Chiết tách protein kháng nguyên để làm vacxin.
41.  Vacxin ăn được • Dùng thực vật là bioreactor để sản xuất dược chất protein là một xu thế phát triển của công nghệ sinh học. Nhiều gen mã hóa kháng nguyên virus được chuyển vào thực vật và đã biểu hiện với hiệu quả cao. Vì vậy, sản xuất vacxin ăn được là hướng nghiên cứu có triển vọng, vacxin ăn được có hoạt tính tương tự vacxin thông thường, chỉ khác là vacxin này được thực vật sản xuất trong những phần ăn được như lá, củ, quả và hạt. • Nỗ lực sản xuất vacxin ăn được từ thực vật đầu tiên được ghi nhận vào năm 1990 bởi 2 nhà khoa học Curtiss và Cardineu khi biểu hiện thành công protein kháng nguyên bề mặt A của vi khuẩn Streptococcus mutans ở cây thuốc lá. • Sau đó nhiều thành công khác về vacxin thực vật đã được công bố sản xuất trên nhiều loại cây khác nhau như rau diếp, cà chua, khoai tây, lúa mì, đậu tương và ngô
42. • Mặt khác, gọi là vacxin ăn được là đề cập đến sự chấp nhận của cơ thể động vật, tức là vacxin bền vững trong dịch tiêu hóa, sau khi ăn vào, vacxin không bị phân hủy và có khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch mạnh. • Người ta dùng thuật ngữ “Plan edible vaccine” để chỉ loại vacxin ăn được sản xuất từ thực vật biến đổi gen này. • Nguyên lý sản xuất vacxin ăn được: Vacxin ăn được là loại vacxin tiểu phần bao gồm một hoặc nhiều chuỗi polypeptit của protein kháng nguyên trong vi sinh vật gây bệnh, người ta chọn lọc những gen mã hóa cho các thành phần này, đưa vào vector (plasmid hoặc vi khuẩn, ví dụ Agrobacterium tumefaciens), dựa vào hệ thống di truyền thực vật để khuyếch đại gen và biểu hiện thành các protein kháng nguyên mong muốn trong các bộ phận ăn được của thực vật.
43. Các thành tựu nghiên cứu vacxin ăn được đã được công bố gồm: Nguồn Đối tượng Đáp ứng Tác giả, năm Protein/Peptit protein thực vật miễn dịch báo cáo Kháng thể dịch Tiểu phần B Độc Thuốc lá thể và kháng thể tế Hagetal, E.coli tố kém chịu nhiệt Khoai tây bào theo đường 1995 LT-B uống và ăn Vibrio Độc tố tả Arakawa, Khoai tây Cho ăn cholerac Tiểu phần B 1998 Virus viêm Mason etal, HBs-Ag Thuốc lá Chưa thử nghiệm gan B 1992 McGarvey Virus dại Glycoprotein Cà chua etal 1995 Lục lạp Tregoing Cl.tetani Ngoại độc tố Cho ăn thuốc lá etal, 2003
44. Sơ đồ tạo vacxin tái tổ hợp có vector dẫn truyền
45.  Vacxin peptit tổng hợp: • Là vacxin thành phần chỉ chứa duy nhất poly peptit kháng nguyên (8 – 20 axit amin) • Do chỉ có các epitop kháng nguyên nên không có khả năng kích thích sinh miễn dịch vì vậy sau khi các peptit được tổng hợp, người ta phải gắn chúng vào các giá đỡ đó là các hạt polyme có khả năng hấp phụ cao. • Ví dụ: vacxin peptit phòng bệnh lở mồm long móng, việc bảo hộ đạt được bằng cách tiêm cho động vật một tập hợp các chuỗi peptit kháng nguyên gồm 20 axit amin.
46. ❖Vacxin peptit có ưu điểm: – Sản xuất và kiểm soát chất lượng đơn giản. – Không có các thành phần không cần thiết như nucleic, protein ngoại lai do đó ít độc. – Có thể thay đổi theo sự biến đổi tự nhiên đối với những virus không ổn định như virus cúm. – Có tính khả thi thậm chí trong trường hợp không nuôi cấy được virus. – Ổn định, giá thành hạ. ❖Nhược điểm của loại vacxin là: – Sinh miễn dịch có thể kém so với các vacxin vô hoạt truyền thống. – Bắt buộc phải có chất bổ trợ. – Yêu cầu tiêm nhắc lại.
47. Sơ đồ tóm tắt phân loại vacxin Vacxin sống Vacxin Vacxin vô hoạt Vacxin sống nguyên độc Vacxin dưới trị Vacxin nguyên tử Vacxin sống vô độc Vacxin ăn Chứa protein KN tổng Tinh chế bằng Tinh chế bằng nguồn được hợp bằng kỹ thuật gen kỹ thuật gen VSV chủ trong tự nhiên Vacxin nhược độc hóa Xóa gen độc Thích ứng nhiệt độ thấp Nhậy cảm nhiệt độ Qua vật chủ trung gian không cảm thụ Tái tổ hợp gen vacxin ADN Vacxin vector di truyền Vacxin ADN
48. 1.6. Chất bổ trợ ❖Khái niệm: – Chất bổ trợ là những hợp chất hóa học được thêm vào trong vacxin nhằm làm tăng khả năng kích thích miễn dịch và tăng hiệu lực của vacxin. – Năm 1930, Ramon là người đầu tiên nghiên cứu về chất bổ trợ. Ông đã chứng minh bằng thực nghiệm rằng khi bổ sung chất bổ trợ vào vacxin thì hiệu lực của vacxin cao hơn. • * Các chất bổ trợ: Gồm 3 loại chính:
49. a. Chất bổ trợ vô cơ: Là những hạt mịn của muối silicat hoặc muối sunfat, muối phosphat hoặc hạt bột talk, than hoạt tính. Ví dụ như: – Alumin hydroxit Al(OH)3 – Sunfat alumin kali AlK(SO4)2.12H2O – Phosphat aluminum Al(PO4) • Trong thú y, người ta hay dùng chất bổ trợ là AlK(SO4)2.12H2O (gọi là keo phèn) trong các vacxin vi khuẩn vô hoạt.
50. b. Chất bổ trợ hữu cơ: Dùng các hợp chất hữu cơ khi trộn vào vacxin sẽ có tính chất huyền phù trông như sữa nên gọi là nhũ dầu. Ví dụ: Dầu khoáng, sapolin Dầu thực vật, mỡ động vật Freund (dầu khoáng paraphin + BCG chết) • Nhưng Freund ít dùng vì hay gây mưng mủ kéo dài hoặc viêm khớp. • Đối với những kháng nguyên phân tử lượng nhỏ người ta có thể gắn với protein mang tải tổng hợp hoặc chất mang từ những hạt mỡ nhỏ gọi là liposon. c. Bổ trợ là sinh vật: Thường dùng là xác của một số loài vi khuẩn như M. tubercullosis hay Sal. typhimurium. Cũng có thể dùng nội độc tố của vi khuẩn như Lypopolysaccarit.
51. * Tác dụng của chất bổ trợ - Kích thích miễn dịch do bản thân chất bổ trợ gây phản ứng viêm nhẹ, kéo các đại thực bào và các tế bào có thẩm quyền miễn dịch khác . - Hấp phụ KN, khoanh vùng KN, làm chậm quá trình giải phóng KN tại vị trí tiêm, do đó KN tồn tại lâu trong cơ thể, kéo dài sự trình diện KN. - Kích thích sự hoạt động của APC để quá trình phân tích, trình diện kháng nguyên đạt hiệu quả. - Chất bổ trợ sinh vật có tác dụng kích thích tế bào miễn dịch. Xác vi khuẩn lao làm tăng tương tác giữa tế bào lympho và đại thực bào, do đó làm tăng đáp ứng miễn dịch tế bào; LPS tác động đến tế bào lympho B làm tăng quá trình phân bào tạo plasmoxyte do đó tăng hàm lượng kháng thể dịch thể đặc hiệu.