›
›

Bài giảng Kỹ thuật chuyển gen cho động vật

pdf 36 trang phuongnguyen 3820
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Bài giảng Kỹ thuật chuyển gen cho động vật", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfbai_giang_ky_thuat_chuyen_gen_cho_dong_vat.pdf

Nội dung text: Bài giảng Kỹ thuật chuyển gen cho động vật

  1. Kỹ thuật chuyển gen cho động vật I. KháI NIệM Về chuyển gen Cho động vật 1.1. Định nghĩa Kỹ thuật chuyển gen là kỹ thuật đ−a một hay nhiều gen lạ đ đ−ợc thiết kế ở dạng ADN tái tổ hợp vào tế bào chủ của động vật làm cho gen lạ có thể tồn tại ở dạng plasmit tái tổ hợp hoặc gắn vào bộ gen tế bào chủ. Trong tế bào chủ, các gen này hoạt động tổng hợp nên các protein đặc tr−ng dẫn tới việc xuất hiện các đặc tính mới của cơ thể chuyển gen. đối với các thể nhân chuẩn, việc chuyển gen đ−ợc xem là thành công khi gen chuyển vào đ−ợc tổ hợp vào genom của tế bào chủ, đặc tính của gen chuyển nạp đ−ợc duy trì ổn đinh qua các thế hệ con cháu 1
  2. 1.2.L−ợc sử phát triển 1977 Gurdon chuyển ARNm và ADN vào phôi Xenopus (ếch) và quan sát thấy sự biểu hiện chức năng của chúng 1980 Brinster và cs nhận đ−ợc kết quả t−ơng tự ở chuột 1981 Wagner và cs đã cấy chuyển thành công gen β-globulin của thỏ vào phôi chuột Từ 1985 nhiều tác giả thành công trong tạo thỏ, cừu, lợn, bò chuyển gen và các vật nuôi chuyển gen tăng tr−ởng nhanh đ−ợc ứng dụng mạnh mẽ trong nông nghi ệp 1.3. mục đích chuyển gen • Chuyển gen vào các dòng tế bào động vật nuôi cấy để sản xuất protein in tái tổ hợp • Tạo vật nuôi chuyển gen với đặc tính cải tiến mới về các sản phẩm sữa, thịt, lông • Biến vật nuôi thành bioreacter sản xuất protein tái tổ hợp • Tạo vật nuôi chuyển gen “knock out” làm mô hình nghiên cứu về y sinh học các bệnh di truyền • Chuyển gen liệu pháp nhằm chữa trị các bệnh di truyền (của ng−ời) 2
  3. 1.4. Đối t−ợng chuyển gen Hầu hết các ph−ơng pháp chuyển gen đ−ợc phát triển trên mô hình chuột và sau đó chúng đ−ợc ứng dụng trên gia súc, gia cầm Việc chuyển gen th−ờng đ−ợc thao tác trên: - Tế bào trứng đ thụ tinh - Tế bào tinh trùng - Mô phôi ở giai đoạn sớm - Tế bào gốc phôi II.Các ph−ơng pháp chuyển gen vào tế bào động vật Ph−ơng pháp chuyển gen trực tiếp : -Chuyển gen nhờ phốt phát canxi -Chuyển gen nhờ xung điện -Chuyển gen nhờ vi tiêm -Chuyển gen nhờ liposom Ph−ơng pháp chuyển gen gián tiếp : Chuyển gen nhờ virus 3
  4. II.1.Các ph−ơng pháp Chuyển gen trực tiếp 1.Chuyển gen nhờ phosphat canxi Kỹ thuật phosphat canxi để đ−a gen vào tế bào động vật có vú lần đầu đ−ợc Graham và Vander Eb đề xuất năm 1973 và cho đến nay vẫn đ−ợc áp dụng rộng rãi. Kỹ thuật này có thể sử dụng để đ−a DNA vào tế bào động vật có vú với mục đích các test thể hiện chuyển nạp hay biến nạp lâu dài. 1.Chuyển gen nhờ phosphat canxi Nguyên tắc: • Các DNA ngoại lai đ−ợc trộn với CaCl2 sau đó đ−ợc chuyển vào một dung dịch chứa ion phosphat. Một phức hợp đồng ng−ng kết (coprecipitate) giữa canxi phosphat và DNA sẽ đ−ợc hình thành. • Phức hợp này sẽ đ−ợc các tế bào động vật có vú tiếp nhận khi nuôi cấy thông qua thực bào , kết quả là có thể tạo tế bào chuyển gen với sự thể hiện gen ngoại lai trong tế bào. • Các DNA chuyển nạp mang một gen chỉ thị chọn lọc (nh− gen aminoglycoside phosphotransferase) để giúp cho việc thanh lọc các tế bào không tiếp nhận DNA. 4
  5. 2.Chuyển gen nhờ xung điện Nguyên tắc: • Khi trong điện tr−ờng có một mật độ tế bào cao và tạo ra một xung điện (điện thế cao trong một thời gian rất ngắn), lúc đó trên màng tế bào xuất hiện các lỗ nhỏ. • Qua các lỗ này, DNA có thể đi sâu vào trong tế bào và ở một số tế bào chúng có thể t−ơng tác với genome của tế bào tạo tế bào chuyển gen. 2.Chuyển gen nhờ xung điện (tiếp) • Máy tạo xung điện th−ờng đ−ợc thiết lập một công suất ổn định và cả thời gian gây xung ổn định với các điện thế biến đổi từ 500-1500 v/cm. • Đối với hầu hết tế bào, sự thiết lập nh− vậy đảm bảo 20-50% số tế bào còn sống sau khi thực nghiệm chuyển DNA. • Quá trình chuyển gen nhờ xung điện đ−ợc thực hiện ở nhiệt độ phòng còn các tế bào đ−ợc giữ liên tục trong đá để kéo dài thời gian mở lỗ các tế bào. 6
  6. Máy tạo xung điện 8
  7. 2.Chuy ển gen nhờ xung điện (tiếp) Chú ý • Các DNA đã đ−ợc duỗi thẳng cho hiệu quả chuyển gen cao hơn các DNA ở dạng siêu xoắn, do ở dạng thẳng chúng dễ t−ơng tác hơn vào bộ genome của tế bào đích. • Để chuyển gen bằng kĩ thuật này cần sử dụng huyền phù tế bào đơn, tránh sử dụng các tế bào dính lại với nhau vì các khối tế bào này hay dính vào thành bình làm giảm hiệu quả chuyển nạp. • Nói chung, để chuyển gen bằng ph−ơng pháp này cần sử dụng nhiều DNA cũng nh− tế bào hơn so với ph−ơng pháp hoá học. • Mỗi loại tế bào có các thông số kỹ thuật tối −u khác nhau khi sử dụng kĩ thuật này. 3.Chuyển gen nhờ vi tiêm Nguyên tắc: • Tiêm trực tiếp ADN ngoại lai vào nhân tế bào động vật nhờ dụng cụ vi tiêm với kim tiêm rất mảnh. • Ph−ơng pháp này cho kết quả rất cao nh−ng số l−ợng tế bào đ−ợc xử lý nhỏ do phải thao tác trên từng tế bào. • Ph−ơng pháp này th−ờng dùng để đ−a ADN vào hợp tử hoặc các tế bào phôi sớm. • Việc chuyển gen vào tế bào động vật tốt nhất là chuyển vào một trong những nhân con của trứng đ thụ tinh tr−ớc khi các nhân con kết hợp với nhau để tạo ra hợp tử l−ỡng bội. • Bằng cách chuyển gen vào giai đoạn tiền nhân, gen chuyển vào sẽ đ−ợc truyền cho các thế hệ phôi tiếp theo và có thể di truyền cho con cháu. 9
  8. 3.chuyển gen bằng vi tiêm (tiếp) Các b−ớc tiến hành: • Thiết kế cấu trúc gen chuyển • Gây siêu bài non ở con cái, thu nhận hợp tử sau khi giao phối • Chuẩn bị dung dịch ADN cho vi tiêm • Chuẩn bị tế bào hợp tử • Vi tiêm ADN vào tiền nhân • Chuyển phôi vi tiêm vào cơ thể nhận • Kiểm tra gen chuyển ở con non. Lai tạo để củng cố di truyền 10
  9. Thiết bị chuyển gen bằng vi tiêm 11
  10. 4.Chuyển gen nhờ Liposom 4.1.Nguyên lý thiết kế vectơ chuyển gen liposom • Ph−ơng pháp dựa trên sự t−ơng tác ion của DNA và thể liposome tạo ra một thể phức hợp, phức hợp này có thể phóng thích các DNA chức năng vào tế bào nuôi cấy • Liposom cấu tạo từ các lớp màng lipid tạo dạng túi, bên trong chứa n−ớc, kích th−ớc khoảng 10 nm đến 1000 nm. Liposom th−ờng có một lớp lipid mang điện tích d−ơng (lipofecamin) và các phân tử lipid trung tính nên liposom có điện tích d−ơng (+) vì vậy nó có thể kết hợp với các phân tử, hoặc các chất mang điện tích âm (-) tạo thành phức hợp ổn định. • Thiết kế tạo vectơ liposom thực chất là tạo các phức hợp liposom - DNA. Phân tử DNA có điện tích âm (-) có thể kết hợp với liposom tạo nên các phức hợp ổn định, đ−ợc sử dụng làm vectơ chuyển gen . 12
  11. Sơ đồ cấu trúc và hoạt động của vec tơ liposom 13
  12. 4.Chuyển gen nhờ Liposom (tiếp) 4.2.Cơ chế hoạt động của vectơ liposom • Vectơ liposom có khả năng tiếp xúc với màng tế bào của các tế bào đích và chui qua màng tế bào, khi đó lớp các phân tử lipid bị phân huỷ làm cho các gen mục tiêu đ−ợc đ−a vào trong tế bào. • Gen mục tiêu có thể đ−ợc đ−a vào trong nhân, tồn tại trong nhân nh− những đơn vị gen độc lập. Trong nhân các gen mục tiêu có thể có quá trình tái tổ hợp làm cho gen này đ−ợc gắn vào bộ gen của tế bào chủ tạo tế bào đ−ợc chuyển gen. ii.2. chuyển gen gián tiếp nhờ virus Nguyên lý chung Khi xâm nhiễm vào tế bào, virus có khả năng chuyển bộ gen của nó vào tế bào chủ.  Một số nhóm virus có thể gắn bộ gen hoặc một số gen của chúng vào bộ gen tế bào chủ, tạo thành một thể thống nhất. Các gen virus gắn với bộ gen của tế bào chủ có thể tồn tại lâu dài cùng với quá trình phân chia của tế bào chủ, tạo nên các provirus. 14
  13. ii.2. chuyển gen gián tiếp nhờ virus (tiếp) Khi trong cơ thể hay từ ngoài môi tr−ờng có một tác nhân nào đó không bình th−ờng tác động vào provirus, làm cho bộ gen virus tách khỏi bộ gen tế bào chủ, thực hiện quá trình tái bản gen virus và các thành phần của virus trong tế bào chủ. Quá trình lắp ghép các thành phần của virus tạo nên các virion, các virion hoạt động tạo nên vô số virus mới phá vỡ tế bào chủ, tiếp tục xâm nhiễm các tế bào khác • Chu trình lây nhiễm của virus 15
  14. ii.2. chuyển gen gián tiếp nhờ virus (tiếp)  Trên cơ sở hiểu biết đặc điểm và cơ chế xâm nhiễm của virus vào tế bào chủ, con ng−ời đ tìm ra các biện pháp loại bỏ hoặc gây bất hoạt các gen có hại của virus, nh−ng vẫn giữ lại các gen virus giúp cho sự xâm nhiễm và gắn gen vào bộ gen của tế bào, tạo nên các vectơ chuyển gen.  Vectơ chuyển gen hình thành từ những virus biến đổi gen nh− trên đ−ợc gọi là vectơ chuyển gen có bản chất virus. Trong các vectơ này, gen ngoại lai cần chuyển nạp đ−ợc thay thế vào vị trí một số gen của virus, nh−ng vẫn đảm bảo để virus có khả năng xâm nhiễm và chuyển gen vào tế bào, hoặc gắn gen ngoại lai với bộ gen của tế bào đích nhằm thực hiện chức năng chuyển gen. ii.2. chuyển gen gián tiếp nhờ virus (tiếp) Vectơ virus gồm một số loại chủ yếu: +Vectơ retrovirus (ARN) +Vectơ adenovirus (ADN sợi kép) +Vectơ adeno-associated virus (ADN sợi đơn) + Vectơ herpes simplex virus (ADN sợi kép) + Vectơ baculovirus (ADN vòng kép) 16
  15. 1.chuyển gen nhờ Vectơ retrovirus 1.1. Đặc điểm cấu tạo và di truyền của retrovirus • Retrovirus là loại virus RNA có khả năng xâm nhiễm tế bào chủ cao và có khả năng gắn bộ gen virus với bộ gen tế bào chủ. Đó là cơ sở thuận lợi để thiết kế các vectơ chuyển gen hiệu quả. • Cấu trúc retrovirus gồm:  Phần vỏ có 3 lớp:lớp vỏ ngoài cùng là glycoprotein, tiếp đến lớp vỏ kép lipid, lớp trong cùng là vỏ capsid.  Bên trong lớp vỏ capsid là phần lõi RNA gồm 2 sợi đồng dạng và các loại enzym của virus:  Enzym phiên mã ng−ợc (reverse transcriptase) giúp virus chuyển bộ gen RNA sang dạng cDNA mạch kép.  Enzym cài xen (integrase) giúp cho quá trình cài xen bộ gen của virus với bộ gen của tế bào chủ ở những điểm t−ơng đồng. • Retrovirus life cycle 17
  16. ψψψ Sơ đồ cấu trúc của Retrovirus • Bộ gen retrovirus gồm hai sợi RNA có cấu trúc và kích tr−ớc giống nhau (7 kb - 11 kb). Mỗi sợi RNA chứa 3 nhóm gen chủ yếu: gag, pol, env . Cụ thể: -Gen gag m hoá protein lõi trong thành phần cấu trúc hạt virion -Gen pol m hoá enzyme phiên m ng−ợc và các enzyme cần thiết cho hoạt động của virus -Gen env m hoá protein trong cấu trúc các lớp vỏ của virus. • Hai đầu mỗi sợi RNA có một trình tự lặp dài tận cùng - LTR (long terminal repeats) mang một số trình tự cần thiết cho quá trình biểu hiện gen của virus và một trình tự đặc hiệu giúp cho quá trình gắn bộ gen của virus với bộ gen của tế bào chủ. • Tại đầu 5’-LTR có một trình tự giúp quá trình đóng gói bộ gen của virus gọi là trình tự ψψψ (psi) 18
  17. 1.1.chuy ển gen nhờ Vect ơ retrovirus (tiếp) 1.2.Nguyên lý thiết kế vectơ retrovirus Thiết kế vectơ retrovirus là một quá trình phức tạp, gồm nhiều giai đoạn khác nhau:  Loại bỏ các gen chủ yếu của virus gag, pol, env và thay thế bằng gen cần chuyển nạp (gen mục tiêu) tạo thành vectơ bộ gen (vector genome).  Xử lý cắt riêng các gen gag, pol và env của retrovirus nh−ng vẫn đảm bảo chức năng các gen.  Đ−a vectơ bộ gen cùng với các gen gag, pol và env đ xử lý của virus vào một tế bào đặc hiệu là tế bào đóng gói.  Trong tế bào đóng gói, các gen virus hoạt động tổng hợp các thành phần vỏ của virus, các thành phần vỏ này kết hợp với vectơ mang gen mục tiêu hình thành nên vectơ retrovirus. Retrovirus vector • Retrovirus Packing Kit Ampho ,Company :Takara Mirus Bio, Price$252.00 • This kit is designed to obtain transient high-titer recombinant retrovirus particles by co- transfection of retrovirus vector plasmid with target gene and two unique vectors for packaging, using calcium phosphate method. This kit contains a gag-pol expression vector and an amphotropic env expression vector. The recombinant virus obtained using this kit are able to infect most mammalian cells. 19
  18. 1.chuy ển gen nhờ Vect ơ retrovirus (tiếp) 1.3.Cơ chế hoạt động của vectơ retrovirus • Vectơ retrovirus đ−ợc đ−a đến các tế bào đích bằng nhiều kỹ thuật khác nhau. Khi tiếp cận tế bào đích ở những thụ thể (receiptor), vectơ retrovirus đ−ợc đ−a vào bên trong tế bào. Trong tế bào chất của tế bào đích các thành phần vỏ của vectơ bị phân huỷ, phần lõi RNA đ−ợc giải phóng. • Enzym phiên mã ng−ợc của virus xúc tác quá trình chuyển RNA sợi đơn thành cDNA sợi kép. cDNA qua lỗ màng nhân vào trong nhân tế bào đích, nhờ enzym cài xencủa virus làm cho cDNA mạch kép đ−ợc gắn xen vào bộ gen ở những điểm t−ơng đồng. Gen mục tiêu cũng đồng thời đ−ợc gắn vào bộ gen của tế bào đích, phiên mã và dịch mã tạo nên các protein sản phẩm của gen mục tiêu trong tế bào đích. Tế bào đóng gói Tế bào đích Sơ đồ hoạt động của vec tơ retrovirus 20
  19. 2.chuyển gen nhờ Vectơ baculovirus 2.1.Cấu trúc baculovirus • Baculovirus có bộ gen ADN vòng, chuỗi kép lớn (từ 88 tới 200Kbp). Bộ gen này đ−ợc liên kết với protein kiềm- giầu arginin (6,5KDa.) nằm bên trong nucleocapsid chứa protein capsid (39KDa.) Kích th−ớc của bộ gen virus xác định theo kích th−ớc của nucleocapsid (chiều dài khoảng 200 – 400nm, chiều rộng khoảng 36nm). • Nucleocapsid đ−ợc gói trong vỏ lipoprotein để hình thành tiểu phần virus hay virion. • Các virion đ−ợc vùi trong nền polyhedron. Polyhedron gồm nhiều protein đơn giản (polyhedrin) . • Polyhedra (hạt baculovirus) là những cấu trúc lớn có kích thứơc 1 - 15 àààm với vỏ polysacarit cứng bọc ngoài để bảo vệ. A) Baculovirus particles, or polyhedra; B) Cross-section of a polyhedron; C) Diagram of polyhedron cross-section. Electron micrographs (A&B) by Jean Adams, graphic â by V. D'Amico. 21
  20. Baculovirus Polyhedratrongtếbào 22
  21. 2.2. Sự nhân lên của baculovirus in vivo • Giai đoạn ấu trùng của côn trùng rất dễ bị nhiễm Baculovirus qua đ−ờng tiêu hóa. Polyhedra đ−ợc hoà tan trong môi tr−ờng kiềm ở ruột, giải phóng ra những virion . • Vỏ lipoprotein của virion hoà vào màng bào t−ơng của tế bào thành ruột và giải phóng nucleocapsid vào trong bào t−ơng. • Nucleocapsid vận chuyển ADN virus vào nhân tế bào. • Baculovirus sản sinh ra 2 dang cấu trúc khác hẳn nhau trong 2 giai đoạn của chu kỳ nhân virus:  Tế bào nhiễm vòng một tạo virus xuất ngoại (extracellular virus – ECV) đ−ợc giải phóng vào haemolymph (huyết t−ơng) để gây nhiễm cho các tế bào khác trong chính cơ thể ấu trùng .  Các tế bào bị nhiễm vòng hai của sự nhân virus trong ấu trùng cũng sản xuất ECV nh−ng có thêm tiểu phần virus (virion) trong polyhedra. Sự tích tụ polyhedra trong côn trùng đ−ợc tiến hành cho đến khi vật chủ biến thành một túi virus. Giai đoạn cuối này, ấu trùng hoá lỏng và giải phóng polyhedra đi gây nhiễm cho côn trùng khác 23
  22. 2.3.Thiết kế vectơ baculovirus • Bộ gen của baculovirus rất lớn nên rất khó gài trực tiếp ADN ngoại lai • Sử dụng plasmid (pUC) làm vectơ vận chuyển gen ngoại lai và có gài promoter polyhedrin, tạo vectơ vận chuyển tái tổ hợp • Đồng chuyển nhiễm vào tế bào côn trùng (sâu khoang-Spodoptera frugiperda ) vectơ vận chuyển tái tổ hợp và ADN cải biến của baculovirus (Autographa californica nuclear polyhedrosis virus -AcNPV ) và thông qua sự tái tổ hợp đồng nhất trong tế bào sâu tạo đ−ợc vectơ virus tái tổ hợp mang gen ngoại lai. 24
  23. Sơ đồ sản xuất protein tái tổ hợp khi sử dụng BaculoGold - vect ơ AcNPV tái tổ hợp (BD Biosciences Pharmingen ) iii.Kỹ thuật chuyển gen trong cải tiến giống động vật 1. Các h−ớng nghiên cứu tạo vật nuôi chuyển gen: • Tăng tr−ởng: làm tăng tốc độ sinh tr−ởng và chất l−ợng thành phần cơ thể động vật thông qua chuyển các gen điều hoà hocmon tăng tr−ởng • Kháng bệnh: Xác định và chuyển các gen có thể tác động đến tính kháng bệnh ở vật nuôi (gen kháng bệnh chuyên biệt, gen receptor tế bào T, gen mã hoá lymphokine, ) • Cải tiến chất l−ợng, thành phần sản phẩm: chuyển gen làm giảm hàm l−ợng lactose trong sữa, tăng hàm l−ợng cystein để gia tăng sự phát triển lông • Gene-farming: dùng động vật nh− hệ thống cải biến sinh học để sản xuất các protein đặc biệt 25
  24. 1. Các h−ớng nghiên cứu tạo vật nuôi chuyển gen (tiếp) • Để kỹ thuật chuyển gen trở thành công cụ hiệu quả trong tạo giống động vật cần tập trung nghiên cứu các vấn đề cơ bản sau: Cải thiện tối −u các ph−ơng pháp chuyển gen Phân lập và định tính đ−ợc các gen mục tiêu Phân lập và đinh tính đ−ợc các nhân tố điều hoà thích hợp (promotor, enhance ) 2.Một số thành tựu trong tạo động vật chuyển gen 2.1.Chuyển gen làm tăng sức sinh tr−ởng • Chuy n gen to hocmon sinh tr ng cho chu t, ln, cu, cỏ hi bng ph ơ ng phỏp vi tiờm gen GH vào nhõn con ca tr ng ó th tinh, ó thu c ng vt chuy n gen cú bi u hi n ca gen chuy n np •((Tỷ lệ thành công khi chuyển gen: chuột 25%, lợn: 10,4%, cừu: 1,3% và bò 0,6%) Chuột chuyển gen hoocmon sinh tr−ởng (phải) và chuột đối chứng 26
  25. CÁ HỒI CHUY ỂN GEN HOOCMON SINH TR ƯỞNG (Tốc độ tăng tr−ởng cao gấp 10-30 lần) 2.2. Chuyển gen kháng bệnh Chuyển gen kháng bệnh chuyên biệt: • Mx là một trong các gen kháng sự nhiễm virus. Chuột mang allele trội Mx1+ kháng vi rus cúm A và B, nếu mang allele lăn Mx1- không kháng đ−ợc sự xâm nhiễm của virus cúm • Chuyển gen Mx1+ cho lợn nhằm kháng virut cúm Orthomyxovirus 27
  26. 2.2. Chuyển gen kháng bệnh • Biểu hiện gen sản xuất kháng thể đơn dòng trong động vật chuyển gen tạo miễn dịch di truyền: chuyển gen m hoá cho chuỗi α và κ trong cấu trúc phân tử kháng thể cho chu ột, cừu, lợn tạo l−ợng lớn sản phẩm của gen • Miễn dịch nội bào: chuyển gen m hoá protein virus hay các dạng đột biến của các protein này để tạo sự bảo vệ với chính virus đó. Ví dụ: chuyển gen m hoá protein của chủng Avian Leucokis virus cho gà để kháng chính virus này 2.3. Chuyển gen cải biến chất l−ợng và thành phần sản phẩm • Năm 1998 Ward và cộng sự đ chuyển 2 gen m hoá cho 2 enzym của vi khuẩn vào cừu để biến đổi Serine thành Cystein nhằm tăng sản l−ợng len • Viện nghiên cứu nông nghiệp quốc gia Pháp (INRA) đ tạo ra giống bò tiết sữa chua (yaourt) do chuyển gen sản sinh các sản phẩm lên men sữa chua vào bộ máy di truyền của bò sữa. Con bò này tên là BuBu do Danny Lactaire tạo thành công. • Làm giảm hàm l−ợng lactose trong sữa cừu và bò bằng chuyển gen lactose kết hợp với promotor chuyên biệt để chuyển lactose thành galactose và glucose 28
  27. 2.4.Chuyển gen vào động vật để sản xuất protein giá trị cao. • Bằng cách chuyển gen vào động vật lấy sữa có thể thu đ−ợc sữa có mang các protein là sản phẩm của gen chuyển nạp: • Chuyển gen tạo Lysostaphin: kháng khuẩn gây bệnh viêm vú • Chuyển gen sản xuất Factor VIII (ng−ời): yếu tố đông máu • ααα1 – antitrypsin (ng−ời): chất ức chế proteinase-chuyển gen ααα1- antitrypsin của ng−ời với promotor βββ -lactoglobulin vào cừu và cho kết quả rất khả quan, hàm l−ợng ααα1- antitrypsin đạt đ−ợc 35g/lít sữa, chiếm 50% tổng l−ợng protein sữa. • Chuyển gen cho dê Alpine để sản xuất sữa chứa protein đặc hiệu điều trị ung th− có tên là BR96. • Chuyển gen vào cừu, bò để sản xuất albumin- thành phần chính cấu tạo nên máu từ sữa cừu. ở Mỹ đang kết hợp kỹ thuật nhân bản động vật với kỹ thuật gen để tạo ra các bò sản xuất albumin cao trong sữa (80 kg albumin/bò/năm). • Chuyển gen βββ-globin kết hợp gen α-1-globin và gen βββ-A-globin tạo đ−ợc lợn chuyển gen sản xuất hemoglobin của ng−ời Lợn sản xu ất Hemoglobin của ng ười 29
  28. Bũ Herman mang gen Lactoferin của ng ười (Pharming Group N.V. – 1990) Dờ sản xu ất TPA (tissue plasminogen activator ) của ng ười 30
  29. Sơ đồ chuyển gen để sản xuát Factor VIII trong sữa lợn Ví dụ : Các protein d−ợc liệu giá trị cao đ−ợc sản xuất trong sữa động vật chuyển gen (ch−a th−ơng mại hóa) động Protein Sử dụng vật Giảm l−ợng máu cần thiết trong một số phẫu Antithrombin III Dê thuật FactorVIII, Dê, lợn, Nhân tố đông máu Factor IX Cừu CFTR Cừu Chống xơ nang (cystic fibrsis) Kháng sinh tự nhiên dùng trong phẫu thuật Lactoferrin Bò thể vành Alpha-1- Cừu Chống xơ nang và khí thũng antitrypsin Lysostaphin Bò Chất kháng khuẩn ngăn chặn sự viêm vú Spider silk Sản xuất vật liệu siêu nhẹ và siêu bền dùng Dê protein trong y học và công nghiệp 31
  30. the new, improved transparent frog lets you see just what’s going on under the skin. Plus, “By attaching green fluorescent markers to a stretch of DNA and injecting it into the frog, researchers can also study the behaviour of genes in a living organism.” Originally developed in 1999 by Singapore scientist Zhihuan Gong, GloFish have been successfully sold throughout the United States, despite being illegal in California — and Canada and the European Union, too. 2.5. Chuyển gen ng−ời vào động vật nhằm sản xuất các nội tạng thay thế • Di ghép (Xenotransplantation): ghép mô tế bào từ loài này sang loài khác • Cản trở lớn nhất khi dị ghép là sự đào thải mạnh cơ quan cấy ghép do sự liên kết giữa các kháng thể có sẵn của cơ thể chủ với các epitor cacbohydrat (α-Gal) trên bề mặt tế bào cơ quan ghép • Nếu con vật cho cơ quan ghép mang 1 hay hơn nữa cac gen m hoá cho protein ức chế bổ thể của ng−ời thì cơ quan ghép sẽ đ−ợc bảo vệ • Tạo lợn chuyển gen mang các gen ức chế bổ thể ng−ời để cung cấp cơ quan cấy ghép 32
  31. Năm 1992, lần đầu tiên các nhà khoa học ởTr−ờng đại học Cambridge đã tạo ra lợn chuyển gen có tim đ−ợc bao bọc bởi protein ng−ời HYPERACUTE REJECTION of a But tissues from pigs có thể ghép cho ng−ời mà không gây pig organ transplanted into a genetically engineered to patient would very likely occur in carry the angular sugar phản ứng đào thải. minutes. It ensues after groups found in people with antibodies bind to the linear type O blood should not sugar chains lining pig blood elicit such reactions (nght). Ngoài sử dụng cơ quan cấy ghép, vessels ( left ). chiến l−ợc sử dụng các mô khác của lợn chuyển gen trị liệu cho ng−ời (mô thần kinh chữa Parkinson, tế bào tuyến tuỵ đảo chữa tiểu đ−ờng ) đang đ−ợc tập trung nghiên cứu Lợn Millie, Christa, Alexis, Carel và Dotcom đ−ợc sinh vào ngày 05/05/2000 qua nhân bản sử dụng các tế bào tr−ởng thành. Các loại cá đ−ợc chuyển gen Loài Gen chuyển Quốc gia Cá trắm cỏ Gen marker Mỹ Cá vằn Gen GFP Mỹ Cá chép, cá hồi Hormon tăng tr−ởng Canada Cá vàng Polypeptide chịu lạnh Cuba Cá trạch Interferon Pháp Cá Northern pike Phytase (chuyển hoá Nauy phytat) Cá hồi rainbow Nhân tố đông máu VII Trung quốc Cá hồi bạc Gen báo cao Nhật ban Cá hồi đại d−ơng Antisense GnRH Hàn quốc 33
  32. 2.6. Chuyển gen tạo côn trùng kháng các tác nhân gây bệnh cho ng−ời • Một thành công rất đáng chú ý là chuyển gen vào muỗi để chống lại bệnh sốt rét với 2 h−ớng:  Tạo muỗi có khả năng đề kháng với ký sinh trùng sốt rét, ký sinh trùng không thể sống lâu trong cơ thể muỗi, chúng sẽ bị diệt bởi ký sinh trùng tr−ớc khi truyền bệnh cho ng−ời.  Tạo muỗi mẫn cảm với ký sinh trùng sốt rét, chúng sẽ bị diệt bởi chính ký sinh trùng này tr−ớc khi truyền bệnh cho ng−ời. IC scientists create first transgenic malaria mosquito (Imperial College scientists and the European Molecular Biology Laboratory in Heidelberg) • Left to right; Dr Flaminia Laser scanner image of transgenic Catteruccia, Dr Andrea mosquito larvae. The white areas Crisanti and Dr Tony of high fluorescent intensity indicate a high level of transgene Nolan, department of expression - particularly in the gut biology - the IC research of the larvae team 34
  33. Female Anopheles gambiae mosquito feeding. Malaria vector, parasite. Marcelo Jacobs-Lorena In March 2007, Jacobs-Lorena and his JHMRI colleagues published a study in Proceedings of the National Academy of Sciences , which demonstrated that modified mosquitoes, resistant to malaria Marcelo Jacobs-Lorena , PhD, a professor with the Johns Hopkins Malaria Research Institute (JHMRI), was honored as one of Scientific American magazine’s “SciAm 50 ” for his work toward developing genetically-modified mosquitoes resistant to malaria. 3.Tồn tại trong tạo động vật chuyển gen • Cải tiến giống động vật bằng kỹ thuật chuyển gen là chiến l−ợc đúng đắn và đ có những thành công nhất định • Tuy nhiên còn nhiều vấn đề cần giải quyết bởi sự biểu hiện của các gen đ−ợc chuyển trong cơ thể động vật rất phức tạp và sự di truyền các gen sang các thế hệ sau là vấn đề nan giải. Các quá trình sinh học xảy ra khi ADN ngoại lai sát nhập vào bộ gen nh− thế nào ch−a đ−ợc hiểu rõ ràng • Vấn đề khảm và đột biến chèn làm hiệu quả tạo động vật chuyển gen giảm rõ rệt 35
  34. 3.Tồn tại trong tạo động vật chuyển gen • Hiên t−ợng thể khảm: th−ờng chỉ xảy ra ở thế hệ Fo. Nếu cơ quan sinh dục không mang gen chuyển thì các thế hệ con sẽ không đ−ợc thừa h−ởng gen chuyển. Nếu cơ quan sinh dục là mô khảm thì thế hệ con mang gen chuyển có thể nằm trong khoảng 0-50%. Hơn thế, gen chuyển hiếm khi đ−ợc ổn định qua vài thế hệ • Đột biến chèn: khi gen chuyển sát nhập vào vị trí lẽ ra là của một gen cần thiết cho sự phát triển của thai thì khi những động vật chuyển gen bán hợp tử (hemizygote transgenic) giao phối với nhau đột biến chèn sẽ đ−ợc thể hiện và không thể sinh ra thế hệ con đồng hợp tử do chúng chết ngay giai đoạn thai 3.Tồn tại trong tạo động vật chuyển gen • Để có thể đ−a động vật chuyển gen ra quần thể bên ngoài thành công cần phải đạt đ−ợc những điều kiện tiên quyết sau:  Sự chuyển ổn định gen ngoại lai sang thế hệ con, cháu  Không xảy ra các đột biến chèn để tạo tạo đ−ợc động vật chuyển gen đồng hợp tử  Biểu hiện ổn định của gen chuyển với tác động d−ơng tính của các tính trạng mục tiêu  ít nhất phải tạo đ−ợc 5-10 cá thể chuyển gen đầu dòng ổn định, cho phép đ−a vào sản xuất thành công bầy đàn 36