Bài giảng Lai phân tử (DNA Hybridization)

Nội dung text: Bài giảng Lai phân tử (DNA Hybridization)

1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Lớp : DHO4SH BÀI THUYẾT TRÌNH LAI PHÂN TỬ (DNA Hybridization)
2. Thành viên : 1. Lê Duy Hoàng Chương 2. Lê Vũ Hồng Hải 3. Nguyễn Thúy Hằng 4. Đặng Cao Hạnh 5. Vũ Quang Hiếu 6. Huỳnh Thanh Hồng 7. Trần Ánh Hồng 8. Nguyễn Thị Tuyết Nga 9. Mã Phạm Quế Mai
3. DÀN BÀI CHUNG I-Lịch sử lai phân tử II–Cơ sở của sự lai phân tử III-Các phương pháp lai phân tử IV-Ứng dụng của lai phân tử Tài liệu tham khảo
4. I-Lịch sử lai phân tử: - 1960 Julius Marmur và những đồng nghiệp của ông quản lý, ngành học tại đại học Harvard đã khám phá ra quá trình ủ lại (reannealing). Quá trình này bao gồm sự kết hợp lại của những mạch đơn thành các phân tử 2 mạch đôi bền vững. Từ sự khám phá ra quá trình reannealing, phương pháp lai các sour nucleic được phát triển. - Sử dụng kỹ thuật những mạch bổ sung từ các nguồn khác nhau của acid nucleic có thể trộn lẫn thành dạng phân tử 2 mạch đôi được đặt tên là thể lai (hybrid).
5. Từ sự phát triển đó, việc lai phân tử mở rộng ra nhiều kỹ thuật khác nhau và được dùng vào những mục đích đa dạng.  Mục đích : Sử dụng lai DNA như một kỹ thuật so sánh dùng cặp base bổ sung để đối chiếu bộ gene chứa toàn bộ nội dung di truyền của 2 loài khác nhau và đánh giá những điểm tương đồng giữa chúng.
6. II–Cơ sở của sự lai phân tử : 1–Khái niệm về “nhiệt độ nóng chảy “ của DNA : Khi một phân tử DNA mạch đôi được đun lên một nhiệt độ vượt quá “nhiệt độ nóng chảy” (Tm) thì hai mạch sẽ tách rời nhau do sự phá vỡ các liên kết hydro nối liền hai mạch.
7. Đường cong Tm
8. 2–Các nhân tố ảnh hưởng đến “nhiệt độ nóng chảy” của DNA : - Ảnh hưởng của các thành phần base trong phân tử DNA . - Ảnh hưởng của độ dài đoạn DNA . - Ảnh hưởng của các điểm bắt cặp sai lệch (các mismatch) . - Ảnh hưởng của môi trường phản ứng .
9. 3-Khái niệm về lai phân tử : - Sau khi hai mạch của phân tử DNA tách rời nhau dưới tác động của Tm, sự bắt cặp sẽ không xảy ra nếu nhiệt độ phản ứng hạ xuống đột ngột. - Lúc đó phân tử DNA sẽ tồn tại trong môi môi trường ở dạng mạch đơn dưới một cấu hình không gian vô trật tự. Ngược lại, nếu sau khi hai mạch tách rời, nhiệt độ được gíảm từ từ cộng với điều kiện thí nghiệm thích hợp, hai mạch sẽ bắt cặp trở lại. → Hiện tượng này được gọi là sự lai phân tử (molecular hybridization).
10.  Đặc điểm :  Đặc hiệu tuyệt đối : sự tái bắt cặp chỉ xảy ra giữa hai trình tự hoàn toàn bổ sung.  Các trình tự bổ sung có thể là DNA hay RNA, dẫn đến sự hình thành các phân tử DNA-DNA, RNA-RNA hay các phân tử lai DNA-RNA.
11. 4-Các yếu tố ảnh hưởng đến sự lai phân tử : 4-1 Nồng độ DNA và thời gian phản ứng - Nồng độ DNA, nghĩa là số lượng các trình tự bổ sung, càng cao thì xác suất tiếp xúc với nhau càng tăng ; → tốc độ phản ứng lai phân tử tăng lên. - Thời gian phản ứng càng dài thì xác suất tiếp xúc càng lớn hơn và số lượng phân tử lai tăng dần cho đến khi toàn bộ các trình tự bổ sung đều tái bắt cặp.
12. 4-2 Nhiệt độ Thông thường tốc độ phản ứng lai cực đại ở nhiệt độ thấp hơn Tm của chính nucleic acid đó độ 25%. 4-3 Độ dài của các trình tự Tốc độ lai tăng tỉ lệ thuận với căn bậc hai của độ dài các trình tự bổ sung. 4-4 Lực ion Nồng độ NaCl 1M làm tăng tốc độ phản ứng lên từ 5 -10 lần . Nồng độ NaCl > 1,2M lại hoàn toàn không còn tác dụng.
13. III-Các phương pháp lai phân tử : Các phương pháp lai phân tử rất đa dạng, cơ bản có thể chia thành 3 nhóm lớn : - Lai trong pha lỏng - Lai trên pha rắn - Lai tại chỗ (in situ hybridization)
14. 1-Lai trong pha lỏng : 1-1 Nguyên tắc : - Các mạch đơn nằm trong môi trường lỏng là một dung dịch đệm. - Sự lai phân tử xảy ra khi các trình tự này gặp nhau do chuyển động nhiệt và khi nhiệt độ môi trường thấp hơn Tm ít nhất vài độ.
15. 1-2 Phân tích định lượng các phân tử lai : 3 phương pháp thường được sử dụng: - Phương pháp dùng quang phổ kế - Phương pháp sử dụng nuclease S1 - Phương pháp sắc kí trên hydroxylapatite
16. i. Phương pháp dùng quang phổ kế - DNA mạch đôi hấp thu ánh sáng yếu hơn DNA mạch đơn. - Sự chuyển từ mạch đôi sang dạng mạch đơn được xác định dễ dàng thông qua việc đo biến động giá trị của mật độ quang (OD) ở bước sóng 260 nm. - Giá trị mật độ quang tăng lên khi phân tử mạch đôi chuyển thành mạch đơn, hiện tượng này có tên gọi là hiệu ứng siêu sắc (hyperchromic effect).
17. Hiệu ứng siêu sắc : Nhuộm tím phân tử DNA , nếu đem chúng đun nóng lên và làm lạnh từ từ thì kết quả là các phân tử DNA sẽ trở nên tím đậm hơn lúc đầu một chút. Nếu hạ nhiệt độ một cách đột ngột thì chúng sẽ trở nên rất đậm. Đó là do hiện tượng các mạch đơn DNA hấp thu tia UV mạnh hơn DNA mạch đôi.
18. ii. Phương pháp sử dụng nuclease S1 - Nuclease S1 là enzyme thủy giải các nucleic acid mạch đơn bất kể là DNA hay RNA trong một số điều kiện thực nghiệm. - Dung dịch phản ứng lai được trích ra một phần, đem xử lí với nuclease S1. - Các mạch đơn sẽ bị thủy giải, các nucleic acid còn lại tương ứng với các phân tử lai được thu nhận qua phương pháp tủa rồi đem định lượng .
19. iii.Phương pháp sắc kí trên hydroxylapatite - Hydroxylapatite là những tinh thể phosphat calci . -Kỹ thuật này sử dụng các mồi đánh dấu (đoạn nucleotide hoặc kháng thể ) để lai với ADN,ARN hoặc với các protein ở trong các tế bào mà không cần tách chiết. - Sau khi các hỗn hợp bị đốt nóng, chúng được làm lạnh để những mạch đơn va chạm ngẫu nhiên. Các hỗn hợp được ủ khoảng 120h ở 600C trong một dung dịch đệm Natri phosphat.
20. - Nhiệt độ này rất quan trọng bởi vì ở nhiệt độ thấp, sự bắt cặp sai lệch sẽ thường xuyên hơn. Tại 600C, DNA chỉ bắt cặp với mạch bổ sung của nó vì đa số các base đủ cho mạch kép bền vững ở nhiệt độ này. - Kế tiếp, 1 mẫu của mỗi thể lai mạch đôi khác nhau tạo thành sẽ được đặt vào cột của hydroxylapatite đã được dìm trong chậu nước 550C. Khi mỗi thể lai tan chảy, nó được rửa sạch cho vào lọ nhỏ và năng lực phóng xạ của mỗi lọ được xác định. Cuối cùng, 1 đường cong tan chảy sẽ được vẽ với những kết quả của thí nghiệm này.
21. 1-3 Các ứng dụng của phương pháp lai trong pha lỏng : a.Tính tỉ lệ % các trình tự giống nhau ở hai loài : Việc lai DNA có thể đo mức độ tương đồng về DNA của các loài khác nhau. Những DNA lai tương đồng nhiều hơn sẽ tan chảy ở nhiệt độ cao hơn. Kỹ thuật này cho thấy rằng người và tinh tinh mang DNA giống nhau nhiều hơn so với DNA của đười ươi hay khỉ đột.
22. b.Phân tích các trình tự lặp lại : - Trong một trình tự DNA, một trình tự lặp lại nhiếu lần sẽ có nhiều cơ may gặp mạch bổ sung hơn so với một trình tự duy nhất. - Bộ gen của Eucaryote có trình tự lặp lại cao hơn ở Procaryote.
23. 2-Lai trên pha rắn : 2-1 Nguyên tắc : - Cùng nguyên tắc với lai trên pha lỏng. - Điểm khác biệt là 1 trong 2 trình tự bổ sung (trình tự đích, trình tự cần tìm) được cố định trên một giá thể rắn (màng nitrocellulose hay nylon). Ưu điểm : + Thao tác dễ dàng. + Tách trực tiếp ADN hay ARN gốc ở dung dịch thuốc thử. + Ngăn sự tái bắt cặp giữa 2 mạch của cùng một phân tử.
24. Hình - Các bước lai trên pha rắn
25. Khuyết điểm : + Phân tích định lượng các phân tử lai kém chính xác. + Hiệu quả thấp + Vận tốc lai trên pha rắn <10 lần so với vận tốc lai trên pha lỏng do một phần các nucleic acid được cố định trên giá thể bị che khuất, không tiếp xúc được với các trình tự bổ sung.
26. 2-3 Ứng dụng của các phương pháp lai trên pha rắn: - Lai trên pha rắn có rất nhiều ứng dụng, hiện nay có 4 phương pháp cơ bản đó là: ✓Southern blot ✓ Northern blot ✓ Western blot ✓ Dot (slot) blot - Nổi bật lên 3 phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất là phương pháp Southern, Northern và Dot blot.
27. Southern Blot Northern Blot Western Blot 1) Trích DNA 1) Trích RNA từ 1) Trích từ tế bào tế bào protein từ tế bào 2) Cắt với enzyme giới hạn 2) Làm biến tính 2) Làm biến với formaldehyde tính với SDS
28. 3) Chạy trên 3) Chạy trên 3) Chạy trên gel gel (thường gel (thường (thường dùng dùng dùng agarose) polyacrylamide agarose) gọi là “SDSPAGE” (hình) (hình) 3*) Làm biến tính DNA với alkali
29. Northern Blot Western Blot
30. 4) Chuyển lên 4) Chuyển lên 4) Chuyển lên màng màng màng nitrocellulose nitrocellulose nitrocellulose ( thường bằng ( thường bằng ( thường do họat động mao họat động mao chạy điện di) dẫn (hình) dẫn 5) Tắc nghẽn 5) Tắc nghẽn 5) Tắc nghẽn với DNA dư với RNA dư với protein dư 6) Lai với mẫu 6) Lai với mẫu 6) Lai với mẫu dò DNA được dò DNA được dò kháng thể đánh dấu. đánh dấu được đánh (hình) dấu
31. Hình – Chuyển DNA từ gel lên màng lai Hình – Lai với mẫu dò DNA được đánh dấu
32. 7) Rửa sạch 7) Rửa sạch 7) Rửa sạch khỏi mẫu dò khỏi mẫu dò khỏi mẫu dò chưa được chưa được chưa được liên liên kết (dưới liên kết (dưới kết sự kiểm sóat sự kiểm soát nghiêm ngặt) nghiêm ngặt) 8) Phóng xạ 8) Phóng xạ tự 8) Phóng xạ tự tự ghi ghi ghi hay thể hiện rõ với chất nền có màu
33. Western blot
34. Những đặc tính quan trọng của 3 phương pháp : Southern Northern Western Cái gì chia DNA bị cắt RNA bị làm Protein bị làm khối lượng bởi enzyme biến tính với biến tính với phân tử cắt formaldehyde SDS đích? Mẫu dò DNA mang DNA mang Kháng thể gene X có gene X có chống lại tính phóng tính phóng xạ protein X đã xạ được đánh dấu phóng xạ hay enzyme
35. Southern Northern Western Ứng -Bản đồ giới hạn - Bao nhiêu - Bao nhiêu dụng của gene X trong mRNA của protein X chromosome. gene X hiện hiện diện ? - Phát hiện các diện? - Độ lớn của fragment - Độ dài protein X? polymorphysm mRNA của của cùng 1 gen ở gene X? các cá thể khác nhau . -Phát hiện đột biến mất đoạn, điểm hay tái tổ hợp trên 1 gen.
36.  Dot blot: - Cho phép định lượng tương đối một DNA hay RNA đặc trưng trong một hỗn hợp mà không cần phải tách chúng ra. - Kỹ thuật Dot (dot là khe) đơn giản hơn nhiều so với các phương pháp khác vì: ▪ Không cần giai đoạn cắt bởi những enzyme cắt giới hạn ▪ Không cần chạy điện di - Kỹ thuật dot được dùng trong nghiên cứu những đoạn DNA ngắn
37. 3-Lai tại chỗ : 3-1 Nguyên tắc : - Lai tại chỗ được phát triển từ phép lai Southern blot. - Kỹ thuật này sử dụng các mồi đánh dấu (đoạn nucleotide hoặc kháng thể ) để lai với ADN, ARN hoặc với các protein ơ trong các tế bào mà không cần tách chiết. ➢ Ứng dụng : định vị gen trên NST, phát hiện dòng vi khuẩn tái tổ hợp, nghiên cứu một RNA chuyên biệt trong tế bào và mô.
38. 3-2 Lai trên khuẩn lạc : Sử dụng để phát hiện dòng vi khuẩn mang vector tái tổ hợp cần tìm trong một ngân hàng gen.
39. 3-2 Lai trên nhiễm sắc thể : - PP này cung cấp thông tin chính xác về vị trí và sự phân bố của một trình tự DNA cần tìm trên NST nhờ mẫu dò chuyên biệt. - Khi nghiên cứu với ARN, NST không được ủ ở pH cao, do đó, chúng giữ nguyên ở trạng thái sợi kép và không lai được với mồi. - Nhờ phương pháp này mà cơ chế hoạt động của gien có thể quan sát được trong trong tổ chức mô.
40. 3-3 Lai trên tế bào và mô : -Trong tế bào và mô, các mRNA có sự phân bố không gian xác định. Điều này có liên quan đến chức năng, sự điều hòa biểu hiện cũng như tương tác giữa mRNA với các thành phần khác của tế bào và mô. -Nghiên cứu trên RNA đã tách chiết và tinh sạch không cho phép thu nhận các thông tin vừa kể → sử dụng pp lai trên tế bào và mô. - Mô được xử lí bằng các pp mô học (cố định, khử nước, tẩm parafin, cắt những lát mỏng (7-10µm), trải trên lam). Kết quả đọc trực tiếp trên lam nhờ kính hiển vi.
41.  Ứng dụng: - Đối tượng có tổ chức phức tạp (não bộ), pp này giúp định vị chính xác vị trí và sự phân bố của một mRNA trong một nhóm tế bào chuyên biệt của tổ chức. - Khi phối hợp pp miễn dịch tế bào và lai tại chỗ, giúp phát hiện đồng thời mRNA và protein của nó → xác định được mối tương qua giữa hoạt động phiên mã và dịch mã của một gen. - Bằng cách lai nhiều lát cắt có cấu trúc gần như đồng nhất với nhiều mẫu dò khác nhau → xác định vị trí, sự phân bố và tương tác giữa các mRNA tham gia vào 1 quá trình sống.
42. IV-Ứng dụng của lai phân tử : 1)Một con thoi sinh học mới – tRNA. - Trên tờ Science (1 July 2005), nhóm tác giả Tohru Yoshihisa đã cho tho thấy các tRNA trưởng thành trong tế bào chất đã chủ động quay trở lại nhân nơi mà chúng được sinh ra. - Các tác giả sử dụng kỹ thuật lai tại chỗ có sự hỗ trợ chất phát hùynh quang (fluorescence in situ hybridization) để lần theo sự di chuyển của chúng trong nấm men.
43. 2) Y học: - Trong lĩnh vực y học, dùng pp này với những con thú cần để thực thử nghiệm việc trị bệnh cho người. Nếu một loài thú được tìm thấy có sự di truyền tương đồng với người qua việc lai DNA, có khả năng rằng những phương pháp chữa bệnh cho người được khám phá bởi việc thực hiện những cuộc phẫu thuật dựa trên kinh nghiệm về những loài thú.
44. 3) Chăn nuôi : Trong ngành thủy sản, dùng pp lai tại chỗ (in situ hybridization) để chẩn đoán bệnh virus đốm trắng của tôm. 4) Thực phẩm : Dùng pp lai phân tử để kiểm tra thực phẩm biến đổi gen.
45. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu trong nước: 1.Hồ Huỳnh Thùy Dương (1998). Sinh học phân tử. 2.Nguyễn Thị Lang. Các phương pháp nghiên cứu cơ bản trong CNSH. Tài liệu trên mạng: 1. Cac file lai PT qtrong\Bio-Strand 3D microarray for DNA, PCR hybridization.htm. 2. Cac file lai PT qtrong\Bio-Strand SNP analysis by DNA hybridization.htm. 3. Cac file lai PT qtrong\Southerns, Northerns, Westerns, & Cloning Molecular Searching Techniques.htm
46. 4.Cac file lai PT qtrong\Western Blot Method.htm. 5.Cac file lai PT qtrong\Southern blotting.htm. 6.Sinh học Việt Nam Tin tức Một con thoi sinh học mới – tRNA_files. 7.Western Blot Activity_files. 8.History Genetic Similarities, Page 2 of 3.htm. 9.Isolation of DNA from Agarose and Polyacrylamide Gels.htm. 10.Immunohistochemistry - In Situ Hybridization.htm H Ế T